KR20100122322A - 콜레라세균, 비브리오장염세균 및 비브리오패혈증세균의 유무 동시 탐지 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 우리나라에서 주요 식중독 세균으로 인식되고 있는 세 가지 비브리오 식중독세균인, 콜레라세균(Vibrio cholerae), 비브리오장염세균(Vibrio parahaemolyticus), 그리고 비브리오패혈증세균(Vibrio vulnificus)의 동시 탐지 방법에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명은 콜레라세균(Vibrio cholerae), 비브리오장염세균(Vibrio parahaemolyticus) 및 비브리오패혈증세균(Vibrio vulnificus)이 갖는, 각각의 병원성을 일으키는 데 관련된 독력인자 단백질을 코딩하는 DNA 염기서열 중 각 세균에 특이한 염기서열 부분에 상보적인 primer set를 한 튜브 내에서 동시에 반응시켜 DNA 효소중합연쇄반응(PCR)을 일으키고, 이를 agarose gel 상에서 관찰함으로써 이루어지는 것을 특징으로 한다.
콜레라세균(Vibrio cholerae), 비브리오장염세균(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오패혈증세균(Vibrio vulnificus), 독력인자 단백질 코딩 DNA, PCR(polymerase chain reaction, 효소중합연쇄반응), multiplex PCR
Description
본 발명은 우리나라에서 주요 식중독 세균으로 인식되고 있는 세 가지 비브리오 식중독세균인, 콜레라세균(Vibrio cholerae), 비브리오장염세균(Vibrio parahaemolyticus), 그리고 비브리오패혈증세균(Vibrio vulnificus)의 동시 탐지 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 PCR 기법을 활용하여 위 세 가지 비브리오 균의 존재 유무를 동시에 확인할 수 있는 다양한 프라이머 세트의 조합을 제공한다.
우리나라에서 주요한 식중독 세균으로 인식되는 3가지 비브리오, 즉, 콜레라세균(Vibrio cholerae), 비브리오장염세균(Vibrio parahaemolyticus), 그리고 비브리오패혈증세균(Vibrio vulnificus)에 대하여 그 존재 유무를 신속하고도 효율적으로 확인하는 탐지 방법이 요청된다.
탐색의 신속성과 경제적 견지에서, 위 세 가지 주요 세균을 동시에 탐지할 수 있다면 매우 바람직할 것이다.
본 발명은 상기한 배경에서 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 콜레라세균(Vibrio cholerae), 비브리오장염세균(Vibrio parahaemolyticus), 그리고 비브리오패혈증세균(Vibrio vulnificus)의 3가지 비브리오균이 갖는 병원성을 일으키는 데 관련된 독력인자 단백질을 코딩하는 DNA 염기서열 중 각 세균에 특이한 염기서열 부분에 상보적인 primer set를 이용, DNA 효소중합연쇄반응(PCR: polymerase chain reaction)을 시킴으로써 용이하게 세 가지 세균의 존재 유무를 동시에 확인할 수 있는 탐지 방법을 제공하는 데 있다.
상기한 목적을 갖는 본 발명의 콜레라세균(Vibrio cholerae), 비브리오장염세균(Vibrio parahaemolyticus) 및 비브리오패혈증세균(Vibrio vulnificus)의 세 가지 식중독세균의 유무 동시 탐지 방법은,
콜레라세균(Vibrio cholerae), 비브리오장염세균(Vibrio parahaemolyticus) 및 비브리오패혈증세균(Vibrio vulnificus) 각각의 병원성을 일으키는 데 관련된 독력인자 단백질을 코딩하는 DNA 염기서열 중 각 세균에 특이한 염기서열 부분에 상보적인 primer set를 한 튜브 내에서 동시에 반응시켜 DNA 효소중합연쇄반응(PCR)을 일으키고, 이를 agarose gel 상에서 관찰함으로써 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 위 경우에,
콜레라세균(Vibrio cholerae), 비브리오장염세균(Vibrio parahaemolyticus) 및 비브리오패혈증세균(Vibrio vulnificus)의 각각의 병원성을 일으키는 데 관련된 독력인자 단백질을 코딩하는 DNA 염기서열 중 각 세균에 특이한 염기서열 부분에 상보적인 primer set의 염기서열 조합은 각각 서열목록세트 1,2-7,8-13,14의 조합, 3,4-9,10-15,16의 조합, 5,6-11,12-17,18의 조합, 1,2-7,8-15,16의 조합, 1,2-9,10-15,16의 조합, 1,2-9,10-17,18의 조합, 3,4-7,8-13,14의 조합, 3,4-7,8-15,16의 조합, 3,4-9,10-17,18의 조합, 5,6-7,8-13,14의 조합, 5,6-7,8-15,16의 조합, 5,6-9,10-15,16의 조합, 5,6-9,10-17,18의 조합, 5,6-11,12-13,14의 조합 및 5,6-11,12-15,16의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
상기한 바와 같은 구성의 본 발명에 따르면, 우리나라에서 주요한 식중독 세균으로 인식되고 있는 3가지 비브리오를 효율적으로 확인할 수 있음은 물론, 세 가지 primer set를 한 튜브 내에서 반응시킴으로써, 한 번의 체크로 3가지 세균의 존재 유무를 동시에 확인하는 게 가능하게 된다.
특히 병원성을 일으키는 데 관련된 독력인자 단백질을 코딩하는 유전자들을 타겟으로 함으로써 세균을 신속하고도 정확하게 탐지할 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 각 종에 선택적으로 특이한 primer set의 디자인
GenBank database에 기탁된 V. vulnificus, V. parahaemolyticus, V. cholerae 세균의 genomic DNA를 탐색한 후, 각 비브리오 식중독세균들만 지니고 있는 특이적으로 존재하는 염기서열을 비교 분석하여 Vibrio vulnificus 증폭용 primer set인 toxR-F 및 toxR-R, vvhBA-F 및 vvhBA-R, vuuA-F 및 vuuA-R, Vibrio cholerae 증폭용 primer set인 nanH-F 및 nanH-R, zot-F 및 zot-R, hlyA-F 및 hlyA-R 그리고 Vibrio parahaemolyticus 증폭용 primer set인 scrB-F 및 scrB-R, scrA-F 및 scrA-R, vmrA-F 및 vmrA-R이라 명명한 primer set를 디자인하였다(표 1 및 표 2). 표 1의 18개의 프라이머를 서열목록 1 내지 18로 본 명세서에 첨부한다.
2. PCR의 특이성 조사
총 5종의 세균(Vibrio vulnificus MO6-24/O, Vibrio cholerae ATCC14035, Vibrio parahaemolyticus ATCC27519, Campylobacter jejuni NCTC12662, Yersinia enterocolitica NCCP12713)을 PCR의 template로 사용하기 위하여, 각 세균을 액체 배지에 배양한 후 cell을 freezing & Thawing 방법으로 lysis시켜서 PCR template로 준비한 다음(Campylobacter jejuni는 genomic DNA를 사용), 반응에 첨가하여 PCR을 수행하였다. 이때 사용된 PCR 반응 buffer의 조성, 반응온도, 시간 조건은 다음과 같다.
(A) PCR 반응 buffer 조성
10mM Tris-HCl, 40mM KCl, 1.5mM MgCl2 (pH9.0)
dNTP [각 0.25mM]
Taq DNA polymerase [1.0 Unit]
Forward primer [20 pmoles]
Reverse primer [20 pmoles]
Template DNA [~ 104 cells 또는 이에 해당되는 DNA]
(B) 반응온도 및 반응시간
I. 95OC for 5 min
II. 30 cycles [95OC for 1 min; 55OC for 1 min; 72OC for 30 sec]
III. 72OC for 10 min
PCR 결과물을 1.5% agarose gel에 loading 후 전기영동하여 ethidium bromide 용액으로 염색하여 UV 하에서 관찰한 결과, 도 1~3에서와 같이 각각의 V. vulnificus, V. parahaemolyticus, V. cholerae 세균의 특이적 DNA가 생성되었으나, 타 세균에서는 이러한 크기의 DNA가 생성되지 않은 것으로 나타났다. 이는 각 primer set가 V. vulnificus (그래프 1), V. cholerae (그래프 2), V. parahaemolyticus (그래프 3) 각각의 세균에만 특이적으로 반응함을 의미한다.
3. 3종의
Vibrio
에 대한 multiplex PCR set1, set2, set3
앞서 본 표 1, 2의 데이터와 그래프 1 내지 3의 결과에 따라, 3종의 비브리오를 동시에 탐지할 수 있는 프라이머 세트를 디자인할 수 있다. 이때 PCR 결과물인 bp의 길이가 비슷하게 되면 각 세균을 구별하여 식별하는 게 어려워지므로 그 길이를 달리하는 경우로 디자인하는 게 필요하다. 이러한 요인을 감안한 결과, 3종 비브리오를 동시 탐지하기 위해서는 다음과 같이 15가지의 프라이머 세트 조합이 바람직하다.
1. set-1: toxR 216bp, nanH 397bp, scrB 491bp(서열목록세트 1,2-7,8-13,14의 조합)
2. set-2: vvhBA 172bp, zot 487bp, scrA 345bp(서열목록세트 3,4-9,10-15,16의 조합)
3. set-3: vuuA 155bp, hlyA 216bp, vmrA 382bp(서열목록세트 5,6-11,12-17,18의 조합)
4. set-4 ; toxR 216bp, nanH 397bp, scrA 345bp(서열목록세트 1,2-7,8-15,16의 조합)
5. set-5 ; toxR 216bp, zot 487bp, scrA 345bp(서열목록세트 1,2-9,10-15,16의 조합)
6. set-6 ; toxR 216bp, zot 487bp, vmrA 382bp(서열목록세트 1,2-9,10-17,18의 조합)
7. set-7 ; vvhBA 172bp, nanH 397bp, scrB 491bp(서열목록세트 3,4-7,8-13,14의 조합)
8. set-8 ; vvhBA 172bp, nanH 397bp, scrA 345bp(서열목록세트 3,4-7,8-15,16의 조합)
9. set-9 ; vvhBA 172bp, zot 487bp, vmrA 382bp(서열목록세트 3,4-9,10-17,18의 조합)
10. set-10 ; vuuA 155bp, nanH 397bp, scrB 491bp(서열목록세트 5,6-7,8-13,14의 조합)
11. set-11 ; vuuA 155bp, nanH 397bp, scrA 345bp(서열목록세트 5,6-7,8-15,16의 조합)
12. set-12 ; vuuA 155bp, zot 487bp, scrA 345bp(서열목록세트 5,6-9,10-15,16의 조합)
13. set-13 ; vuuA 155bp, zot 487bp, vmrA 382bp(서열목록세트 5,6-9,10-17,18의 조합)
14. set-14 ; vuuA 155bp, hlyA 216bp, scrB 491bp(서열목록세트 5,6-11,12-13,14의 조합)
15. set-15 ; vuuA 155bp, hlyA 216bp, scrA 345bp(서열목록세트 5,6-11,12-15,16의 조합)
발명자들은 그중 표본으로서 1번부터 3번까지의 세트에 대해 시험을 수행하 였다.
먼저 microliter에 3가지 균주가 각각 104 CFU씩 존재하는 희석액을 준비하였다. 이 희석액을 freezing-and-thawing 방법으로 crude cell lysate를 만든 후, 3 microliter를 Vibrio 종 구분용 3가지 primer set를 포함하는 PCR 반응의 template로 사용하였다. 이 결과 그래프 4~6의 lane 2에서와 같이 3가지 Vibrio 종의 존재를 보여주는 3가지 크기의 DNA 밴드가 동시에 증폭되었다. 이는 1개의 PCR로서 V. vulnificus, V. cholerae, V. parahaemolyticus의 존재를 동시에 탐지할 수 있음을 의미한다.
- Multiplex PCR set-1: V. vulnificus 유래의 toxR 216bp, V. cholerae 유래의 nanH 397bp, 그리고 V. parahaemolyticus 유래의 scrB 491bp (그래프 4)
- Multiplex PCR set-2: V. vulnificus 유래의 vvhBA 172bp, V. cholerae 유래의 zot 487bp, 그리고 V. parahaemolyticus 유래의 scrA 345bp (그래프 5)
- Multiplex PCR set-3: V. vulnificus 유래의 vuuA 155bp, V. cholerae 유래의 hlyA 216bp, 그리고 V. parahaemolyticus 유래의 vmrA 382bp) (그래프 6)
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Claims (2)
- 콜레라세균(Vibrio cholerae), 비브리오장염세균(Vibrio parahaemolyticus) 및 비브리오패혈증세균(Vibrio vulnificus) 각각의 병원성을 일으키는 데 관련된 독력인자 단백질을 코딩하는 DNA 염기서열 중 각 세균에 특이한 염기서열 부분에 상보적인 primer set를 한 튜브 내에서 동시에 반응시켜 DNA 효소중합연쇄반응(PCR)을 일으키고, 이를 agarose gel 상에서 관찰함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는,콜레라세균(Vibrio cholerae), 비브리오장염세균(Vibrio parahaemolyticus) 및 비브리오패혈증세균(Vibrio vulnificus)의 세 가지 식중독세균의 유무 동시 탐지 방법.
- 제1항에 있어서,콜레라세균(Vibrio cholerae), 비브리오장염세균(Vibrio parahaemolyticus) 및 비브리오패혈증세균(Vibrio vulnificus) 각각의 병원성을 일으키는 데 관련된 독력인자 단백질을 코딩하는 DNA 염기서열 중 각 세균에 특이한 염기서열 부분에 상보적인 primer set의 염기서열 조합은 서열목록세트 1,2-7,8-13,14의 조합, 3,4-9,10-15,16의 조합, 5,6-11,12-17,18의 조합, 1,2-7,8-15,16의 조합, 1,2-9,10-15,16의 조합, 1,2-9,10-17,18의 조합, 3,4-7,8-13,14의 조합, 3,4-7,8-15,16의 조 합, 3,4-9,10-17,18의 조합, 5,6-7,8-13,14의 조합, 5,6-7,8-15,16의 조합, 5,6-9,10-15,16의 조합, 5,6-9,10-17,18의 조합, 5,6-11,12-13,14의 조합 및 5,6-11,12-15,16의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는,콜레라세균(Vibrio cholerae), 비브리오장염세균(Vibrio parahaemolyticus) 및 비브리오패혈증세균(Vibrio vulnificus)의 세 가지 식중독세균의 유무 동시 탐지 방법.
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| CN103255202A (zh) * | 2012-02-20 | 2013-08-21 | 南开大学 | 霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的三重pcr检测方法 |
| KR101954747B1 (ko) * | 2018-03-14 | 2019-03-06 | 부산대학교 산학협력단 | 다중 중합효소 연쇄반응을 이용한 비브리오 분지군 동시 검출용 조성물 |
| KR102232688B1 (ko) * | 2019-09-25 | 2021-03-30 | 주식회사 세니젠 | 콜레라균 검출용 바이오 마커 및 중합효소연쇄반응 키트 |
-
2009
- 2009-05-12 KR KR1020090041307A patent/KR101119695B1/ko not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103255202A (zh) * | 2012-02-20 | 2013-08-21 | 南开大学 | 霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的三重pcr检测方法 |
| KR101954747B1 (ko) * | 2018-03-14 | 2019-03-06 | 부산대학교 산학협력단 | 다중 중합효소 연쇄반응을 이용한 비브리오 분지군 동시 검출용 조성물 |
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| KR101119695B1 (ko) | 2012-03-12 |
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