CN112239784A - Ifitm3多态性在制备检测老年肾透析患者分泌h3n2抗体水平产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了IFITM3多态性在制备检测老年肾透析患者分泌H3N2抗体水平产品中的应用。本发明提供了检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备筛查建议接种疫苗的老年肾透析患者的产品中的应用；所述疫苗为预防H3N2亚型流感病毒引起的疾病的疫苗。本发明可用于筛查需要建议注射预防H3N2亚型流感病毒引起的流行性感冒的疫苗的老年肾透析患者。

Description

IFITM3多态性在制备检测老年肾透析患者分泌H3N2抗体水平 产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域中IFITM3多态性在制备检测老年肾透析患者分泌H3N2抗体水平产品中的应用。

背景技术

干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM3，也被称为1-8U)的基因最初确定于1984年，系从INF治疗神经母细胞瘤筛选cDNA过程中发现，其克隆来源于人淋巴细胞的cDNA文库。IFITM3可在大多数组织中翻译表达，并高度诱导干扰素表达。以往的研究表明IFITM3属于鼠基因家族，其较短，含有2个跨膜结构域的蛋白(5-18kDa)，具有较高的核心序列相似性，但N和C-末端存在进化差异。人类的同源基因(IFITM1，IFITM2，和IFITM3)均聚集在11号染色体上一个18-kb的基因组序列内，并介导细胞的发育过程，包括细胞粘附，免疫细胞调节，生殖细胞归巢和成熟。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)指基因组单个核苷酸的变异，它是最微小的变异单元，是由单个核苷酸对置换、颠换、插入或缺失所形成的变异形式。单核苷酸多态性是基因组上高密度的遗传标志，在人类基因组中已发现的SNP数量超过3000万。作为第三代遗传标记SNP数量众多、分布密集，易于检测，因而是理想的基因分型目标。

rs12252是人染色体11p5.5上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换(T/C，在其互补链上则为A/G)，该位点位于干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)基因中。

目前，疫苗接种是防控流感的主要方法。儿童、老人、慢性病患者、孕妇都建议接种疫苗，避免他们因为感染流感导致严重疾病，以及并发症的发生。尿毒症是一种慢性病。血液透析作为晚期尿毒症的主要治疗手段已广泛开展，接受血液透析治疗的老年患者逐渐增加，高龄已不再是血透的禁忌证。但伴多器官功能衰退的老年患者的血透并发症及死亡率仍高于非老年患者。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何筛查建议接种H3N2亚型流感病毒疫苗的尿毒症并接受血液透析的老年患者(简称老年肾透析患者)。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述任一种应用：

1.检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备筛查建议接种疫苗的老年肾透析患者的产品中的应用；所述疫苗为预防H3N2亚型流感病毒引起的疾病(如流行性感冒)的疫苗。

2.检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备鉴别或辅助鉴别老年肾透析患者中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平的产品中的应用。

3.检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备检测或辅助检测老年肾透析患者中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平的产品中的应用。

4.检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备鉴别或辅助鉴别老年肾透析患者对H3N2亚型流感病毒的抵抗力的产品中的应用。

5.检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备检测或辅助检测老年肾透析患者对H3N2亚型流感病毒的抵抗力的产品中的应用。

rs12252是人染色体11p5.5上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换(T或C，在其互补链上则为A或G)。

上述应用中，所述rs12252基因型是CC、CT或TT。其中，CC是rs12252位点为C的纯合型，TT是rs12252位点为T的纯合型，CT是rs12252位点为T和C的杂合型。

上述应用中，所述老年肾透析患者可为接受血液透析的尿毒症老年患者。所述老年肾透析患者可为一年之内未接种流感疫苗的接受血液透析的尿毒症老年患者。所述老年肾透析患者可为当年未接种流感疫苗的接受血液透析的尿毒症老年患者。所述老年肾透析患者的年龄可为60-81岁。

上述应用中，所述健康老年人可为一年之内未接种流感疫苗的老年人。所述健康老年人可为当年未接种流感疫苗的老年人。所述健康老年人的年龄可为57-83岁。

上述应用中，rs12252基因型为CC的健康老年人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平显著高于rs12252基因型为CC的老年肾透析患者人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平；rs12252基因型为CT的健康老年人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平显著高于rs12252基因型为CT的老年肾透析患者人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平；rs12252基因型为TT的健康老年人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平与rs12252基因型为TT的老年肾透析患者人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平之间无统计学差异)。说明预防H3N2亚型流感病毒引起的流行性感冒的疫苗对所述rs12252基因型是CC或CT的老年肾透析患者更有效。

上述应用中，所述老年肾透析患者和健康老年人均可为中国人。

上述应用中，所述检测人基因组中rs12252的多态性或基因型具体可通过检测rs12252的核苷酸种类确定。

上述应用中，检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质可为通过下述至少一种方法确定rs12252的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片、TaqMan探针技术和SequenomMassArray技术。其中，利用Sequenom MassArray技术确定rs12252的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括PCR引物对、基于单碱基延伸反应的延伸引物、磷酸酶(如虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP))、树脂、芯片、MALDI-TOF(matrix-assistedlaser desorption/ionization–time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)以及Sequenom MassArray技术所需要的其他试剂和仪器；利用限制性酶切片段长度多态性确定rs12252的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括PCR引物对和限制性内切酶；SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。

上述应用中，所述检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质可包括扩增包括rs12252在内的基因组DNA片段的PCR引物对/或限制性内切酶MscI。所述检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质也可仅为扩增包括rs12252在内的基因组DNA片段的PCR引物对和/或限制性内切酶MscI。

本发明的一个实施例中，采用限制性酶切片段长度多态性确定rs12252的多态性和基因型。所述PCR引物对在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括rs12252在内的基因组DNA片段即可，具体可为序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的单链DNA。所述限制性内切酶具体可为MscI。

上述应用中，所述产品均可为试剂、试剂盒或系统。上述应用中，所述系统可包括试剂、试剂盒和/或仪器。

上述应用中，所述产品均可包括所述检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质，还可进一步包括定量检测针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平的系统。所述定量检测针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平的系统可为通过血细胞凝集抑制试验(HAI)针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平所需的试剂和/或仪器。

本文中，所述针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平可为血浆中的针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平。

在实际应用中，可将检测rs12252的多态性或基因型的物质与定量检测针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平的系统联合在一起检测针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平。如可先检测待测老年肾透析患者的rs12252的多态性或基因型，如果待测老年肾透析患者的所述rs12252基因型是CC或CT，预测其针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平较低，可通过进一步定量检测其针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平，再确定该待测老年肾透析患者对H3N2亚型流感病毒的抵抗力的大小，再决定是否建议其注射预防H3N2亚型流感病毒引起的流行性感冒的疫苗。

本发明可用于筛查需要建议注射预防H3N2亚型流感病毒引起的流行性感冒的疫苗的老年肾透析患者。

附图说明

图1为使用MscI限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切的电泳图谱；其中，M:为DNA分子量标准(50bp Ladder)；样品1-1、1-2和1-3为rs12252基因型是CT的酶切产物；样品2-1、2-2和2-3为rs12252基因型是CC的酶切产物；样品3-1、3-2和3-3为rs12252基因型是TT的酶切产物。

图2为比较正常老年人及老年肾透析患者分泌H3N2抗体水平。

图3为比较不同rs12252基因型的健康老年人分泌H3N2抗体水平。

图4为比较不同rs12252基因型的老年肾透析患者分泌H3N2抗体水平。

图5为比较不同rs12252基因型的健康老年人及老年肾透析患者分泌H3N2抗体水平。图中，A是rs12252基因型为CC，B是rs12252基因型为CT，C是rs12252基因型为TT。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的实验所有数据采用prism 7.0统计作图软件的独立样本t检验及秩和检验处理统计。

实施例1、IFITM3 rs12252是与老年肾透析患者和健康老年人的针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平相关的单核苷酸多态性位点

rs12252是人染色体11p5.5上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换(T/C，在其互补链上则为A/G)，该位点位于IFITM3基因中。rs12252基因型是CC、CT或TT。其中，CC是rs12252位点为C的纯合型，TT是rs12252位点为T的纯合型，CT是rs12252位点为T和C的杂合型。

一、受试者及样品

选取2014年-2015年间招募的尿毒症并接受血液透析老年患者(又称老年肾透析患者)(中国人)37例，男24例，女13例，年龄60-81岁，平均(66.84±5.336)岁；健康老年人(又称正常老年人)(中国人)68例，男23例，女45例，年龄57-83岁，平均(70.35±5.593)岁。其中，68例健康老年人来自于常规健康体检人群且在样本收集时未发现有任何肾病。上述37例老年肾透析患者和68例健康老年人均未注射过当年的流感疫苗。

提取每个人的基因组DNA。

二、rs12252位点的基因分型

(1)扩增含SNP位点的核苷酸片段

根据rs12252的侧翼序列设计引物，正向引物F：5’-GAAAAGGAAACTGTTGAGAACCGAA-3’(SEQ ID NO.1)，反向引物R：5’-GAGCCTCCTCCTAAACCTGCAC-3’(SEQ ID NO.2)，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，PCR产物为序列表中SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.3中，y为C或T。rs12252位点位于SEQ ID NO.3的140bp处，该处核苷酸为C或T，当该处核苷酸为T时，可被MscI内切酶(识别序列为TGG^CCA)识别。

其中，PCR反应体系以50μl计为：150-200ng/μl人基因组DNA1μl，10μM引物F和R各2μl，Premix Taq HS 25μl，余量为ddH₂O；其中，Premix Taq HS为TaKaRa公司(货号：DR028A)产品。使用Premix Taq Hot Start Version(TaKaRa公司)。

PCR反应条件为：95℃10分钟；95℃60秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃5分钟。

(2)针对第142位核苷酸的不同选择适当的内切酶进行PCR-RFLP

该PCR产物用MscI内切酶酶切，反应体系以20μl计为：PCR扩增产物10μl，快速消化MscI酶(Fast Digest MScI，Fermentas公司)1μl，10×FastDigest Green缓冲液2μl，无核酸酶的ddH₂O17μl。反应条件为：37℃水浴，酶切30min。

然后，将得到的酶切产物在2％琼脂糖凝胶中进行电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观察。

制胶：用蒸馏水将与胶接触的器皿洗干净，室温自然晾干，将含有Golden View的2％琼脂糖凝胶倒入模板中，插入13个孔的梳子，待胶自然聚合后，拔出梳子，则制得含有13个孔的2％的琼脂糖凝胶。

电泳：向15μl酶切产物中加入6×上样缓冲液3μl，上样检测，100V恒压，电泳2小时。

根据PCR-RFLP的结果确定该位点在检测群体中的基因型。当PCR产物的140bp处核苷酸均为C时，MscI内切酶不可识别该位点，即PCR产物不能被切开，凝胶中只有一条带，长度为562bp，该rs12252基因型记为CC；当140bp处的核苷酸均为T时，即可将PCR扩增片段切成两个片段，一个为420bp，另一个片段为142bp，该rs12252基因型记为TT；当140bp处既含有C又含有T时，即凝胶电泳中含有三条带，长度分别约为562bp、420bp和142bp，该rs12252基因型记为CT(杂合型)(图1)。回收这些条带测序，结果表明rs12252基因型为CC是rs12252位点为C的纯合型，rs12252基因型为TT是rs12252位点为T的纯合型，rs12252基因型为CT是rs12252位点为T和C的杂合型。

结果表明，37例老年肾透析患者中，10例的rs12252基因型为CC，19例的rs12252基因型为CT，8例的rs12252基因型为TT。68例健康老年人中，23例的rs12252基因型为CC，33例的rs12252基因型为CT，12例的rs12252基因型为TT。

三、老年肾透析患者和健康老年人的一般临床资料

采用全自动生化分析仪检测上述健康老年人和老年肾透析患者的WBC(白细胞)、RBC(红细胞)、血小板(PLT)及血红蛋白(Hb)含量，结果表明上述健康老年人和老年肾透析患者的WBC、RBC、血小板及血红蛋白含量均在正常值范围，但是，健康老年人的红细胞含量(4.640±0.0600)×10¹²/L，显著高于老年肾透析患者的3.590±0.0728×10¹²/L，P值为<0.0001；健康老年人的血小板数量(234.1±7.8690)×10⁹/L，显著高于老年肾透析患者(189.0±10.320)×10⁹/L，p值为0.0008；健康老年人的血红蛋白含量(139.7±1.6750)g/L，显著高于老年肾透析患者(106.5±2.069)g/L，P值为<0.0001。提示：老年肾透析患者的RBC、血小板及血红蛋白均正常，但是显著低于健康老年人群，见表1。

表1.健康老年人与老年肾透析患者的一般临床资料比较

注：P<0.05具有显著性差异。

四、健康老年人和老年肾透析患者分泌针对H3N2亚型流感病毒抗体水平比较

分别取上述68例健康老年人志愿者和上述37例老年肾透析患者的外周血，采用血细胞凝集抑制试验(HAI)检测上述68例健康老年人志愿者和上述37例老年肾透析患者的血清中针对H3N2亚型流感病毒的抗体(简称H3N2抗体)水平。血细胞凝集抑制试验中所用的血凝素为A/瑞士/9715293/2013(H3N2)-类似株(IVR-175)病毒液。血细胞凝集抑制试验中以出现完全抑制的血清最高稀释度的倒数为抗体的效价。

结果表明上述68例健康老年人产生H3N2抗体水平显著高于上述37例老年肾透析患者产生H3N2抗体水平(表2和图2)，p值为0.0021，Mann-Whitney U是845.5。

表2.健康老年人与老年肾透析患者血清中的H3N2抗体滴度

曼-惠特尼检验描述性统计(Mann-Whitney test descriptive statistics)	健康老年人	老年肾透析患者
			样本数(例)	68	37
H3N2抗体效价最小值(minimum)	10	10
			H3N2抗体效价25％分位数(25％percentile)	10	10
H3N2抗体效价中位数(median)	20	10
			H3N2抗体效价75％分位数(75％percentile)	40	20
H3N2抗体效价最大值(maximum)	640	320
			95％置信区间下限值(lower 95％CI)	24.87	6.561
95％置信区间上限值(upper 95％CI)	67.19	43.71

五、健康老年人分泌针对H3N2亚型流感病毒抗体水平比较

根据rs12252基因型，对步骤四的健康老年人分泌针对H3N2亚型流感病毒抗体水平进行比较，结果表明上述68例健康老年人中，rs12252基因型为TT的健康老年人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平高于rs12252基因型为CC的健康老年人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平和rs12252基因型为CT的健康老年人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平(表3和图3)，但是三者间无显著差异。rs12252基因型为CC的健康老年人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平和rs12252基因型为CT的健康老年人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平之间的p值为0.9934，rs12252基因型为CT的健康老年人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平和rs12252基因型为TT的健康老年人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平之间的p值为0.9589，rs12252基因型为CC的健康老年人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平和rs12252基因型为TT的健康老年人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平之间的p值为0.9741。说明在健康老年人群中，rs12252的基因型与H3N2亚型流感病毒抗体水平无显著关联。

表3不同rs12252基因型的健康老年人血清中的H3N2抗体滴度

六、老年肾透析患者分泌针对H3N2亚型流感病毒抗体水平比较

根据rs12252基因型，对步骤四的老年肾透析患者分泌针对H3N2亚型流感病毒抗体水平进行比较，结果表明上述37例老年肾透析患者中，rs12252基因型为TT的老年肾透析患者人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平高于rs12252基因型为CC的老年肾透析患者人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平和rs12252基因型为CT的老年肾透析患者人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平(表4和图4)，但是三者间无显著差异。rs12252基因型为CC的老年肾透析患者人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平和rs12252基因型为CT的老年肾透析患者人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平之间的p值为0.3472，rs12252基因型为CT的老年肾透析患者人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平和rs12252基因型为TT的老年肾透析患者人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平之间的p值为0.2427，rs12252基因型为CC的老年肾透析患者人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平和rs12252基因型为TT的老年肾透析患者人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平之间的p值为0.0850。说明在老年肾透析患者人群中，rs12252的基因型与H3N2亚型流感病毒抗体水平无显著关联。

表4.不同rs12252基因型的老年肾透析患者血清中的H3N2抗体滴度

七、相同rs12252基因型之间健康老年人和老年肾透析患者分泌针对H3N2亚型流感病毒抗体水平比较

按照相同的rs12252基因型，对步骤四的健康老年人和老年肾透析患者分泌针对H3N2亚型流感病毒抗体水平进行比较，结果表明，rs12252基因型为CC的健康老年人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平显著高于rs12252基因型为CC的老年肾透析患者人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平，p值为0.0129(图5中A)；rs12252基因型为CT的健康老年人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平显著高于rs12252基因型为CT的老年肾透析患者人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平，p值为0.0219(图5中B)；rs12252基因型为TT的健康老年人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平与rs12252基因型为TT的老年肾透析患者人群中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平之间无显著差异，p值为0.7260(图5中C)。

结论

老年人群中，肾透析老年人更易感染H3N2亚型流感病毒，其中rs12252基因型为CC和CT的肾透析老年患者更易被感染，更有接种流感疫苗的必要性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 首都医科大学附属北京佑安医院

<120> IFITM3多态性在制备检测老年肾透析患者分泌H3N2抗体水平产品中的应用

<130> GNCFH190971

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaaaggaaa ctgttgagaa ccgaa 25

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagcctcctc ctaaacctgc ac 22

<210> 3

<211> 562

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 3

gaaaaggaaa ctgttgagaa ccgaaactac tggggaaagg gagggctcac tgagaaccat 60

cccagtaacc cgaccgccgc tggtcttcgc tggacaccat gaatcacact gtccaaacct 120

tcttctctcc tgtcaacagy ggccagcccc ccaactatga gatgctcaag gaggagcacg 180

aggtggctgt gctgggggcg ccccacaacc ctgctccccc gacgtccacc gtgatccaca 240

tccgcagcga gacctccgtg cccgaccatg tcgtctggtc cctgttcaac accctcttca 300

tgaacccctg ctgcctgggc ttcatagcat tcgcctactc cgtgaaggtg cgtatggccc 360

cagggaatgc tcagagggtg ccgctgagcc tggagctcca cctgcccaca tgctgcctgg 420

ggtggggact tgtgtgtccc tgtgactgtg agtttgtgtg cacctctgtc ccgtgtgtgc 480

ccacgtcagt ggctttgtct gtgtgatctg tgtgtgtgtg tggcttgggg aatctgccca 540

gtgcaggttt aggaggaggc tc 562

Claims (5)

1.检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备筛查建议接种疫苗的老年肾透析患者的产品中的应用；所述疫苗为预防H3N2亚型流感病毒引起的疾病的疫苗。

2.检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备鉴别或辅助鉴别老年肾透析患者中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平的产品中的应用。

3.检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备检测或辅助检测老年肾透析患者中针对H3N2亚型流感病毒的抗体水平的产品中的应用。

4.检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备鉴别或辅助鉴别老年肾透析患者对H3N2亚型流感病毒的抵抗力的产品中的应用。

5.检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备检测或辅助检测老年肾透析患者对H3N2亚型流感病毒的抵抗力的产品中的应用。

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