CN113444792B - 一种辅助筛查家族性甲状腺乳头状癌的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种辅助筛查家族性甲状腺乳头状癌的试剂盒，属于基因多态性检测试剂盒领域。本发明的试剂盒主要包括检测变异的人类CSTF3基因的试剂，该基因是基因组第11号染色体第33106691位碱基由G变成A对应的CSTF3基因。本发明还公开了检测前述碱基变异的试剂在制备家族性甲状腺乳头状癌辅助筛查试剂中的用途，以及家族性甲状腺乳头状癌辅助筛查试剂盒。本发明试剂盒，可用于甲状腺癌的辅助性诊断，应用前景优良。

Description

一种辅助筛查家族性甲状腺乳头状癌的试剂盒
技术领域
本发明属于基因多态性检测试剂盒领域，尤其涉及一种辅助筛查家族性甲状腺乳头状癌的试剂盒。
背景技术
甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常见的一种甲状腺癌，起源于能够产生和储存甲状腺激素的滤泡细胞。PTC的风险与基因多态性存在密切联系，这解释了有家族史者PTC的发病风险比无家族史者更高。
目前已经报道了数个基因的多态性与PTC发病风险相关，例如：王迎雪研究发现，Bcl-2基因938C/A多态性与Survivin基因9194A/G多态性与PTC发病风险相关，PTC患者的Bcl-2基因C等位基因频率以及Survivin基因的A等位基因频率高于健康对照(王迎雪.Bcl-2、survivin基因多态性与甲状腺乳头状癌的发病风险及其蛋白表达差异的相关性研究.山东大学2013)；王崇等报道，USF1基因的rs2516839位点多态性与PTC有关联，携带A等位基因可能PTC的危险因素(王崇.甲状腺乳头状癌与USF1基因多态性的关系研究.吉林大学2013)。研究者们还在不断地发现新的与PTC有关的基因多态性位点，以继续提高PTC风险诊断的准确性。
CSTF3基因(Ensembl：ENSG00000176102)编码一种剪切刺激因子(cleavagestimulation factors)CSTF3蛋白，主要参与行使pre-mRNA的3’的多腺苷酸化和3’端剪切功能。目前未见关于CSTF3基因突变与甲状腺癌的关系的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种新的辅助筛查家族性甲状腺乳头状癌的基因多态性位点，以及相关试剂盒。
技术方案如下：
一种变异的人类CSTF3基因，它是包括如下位点的突变CSTF3基因：
chr11 33106691 G＞A；
该位点表示第11号染色体第33106691碱基由G突变为A。本发明碱基位点所依据的基因组版本是GRCh37。
一种变异的人类CSTF3蛋白，其特征在于：它是由前述基因翻译得到的蛋白。
检测前述突变CSTF3基因的相关试剂在制备甲状腺乳头状癌筛查试剂中的用途。
如前述的用途，检测前述突变基因的相关试剂是测序用试剂、荧光定量PCR试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。
如前述的用途，所述甲状腺乳头状癌筛查试剂还包括扩增含有基因组第11号染色体第33106691位碱基的序列的扩增试剂。
如前述的用途，所述扩增试剂包括序列如SEQ ID NO.1～2所述的引物。
一种甲状腺乳头状癌的筛查试剂盒，它包括任选的用于检测前述突变基因的相关试剂。
如前述的试剂盒，所述检测前述突变基因的相关试剂是测序用试剂、荧光定量PCR试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。
如前述的试剂盒，它还包括扩增含有基因组第11号染色体第33106691位碱基的序列的扩增试剂。
如前述的试剂盒，所述扩增试剂包括序列如SEQ ID NO.1～2所述的引物。
本发明提供的试剂盒，可以有效筛查待检人群的对患乳头状甲状腺癌的可能性，应用前景良好。
本发明的关键在于针对基因组第11号染色体第33106691位碱基，检测的样品为DNA，可提取自人的体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等；本发明的试剂盒及制备试剂盒的用途对具体检测突变CSTF3基因(含chr11 33106691 G＞A位点)的试剂也没有任何限制，凡是能检测该基因的试剂被用于制备检测辅助筛查家族性甲状腺乳头状癌的试剂盒，均在本发明的范围内。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例、实验例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是发生CSTF3 chr11 33106691 G＞A杂合突变的测序比对图。
图2是未发生CSTF3 chr11 33106691 G＞A杂合突变的测序比对图。
图3是甲状腺乳头状癌患者家系图。
图4是转染慢病毒甲状腺细胞中癌基因表达图；横轴为对应的转染病毒的类型：N3-GFP，表达GFP的慢病毒；N3-C-OE，表达CSTF3野生型基因的慢病毒；N3-C-MU，表达CSTF3突变(对应chr11 33106691 G＞A)基因的慢病毒。
具体实施方式
实施例本发明的试剂盒
一、试剂盒的组成
本发明试剂盒包括扩增CSTF3基因的扩增试剂，以及Sanger测序用的试剂。
1.扩增试剂
PCR扩增试剂用于扩增SNP位点所在的一段DNA序列，其组成见表1。
表1 PCR扩增试剂
Figure SMS_1
表1中PCR混合液包括Taq酶、dNTP、镁离子等常规PCR所需成分；其中引物对信息如表2所示。
表2基因扩增所用引物
Figure SMS_2
2.测序试剂
该试剂包括如表3所示的组分。
表3基因变异分型检测试剂(包括纯化用试剂)
Figure SMS_3
Figure SMS_4
其中测序引物序列与扩增所用引物一致。
二、使用方法
1.DNA提取
取全血样本200微升，采用新百基UPure Blood DNA Extraction Kit(M2002-01)试剂盒提取DNA。
2.PCR扩增
1)体系配制：
DNA 2微升
2X Taq PCR MasterMix(KT201) 12.5微升
上游引物 1微升
下游引物 1微升
灭菌水 9.5微升
2)反应程序：
步骤 温度 时间
1 94℃ 3min
2 94℃ 30s
3 60℃ 30s
5 72℃ 1min
6 返回2步，共30次
7 72℃ 5min
3)PCR产物检测：
用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察PCR反应的效果，并确定其作为模板在后续反应中加入的量。
3.sanger测序
第一步：PCR产物纯化
体系：
Figure SMS_5
Figure SMS_6
反应条件：
Figure SMS_7
第二步：Sanger测序
将前述分型检测试剂作为测序扩增试剂，用于第一步纯化的PCR产物的Sanger测序。
4.结果判读
将测序结果比对到人类基因组第11号染色体上，判读11号染色体33106691位碱基的位置是否出现G突变为A的情形，包括杂合突变、纯合突变。其中杂合突变的情形如图1所示，而未突变的情形如图2所示。若测序结果中对应出现G突变为A的情形，则发生本发明要检测的突变基因，说明该检测对象对甲状腺乳头状癌易感。为了说明chr11 33106691 G＞A突变与甲状腺乳头状癌相关，以下以实验例的方式说明。
实验例1突变位点验证
1.实验对象
确诊为甲状腺乳头状癌患者4名，其家系成员患病情况如图3所示。另有经诊断明确未患甲状腺乳头状癌的300人作为对照。
2.方法
取前述患者及其家系成员和300人对照的外周血(两个家庭的的父母未能取得血样)，提取DNA，使用实施例中的试剂盒对含有第11号染色体第33106691位碱基的DNA序列进行Sanger测序检测。
3.结果
两个家系共有23人，患有甲状腺乳头状癌共有4人；家系中患者均携带chr1133106691 G＞A突变，而未患病者均未携带chr11 33106691 G＞A突变，300名对照均未携带chr11 33106691 G＞A突变。
本实验例的结果说明chr11 33106691 G＞A突变是家族性甲状腺乳头状癌的一个致病突变。
实验例2chr11 33106691 G＞A突变致癌作用验证
1.实验对象
甲状腺正常细胞系(Nthy-ori 3-1)。
表达CSTF3突变基因(携带chr11 33106691 G＞A突变对应位点)的慢病毒(简称CSTF3突变慢病毒)，表达CSTF3野生型基因的慢病毒(简称CSTF3慢病毒)，表达GFP基因的慢病毒(简称GFP慢病毒)。
2.方法
将CSTF3突变慢病毒转染进甲状腺正常细胞系，验证癌症相关指标(癌基因：CDK4、CTSL2)表达情况。
3.结果
如图3所示，转染CSTF3突变慢病毒的细胞相比转染CSTF3慢病毒或GFP慢病毒的细胞，癌症指标基因表达上调明显。
结果表明，在CSTF3突变基因的作用下，甲状腺正常细胞会向癌细胞转化。这进一步表明了CSTF3突变与甲状腺乳头状癌相关。
综上，本发明阐明了CSTF3基因chr11 33106691 G＞A突变与甲状腺乳头状癌的相关性；使用本发明的试剂盒对人的组织进行检测，如果检测到所述突变，即可初步判断被检人群存在甲状腺乳头状癌的风险；本发明可用于甲状腺乳头状癌的辅助诊断，与其他甲状腺乳头状癌相关突变基因检测试剂或其他甲状腺乳头状癌检测手段配合，本发明的试剂盒可进一步提高检测的准确性。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川省三物科技有限公司
<120> 一种辅助筛查家族性甲状腺乳头状癌的试剂盒
<130> GYKH1363-2021P0112693CCZ
<150> 2020102159785
<151> 2020-03-24
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
agaggcacca atgacaatac 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
cccaacgagg attcagatg 19

Claims (3)

1.检测人类CSTF3基因突变位点chr11 33106691 G>A的试剂在制备甲状腺乳头状癌筛查试剂中的用途，其特征在于：所述试剂是测序用试剂、荧光定量PCR试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂；所述突变位点chr11 33106691 G>A表示第11号染色体第33106691碱基由G突变为A，碱基位点所依据的基因组版本是GRCh37。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述甲状腺乳头状癌筛查试剂还包括扩增含有基因组第11号染色体第33106691位碱基的序列的扩增试剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述扩增试剂包括序列如SEQ ID NO.1~2所示的引物。
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