BR112016011840B1 - Método para tipificação de dna de um gene hla, e, conjunto de iniciadores - Google Patents

Método para tipificação de dna de um gene hla, e, conjunto de iniciadores Download PDF

Info

Publication number
BR112016011840B1
BR112016011840B1 BR112016011840-5A BR112016011840A BR112016011840B1 BR 112016011840 B1 BR112016011840 B1 BR 112016011840B1 BR 112016011840 A BR112016011840 A BR 112016011840A BR 112016011840 B1 BR112016011840 B1 BR 112016011840B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
hla
gene
seq
pcr
genes
Prior art date
Application number
BR112016011840-5A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112016011840A2 (pt
Inventor
Takashi Shiina
Shingo Suzuki
Yuki Wada
Shigeki Mitsunaga
Hidetoshi Inoko
Original Assignee
Genodive Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genodive Pharma Inc filed Critical Genodive Pharma Inc
Publication of BR112016011840A2 publication Critical patent/BR112016011840A2/pt
Publication of BR112016011840B1 publication Critical patent/BR112016011840B1/pt

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

MÉTODO PARA TIPIFICAÇÃO DE DNA DE UM GENE HLA, E, CONJUNTO DE INICIADORES. [Problema] A presente invenção aborda o problema de prover um método e kit para perfilagem de DNA de genes HLA usando um sequenciador massivamente paralelo de alto rendimento. [Solução] A presente invenção se refere a um método para a perfilagem de DNA de genes HLA, dito método sendo caracterizado por incluir: (1) uma etapa para preparar um conjunto de iniciadores que anela especificamente ao éxon 4 e íntron 1 e inclui éxon 2 e éxon 3 de pelo menos um gene alvo selecionado do grupo que consiste em HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1 e HLA-DPB1 na sequência de base do genoma humano; (2) uma etapa para amplificar uma amostra (DNA) por PCR usando o conjunto de iniciadores; (3) uma etapa para determinar a sequência de base do produto de PCR amplificado; e (4) uma etapa para realizar uma pesquisa de homologia em um banco de dados.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção se refere a um método e um kit para tipificação de DNA de genes HLA usando um sequenciador massivamente paralelo de alto rendimento.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] O antígeno de leucócito humano (HLA) exerce um papel central na discriminação imunológica entre próprios e não próprios. Esta discriminação é alcançada quando células T reconhecem, por meio dos receptores da célula T, complexos HLA-peptídeo que apresentam peptídeos derivados próprios ou não próprios em HLAs. Células T reconhecem células que expressam, na superfície, complexos HLA-peptídeo que apresentam peptídeos derivados não próprios (micróbios patogênicos, tais como vírus e bactérias ou antígenos estranhos, tais como pólens) em HLAs não próprios, ou células que expressam, na superfície, alelos HLA não próprios que entraram no corpo por meio de transplante ou transfusão, causando assim ativação de imunócitos ou destruição das células de apresentação.
[003] Tal ativação de imunócitos ou destruição das células de apresentação causa uma resposta à rejeição ou doença enxerto versus hospedeiro (GVHD) em transfusão, transplante médico incluindo transplante de medula óssea ou medicina regenerativa usando células iPS ou células ES. Em pacientes que recebem frequente transfusão de plaqueta, um anticorpo contra um HLA não próprio é produzido e ocasiona uma redução significativa na eficácia do transplante de plaqueta. Em alguns casos de medicação, um medicamento (e um peptídeo) ligado com um HLA particular pode ser reconhecido como uma substância estranha, causando uma reação ao medicamento adversa severa com base, na maioria das vezes, a uma resposta alérgica.
[004] Desta maneira, transplante médico ou medicina regenerativa requer a combinação de HLAs entre um paciente e um doador. Transfusão de “plaqueta compatível com HLA” com combinação de HLA também é necessária para pacientes de transplante de plaqueta nos quais um anticorpo anti-HLA contra um alelo particular é produzido. Para reações medicamentosas adversas, também é importante examinar HLAs antes da medicação, quando o medicamento a ser administrado é reportadamente relacionado a um alelo de HLA particular. Na realidade, bulas de embalagem de alguns medicamentos claramente estabelecem recomendação para examinar HLAs. Terapia de vacina de peptídeo de câncer também requer exame de HLAs para prever se a vacina com peptídeo pode ou não se ligar aos HLAs de paciente.
[005] Como HLAs principais, seis tipos de antígenos são conhecidos, a saber, moléculas de classe I (HLA-A, HLA-B e HLA-C), que são expressas em quase todas as células e moléculas de classe II (HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP), que são expressas principalmente em células imunes.
[006] O antígeno de classe I de HLA consiste em uma cadeia α altamente polimórfica e uma β2-microglobulina substancialmente não polimórfica; enquanto que o antígeno de classe II de HLA consiste em uma cadeia β altamente polimórfica e uma cadeia α menos polimórfica. As cadeias α das moléculas de classe I são codificadas por genes HLA-A, HLA-B e HLA-C. As cadeias β dos antígenos de classe II são codificadas por genes HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1 e HLA- DPB1, enquanto que as cadeias α são codificadas por genes HLA-DRA1, HLA-DQA1 e HLA-DPA1. Em um nível genético, no antígeno de classe I de HLAs, éxon 2 e éxon 3 de um gene que codifica uma cadeia α são altamente polimórficos; enquanto que, no antígeno de classe II de HLAs, éxon 2 de um gene que codifica uma cadeia β é altamente polimórfico.
[007] Uma região genética que codifica um HLA é localizada no braço pequeno do cromossomo humano 6 a 6p21.3. Uma região de classe I (HLA-A, HLA-C, HLA-B, etc.), uma região de classe III e uma região de classe II (HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, etc.) são dispostas nesta ordem do lado do telômero em direção ao lado do centrômero. Muitos genes são codificados em uma densidade extremamente alta e associação destes genes com transfusão, transplante e várias doenças foi reportada. Na região de classe III, nenhum gene HLA está presente e genes de componentes do complemento e fatores de necrose tumoral (TNF), etc. estão presentes.
[008] Em uma região genética HLA-DRB que codifica uma cadeia β de um antígeno HLA-DR, foi confirmado que 5 tipos de polimorfismos estruturais estão presentes. No tipo DR1 e tipo DR10, pseudogenes, tais como HLA-DRB6 e HLA-DRB9, além de HLA-DRB1, são localizados no mesmo cromossomo. No tipo DR2, um gene HLA-DRB5 (DR51) e pseudogenes, tais como HLA-DRB6 e HLA-DRB9, além de HLA-DRB1, são localizados no mesmo cromossomo. Nos tipos DR3, DR5 e DR6, um gene HLA-DRB3 (DR52) e pseudogenes, tais como HLA-DRB2 e HLA-DRB9, além de HLA- DRB1, são localizados no mesmo cromossomo. Nos tipos DR4, DR7 e DR9, um gene HLA-DRB4 (DR53) e pseudogenes, tais como HLA-DRB7, HLA- DRB8 e HLA-DRB9, além de HLA-DRB1, são localizados no mesmo cromossomo. Ao contrário, no tipo DR8, nenhum gene HLA-DRB, exceto HLA-DRB1, é localizado no mesmo cromossomo (ver figura 1).
[009] No éxon de cada alelo, uma pluralidade de regiões que apresentam polimorfismo estão presentes. Em muitos casos, uma sequência de nucleotídeos (sequência de aminoácidos) presente em uma certa região polimórfica comumente está presente em uma pluralidade de alelos. Resumidamente, cada alelo de HLA é especificado por uma pluralidade de regiões polimórficas em combinação. Em um antígeno de classe II de HLA, não somente uma região polimórfica no éxon, mas também éxon 2 ou éxon 3, tendo a mesma sequência de nucleotídeos algumas vezes comumente está presente em uma pluralidade de alelos.
[0010] Uma vez que uma região altamente polimórfica está presente em um HLA, o número de tipos de alelos é conhecido como extremamente grande e notação deles deve ser definida: isto é, um primeiro campo (nível de 2 dígitos) é para discriminação de tipos de HLA sorológico, um segundo campo (nível de 4 dígitos) é para a discriminação de alelos tendo uma substituição de aminoácido no mesmo tipo de HLA sorológico, um terceiro campo (nível de 6 dígitos) é para a discriminação de alelos tendo uma substituição de base que não acompanha uma mutação do aminoácido e um quarto campo (nível de 8 dígitos) é para a discriminação de alelos tendo uma substituição de base em um íntron, que está fora da região genética que codifica uma molécula de HLA (ver figura 2).
[0011] Em vários casos médicos, o exame dos alelos de HLA (tipificação de DNA de genes HLA) é importante. Entretanto, um método SBT (tipificação com base na sequência) ou um método Luminex (sondas de oligonucleotídeo específico para sequência de PCR (SSOP)- método Luminex), que foi até hoje usado frequentemente, não pode facilmente determinar se regiões polimórficas estão em uma configuração cis (no mesmo cromossomo) ou em uma configuração trans (em diferentes cromossomos), se uma pluralidade de diferentes regiões polimórficas estiver presente entre os alelos. Desta forma, os alelos foram algumas vezes incapazes de ser exatamente determinados devido à ocorrência da então chamada ambiguidade de fases.
[0012] Assim, foi desenvolvido um método capaz de eliminar a ambiguidade de fases usando um sequenciador de última geração (sequenciador massivamente paralelo de alto rendimento). Neste método, entretanto, tipificação de DNAs fragmentados em um estado de conservação ruim algumas vezes não foi facilmente realizada, em virtude de uma região longa contendo 3'UTR ser amplificada a partir de uma região promotora. Particularmente, um gene de classe II de HLA tem íntron 1 longo, que requer amplificação de uma região cerca de duas vezes maior que a de um gene de classe I. Desta forma, amostras de fragmento de tipificação de DNA não foram facilmente realizadas.
DOCUMENTO DA TÉCNICA RELACIONADA Documento Patente
[0013] Documento patente 1: JP H11-216000 A
Documento Não Patente
[0014] Documento não patente 1: Lind C. et al., Human Immunology, Vol. 71, Páginas 1033-1042 (2010)
[0015] Documento não patente 2: Shiina T. et al., Tissue Antigen, Vol. 80, Páginas 305-316 (2012) SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Problemas a serem Resolvidos pela Invenção
[0016] Um objetivo da presente invenção é prover um método, um conjunto de iniciadores e um kit para tipificação de DNA de genes HLA usando um sequenciador massivamente paralelo de alto rendimento, que alcança tipificação mesmo no caso de usar amostras de DNA fragmentado em um estado de conservação ruim e são capazes de simultaneamente amplificar genes HLA por PCR usando uma pluralidade de conjunto de iniciadores nas mesmas condições de PCR.
Meios para Resolver os Problemas
[0017] Os presentes inventores desenvolveram um sistema no qual uma região do éxon 2 para uma porção do éxon 4 de um gene de classe II de HLA, que é altamente polimórfico, de maneira a causar uma diferença entre alelos e codifica um domínio extracelular que pode ser reconhecido por um anticorpo ou um receptor de célula T, é amplificada e submetida à tipificação de DNA usando um sequenciador de última geração.
[0018] Especificamente, os presentes inventores vieram com uma ideia nova de recém projetar cada um dos iniciadores de PCR capazes de simultaneamente amplificar genes HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 e HLA-DRB5, que são gene de classe II de HLAs e iniciadores de PCR capazes de especificamente amplificar genes HLA-DQB1 e HLA-DPB1, ajustando as condições de PCR preferíveis e usando uma técnica de sequenciamento massivamente paralela de alto rendimento. Como um resultado de realizar pesquisa cuidadosa com base nesta ideia, de maneira a resolver os problemas descritos anteriormente, os presentes inventores completaram a presente invenção.
[0019] Em outras palavras, a presente invenção provê um método para tipificação de DNA de um gene HLA, incluindo as seguintes etapas: (1) uma etapa de preparar um conjunto de iniciadores que hibridizam especificamente a uma região do íntron 1 contendo éxon 2 e éxon 3 e uma região do éxon 4, respectivamente, de pelo menos um gene alvo selecionado do grupo que consiste em genes HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA- DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1 e HLA-DPB1 em uma sequência de genoma humano; (2) uma etapa de PCR que amplifica uma amostra de teste (DNA) usando o conjunto de iniciadores; (3) uma etapa de determinar a sequência de nucleotídeos do produto amplificado por PCR; e (4) uma etapa de realizar uma pesquisa de homologia em uma base de dados.
[0020] Em uma modalidade, o gene alvo é pelo menos um gene selecionado do grupo que consiste em genes HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA- DRB4 e HLA-DRB5 e o conjunto de iniciadores é oligonucleotídeos tendo sequência de nucleotídeos conforme conhecido em SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente. Em uma modalidade alternativa, o gene alvo é um gene HLA-DQB1 e o conjunto de iniciadores é oligonucleotídeos tendo sequência de nucleotídeos conforme conhecido em qualquer uma de SEQ ID NOs: 3 e 4 ou SEQ ID NO: 5, respectivamente. Em uma modalidade alternativa adicional, o gene alvo é um gene HLA-DPB1 e o conjunto de iniciadores é oligonucleotídeos tendo sequência de nucleotídeos conforme conhecido em SEQ ID NOs: 6 e 7, respectivamente.
[0021] Em aspecto adicional, a presente invenção se refere a um conjunto de iniciadores capazes de simultaneamente amplificar por PCR uma região do DNA incluindo éxon 2 e éxon 3 de pelo menos um gene selecionado do grupo que consiste em genes HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA- DRB4 e HLA-DRB5. Em uma modalidade, a presente invenção provê um conjunto de iniciadores para tipificação de DNA de pelo menos um gene selecionado do grupo que consiste em genes HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA- DRB4 e HLA-DRB5, incluindo oligonucleotídeos tendo sequência de nucleotídeos conforme conhecido em SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente. Em uma modalidade alternativa, a presente invenção provê um conjunto de iniciadores para tipificação de DNA de um gene HLA-DQB1, incluindo oligonucleotídeos tendo sequência de nucleotídeos conforme conhecido em qualquer uma de SEQ ID NOs: 3 e 4 ou ambos e SEQ ID NO: 5, respectivamente. Em uma modalidade alternativa adicional, a presente invenção provê um conjunto de iniciadores para tipificação de DNA de um gene HLA-DPB1, incluindo oligonucleotídeos tendo sequência de nucleotídeos conforme conhecido em SEQ ID NOs: 6 e 7, respectivamente. Efeitos da Invenção
[0022] O método da presente invenção, uma vez que provê todas as sequências de nucleotídeos requeridas para tipificação de DNA de um gene HLA de uma molécula simples, é um último método de tipificação de DNA no qual ambiguidade de fases devido à relação posicional cis/trans não clara é eliminada. Devido a isto, uma região de éxon 2 para uma porção do éxon 4 de um gene de classe II de HLA, que é altamente polimórfico e codifica um domínio extracelular que pode ser reconhecido por um anticorpo ou um receptor de célula T, pode ser amplificado e tipificação de DNA com um sequenciador de última geração é realizada.
[0023] Além do mais, uma vez que uma região de amplificação é encurtada, tipificação de DNA de um gene HLA pode ser relativamente facilmente realizada, mesmo no caso de usar amostras de DNA em um estado de conservação ruim. Além do mais, o comprimento da região a ser amplificada é quase igual a uma região de amplificação já publicada de um gene de classe I. Uso do conjunto de iniciadores da presente invenção possibilita que uma pluralidade de genes HLA seja simultaneamente amplificada por PCR nas mesmas condições de PCR e possa, desta forma, encurtar o tempo requerido para PCR. Além disso, o tamanho dos dados também é reduzido e o tempo requerido para análise de dados, desta forma, também é encurtado.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[Figura 1] Um diagrama que mostra uma região genética HLA-DR, citada de “Transplantation/transfusion Examination”, supervisionada por Hidetoshi Inoko, Takehiko Sasazuki and Takeo Juuji, Kodan-sha Scientific, 2004, página 48. [Figura 2] Um diagrama que mostra uma classificação dos alelos de HLA, citado da base de dados IMGT-HLA (www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/). [Figura 3] (a) Um diagrama que mostra a relação entre a estrutura de um gene HLA de classe I e a estrutura de uma molécula de classe I de HLA; e (b) Um diagrama que mostra a estrutura de uma região promotora de um gene HLA de classe I, citada do “Transplantation/transfusion Examination”, supervisionado por Hidetoshi Inoko, Takehiko Sasazuki and Takeo Juuji, Kodan-sha Scientific, 2004, página 35. [Figura 4] Um diagrama esquemático que mostra a estrutura de cada gene HLA. [Figura 5] Um diagrama que mostra os comprimentos dos produtos de PCR estimados das posições dos iniciadores designados em um gene de classe II de HLA e sequências de referência. [Figura 6] Um padrão eletroforético em gel de agarose obtido usando iniciadores recém desenvolvidos. [Figura 7] Um padrão eletroforético em gel de agarose obtido por um PCR multiplexo. [Figura 8] Um padrão eletroforético em gel de agarose obtido por um PCR multiplexo.
Modos de Realizar a Invenção
[0024] Agora, o método de tipificação de DNA da presente invenção será mais especificamente descrito etapa por etapa. (1) Etapa de preparar um conjunto de iniciador
[0025] No método de tipificação de DNA da presente invenção, primeiro, um conjunto de iniciadores que hibridiza especificamente a íntron 1 incluindo éxon 2 e éxon 3 e éxon 4, respectivamente, de pelo menos um gene alvo selecionado do grupo que consiste em genes HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1 e HLA-DPB1 em uma sequência de genoma humano e pode hibridizar nas mesmas condições é preparado.
[0026] A sequência de genoma do cromossomo humano 6 (6p21.3) no qual um gene HLA está presente já foi elucidada e associação entre a estrutura do gene e a estrutura de um produto de expressão (antígeno de HLA) foi conhecida (ver Figuras 3 e 4).
[0027] Na presente invenção, um conjunto de iniciadores que pode, de forma abrangente, amplificar por PCR regiões incluindo éxon 2 e éxon 3 dos antígenos de classe II (HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1 e HLA-DPB1) é preparado (ver figura 5) e produtos de PCR obtidos por amplificação por PCR usando o conjunto de iniciadores são submetidos a sequenciamento de alto desempenho (descrito posteriormente). Desta forma, incerteza, tal como ambiguidade de fases, pode ser eliminada e a presença ou ausência de um alelo nulo pode ser exatamente detectada.
[0028] Na tabela 1, SEQ ID NOs: 1 e 2 representam um conjunto de iniciadores de PCR que amplificam especificamente um gene HLA-DRB1, um gene HLA-DRB3, um gene HLA-DRB4 e um gene HLA-DRB5, que são cadeias β da classe II de MHC. Estes iniciadores do conjunto são sequências de nucleotídeos localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante do éxon 2 e éxon 3 de cada de um gene HLA-DRB1 e um gene HLA- DRB5 em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19), um gene HLA-DRB1 e um gene HLA-DRB3 em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: 6_cox_hap2) e um gene HLA- DRB1 e um gene HLA-DRB4 em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: mann_hap4) e prensa estes éxons.
[0029] SEQ ID NO: 1 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde à 32552643a posição para a 32552667a posição e a 32490446a posição para a 32490470a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19), a 4003862a posição para a 4003886a posição e a 3939870a posição para a 3939894a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: 6_cox_hap2) e a 4000197a posição para a 4000221a posição e a 3851785a posição para a 3851809a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: mann_hap4).
[0030] SEQ ID NO: 2 tem uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde à 32548609a posição para a 32548631a posição e a 32486419a posição para a 32486441a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19), a 3999861a posição para a 3999883a posição e a 3935840a posição para a 3935862a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: 6_cox_hap2) e a 3996203a posição para a 3996225a posição e a 3847267a posição para a 3847289a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: mann_hap4).
[0031] O comprimento de um produto de PCR obtido usando este conjunto de iniciadores é estimado da sequência de referência como cerca de 4.000 a cerca de 4.500 bases (bp).
[0032] Na tabela 1, SEQ ID NOs: 3 a 5 representam um conjunto de iniciadores de PCR que amplificam especificamente um gene HLA-DQB1, que é uma cadeia β da classe II de MHC. Estes iniciadores do conjunto são sequências de nucleotídeos localizadas nas posições, que correspondem à montante e à jusante do éxon 2 e éxon 3 de um gene HLA-DQB1 e prensam estes éxons, em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19).
[0033] SEQ ID NO: 3 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde à 32633103a posição para a 32633128a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19).
[0034] SEQ ID NO: 4 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde à 32633103a posição para a 32633127a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19).
[0035] SEQ ID NO: 5 tem uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde à 32629214a posição para a 32629237a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19).
[0036] O comprimento de um produto de PCR obtido usando este conjunto de iniciadores é estimado da sequência de referência como cerca de 3.900 bases (bp).
[0037] Na tabela 1, SEQ ID NOs: 6 e 7 representam um conjunto de iniciadores de PCR que amplificam especificamente um gene HLA-DPB1, que é uma cadeia β da classe II de MHC. Estes iniciadores do conjunto são sequências de nucleotídeos localizadas nas posições, que correspondem à montante e à jusante do éxon 2 e éxon 3 de um gene HLA-DPB1 e prensam estes éxons, em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19).
[0038] SEQ ID NO: 6 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde à 33048187a posição para a 33048207a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19).
[0039] SEQ ID NO: 7 tem uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde à 33053563a posição para a 33053591a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19).
[0040] O comprimento de um produto de PCR obtido usando este conjunto de iniciadores é estimado da sequência de referência como cerca de 5.400 bases (bp).
[0041] Estes iniciadores podem ser preparados por um método rotineiramente usado neste campo. Além do mais, os conjuntos de iniciadores descritos na tabela 1 são os exemplos mais preferíveis. No método da presente invenção, qualquer conjunto de iniciadores pode ser usado, desde que o conjunto de iniciadores seja um conjunto de um iniciador sentido e um iniciador anti-sentido capaz de hibridizar para as posições, que correspondem à montante e à jusante do éxon 2 e éxon 3 de cada gene HLA e prensam estes éxons.
[0042] Adicionalmente, no presente pedido de patente, mesmo se iniciadores correspondem à mesma região na sequência de referência, um número de ID de sequência separado é designado para cada iniciador, desde que eles sejam diferentes nos nucleotídeos. A diferença no nucleotídeo é devido a um polimorfismo.
Figure img0001
[0043] Também, na presente invenção, um conjunto de iniciadores para PCR de uma região incluindo éxon 2 e éxon 3 conhecido como sendo altamente polimórfico em cada dos genes de HLA-A, HLA-B e HLA-C, que são antígenos de classe I clássicos, pode ser usado em combinação com o conjunto de iniciadores específicos para os antígenos de classe II clássicos. O conjunto de iniciadores específico para cada dos genes HLA-A, HLA-B e HLA-C pode ser exemplificado como se segue.
[0044] Na tabela 2, SEQ ID NOs: 8 a 10 representam um conjunto de iniciadores de PCR que amplificam especificamente um gene HLA-A, que é uma cadeia α da classe I de MHC. Estes iniciadores do conjunto são sequências de nucleotídeos localizadas nas posições, que correspondem à montante e à jusante de todas as regiões de um gene HLA-A (incluindo promotor, éxons e íntrons) e prensam todas as regiões, em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19).
[0045] SEQ ID NO: 8 ou 9 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde à 29909483a posição para a 29909514a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19).
[0046] SEQ ID NO: 10 tem uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde à 29914925a posição para a 29914954a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19).
[0047] O comprimento de um produto de PCR obtido usando este conjunto de iniciadores é estimado da sequência de referência como cerca de 5.500 bases (bp).
[0048] Na tabela 2, SEQ ID NOs: 11 e 12 representam um conjunto de iniciadores de PCR que amplificam especificamente um gene HLA-B, que é uma cadeia α da classe I de MHC. Estes iniciadores do conjunto são sequências de nucleotídeos localizadas nas posições, que correspondem à montante e à jusante de todas as regiões de um gene HLA-B (incluindo promotor, éxons e íntrons) e prensam todas as regiões, em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19).
[0049] SEQ ID NO: 11 tem uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde à 31325796a posição para a 31325824a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19).
[0050] SEQ ID NO: 12 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde à 31321210a posição para a 31321235a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19).
[0051] O comprimento de um produto de PCR obtido usando este conjunto de iniciadores é estimado da sequência de referência como cerca de 4.600 bases (bp).
[0052] Na tabela 2, SEQ ID NOs: 13 a 15 representam um conjunto de iniciadores de PCR que amplificam especificamente um gene HLA-C, que é uma cadeia α da classe I de MHC. Estes iniciadores do conjunto são sequências de nucleotídeos localizadas nas posições, que correspondem à montante e à jusante de todas as regiões de um gene HLA-C (incluindo promotor, éxons e íntrons) e prensam todas as regiões, em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19).
[0053] SEQ ID NO: 13 ou 14 tem uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde à 31240868a posição para a 31240896a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19).
[0054] SEQ ID NO: 15 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde à 31236075a posição para a 31236114a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19).
[0055] O comprimento de um produto de PCR obtido usando este conjunto de iniciadores é estimado da sequência de referência como cerca de 4.800 bases (bp).
Figure img0002
[0056] Um ou dois ou mais conjuntos de iniciadores descritos no presente pedido de patente podem ser usados em um único recipiente para amplificação por PCR de cada gene HLA, por exemplo, por um método de PCR multiplex. (2) Etapa de amplificar por PCR
[0057] No método da presente invenção, uma amostra de teste (DNA) é amplificada por um método PCR usando o conjunto de iniciadores preparado na etapa anterior (1).
[0058] A reação de amplificação por PCR é realizada de acordo com um protocolo geral e, mais especificamente, como se segue. 1. DNA é extraído de uma amostra de teste dependendo da amostra. 2. O DNA extraído é quantificado e as concentrações de iniciadores são apropriadamente ajustadas para preparar a solução de reação. 3. Condições de reação são ajustadas e um PCR é realizado.
Por exemplo:
[0059] Etapa de desnaturação térmica (normalmente 92 a 98°C)
[0060] Etapa de hibridização (normalmente 55 a 72°C)
[0061] Etapa de extensão (normalmente 65 a 80°C)
[0062] No método da presente invenção, a temperatura da etapa de hibridização e a etapa de extensão são preferivelmente ajustadas a cerca de 65 a 70°C, mais preferivelmente a 65 a 68°C. Devido à hibridização e extensão a cerca de 65 a 70°C, alelos de HLA podem ser produzidos na razão equivalente (uniformemente). 4. O produto de PCR obtido é purificado e submetido à seguinte etapa de sequenciamento de nucleotídeo.
[0063] A enzima (DNA polimerase) usada na presente invenção não é particularmente limitada e pode ser produtos comerciais. Exemplos podem incluir PrimeSTAR(R) GXL DNA Polimerase, Tks Gflex(R) DNA Polimerase e TaKaRa LA Taq ® (fabricado por TaKaRa Bio Inc.). (3) Etapa de sequenciamento de nucleotídeo
[0064] Em seguida, a sequência de nucleotídeos do produto de PCR (DNA amplificado) produzida na etapa anterior (2) é determinada. A etapa é preferivelmente realizada por uma técnica chamada sequenciamento de alto desempenho (ou sequenciamento ultra alto, um sequenciamento massivamente paralelo). Com relação ao sequenciamento de alto desempenho, ver, por exemplo, “Experimental Medicine”, Vol. 27, No. 1, 2009 (Yodo-sha).
[0065] Um sequenciador massivamente paralelo de alto rendimento inclui um sistema 454 GS da Roche, um sistema de sequenciador de genoma Ion Torrent PGM(TM) da Life Technologies Corporation e sistema MiSeq da illumina, Inc., etc. No presente pedido de patente, um método de sequenciamento que é empregado em um sistema 454 GS da Roche será descrito a seguir. 1. O produto de PCR obtido na etapa anterior (2) é disperso por um nebulizador em fragmentos de cerca de 500 bases. 2. A uma extremidade de cada dos fragmentos de DNA, um adaptador de DNA é anexado. 3. Fragmentos de DNA anexados com um adaptador de DNA são dissociados em fragmentos de DNA de fita simples, que se ligam naturalmente às contas por meio do adaptador. As contas obtidas estão englobadas e retiradas em uma emulsão água em óleo. Consequentemente, um ambiente de micro reator contendo um fragmento de DNA simples ligado a uma conta simples é formado. 4. PCR em emulsão é realizada para amplificar cada fragmento de DNA. Por este PCR em emulsão, cada fragmento de DNA é clonalmente amplificado em cada micro reator. Desta maneira, muitos fragmentos podem ser amplificados simultaneamente e em paralelo sem competição com outras sequências. Subsequentemente, a emulsão é destruída e contas ligadas aos fragmentos de DNA amplificado são coletadas. 5. As contas são concentradas e carregadas em uma placa de picotitulação. Um único poço da placa de picotitulação tem um tamanho suficiente para colocar uma única conta. 6. Quatro tipos de ácidos nucleicos (A, C, G e T) são adicionados em uma ordem predeterminada a cada conta. Ácido pirofosfórico produzido durante a incorporação de cada ácido nucleico adicionado na sequência de DNA por meio de uma polimerase é detectado com relação a cada conta por reação fluorescente de luciferase. Com base na intensidade de sinal e dados de posição em combinação, a sequência de nucleotídeos é determinada. (4) Etapa de tipificação de DNA
[0066] Subsequentemente, depois de o arquivo sff obtido na etapa anterior (3) ser classificado dependendo dos marcadores MID, ele é comparado aos dados de alelos de HLA conhecidos na base de dados do sequenciamento de nucleotídeo. Desta maneira, o tipo de alelo (níveis de 6 dígitos ou 8 dígitos) contido na amostra de teste é determinado no nível 3 do campo ou o nível 4 do campo.
[0067] No método da presente invenção, conjuntos típicos de iniciadores são listados na tabela 1 (descrito anteriormente). A presente invenção é caracterizada em que iniciadores são designados de maneira a corresponder à montante e à jusante do éxon 2 e éxon 3 de cada dos genes de classe II de HLA e prensam estes éxons e a sequência do DNA amplificado que corresponde a quase todas as regiões é determinada. Desta maneira, ambiguidade de fases (incerteza) é eliminada e informação com relação a um alelo nulo pode ser obtida.
[0068] De acordo com a presente invenção, uma vez que conjuntos de iniciadores para genes HLA são designados de maneira a hibridizar na mesma temperatura durante PCR, amplificação por PCR pode ser simultaneamente realizada para uma pluralidade de genes em um aparelho de PCR simples.
[0069] Adicionalmente, devido ao conjunto de iniciadores de acordo com a presente invenção, um PCR multiplex em que uma pluralidade de genes HLA é simultaneamente PCR amplificado em um ou dois tubos pode ser realizado.
[0070] Além do mais, foi confirmado que conjuntos de iniciadores e enzimas usados na presente invenção podem ser aplicados a um aparelho de PCR de alta velocidade. Assim, PCR pode ser realizado mais rápida e exatamente que antes.
Exemplos
[0071] A presente invenção será mais especificamente descrita a título de Exemplos a seguir; entretanto, a presente invenção não é limitada a estes exemplos.
(Exemplo 1) [Propósito]
[0072] O propósito deste exemplo é checar os estados de amplificação para cada gene de classe II de HLA.
[Método]
[0073] Usando PrimeSTAR(R) GXL DNA Polimerase (TaKaRa Bio Inc.) como uma enzima, DNA genômico já extraído como um molde e conjunto de iniciadores específicos para genes de classe II de HLA individuais (ver Tabela 1: SEQ ID NOs: 1 a 7), um PCR foi realizado. O procedimento é mais especificamente como se segue. (1) A 25 ng de uma solução de DNA genômico, 4 μL de 5 x tampão PrimeSTAR(R) GXL, 1,6 μL de uma solução de dNTP, 1 μL de iniciadores de PCR (4 pmol/μL) para cada e 0,8 μL de PrimeSTAR(R) GXL polimerase foram adicionados. A quantidade total da solução de reação foi ajustada como 20 μL com água esterilizada. (2) Depois de manter a 94°C por 2 minutos, a preparação de (1) foi submetida a uma etapa que consiste em uma reação a 98°C por 10 segundos e uma reação a 70°C por 3 minutos. Esta etapa foi repetida 30 vezes por PCR. Observe que, para a amplificação por PCR, GeneAmp(R) PCR System 9700 (Life Technologies Corporation) foi usado. Depois do PCR, os estados de amplificação dos produtos de PCR foram checados por um método de eletroforese em gel de agarose. [Resultados e discussão]
[0074] PrimeSTAR(R) GXL DNA Polimerase foi capaz de amplificar por PCR genes HLA. Os resultados de realizar eletroforese em gel de agarose usando os produtos amplificados por PCR são conhecidos na figura 6. Foi observado que a linha 1 foi produtos de PCR que correspondem às regiões incluindo éxon 2 e éxon 3 de genes HLA-DRB1, HLA-DRB4 e HLA-DRB5, linha 2 foi um produto de PCR que corresponde a uma região incluindo éxon 2 e éxon 3 de um gene HLA-DQB1 e linha 3 foi um produto de PCR que corresponde a uma região incluindo éxon 2 e éxon 3 de um gene HLA-DPB1. Na figura 6, linha M representa um marcador do tamanho do DNA. Um produto amplificado por PCR simples tendo um peso molecular desejado foi obtido com êxito para cada dos genes de classe II de HLA usando estes iniciadores.
(Exemplo 2) [Propósito]
[0075] O propósito deste exemplo é determinar a potencialidade de um método de PCR multiplex de 6 locos de genes HLA incluindo genes HLA-A, HLA-B e HLA-C além da classe II de HLA do exemplo 1. [Método] 1. Usando PrimeSTAR(R) GXL DNA Polimerase (TaKaRa Bio Inc.), DNA genômico já extraído de seis corpos de prova (Amostras 1 a 6 na tabela 3) como um molde e conjunto de iniciadores específico para genes de classe I e de classe II de HLA individual (ver Tabela 2: SEQ ID NOs: 8 a 15 e Tabela 1: SEQ ID NOs: 1 a 7), um PCR foi realizado. Observe que, o tipo de HLA para cada dos seis corpos de prova já foi revelado e os corpos de prova incluem uma combinação de alelos, nos quais ambiguidade de fases foi observada em um método de tipificação de DNA convencional. O procedimento é mais especificamente como se segue. (1) O PCR foi realizado em dois tubos de 0,2 mL. Resumidamente, genes HLA-A, HLA-B e HLA-C foram amplificados em um dos tubos e genes HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1 e HLA-DPB1 foram amplificados no outro tubo. (2) A 25 ng de uma solução de DNA genômico, 4 μL de 5 x tampão PrimeSTAR(R) GXL, 1,6 μL de uma solução de dNTP, 3,2 a 5 μL de iniciadores de PCR (10 pmol/μL) para cada e 0,8 μL de PrimeSTAR(R) GXL polimerase foram adicionados. A quantidade total da solução de reação foi ajustada como 20 μL com água esterilizada. (3) Depois de manter a 94°C por 2 minutos, a preparação de (2) foi submetida a uma etapa que consiste em uma reação a 98°C por 10 segundos e uma reação a 70°C por 3 minutos. Esta etapa foi repetida 30 vezes por amplificação por PCR. Observe que, para a amplificação por PCR, GeneAmp(R) PCR Sistema 9700 (Life Technologies Corporation) foi usado. Depois do PCR, os estados de amplificação dos produtos de PCR foram checados por um método de eletroforese em gel de agarose. 2. As sequências de nucleotídeos dos produtos de PCR foram determinadas especificamente como se segue. (1) Um produto de PCR foi purificado por AMPure XP Kit (Beckman Coulter, Inc.) de acordo com o protocolo padrão. (2) A concentração do produto de PCR purificado foi medida por PicoGreen(R) dsDNA Quantitation Kit (Invitrogen Corp.) de acordo com o protocolo padrão. (3) Os produtos de PCR purificados derivados dos genes de classe I e os produtos de PCR purificados derivados dos genes de classe II foram misturados em quantidades iguais. (4) Uma solução dos produtos de PCR purificados, uma concentração que foi ajustada como 500 ng/100 μL, foi submetida à construção de uma biblioteca rápida e então PCR de emulsão e sequenciamento por GS Junior (Roche) foram realizados de acordo com o protocolo padrão para obter sequências de nucleotídeos de 15.000 leituras por amostra. (5) Uma pesquisa com relação à homologia entre estas sequências de nucleotídeos e sequências de nucleotídeos conhecidas dos alelos de HLA em uma base de dados IMGT HLA foi realizada para selecionar alelos candidatos. (6) As sequências dos alelos candidatos foram usadas como uma referência. O mapeamento foi realizado por GS Reference Mapper (Roche) em condição que a referência combina a leitura perfeitamente. O estado do mapeamento foi checado visualmente para identificar um alelo de HLA.
[Resultados e discussão]
[0076] 1. Os resultados de realizar eletroforese em gel de agarose usando os produtos amplificados por PCR são conhecidos na figura 7. Na figura 7, linhas 1 a 6 correspondem aos produtos de PCR obtidos usando ID da amostra 1 a ID da amostra 6 da Tabela 3. Linha M representa um marcador do tamanho do DNA. Conforme evidente a partir da Figura 7, um produto de PCR e um produto amplificado por PCR simples tendo um peso molecular desejado foram obtidos com êxito para cada dos genes de classe I e classe II de HLA em todas as amostras usando os iniciadores conhecidos nas tabelas 1 e 2. Além do mais, as sequências de nucleotídeos dos produtos de PCR foram determinadas pelo método Sanger. Como um resultado, alelos de HLA foram obtidos em consistência com documentos conhecidos. Desta maneira, tipificação de DNA de genes HLA pode ser realizada pelo sistema PCR usando os iniciadores conhecidos nas tabelas 1 e 2.
[0077] 2. Usando seis corpos de prova contendo uma combinação de alelos, nos quais ambiguidade de fases é observada em um método de tipificação de DNA convencional, um PCR foi realizado. Produtos de PCR derivados das regiões incluindo éxon 2 e éxon 3 de genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1 e HLA-DPB1 foram submetidos à tipificação de DNA de genes HLA por GS Junior. Como um resultado, tipificação de DNA de todos os genes foi feita com êxito em um nível de 6 dígitos (Tabela 3). A partir disto, o método da presente invenção pode realizar tipificação de DNA de genes HLA em um nível de 6 dígitos ou superior sem ambiguidade de fases e pode eficientemente detectar uma substituição, uma inserção e uma deleção de bases, mesmo em íntrons, que podem ser causas de um alelo nulo.
Figure img0003
(Exemplo 3) [Propósito]
[0078] O propósito deste exemplo é determinar a potencialidade de um método de PCR multiplex de 7 locos de genes HLA (genes HLA-A, HLA- B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 e HLA-DRB5) e 9 locos de genes HLA (genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1 e HLA-DPB1). [Método] 1. Usando PrimeSTAR(R) GXL DNA Polimerase (TaKaRa Bio Inc.), DNA genômico já extraído de quatro corpos de prova (Amostras 1 a 4 na tabela 4) como um molde e conjunto de iniciadores específico para genes de classe I e de classe II de HLA individuais (ver Tabela 2: SEQ ID NOs: 8 a 15 e Tabela 1: SEQ ID NOs: 1 a 5), um PCR foi realizado. Observe que, o tipo de HLA para cada dos quatro corpos de prova já foi revelado e os corpos de prova incluem uma combinação de alelos, em que ambiguidade de fases foi observada em um método de tipificação de DNA convencional.
[0079] SEQ ID NOs: 8 a 15 da Tabela 2 e SEQ ID NOs: 1 a 5 da Tabela 1 foram usados com relação aos genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5 e HLA-DQB1. DPB1- F2 (5'-CTCAGTGCTCGCCCCTCCCTAGTGAT-3': SEQ ID NO: 16) e DPB1-R2 (5'-GCACAGTAGCTTTCGGGAATTGACCA-3': SEQ ID NO: 17) foram usados com relação a um gene HLA-DPB1. DPB1-F2 (SEQ ID NO: 16) e DPB1-R2 (SEQ ID NO: 17) representam um conjunto de iniciadores de PCR que amplificam especificamente um gene HLA-DPB1, que é uma cadeia β da classe II de MHC. Estes iniciadores do conjunto são sequências de nucleotídeos localizadas nas posições, que correspondem à montante e à jusante do éxon 2 a uma região 3' não traduzida de um gene HLA-DPB1 e prensadas na região, em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19). SEQ ID NO: 16 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde à 33048182a posição para a 33048207a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19). SEQ ID NO: 17 tem uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde à 33055428a posição para a 33055453a posição em uma sequência de genoma humano (Sequência de referência: hg19). O comprimento de um produto de PCR obtido usando este conjunto de iniciadores é estimado da sequência de referência como cerca de 7.300 bases (bp).
[0080] O procedimento é mais especificamente como se segue. (1) O PCR foi realizado em dois tubos de 0,2 mL. Resumidamente, genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 e HLA-DRB5 foram amplificados em um dos tubos. Genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA- DRB5, HLA-DQB1 e HLA-DPB1 foram amplificados no outro tubo.
[0081] (2) A 25 ng de uma solução de DNA genômico, 4 μL de 5 x tampão PrimeSTAR(R) GXL, 1,6 μL de uma solução de dNTP, 3,2 a 5 μL de iniciadores de PCR (10 pmol/μL) para cada e 0,8 μL de PrimeSTAR(R) GXL polimerase foram adicionados. A quantidade total da solução de reação foi ajustada como 20 μL com água esterilizada.
[0082] (3) Depois de manter a 94°C por 2 minutos, a preparação de (2) foi submetida a uma etapa que consiste em uma reação a 98°C por 10 segundos e uma reação a 70°C por 3 minutos. Esta etapa foi repetida 30 vezes por amplificação por PCR. Observe que, para a amplificação por PCR, GeneAmp(R) PCR Sistema 9700 (Life Technologies Corporation) foi usado. Depois do PCR, os estados de amplificação dos produtos de PCR foram checados por um método de eletroforese em gel de agarose. 2. As sequências de nucleotídeos dos produtos de PCR foram determinadas especificamente como se segue. (1) Um produto de PCR foi purificado por AMPure XP Kit (Beckman Coulter, Inc.) de acordo com o protocolo padrão. (2) A concentração do produto de PCR purificado foi medida por PicoGreen(R) dsDNA Quantitation Kit (Invitrogen Corp.) de acordo com o protocolo padrão. (3) Os produtos de PCR purificados derivados dos genes de classe I e os produtos de PCR purificados derivados dos genes de classe II foram misturados em quantidades iguais. (4) Uma solução dos produtos de PCR purificados, uma concentração que foi ajustada como 500 ng/100 μL, foi submetida à construção de uma biblioteca e, então, PCR por emulsão e sequenciamento por Ion PGM (Life Technologies Corporation) foram realizados de acordo com o protocolo padrão para obter sequências de nucleotídeos de 400.000 leituras por amostra. (5) Uma pesquisa com relação à homologia entre estas sequências de nucleotídeos e sequências de nucleotídeos conhecidas de alelos de HLA em uma base de dados IMGT HLA foi realizada para selecionar alelos candidatos. (6) As sequências dos alelos candidatos foram usadas como uma referência. Mapeamento foi realizado por GS Reference Mapper (Roche) na condição que a referência combina a leitura perfeitamente. O estado de mapeamento foi checado visualmente para identificar um alelo de HLA. [Resultados e discussão] 1. Os resultados de realizar eletroforese em gel de agarose usando os produtos amplificados por PCR são conhecidos na figura 8. Na figura 8, linhas 1 a 4 correspondem aos produtos de PCR obtidos usando ID da amostra 1 a ID da amostra 4 da Tabela 4. A linha mais à esquerda representa um marcador do tamanho do DNA. Conforme é evidente a partir da Figura 8, um produto de PCR e um produto amplificado por PCR simples tendo um peso molecular desejado foram obtidos com êxito para cada dos genes em todas as amostras tanto dos 7 locos de genes HLA quanto dos 9 locos de genes HLA usando os iniciadores descritos anteriormente. 2. Usando quatro corpos de prova contendo uma combinação de alelos, nos quais ambiguidade de fases é observada em um método de tipificação de DNA convencional, um PCR foi realizado. Produtos de PCR derivados de cada um dos genes foram submetidos à tipificação de HLA por Ion PGM. Como um resultado, tipificação de DNA de todos os genes foi feita com êxito em um nível de 6 dígitos (Tabela 4). A partir disto, o método da presente invenção pode realizar tipificação de DNA de genes HLA a um nível de 6 dígitos ou superior sem ambiguidade de fases e pode efetivamente detectar uma substituição, uma inserção e uma deleção das bases, mesmo em íntrons, que pode ser causas de um alelo nulo.
Figure img0004

Claims (5)

1. Método para tipificação de DNA de um gene do antígeno leucocitário humano (HLA), caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (1) uma etapa de preparar um conjunto de iniciadores para pelo menos um gene alvo selecionado do grupo que consiste em genes HLA- DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1 e HLA-DPB1 em uma sequência genômica humana, em que os iniciadores anelam especificamente a uma região de íntron 1 e uma região de éxon 4, respectivamente, e amplificam uma região compreendendo exon 2, intron 2, exon 3, intron 3 e uma parte do exon 4, em que quando o gene alvo é pelo menos um gene selecionado do grupo que consiste nos genes HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 e HLA-DRB5, o conjunto de iniciadores é oligonucleotídeos com sequências de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente, em que quando o gene alvo é um gene HLA-DQB1, o conjunto de iniciadores é oligonucleotídeos com sequências de nucleotídeos como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 3 e 4, ou ambas, e SEQ ID NO: 5, respectivamente, e em que quando o gene alvo é um gene HLA-DPB1, o conjunto de iniciadores é oligonucleotídeos com sequências de nucleotídeos como mostrado nas SEQ ID NOs: 6 e 7, respectivamente; (2) uma etapa de amplificar por PCR uma amostra de DNA de teste usando o conjunto de iniciadores; e (3) uma etapa de determinar a sequência de nucleotídeos do produto de PCR amplificado por sequenciamento massivo paralelo de alto rendimento; em que a a ambiguidade da fase é eliminada e a presença ou ausência de um alelo nulo HLA pode ser detectada com precisão.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida tipagem de DNA inclui um nível de dois dígitos, quatro dígitos, 6 dígitos e 8 dígitos de discriminação alélica entre os genes HLA.
3. Conjunto de iniciadores, caracterizado pelo fato de que é para tipificação de DNA de pelo menos um gene selecionado do grupo que consiste em genes HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 e HLA-DRB5, consistindo de oligonucleotídeos tendo sequências de nucleotídeos como mostrado nas SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente.
4. Conjunto de iniciadores, caracterizado pelo fato de que é para tipificação de DNA de um gene HLA-DQB1, consistindo de oligonucleotídeos tendo sequências de nucleotídeos como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 3 e 4, ou ambas, e SEQ ID NO: 5, respectivamente.
5. Conjunto de iniciadores, caracterizado pelo fato de que é para tipificação de DNA de um gene HLA-DPB1, consistindo de oligonucleotídeos tendo sequências de nucleotídeos como mostrado nas SEQ ID NOs: 6 e 7, respectivamente.
BR112016011840-5A 2013-11-27 2014-11-27 Método para tipificação de dna de um gene hla, e, conjunto de iniciadores BR112016011840B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013-244624 2013-11-27
JP2013244624 2013-11-27
PCT/JP2014/081464 WO2015080226A1 (ja) 2013-11-27 2014-11-27 超並列高速シークエンサーによる簡便なhla遺伝子のdnaタイピング方法およびキット

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112016011840A2 BR112016011840A2 (pt) 2017-09-26
BR112016011840B1 true BR112016011840B1 (pt) 2023-02-23

Family

ID=53199162

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112016011840-5A BR112016011840B1 (pt) 2013-11-27 2014-11-27 Método para tipificação de dna de um gene hla, e, conjunto de iniciadores

Country Status (8)

Country Link
US (1) US10494673B2 (pt)
EP (1) EP3075863B1 (pt)
JP (1) JP6643902B2 (pt)
CN (1) CN106103738B (pt)
AU (1) AU2014355369B2 (pt)
BR (1) BR112016011840B1 (pt)
CA (1) CA2931828C (pt)
WO (1) WO2015080226A1 (pt)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6308724B2 (ja) * 2013-05-09 2018-04-11 ジェノダイブファーマ株式会社 Hla遺伝子のマルチプレックスdnaタイピング方法及びキット
CN106381331B (zh) * 2016-08-31 2019-09-03 中国水产科学研究院珠江水产研究所 草鱼生长速度相关的snp标记及其应用
JP6798697B2 (ja) * 2017-02-13 2020-12-09 国立大学法人京都大学 Hla遺伝子のpcrプライマーセット及びそれを用いたシークエンス法
WO2018167153A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 Novozymes A/S Improved filamentous fungal host cell
CA3090593A1 (en) * 2017-09-01 2019-03-07 Orig3N, Inc. Ipsc-derived secretome compositions, and related systems and methods
CN108048546A (zh) * 2017-10-10 2018-05-18 上海荻硕贝肯医学检验所有限公司 用于hla基因高分辨率分型的引物、试剂盒及方法
KR102673550B1 (ko) * 2017-11-23 2024-06-12 (주)오상헬스케어 실시간 중합 효소 연쇄 반응을 이용한 hla 대립유전자 검사 키트
US11608530B1 (en) 2018-04-18 2023-03-21 One Lambda, Inc. Single reaction multiplex PCR primer design for amplifying multiple HLA class I and II genes
EP3626835A1 (en) 2018-09-18 2020-03-25 Sistemas Genómicos, S.L. Method for genotypically identifying both alleles of at least one locus of a subject's hla gene
CN111057706A (zh) * 2019-10-09 2020-04-24 西安市中心血站(陕西省血液中心) 一组引物以及hla-dpb1基因测序分型的检测方法
CN117265091B (zh) * 2023-10-31 2024-06-14 江苏伟禾生物科技有限公司 一种用于hla-drb3/4/5基因分型的引物组、试剂盒及应用
CN117512085B (zh) * 2023-11-21 2024-06-04 江苏伟禾生物科技有限公司 一种用于检测hla-dpb1基因分型的引物组及试剂盒

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0216000A (ja) 1988-07-01 1990-01-19 Fujitsu Ltd 組立定尺プリント基板の切断装置
EP0892069B1 (en) 1997-06-26 2010-07-28 BIO-Rad Medical Diagnostics GmbH A method for determinig the histocompatibility locus antigen class II
JPH11216000A (ja) 1997-10-29 1999-08-10 Shionogi & Co Ltd Hla−a対立遺伝子型の判別方法
ES2351686T3 (es) 1999-04-09 2011-02-09 Innogenetics N.V. Método para la amplificación de alelos hla de clase i.
US20070111213A1 (en) 2003-10-28 2007-05-17 Lu Wang Primers, methods and kits for amplifying or detecting human leukocyte antigen alleles
US20100086914A1 (en) 2008-10-03 2010-04-08 Roche Molecular Systems, Inc. High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing
CA2701411A1 (en) * 2007-10-16 2009-04-23 F. Hoffmann-La Roche Ag High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing
US20100261189A1 (en) * 2008-10-03 2010-10-14 Roche Molecular Systems, Inc. System and method for detection of HLA Variants
CN101928770B (zh) * 2009-09-18 2012-02-29 深圳市血液中心 人类白细胞抗原HLA-Cw基因测序分型的方法
CN101892317B (zh) 2010-07-29 2012-08-22 苏州大学 Hla高分辨基因测序试剂盒
CN101962676B (zh) 2010-08-31 2011-08-31 深圳市血液中心 人类白细胞抗原hla基因测序分型方法
CN103890190B (zh) 2011-07-21 2016-08-17 吉诺戴夫制药株式会社 Hla基因的dna分型方法和试剂盒
JP6308724B2 (ja) 2013-05-09 2018-04-11 ジェノダイブファーマ株式会社 Hla遺伝子のマルチプレックスdnaタイピング方法及びキット

Also Published As

Publication number Publication date
CA2931828C (en) 2022-07-12
EP3075863B1 (en) 2019-03-13
CN106103738A (zh) 2016-11-09
AU2014355369A1 (en) 2016-06-23
EP3075863A1 (en) 2016-10-05
CA2931828A1 (en) 2015-06-04
AU2014355369B2 (en) 2020-08-13
US10494673B2 (en) 2019-12-03
JPWO2015080226A1 (ja) 2017-03-16
CN106103738B (zh) 2020-08-28
EP3075863A4 (en) 2017-06-14
WO2015080226A1 (ja) 2015-06-04
JP6643902B2 (ja) 2020-02-12
US20170029885A1 (en) 2017-02-02
BR112016011840A2 (pt) 2017-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112016011840B1 (pt) Método para tipificação de dna de um gene hla, e, conjunto de iniciadores
JP6809977B2 (ja) Hla遺伝子のdnaタイピング方法及びキット
BR112015028027B1 (pt) Método para tipagem de dna de hla, e, conjunto de iniciadores e kit para tipagem de dna de um gene de hla
US9920370B2 (en) Haplotying of HLA loci with ultra-deep shotgun sequencing
JP2012507306A (ja) 核酸配列を調査するための手段および方法
Gineau et al. Balancing immunity and tolerance: genetic footprint of natural selection in the transcriptional regulatory region of HLA-G
Yang et al. Molecular identification of avian leukosis virus subgroup E loci and tumor virus B locus in Chinese indigenous chickens
Truong The investigation of single molecule sequencing to characterise HLA genes for clinical use in allogeneic transplantation
JP2009050258A (ja) Hla−a2新規アリル
JP2008271966A (ja) HLA−Cw03新規アリル

Legal Events

Date Code Title Description
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 27/11/2014, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS