CN107354223B - 与hcv感染肝硬化相关的单核苷酸多态性位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与HCV感染肝硬化相关的单核苷酸多态性位点及其应用。本发明所保护的技术方案是检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备筛查HCV感染肝硬化患者产品中的应用。可将检测rs12252的多态性或基因型的物质与其它物质(如检测其它的与HCV感染肝硬化相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备筛查HCV感染肝硬化患者的产品。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域中，与HCV感染肝硬化相关的单核苷酸多态性位点及其应用。
背景技术
干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM3，interferon-induced transmembraneprotein-3，也被称为1-8U)的基因最初确定于1984年，系从INF治疗神经母细胞瘤筛选cDNA过程中发现，其克隆来源于人淋巴细胞的cDNA文库。IFITM3可在大多数组织中翻译表达，并高度诱导干扰素表达。以往的研究表明IFITM3属于鼠基因家族，其较短，含有2个跨膜结构域的蛋白(5-18kDa)，具有较高的核心序列相似性，但N和C-末端存在进化差异。人类的同源基因(IFITM1，IFITM2，和IFITM3)均聚集在11号染色体上一个18-kb的基因组序列内，并介导细胞的发育过程，包括细胞粘附，免疫细胞调节，生殖细胞归巢和成熟。
干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)是一种具有广谱抗囊膜病毒活性的蛋白，IFITM3是由I型或II型干扰素(IFN)诱导产生的，它可以通过抑制流感病毒和其他包膜病毒进入细胞而限制病毒复制，缺失IFITM3基因后，IFN的抗病毒作用会明显变弱。
丙型肝炎病毒(HCV)感染是一个全球性的健康问题，全球有超过1.7亿感染者，中国约有25-50万人。丙型肝炎病毒感染是发展为慢性肝病的主要危险因素，约三分之一的慢性HCV感染者最终发展为肝硬化或肝细胞癌，这是癌症相关死亡的第二大原因。前期临床研究还证实IFITM3基因中的rs12252SNP位点多态性与流感重症和HIV感染快速进展相关，而与HCV感染疾病进展相关性尚不可知。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何筛查肝硬化患者，尤其是HCV感染者中的肝硬化患者。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述1-6中任一用途：
1、检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备筛查或辅助筛查HCV感染肝硬化患者产品中的应用；
2、检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备检测或辅助检测HCV感染肝硬化易感性产品中的应用；
3、检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备检测或辅助检测与HCV感染肝硬化相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；
4、检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定与HCV感染肝硬化相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；
5、人基因组中rs12252的多态性或基因型在制备筛查或辅助筛查HCV感染肝硬化患者产品中的应用；
6、人基因组中rs12252的多态性或基因型在制备检测或辅助检测HCV感染肝硬化易感性产品中的应用。
rs12252是人染色体11p5.5上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换(T/C，在其互补链上则为A/G)。rs12252基因型是CC、CT或TT。其中，CC是rs12252位点为C的纯合型，TT是rs12252位点为T的纯合型，CT是rs12252位点为T和C的杂合型。所述检测人基因组中rs12252的多态性或基因型具体可通过检测rs12252的核苷酸种类确定。
上述用途中，所述人可为中国人。
为解决上述技术问题，本发明还提供了含有检测或辅助检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质的产品。
本发明所提供的含有检测或辅助检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质的产品，为a)-h)中的任一种产品：
a)检测或辅助检测与HCV感染肝硬化相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
b)鉴定或辅助鉴定与HCV感染肝硬化相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
c)筛查或辅助筛查HCV感染肝硬化患者产品；
d)检测或辅助检测HCV感染肝硬化易感性产品。
上述产品中，所述人可为中国人。
本发明中，所述检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质可包括扩增包括rs12252在内的基因组DNA片段的PCR引物对，还可包括限制性内切酶MscI。所述检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质也可仅为扩增包括rs12252在内的基因组DNA片段的PCR引物对，也可为所述引物对与限制性内切酶MscI。
本发明中，所述PCR引物对可为序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA和序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA。
实验证明，rs12252的C等位基因在HCV感染肝硬化患者群体中的比例分别高于该等位基因在健康人群和慢性HCV感染患者群体中的比例，具有统计学差异，说明rs12252的C等位基因为HCV感染肝硬化的风险等位基因。rs12252的三个基因型中，CC基因型的个体在HCV感染肝硬化患者群体中的比例高于该基因型的个体在健康人群中的比例，CT和TT基因型的个体在HCV感染肝硬化患者群体中的比例分别低于相应基因型的个体在健康人群中的比例；CC基因型的个体在HCV感染肝硬化患者群体中的比例高于该基因型的个体在慢性HCV感染患者群体中的比例，CT和TT基因型的个体在HCV感染肝硬化患者群体中的比例分别低于相应基因型的个体在慢性HCV感染患者群体中的比例。与携带TT和CT基因型的个体相比，携带CC基因型的个体肝硬化的风险增加，OR值为2.103[95％置信区间(95％CI)＝1.225-3.610；P<0.001]。说明rs12252多态性位点与HCV感染肝硬化显著关联。CC基因型的HCV感染个体易感肝硬化，CT和TT基因型的HCV感染个体不易感肝硬化，即与CT和TT基因型的HCV感染个体相比，CC基因型的HCV感染个体易感肝硬化。
在实际应用中，可将检测rs12252的多态性或基因型的物质与其它物质(如检测其它的与HCV感染肝硬化相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备筛查或辅助筛查HCV感染肝硬化患者的产品。
其中，检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质可为通过下述至少一种方法确定rs12252的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片、TaqMan探针技术和SequenomMassArray技术。其中，利用Sequenom MassArray技术确定rs12252的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括PCR引物对、基于单碱基延伸反应的延伸引物、磷酸酶(如虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP))、树脂、芯片、MALDI-TOF(matrix-assistedlaser desorption/ionization–time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)以及Sequenom MassArray技术所需要的其他试剂和仪器；利用限制性酶切片段长度多态性确定rs12252的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括PCR引物对和限制性内切酶；SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。
本发明的一个实施例中，采用限制性酶切片段长度多态性确定rs12252的多态性和基因型。所述PCR引物对在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括rs12252在内的基因组DNA片段即可，具体可为序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的单链DNA。所述限制性内切酶具体可为MscI。
本发明在中国人群中发现rs12252是与HCV感染肝硬化相关的单核苷酸多态性，HCV感染肝硬化是指HCV感染群体中的肝硬化患者，表明了rs12252与HCV感染的肝硬化进展显著相关。另外研究了与HCV清除相关的存在于人类第19号染色体上的IFNλ3/4基因位点的五个SNP(rs12980275，rs8099917，rs368234815，rs4803217和rs12979860)与HCV感染肝硬化的相关性，结果显示与这五个SNP相比，rs12252的多态性与HCV感染肝硬化更相关。可将检测rs12252的多态性或基因型的物质与其它物质(如检测其它的与HCV感染肝硬化相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备筛查HCV感染肝硬化患者的产品。
附图说明
图1为使用MscI限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切的电泳图谱；其中，M:为DNA分子量标准(50bp Ladder)；样品1-1、1-2和1-3为CT基因型酶切产物；样品2-1、2-2和2-3为CC基因型酶切产物；样品3-1、3-2和3-3为TT基因型酶切产物。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、IFITM3rs12252是与HCV感染肝硬化相关的单核苷酸多态性位点
rs12252是人染色体11p5.5上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换(T/C，在其互补链上则为A/G)，该位点位于IFITM3基因中。rs12252基因型是CC、CT或TT。其中，CC是rs12252位点为C的纯合型，TT是rs12252位点为T的纯合型，CT是rs12252位点为T和C的杂合型。
一、研究对象
健康对照组：1369例正常健康人。
HCV感染组：378例HCV感染患者，根据EASL丙型肝炎病毒感染临床实践指南诊断，包括入选慢性HCV感染组的313例慢性HCV感染患者和入选HCV感染肝硬化组的65例HCV感染肝硬化患者。
慢性HCV感染组的入选标准为：HCV抗体和HCV RNA均为阳性的慢性肝炎患者。
HCV感染肝硬化组的入选标准为：确诊为慢性HCV感染，且APRI>2或FIB4>3.25的患者。
所有研究对象均来自中国大陆，且无血缘关系。按照如下方法检测各研究对象的临床和实验室特征：使用Elecsys Anti-HCV(Roche Diagnostics GmbH，Germany)进行HCV抗体测试；使用定性的Roche COBAS Amplicor测定[2.0版；Roche Molecular Systems(Branchburg，NJ，USA)]血浆中HCV RNA,检测下限为50IU/ml；在所有HCV RNA阳性患者中通过PCR反向杂交测定(Da An Gene，Guangzhou，China)检测HCV基因型；使用拜耳ADVIA2400(SIEMENS，Genmany)进行包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)，总胆红素(Tbil)，直接胆红素(Dbil)等反应肝功能指标的测定。
在慢性HCV感染患者和HCV感染肝硬化患者之间，AST与血小板比指数(APRI)有明显的差异(0.74±0.75vs.1.91±1.62，p<0.001)。另外慢性丙型肝炎病毒感染患者(2.21±1.52)与肝硬化患者(5.84±4.82，P<0.001)(FIB-4)的纤维化指数比较差异有统计学意义。
具体信息如表1所示。
表1、研究对象特征
表1中，“N.A.”表示未检测。
二、rs12252位点的基因分型
一)rs12252位点基因分型
使用PureGene DNA Isolation试剂盒(Gentra Systems，Minneapolis，MN，USA)从外周血单核细胞中提取基因组DNA。在Applied Biosystems 3730x1 DNA分析仪(GATCBiotech)上测序对IFITM3rs12252的基因型进行分型。单核苷酸多态性的检测使用中国深圳BGI的Chromas(Technelysium Pty Ltd)进行。
二)rs12252位点基因分型的验证
(1)扩增含SNP位点的核苷酸片段
根据rs12252的侧翼序列设计引物，正向引物F：5’-GAAAAGGAAACTGTTGAGAACCGAA-3’(SEQ ID NO.1)，反向引物R：5’-GAGCCTCCTCCTAAACCTGCAC-3’(SEQ ID NO.2)，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，PCR产物为序列表中SEQ ID NO.3。rs12252位点位于SEQ ID NO.3的140bp处，该处核苷酸为C或T，当该处核苷酸为T时，可被MscI内切酶(识别序列为TGG^CCA)识别。
其中，PCR反应体系以50μl计为：150-200ng/μl人基因组DNA 1μl，10μM引物F和R各2μl，Premix Taq HS 25μl，余量为ddH2O；其中，Premix Taq HS为TaKaRa公司(货号：DR028A)产品。使用Premix Taq Hot Start Version(TaKaRa公司)。
PCR反应条件为：95℃10分钟；95℃60秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃5分钟。
(2)针对第142位核苷酸的不同选择适当的内切酶进行PCR-RFLP
该PCR产物用MscI内切酶酶切，反应体系以20μl计为：PCR扩增产物10μl，快速消化MscI酶(Fast Digest MScI，Fermentas公司)1μl，10×FastDigest Green缓冲液2μl，无核酸酶的ddH2O 17μl。反应条件为：37℃水浴，酶切30min。
然后，将得到的酶切产物在2％琼脂糖凝胶中进行电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观察。
制胶：用蒸馏水将与胶接触的器皿洗干净，室温自然晾干，将含有Golden View的2％琼脂糖凝胶倒入模板中，插入13个孔的梳子，待胶自然聚合后，拔出梳子，则制得含有13个孔的2％的琼脂糖凝胶。
电泳：向15μl酶切产物中加入6×上样缓冲液3μl，上样检测，100V恒压，电泳2小时。
根据PCR-RFLP的结果确定该位点在检测群体中的基因型。当PCR产物的140bp处核苷酸均为C时，MscI内切酶不可识别该位点，即PCR产物不能被切开，凝胶中只有一条带，长度为562bp，该基因型记为CC型；当140bp处的核苷酸均为T时，即可将PCR扩增片段切成两个片段，一个为420bp，另一个片段为142bp，该基因型记为TT型；当140bp处既含有C又含有T时，即凝胶电泳中含有三条带，长度分别约为562bp、420bp和142bp，该基因型记为杂合型CT型。(图1)
各组的分型结果如表2所示。
表2、各组IFITM3 rs12252位点的基因型
*表示与健康人群比较。
#x2和P值均为利用x2-tests进行计算的结果。
三、rs12252位点的多态性与慢性HCV感染相关
在378例HCV感染患者和1369例HCV阴性健康人群中检测了SNP rs12252中IFITM3的遗传变异。其中35.98％(136/378)HCV感染患者携带rs12252位点CC基因型，其频率高于健康人群中CC基因型所占的百分比(29.15％，399/1369，p＝0.002)。此外，与健康人群和慢性HCV感染患者相比，HCV感染肝硬化患者的CC基因型所占百分比(50.77％，33/65)显著增加(p＝0.013，表2)。此外，rs12252与HCV感染肝硬化的关系也通过假设的不同遗传基因模型与慢性HCV感染进行比较。HCV感染肝硬化(50.77％，33/65)患者CC基因型频率显著高于慢性HCV感染者(32.91％，103/313，p＝0.013)。特别是在主导模式下，与CT/TT基因型携带者相比，CC基因型携带者的肝硬化风险增加了两倍(p＝0.006，优势比＝2.103,95％置信区间为1.225-3.610，表3)。
rs12252位点的三个基因型中，CC基因型的个体在HCV感染肝硬化患者群体中的比例显著高于该基因型的个体在健康人群中的比例，CT和TT基因型的个体在HCV感染肝硬化患者群体中的比例分别显著低于相应基因型的个体在健康人群中的比例；CC基因型的个体在HCV感染肝硬化患者群体中的比例显著高于该基因型的个体在慢性HCV感染患者群体中的比例，CT和TT基因型的个体在HCV感染肝硬化患者群体中的比例分别显著低于相应基因型的个体在慢性HCV感染患者群体中的比例。
rs12252位点的风险等位基因为C，该等位基因在HCV感染肝硬化患者中的基因频率为70.77％，在健康人群中的基因频率为57.23％，与健康人群相比，该等位基因在HCV感染肝硬化患者中增加了23.66％；在C等位基因在慢性HCV感染患者中的基因频率为56.55％，与慢性HCV感染患者相比，该等位基因在HCV感染肝硬化患者中增加了25.15％。表明，rs12252的多态性或基因型或等位基因频率可用于从人群中筛查HCV感染肝硬化患者，还可在HCV感染群体中筛查肝硬化患者。
表3、不同遗传基因模型下rs12252与HCV感染进展的相关性
四、携带CC基因型HCV感染者拥有更高的纤维化指数
利用HCV病毒载量、肝功能和纤维化指数来评估HCV感染患者(包括慢性HCV感染患者和HCV感染肝硬化患者)SNP rs12252中IFITM3基因变异的相关性。在CC基因型和CT/TT基因型患者中，ALT，TBil，HCV病毒载量和AFP没有差异。而纤维化指数与遗传变异显着相关。CC基因型患者的APRI水平为1.231±0.235，远高于CT/TT基因型患者(0.892±0.053，p＝0.022)。纤维化指数的另一个标志物FIB-4也呈相同趋势，其中CC基因型患者FIB-4的值为3.477±0.329，高于CT/TT基因型(2.841±0.149，p＝0.08)，差异接近统计学意义。
五、SNP 12252基因多态性与肝硬化疾病进展密切相关
对比5种已知的IFN相关SNPs(rs12980275，rs8099917，rs368234815，rs4803217和rs12979860)与HCV感染进展的相关性，对于慢性HCV感染者和HCV感染肝硬化患者之间这五个SNP的分布无显着差异，尽管肝硬化患者所占百分比更高。此外，6个IFN相关SNPs和肝硬化之间的相关性以优势比和95％置信区间显示后，SNP 12252基因多态性与另外5种已知的IFN相关SNPs相比对HCV感染病程进展更有影响(表4和表5)。
其中，rs12980275，rs8099917，rs368234815，rs4803217，rs12979860的基因型按照如下方法进行分型：使用PureGene DNA Isolation试剂盒(Gentra Systems，Minneapolis，MN，USA)从外周血单核细胞中提取基因组DNA，在Applied Biosystems3730x1 DNA分析仪(GATC Biotech)上测序。
表4、五个SNP与HCV感染病程进展的相关性
表5、SNP与HCV感染病程进展的相关性
六、SNP12252C等位基因与另外5个已知的IFN相关SNPs无连锁不平衡
另外，通过软件分析结果:D'(0.066,0.24,8.,0.994和0.194)和r2(0.001,0.008,0.000，0.005，0.005)发现rs12252和另外5个已知SNPs(rs12980275，rs8099917，rs368234815，rs4803217和rs12979860)之间无连锁不平衡。
<110> 首都医科大学附属北京佑安医院
<120> 与HCV感染肝硬化相关的单核苷酸多态性位点及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
gaaaaggaaa ctgttgagaa ccgaa 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gagcctcctc ctaaacctgc ac 22
<210> 3
<211> 562
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<222> (140)..(140)
<223> n为c或t
<400> 3
gaaaaggaaa ctgttgagaa ccgaaactac tggggaaagg gagggctcac tgagaaccat 60
cccagtaacc cgaccgccgc tggtcttcgc tggacaccat gaatcacact gtccaaacct 120
tcttctctcc tgtcaacagn ggccagcccc ccaactatga gatgctcaag gaggagcacg 180
aggtggctgt gctgggggcg ccccacaacc ctgctccccc gacgtccacc gtgatccaca 240
tccgcagcga gacctccgtg cccgaccatg tcgtctggtc cctgttcaac accctcttca 300
tgaacccctg ctgcctgggc ttcatagcat tcgcctactc cgtgaaggtg cgtatggccc 360
cagggaatgc tcagagggtg ccgctgagcc tggagctcca cctgcccaca tgctgcctgg 420
ggtggggact tgtgtgtccc tgtgactgtg agtttgtgtg cacctctgtc ccgtgtgtgc 480
ccacgtcagt ggctttgtct gtgtgatctg tgtgtgtgtg tggcttgggg aatctgccca 540
gtgcaggttt aggaggaggc tc 562
Claims (2)
1.检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备辅助筛查肝硬化患者的产品中的应用；
所述肝硬化是由HCV感染引起的肝硬化；
所述检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质包括扩增包括rs12252在内的基因组DNA片段的PCR引物对和/或限制性内切酶MscI。
2.检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备辅助筛查肝硬化易感性个体的产品中的应用；所述肝硬化是由HCV感染引起的肝硬化；
所述检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质包括扩增包括rs12252在内的基因组DNA片段的PCR引物对和/或限制性内切酶MscI。
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