JP2009050258A

JP2009050258A - Ｈｌａ−ａ２新規アリル

Info

Publication number: JP2009050258A
Application number: JP2008195641A
Authority: JP
Inventors: Etsuko Maruya; 悦子丸屋; Satoshi Morikawa; 諭森川; Masaki Matsushita; 正毅松下
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2007-07-31
Filing date: 2008-07-30
Publication date: 2009-03-12

Abstract

【課題】ＨＬＡ−Ａ抗原のサブタイプのひとつであるＡ２に含まれる新規アリルの提供。
【解決手段】オリゴヌクレオチドプローブを固相に、複数のビーズを用いてＨＬＡ−Ａ遺伝子の遺伝子型を解析したところ、既知のアリルと全く異なる陽性反応を示す特定のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ−Ａ２新規アリル及び特定の塩基配列又はその相補配列を有するＨＬＡ−Ａ２新規アリルを確認した。特定のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ-Ａ２新規アリル、または、特定の塩基配列もしくはその相補配列を有するＨＬＡ-Ａ２新規アリルについて、オリゴヌクレオチドプローブを固相した複数のビーズを用いてＨＬＡ−Ａ遺伝子の遺伝子型を解析したところ、既知のアリルと全く異なる陽性反応を示した。
【選択図】図１

Description

本発明は、ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen；以下ＨＬＡと略す）の新規アリルに関する。

ＨＬＡのタイピングは移植時の適合性を判定するのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいて重要性が注目されている。

臓器移植を行う場合、臓器の提供者と患者の間でＨＬＡの型がどれだけ一致しているかが移植成功率に大きく影響する。ＨＬＡ型が一致しない場合、拒絶反応のため臓器が患者に生着せず、逆に提供者由来の免疫細胞のためにＧＶＨＤ（移植片対宿主病(Graft-Versus-Host Disease)）が発生し、患者の生命が危険にさらされることになる。また糖尿病など特定の疾患とHLA型との関連も指摘されている。ＨＬＡのタイピングはこのような医療技術の高度化に従い重要性を増したといえる。

従来のＨＬＡタイピングは抗体を用いて行われる血清学的手法であったが、近年の技術革新によりＨＬＡ分子をコードする遺伝子の配列より型分けを行う、いわゆる遺伝子タイピング法が主流となってきた。骨髄移植において遺伝子型でのマッチングが移植成績と相関することが明らかとなり、ＨＬＡの遺伝子タイピングは医療現場においても重要度を増してきている。

塩基配列を確認する方法としては、シークエンシング反応により配列を決定するサンガー法（例えば、非特許文献１参照）などがあるが、コスト面からＨＬＡの遺伝子タイピングは部分的な配列をプローブやプライマーとして利用し、その反応性から遺伝子配列を推定し、HLA型を決める方法が利用されている（例えば、非特許文献２、３参照）。

ＨＬＡ−Ａ抗原のサブタイプのひとつであるＡ2に含まれる遺伝子型は２００７年６月の時点で、１４１種類が報告されているが、アリルの存在については充分検討されていないのが現状である（例えば、非特許文献４参照）。

Santamaria P. et al. HLA class I sequence-based typing. Hum Immunol. 37(1):39-50, 1993. Bunce M. et al. Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens. 46(5):355-67, 1995. Kawai S. et al. Routine low and high resolution typing of the HLA-DRB gene using the PCR-MPH (microtitre plate hybridization) method. Eur J Immunogenet. 23(6):471-86, 1996. Allele Frequencies ［online］、[平成１９年６月２９日検索]、インターネット＜URL：http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/＞

発明の概要

従って、本発明の目的は、ＨＬＡ−Ａ抗原のサブタイプのひとつであるＡ２に含まれる新規アリルを提供することにある。

本発明者らは今般、オリゴヌクレオチドプローブを固相した複数のビーズを用いてＨＬＡ−Ａ遺伝子の遺伝子型を決める方法によって、既知のアリルとは異なる陽性反応を示す遺伝子を見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。

即ち、本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ-Ａ２新規アリルを提供するものである。

また本発明は、配列番号２記載の塩基配列又はその相補配列を有するＨＬＡ-Ａ２新規アリルを提供するものである。

本発明により、ＨＬＡ−Ａ抗原の詳細なタイピングが可能となるため、移植時の適合性を判定するのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいて、極めて有用となる。

発明の具体的説明

ＤＮＡタイピング法の1つであるＰＣＲ−ＳＳＯＰ（Sequence Specific Oligonucleotide probe）法に基づき、Ｌｕｍｉｎｅｘ社のｘＭＡＰ測定技術（http://www.luminexcorp.com/01_xMAPTechnology/index.html）を用いてＨＬＡ遺伝子のタイピングが可能なＷＡＫＦｌｏｗＨＬＡタイピング試薬（湧永製薬製）を用いてＨＬＡ−Ａ抗原の遺伝子型をタイピングしたところ、血液より抽出したＤＮＡ検体で既知の遺伝子型の反応性が示されなかった。

ダイレクトシークエンシング法（Wong C. et al. Characterization of beta-thalassaemia mutations using directgenomic sequencing of amplified single copy DNA. Nature. 330:384-6, 1987.）によりエクソン２およびエクソン３の配列を確認した。エクソン2およびエクソン3のそれぞれ上流と下流に設定したプライマーを用いて、センス鎖アンチセンス鎖の両側から配列を確認したところ、エクソン2はＡ＊０２０７とＡ＊２４２０の配列であるが、エクソン3はＡ＊２４２０の配列とこれまでに報告されていない配列とが検出された。よって、この検体がＡ＊２４２０と未知のアリルのヘテロ接合である可能性が考えられた。

配列を詳細に調べるため、ＨＬＡ−Ａ抗原遺伝子のエクソン２からエクソン３にかけて約１Ｋｂの領域をサブクローニングにより単離した。ＨＬＡ−Ａ抗原のエクソン２上流とエクソン３下流に設定したプライマーを用いて、ＰＣＲ反応によりこの領域を増幅し、電気泳動で目的とする長さの断片を取り出してＴＡクローニングによりプラスミドベクターに取り込ませた。このプラスミドを用いて形質転換させた大腸菌を少量の培地で培養し、培地から回収した大腸菌よりプラスミドを抽出した。得られたプラスミドの中から約１Ｋｂのインサートの入ったものを制限酵素処理により選び出し、得られた９クローンのプラスミドについて配列を確認した。

その結果、ＨＬＡ−Ａ＊２４２０が１クローン、ＨＬＡ−Ａ以外の遺伝子が４クローン見つかった他、ダイレクトシークエンシング法で確認された新規配列を有する変異型が４クローン得られた。

新規配列を有する変異型４クローンについて、遺伝子の塩基配列の確認を行った結果、図１のようにＡ＊０２０７の配列のエクソン３内に１箇所の変異を確認した。この変異は図２に示す１５１番目のアミノ酸がヒスチジンからアルギニンへと置き換わる非同義置換であった。また、１５１番目のアミノ酸はＨＬＡ−Ａ分子において抗原ペプチドをはさみこむ領域の内側に位置している。

このことから、これらのアミノ酸はＨＬＡ−Ａ分子に結合するペプチドモチーフにも重要な部位であり、免疫系において重要な役割を果たしている可能性が高い。したがって、Ａ＊０２０７と本発明の変異をもつ遺伝子型（Ａ＊０２０７Ｖ）とは、移植医療においては区別する必要があり、移植時の適合性判定などにおいて、ＨＬＡ−Ａ抗原のタイピング精度を高める上で、極めて有用かつ重要なものである。
なお、本発明において見出された新規アリルは、ＷＨＯ命名によれば「Ａ＊９２３０」とされている。このため本明細書においては、新規アリルを「Ａ＊０２０７Ｖ」または「Ａ＊９２３０」のいずれかで表示する。

よって、本発明による新規アリルは、前記したように、配列番号1記載のアミノ酸配列をコードしてなるものであり、また、配列番号2記載の塩基配列又はその相補配列を有するものである。

また本発明の新規アリルでコードされるペプチドを有するタンパクもアリルと同様に移植時の適合性判定などにおいて、極めて有用かつ重要なものである。

本発明の別の態様によれば、ＨＬＡ−Ａ２抗原のタイピング方法であって、遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とする方法が提供される。ここで、それらから得られる配列変異情報とは、図１および図２にも示されているように既知のアリル（Ａ＊０２０７）と本件新規アリル（Ａ＊０２０７Ｖ）とを塩基配列またはアミノ酸配列を比較することにより得られる配列上の変異情報である。例えば、アミノ酸配列の場合であれば、前記したような、Ａ＊０２０７のアミノ酸配列上、１５１番目のアミノ酸がヒスチジンからアルギニンへと置き換わっている場合が挙げられる。

既知のアリル（Ａ＊０２０７）とＨＬＡ−Ａ２新規アリル（Ａ＊０２０７Ｖ）との塩基配列の比較。既知のアリル（Ａ＊０２０７）とＨＬＡ−Ａ２新規アリル（Ａ＊０２０７Ｖ）とのアミノ酸配列の比較。

Claims

配列番号１のアミノ酸配列をコードする、ＨＬＡ-Ａ２新規アリル。
配列番号２の塩基配列又はその相補配列を有する、ＨＬＡ-Ａ２新規アリル。
請求項１または２に記載のＨＬＡ-Ａ２新規アリルでコードされるペプチドを有する、タンパク質。
遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とするＨＬＡ−Ａ２抗原のタイピング方法。