CN102286465A - 一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪ifitm3基因及构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪
IFITM3
基因及构建方法和应用，其步骤
A
、猪
IFITM3
基因的合成：设计引物，提取猪的淋巴结组织
RNA
，进行
RT-PCR
扩增
sIFITM3
基因，扩增，利用
pCA-sIFITM3
转染
BHK-21
细胞，通过共聚焦显微镜观察该蛋白表达于细胞膜；
B
、表达
sIFITM3
基因的慢病毒的构建以及纯化；
C
、稳定表达
sIFITM3
基因的
BHK21-sIFITM3eGFP
细胞系的构建：构建稳定表达
sIFITM3
的
BHK-21
细胞系，利用
Lentivirus-sIFITM3eGFP
和
LentiviruseGFP
分别转导
BHK-21
细胞，通过绿荧光进行克隆筛选，通过
RT-PCR
和
Westernblotting
鉴定
sIFITM3
的表达，为
BHK21-sIFITM3eGFP
。该基因、细胞系
BHK21-sIFITM3eGFP
、慢病毒
Lentivirus-sIFITM3
和真核质粒
pCA-sIFITM3
在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用。构建的
BHK21-sIFITM3eGFP
细胞系能稳定表达
sIFITM3
蛋白、
BHK21-sIFITM3eGFP
能够抑制口蹄疫病毒复制、携带
sIFITM3
基因的慢病毒
lentivirus-sIFITM3
和真核质粒
pCA-sIFITM3
在机体水平能够抑制口蹄疫病毒复制。
Description
技术领域
本发明涉及病毒学和抗病育种领域。更具体涉及一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因(interferoninduced transmembrane 3，IFITM3)，同时还涉及一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因的构建方法，还涉及一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因在口蹄疫抗病育种中的应用。
背景技术
我国是世界养猪第一大国。养猪业是我国畜牧业的主导产业，猪肉占肉类的67.7％，是我国人民动物蛋白质的最主要来源。传染病严重危害人类和动物的健康。全球每年有1500万人死于传染病，我国每年有1160万头猪、45.3万头牛和5.3亿只禽发病，直接损失近400亿元。病毒性传染病在人和动物传染病中扮演着重要的作用，近年来新发传染病绝大部分是由病毒引起的，一旦发病，一般无特效药物治疗，因而其危害也是越来越严重。猪病严重制约着我国养猪业发展。近年来，口蹄疫、猪繁殖与呼吸道综合征等重大疾病频频爆发，对我国养猪业造成巨大损失。
口蹄疫(Foot and Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)引起多种偶蹄动物共患的急性、热性、高度接触性的传染病。FMDV属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，有7个血清型，各个血清型间无交叉反应。FMDV基因组为具有感染性的单股正链RNA病毒，大小约8.5kb，只有一个开放的读码框(open reading frame，ORF)，两侧各有一个非编码区(noncoding region，NCR)。开放读码框首先翻译为一个多聚蛋白，经过蛋白酶切割为成熟的结构和非结构蛋白以及一些中间体(Grubman MJ andBaxt B，2004)。另外，FMDV以“准种”形式存在，基因组RNA没有单一准确的核酸序列，呈现类群分布，这种特性使得RNA病毒在病毒变异和适应性方面具有极大的潜能，加上不同血清型之间无交叉保护、病毒传播快等特点给口蹄疫的预防和控制带来了极大的困难(Martinez etal.，1992；Domingo E，et al.，2005(a)，(b))。
口蹄疫传播途径多，传播速度快，感染动物通过气体中的悬浮微粒快速传播FMDV给其它的动物，造成畜牧业生产的巨大经济损失，通常给该国畜牧经济以毁灭性打击(P.W.Mason，et al.，2003；Alexandersen S，et al.，2003；M.J. Grubman and B.Baxt，2004)。一个国家或地区一旦发现有口蹄疫，其有关动物及其产品贸易受阻，感染及接触动物将被屠杀等(Pereira HG，1981)。1994、1996、2000年希腊，1992年阿尔巴尼亚，1997年我国台湾省以及2001年英国等爆发的口蹄疫均给畜牧经济致命性打击。我国的口蹄疫疫情非常严重。据统计资料表明，1999-2003年期间，我国发病动物总数达890616头(只)，遍及31个省、市、自治区，疫情暴发次数1129个，疫点数2375个。2003年4月份以后，O型口蹄疫出现了我国罕见的基因型毒株，泛亚毒株又卷土重来。青海和新疆分别发现了A型和Asia I型口蹄疫。新疆O型和Asia I型口蹄疫同时流行，在病畜中还发现O型和Asia I型混合感染。据世界动物卫生组织(OIE)报道，2009年至今我国及其周边国家或地区多处出现口蹄疫疫情，损失惨，2009-2010年猪O型口蹄疫耿马毒在我国养猪场大面积的流行(http://web.oie.int/wahis/public.php)。
病毒感染机体后，宿主启动一些因子来抵御病毒感染。I型干扰素在病毒感染天然免疫中发挥重要的作用(Randall RE.2008)。病毒感染后细胞释放干扰素进而激活细胞信号通路，诱导大量干扰素刺激基因(interferon stimulated genes，ISGs)表达，通过各种机制减弱病毒复制发挥抗病毒作用，如使干扰素信号放大、产生细胞因子激活获得型免疫或直接抑制病毒增值。目前研究表明，口蹄疫病毒对I型和II型干扰素非常敏感，干扰素处理的细胞能够很好的抑制口蹄疫病毒的增殖，因而激活干扰素信号通路的宿主信号分子具有抗口蹄疫病毒复制的潜力(Chinsangaram，J.，et al.，2001；Moraes，M.P.，et al.，2007；Diaz-San SegundoF.et al.，2010；Dias CC.，et al.，2011)。干扰素诱导跨膜基因(interferon induced transmembrane，IFITM)属于ISGs中一类较小的分子，包括5个序列相关高度保守的基因：IFITM 1～3，IFITM5和IFITM6，编码细胞表面蛋白，该类蛋白较短、含有两个跨膜区域，保守核心区和差异较大N端和C端(Martensen et al.，2004；Fredy Siegrist et al.，2011)。除IFITM 5为诱导型转录外，其它的IFITM在多种组织中广泛转录。干扰素诱导跨膜蛋白(IFITMs)参与早期发育、细胞间黏着、细胞分化和抑制细胞生长等功能(Saitou M et al.，2002)。最新研究表明，机体被病毒和细菌等病原感染后导致IFITM激活，在宿主免疫防御反应方面具有一定的功能，并且参与天然免疫相关的生物过程(Siegrist F，et al.，2011)。其中IFITM3是最具有潜力的抑制病毒复制的宿主限制因子，具有潜在的抗口蹄疫病毒复制的能力(Brass et al.，2009；Jiang et al.，2010)。
动物病毒性疫病的预防传统上主要通过疫苗的免疫预防接种，在动物疫病预防与控制中发挥着极其重要的作用。由于口蹄疫病毒各亚型之间无明显的交叉保护，增加了疫情的复杂性和控制难度，使防疫工作面临很大困难。近年来随着转基因等生物技术的快速发展，动物的分子抗病育种得到长足的进步，可以从源头上控制疫病尤其是病毒性疾病的发生。分子抗病育种是控制疾病有效的策略之一，如将疫苗免疫和分子抗病育种结合在一起必将有助于动物疫病的控制。以IFITM3蛋白为研究对象，利用过表达IFITM3蛋白的细胞系和表达IFITM3的慢病毒免疫乳鼠来评价IFITM3对口蹄疫病毒增值的影响，为口蹄疫病毒的抗病毒育种提供优良的候选基因奠定基础。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪干扰素诱导跨膜3基因(interferon inducedtransmembrane 3，IFITM3)，该基因属于干扰素刺激基因中一类小分子，具有抑制病毒复制的能力。
本发明的另一个目的是在于提供了一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因的制备方法，将IFITM3基因分别亚克隆入真核载体pCA和慢病毒转移载体pLentiV7.3/V5-TOPO，直接转染细胞获得慢病毒或直接注射小鼠后便可评价其抗病毒能力。
本发明的另一个目的是在于提供了一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因的细胞系BHK21-sIFITM3eGFP在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用。在BHK-21细胞上过表达猪IFITM3，通过细胞病变程度可以直接评价该蛋白抗病毒活性。
本发明的另有一个目的是在于提供了一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因的慢病毒Lentivirus-sIFITM3在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用。慢病毒可以有效的将外源基因IFITM3整合到宿主体内分化和非分化细胞中进行稳定表达，发挥更佳的抗病毒活性，也是制备转基因动物的优良载体。
本发明的还有一个目的是在于提供了一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因的真核质粒pCA-sIFITM3在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用。该载体可以直接转染细胞或注射动物或显微注射动物胚胎，来评价其抗病毒活性或构建转基因动物。
本发明的还有一个目的是在于提供了猪IFITM3基因可以用来构建转基因猪等转基因动物，为抗病育种研究提供良好素材。
为了实现上的目的，本发明采用以下技术措施：
一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因(sIFITM3)的制备方法，其步骤是：
1、猪IFITM3基因(sIFITM3)的合成：
参照GenBank人和小鼠IFITM3基因序列，与猪的EST序列进行比对，选择同源性最高的序列作为靶序列，设计一对引物，提取猪的淋巴结组织RNA，进行RT-PCR扩增sIFITM3基因，其引物序列如下：
sIFITM 3F：5’-tttgaattccaccatgaactgcgct-3’
sIFITM 3R：5’-tttctcgagtcagatcatcgga-3’
利用两步法进行扩增，首先反转录得到cDNA，进而以此为模板进行PCR扩增，其反应体系为：模板质粒0.25μL，10×LAbuffer 5μL，pTRIM25F、pTRIM25R引物各1.0μL(终浓度为10pmol/L)，LA酶0.25μL，dNTPS 1.0μL，加ddH2O至50μL。按94℃作用3分钟；然后94℃作用30秒分钟，58℃退火30秒，72℃延伸3分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟的反应条件在PCR仪上进行扩增，扩增的PCR产物经0.8％(g/v)的琼脂糖凝胶电泳分析，一条大小438bp片段。
将获得基因片段其克隆入T载体进行测序，上传GenBank，其登录号为：HQ641403.1。并与人源、鼠源以及牛源干扰素诱导跨膜蛋白基因3进行比较，发现与牛源基因同源性较高，处于同一个分支，其次是人源基因。
通过XbaI和XhoI将sIFITM3亚克隆于的真核表达载体pCA(Invitrogen，Amp+，4713bp)中，获得载体pCA-sIFITM3，大小为5151bp，转化大肠杆菌DH-5α，置-80℃保存。利用pCA-sIFITM3转染BHK-21细胞，通过共聚焦显微镜观察该蛋白表达于细胞膜(详见图1)。
2、表达sIFITM3基因的慢病毒的构建以及纯化：
sIFITM3基因在哺乳动物细胞中高效表达是成功研究抗病毒活性的关键。由于慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，在细胞机体细胞上持久稳定地表达，为此利用ViraPowerTM HiPerformTM Lentiviral Expression Systems(InvitrogenTM)来建立携带sIFITM3基因的慢病毒。为了获得表达sIFITM3的慢病毒Lentivirus，首先通过Xba I和Xho I酶将sIFITM3亚克隆入慢病毒转移载体pLentiV7.3/V5-TOPO相应位点，构建质粒pLV7.3-sIFITM3。为了便于构建稳定表达sIFITM3的细胞系，通过Xho I和XmaI将绿荧光蛋白基因eGFP置于sIFITM3的下游进行，构建质粒pLV7.3-sIFITM3eGFP。然后与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG，通过脂质体法Lipofectamine 2000(Invitrogen)共转染293ft细胞。由于存在VSVG，转染后48h可以通过显微镜观察到典型的细胞融合特征。72h后收集上清，同时补加生长液，12h后再次收集上清液，获得HIV假型病毒，命名为Lentivirus-sIFITM3eGFP。用同样的方法将eGFP亚克隆于pLentiV7.3/V5-TOPO获得转移质粒pLV7.3-eGFP与包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293ft细胞获得慢病毒Lentivirus-eGFP，作为对照。
将收集的上清液2000rpm/min离心5分钟，通过0.45μm的滤膜，过滤之后进行超速离心，具体方法参照Gustavo Tiscornia等(Gustavo Tiscornia，Oded Singer&Inder M Verma，natyre protocols，2006)，获得纯化的慢病毒Lentivirus-sIFITM3eGFP和Lentivirus-eGFP。
按照ViraPowerTM HiPerformTM Lentiviral Expression Systems(InvitrogenTM)说明书，将纯化的病毒转导BHK-21细胞，通过流流式细胞仪计算测定效价。
3、稳定表达sIFITM3基因的BHK21-sIFITM3eGFP细胞系的构建：
为了构建稳定表达sIFITM3的BHK-21(Baby hamster kidney，ATCC CCL10)细胞系，利用Lentivirus-sIFITM3eGFP和LentiviruseGFP分别转导BHK-21细胞，通过绿荧光进行初步克隆筛选(如图2B)，进而通过RT-PCR和Westernblotting鉴定sIFITM3的表达，并命名为BHK21-sIFITM3eGFP。
①慢病毒Lentivirus-sIFITM3eGFP转导BHK-21细胞：
长满单层，形态良好的BHK-21细胞，通过胰酶消化进行传代，胎盘蓝染色进行细胞计数，调整细胞量为1×106个/ml。取100μl上述细胞(105个细胞)、1μl 5μg/ml的polybrene、500μl没有超离纯化的慢病毒(Lentivirus-sIFITM3eGFP和Lentivirus-eGFP)和500μl无抗生素的DMEM与1.5ml离心管中，轻轻混匀，与37℃孵育1h，期间每隔15分钟轻轻混匀2～3次。随后500μl/孔接种于24孔板培养，次日吸弃上清，另补加1ml生长液继续培养。通过荧光显微镜观察绿荧光，进行克隆筛选。
②RT-PCR扩增BHK21-sIFITM3eGFP细胞中sIFITM3基因：
收集BHK-eGFP和BHK21-sIFITM3eGFP细胞，提取细胞总RNA，进行RT-PCR检测sIFITM3，其反应条件同上基因扩增。结果在BHK21-sIFITM3eGFP中可以扩增438bp的sIFITM3片段，而正常BHK-eGFP细胞阴性，表明BHK21-sIFITM3eGFP细胞株中有sIFITM3基因(如图2C)。
③Western blotting鉴定外源基因sIFITM3的表达：
收集长满单层BHK-eGFP和BHK-TRIM25eGFP细胞，提取蛋白，进行SDS-PAGE和Western blotting检测。所用一抗为兔抗sIFITM3多抗(实验室制备，首先构建原核表达载体pET-28a-sIFITM3，进行原核表达。表达蛋白通过多次免疫家兔获得多克隆抗兔抗体，本领域的普通技术人员均可制备)，二抗是HRP标记的鼠抗兔单克隆抗体。结果在BHK21-sIFITM3eGFP细胞中有20KD的特异性阳性带，与sIFITM3蛋白大小相符，而正常BHK-eGFP细胞阴性，表明BHK21-sIFITM3eGFP细胞株中sIFITM3有效表达(如图2D)。通过制备获得了该基因，该基因公布在Genbank(HQ641403.1)上。
一种抑制口蹄疫病毒增殖的细胞系BHK21-sIFITM3eGFP、慢病毒Lentivirus-sIFITM3和真核质粒pCA-sIFITM3在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用，其步骤是：
1、一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因的细胞系BHK21-sIFITM3eGFP在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用，其步骤是：
①空斑试验：为了初步观察sIFITM3蛋白对FMDV增殖的影响，将相同数量BHK21-sIFITM3eGFP和BHK-21细胞接种入6孔板，待细胞长势90％左右进行空斑试验，观察sIFITM3蛋白对病毒产生噬斑能力的影响。结果表明，BHK21-sIFITM3eGFP细胞上噬斑数为19-39个，并且噬斑为分开可数的；同样剂量的病毒感染的BHK-eGFP细胞中噬斑数很多，很多病毒噬斑连在一起，无法计算噬斑数。表明FMDV在BHK-eGFP细胞中得到大量的增殖，可见BHK21-sIFITM3eGFP细胞中表达的sIFITM3蛋白显著抑制FMDV的增殖，呈现出良好的抗病毒活性(如图3)。
②病毒滴度的测定：为了量化sIFITM3蛋白对FMDV的抑制效果，将BHK-eGFP和BHK-sIFITM3-eGFP细胞分别接种96孔细胞培养板，0.8×104cells/well，次日用0.01MOI O型口蹄疫病毒进行病毒感染。分别在感染后不同时间点观察病毒感染细胞所致细胞病变效应并收集上清测定病毒感染后不同时间点6h，12h，18h，24h，30h，36h样品中FMDV的滴度。
在显微镜下观察病毒致细胞病变效应(CPE)，感染后6h可以发现BHK-eGFP细胞中有明显的细胞变圆，而BHK-sIFITM3-eGFP细胞长势良好，直到感染后36h BHK-sIFITM3-eGFP细胞才有的典型CPE。感染后不同时间点的上清液，按Reed-Muench法测定病毒半数组织细胞感染剂量(TCID50)。结果表明感染BHK-sIFITM3-eGFP细胞组病毒含量一直低于BHK-eGFP细胞感染组，滴度低102～102.5倍，表明sIFITM3能显著抑制FMDV的增殖(如图4)。
2、一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因的慢病毒Lentivirus-sIFITM3在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用，其步骤是：
为了评价sIFITM3蛋白抑制口蹄疫病毒增殖活性，进而在动物机体上观察其抑制病毒增值情况。选取FMDV敏感的1～2日龄乳鼠，设4组，每组10只乳鼠。利用慢病毒Lentivirus系统来免疫乳鼠。首先通过肌肉注射相同剂量的纯化的3×107TU/ml Lentivirus-sIFITM3(50μl/只)和Lentivirus(对照组)，48小时后分别用5MLD50和20MLD50的FMDV进行攻毒。攻毒后观察乳鼠的死亡情况，连续观察8天。
结果显示sIFITM3蛋白对5MLD50保护率为90％，对照组为40％(如图5A所示)；sIFITM3蛋白对20MLD50保护率为50％，对照组为20％(如图5B所示)。结果表明在机体水平上sIFITM3蛋白能有效是抑制FMDV复制感染，使机体抵御FMDV的感染。
3、一种抑制口蹄疫病毒增殖的真核质粒pCA-sIFITM3在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用，其步骤是：
为了进一步评价sIFITM3蛋白抑制口蹄疫病毒增殖活性，进而利用真核质粒pCA系统来免疫乳鼠，在动物机体上观察其抑制病毒增值情况。选取FMDV敏感的1～2日龄乳鼠，设4组，每组10只乳鼠。在用5MLD50或20MLD50的FMDV进行攻毒前48小时，用5.0μg pCA-sIFITM3和pCA分别肌肉注射乳鼠，攻毒后观察乳鼠的死亡情况，连续观察8天。
结果显示sIFITM3蛋白对5MLD50保护率为100％，对照组为40％(如图6A所示)；sIFITM3蛋白对20MLD50保护率为60％，对照组为10％(如图6B所示)。结果再次表明在机体水平上sIFITM3蛋白能有效是抑制FMDV复制感染，使机体抵御FMDV的感染。
4、一种抑制口蹄疫病毒增殖的sIFITM3基因在转基因猪等转基因动物中的应用，其应用过程是：
为了评价sIFITM3基因具有潜在的育种价值，在机体水平研究sIFITM3基因的抗病毒活性。利用AccI和HindIII酶切真核质粒pCA-sIFITM3，回收含有启动子、sIFITM3和polyA的2606bp片段于转基因专用TE中，终浓度为2μg/ml。然后通过常规的方法进行显微注射(于政权。转基因小鼠乳腺表达具有抗菌活性重组溶菌酶的研究，中国农业大学，博士学位论文)进行转基因小鼠/猪的研究。获得的小鼠提取其尾部DNA，用sIFITM 3F(5’-tttgaattccaccatgaactgcgct-3’)和sIFITM 3R(5’-tttctcgagtcagatcatcgga-3’)进行PCR扩增，在115个F0代转基因小鼠中2和8号小鼠是阳性，能够扩出438bp的目的带。图7为转基因小鼠第一代DNA检测结果。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1.本发明所构建的BHK21-sIFITM3eGFP细胞系能稳定表达sIFITM3蛋白。
2.本发明稳定表达sIFITM3基因的细胞系BHK21-sIFITM3eGFP能够抑制口蹄疫病毒复制。
3.本发明携带sIFITM3基因的慢病毒lentivirus-sIFITM3和真核质粒pCA-sIFITM3在机体水平能够抑制口蹄疫病毒复制。
4.本发明的sIFITM3基因可以用来构建转基因小鼠和转基因猪等转基因动物。
附图说明
图1为一种显示了猪干扰素转膜蛋白3(sIFITM3)的克隆与分析示意图。
通过RT-PCR扩增猪的IFITM3基因，测序结果表明全长为438bp，具有两个跨膜区(a)。与其它物种IFITM3进行系统进化分析发现，与牛的IFITM3亲缘关系最近(b)。转染细胞后通过共聚焦显微镜显示，该蛋白表达与细胞膜中(c)。
图2为一显示了sIFITM3基因在BHK21细胞中稳定表达细胞株构建策略及蛋白表达鉴定；
其中A图是将sIFITM3和绿荧光蛋白eGFP基因克隆入慢病毒载体pLentiV7.3/V5-TOPO获得转移载体pLV7.3-sIFITM3的策略图。转移载体pLV7.3-sIFITM3eGFP与包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转293ft细胞，获得慢病毒Lentivirus-sIFITM3eGFP，进而转导BHK-21细胞后获得稳定表达sIFITM3的细胞株(B)。是分别通过RT-PCR(C)和Western-blotting对细胞株进行鉴定(D)。
图3为一显示稳定表达sIFITM3基因细胞系抑制口蹄疫病毒增殖的空斑试验图谱；
分别以25MOI的O型FMDV接种BHK21-sIFITM3eGFP和BHK21-eGFP细胞，72h后利用结晶紫染色，噬斑数显示sIFITM3对口蹄疫病毒增殖具有明显的抑制作用。A-C为BHK21-eGFP细胞中噬斑，D-G为BHK21-sIFITM3eGFP细胞上噬斑。
图4为一是sIFITM3基因抑制口蹄疫病毒滴度测定效果图；
将BHK-eGFP和BHK-sIFITM3-eGFP细胞分别接种96孔细胞培养板，0.8×104cells/well。次日用0.01MOI O型口蹄疫病毒进行病毒感染，分别于感染后不同时间点(6h，12h，18h，24h，30h，36h)取样测定病毒含量即TCID50，。结果统计表明病毒感染后不同时间点，在两种细胞中TCID50均存在明显差异，其1g值差异达2～2.5，sIFITM3抑制效果达100倍，能显著抑制FMDV的增殖。
图5为一显示在机体水平利用慢病毒Lentivirus-sIFITM3eGFP注射小鼠抑制口蹄疫病毒效果图。
利用慢病毒Lentivirus-sIFITM3eGFP免疫注射乳鼠，在机体上直接评价sIFITM3抗口蹄疫病毒的能力。结果表明在小鼠机体水平，sIFITM3能显著抑制FMDV的增殖。
图6为一显示在机体水平利用真核质粒pCA-sIFITM3注射小鼠抑制口蹄疫病毒效果图。
利用真核质粒pCA-sIFITM3分别来免疫注射乳鼠，在机体上直接评价sIFITM3抗口蹄疫病毒的能力。结果表明在小鼠机体水平，sIFITM3能显著抑制FMDV的增殖。
图7为一为sIFITM3基因转基因小鼠的PCR检测图
利用真核质粒pCA-sIFITM3进行显微注射制备转基因小鼠的研究。该图显示F0代转基因小鼠样品的DNA检测结果，表明2号和8号为阳性样品。
具体实施方式
实施例1：一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因的制备方法，其步骤是：
1、猪IFITM3基因(sIFITM3)的克隆与真核载体pCA-sIFITM3的构建
参照GenBank人和小鼠IFITM基因序列，与猪的EST序列进行比对，选择同源性最高的序列作为靶序列，设计一对引物，提取猪的淋巴结组织RNA，进行RT-PCR扩增sIFITM3基因，其引物序列如下：
sIFITM 3F：5’-tttgaattccaccatgaactgcgct-3’
sIFITM 3R：5’-tttctcgagtcagatcatcgga-3’
利用两步法进行扩增，首先反转录得到cDNA，进而以此为模板进行PCR扩增，其反应体系为：模板质粒0.25μL，10×LAbuffer 5μL，pTRIM25F、pTRIM25R引物各1.0μL(终浓度为10pmol/L)，LA酶0.25μL，dNTPS 1.0μL，加ddH2O至50μL。按94℃作用3分钟；然后94℃作用30秒分钟，58℃退火30秒，72℃延伸3分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟的反应条件在PCR仪上进行扩增，扩增的PCR产物经0.8％(g/v)的琼脂糖凝胶电泳分析，一条大小438bp片段。
将获得基因片段其克隆入T载体进行测序(SEQ ID NO：1)，并与人源、鼠源以及牛源干扰素诱导跨膜蛋白基因3进行比较，发现与牛源基因同源性较高，处于同一个分支，其次是人源基因。
通过XbaI和XhoI将sIFITM3亚克隆于的真核表达载体pCA(Invitrogen，Amp+)中，获得载体pCA-sIFITM3，转化大肠杆菌DH-5α，置-80℃保存。通过脂质体法将pCA-sIFITM3转染BHK-21细胞，共聚焦显微镜观察该蛋白表达于细胞膜(详见图1)。
2、表达sIFITM3基因的慢病毒的构建以及纯化
sIFITM3基因在哺乳动物细胞中高效表达是成功研究抗病毒活性的关键。由于慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，在细胞机体细胞上持久稳定地表达，为此利用ViraPowerTM HiPerformTM Lentiviral Expression Systems(InvitrogenTM)来建立携带sIFITM3基因的慢病毒。为了获得表达sIFITM3的慢病毒Lentivirus，首先将通过Not I和Xho I酶将sIFITM3亚克隆入慢病毒转移载体pLentiV7.3/V5-TOPO相应位点，构建质粒pLV7.3-sIFITM3，转化于大肠杆菌DH-10α，置-80℃保存。通过脂质体法Lipofectamine 2000(Invitrogen)将pLV7.3-sIFITM3与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293ft细胞(InvitrogenTM)。由于存在VSVG，转染后48h可以通过显微镜观察到典型的细胞融合特征。72h后收集上清，同时补加生长液，12h后再次收集上清液，获得HIV假型病毒，命名为Lentivirus-sIFITM3。用同样的方法将pLentiV7.3/V5-TOPO与包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293ft细胞获得慢病毒Lentivirus，作为对照。
将收集的上清液2000rpm/min离心5分钟，通过0.45μm的滤膜，过滤之后进行超速离心，具体方法参照Gustavo Tiscornia等(Gustavo Tiscornia，Oded Singer&Inder M Verma，natyre protocols，2006)，获得纯化的慢病毒Lentivirus-sIFITM3和Lentivirus。
按照ViraPowerTM HiPerformTM Lentiviral Expression Systems(InvitrogenTM)说明书，将纯化的病毒转导BHK-21细胞，通过流流式细胞仪计算测定效价。
3、稳定表达sIFITM3基因的BHK21-sIFITM3eGFP细胞系的构建
为了构建稳定表达sIFITM3的BHK-21细胞系(Baby Hamster Kidney，CCTC)，利用Lentivirus-sIFITM3和Lentivirus分别转导BHK-21细胞，通过绿荧光进行初步克隆筛选(如图2B)，进而通过RT-PCR和Westernblotting鉴定表达sIFITM3细胞系。
A、慢病毒转导BHK-21细胞
长满单层，形态良好的BHK-21细胞，通过胰酶消化进行传代，胎盘蓝染色进行细胞计数，调整细胞量为1×106个/ml。取100μl上述细胞(105个细胞)、1μl 5μg/ml的polybrene、500μl没有超离纯化的慢病毒(Lentivirus-sIFITM3和Lentivirus)和500μl无抗生素的DMEM与1.5ml离心管中，轻轻混匀，与37℃孵育1h，期间每隔15分钟轻轻混匀2～3次。随后500μl/孔接种于24孔板培养，次日吸弃上清，另补加1ml生长液继续培养。通过荧光显微镜观察绿荧光，进行克隆筛选。
B、RT-PCR扩增BHK21-sIFITM3eGFP细胞中sIFITM3基因
收集BHK-eGFP和BHK21-sIFITM3eGFP细胞，提取细胞总RNA，进行RT-PCR检测sIFITM3，其反应条件同上基因扩增。结果在BHK21-sIFITM3eGFP中可以扩增438bp的sIFITM3片段，而正常BHK-21细胞阴性，表明BHK21-sIFITM3eGFP细胞株中有sIFITM3基因(如图2C)。
C、Western blotting鉴定外源基因sIFITM3的表达
收集长满单层BHK-eGFP和BHK-TRIM25-eGFP细胞，提取蛋白，进行SDS-PAGE和Western blotting检测。所用一抗为兔抗sIFITM3多抗(实验室制备，首先构建原核表达载体pET-28a-sIFITM3，进行原核表达。表达蛋白通过多次免疫家兔获得多克隆抗兔抗体。)，二抗为HRP标记的鼠抗兔单克隆抗体。结果在BHK21-sIFITM3eGFP细胞中有20KD的特异性阳性带，与sIFITM3蛋白大小相符，而正常BHK-eGFP细胞阴性，表明BHK21-sIFITM3eGFP细胞株中sIFITM3有效表达(如图2D)。
实施例2：一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因、细胞系BHK21-sIFITM3eGFP、慢病毒Lentivirus-sIFITM3和真核质粒pCA-sIFITM3在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用。(这五种都是相同的应用过程吗？如果相同则可以写在同一实施例中进行描述，如果应用不同，则分别对应用进行描述？
1、一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因的细胞系BHK21-sIFITM3eGFP在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用，其步骤是：
①空斑试验：为了初步观察sIFITM3蛋白对FMDV增殖的影响，将相同数量BHK21-sIFITM3eGFP和BHK-21细胞接种入6孔板，待细胞长势90％左右进行空斑试验，观察sIFITM3蛋白对病毒产生噬斑能力的影响。结果表明，BHK21-sIFITM3eGFP细胞上噬斑数为19-39个，并且噬斑为分开可数的；同样剂量的病毒感染的BHK-eGFP细胞中噬斑数很多，很多病毒噬斑连在一起，无法计算噬斑数。表明FMDV在BHK-eGFP细胞中得到大量的增殖，可见BHK21-sIFITM3eGFP细胞中表达的sIFITM3蛋白显著抑制FMDV的增殖，呈现出良好的抗病毒活性(如图3)。
②病毒滴度的测定：为了量化sIFITM3蛋白对FMDV的抑制效果，将BHK-eGFP和BHK-sIFITM3-eGFP细胞分别接种96孔细胞培养板，0.8×104cells/well，次日用0.01MOI O型口蹄疫病毒进行病毒感染。分别在感染后不同时间点观察病毒感染细胞所致细胞病变效应并收集上清测定病毒感染后不同时间点(6h，12h，18h，24h，30h，36h)样品中FMDV的滴度。
在显微镜下观察病毒致细胞病变效应(CPE)，感染后6h可以发现BHK-eGFP细胞中有明显的细胞变圆，而BHK-sIFITM3-eGFP细胞长势良好，直到感染后36h BHK-sIFITM3-eGFP细胞才有的典型CPE。感染后不同时间点的上清液，按Reed-Muench法测定病毒半数组织细胞感染剂量(TCID50)。结果表明感染BHK-sIFITM3-eGFP细胞组病毒含量一直低于BHK-eGFP细胞感染组，滴度低102～102.5倍，表明sIFITM3能显著抑制FMDV的增殖(如图4)。
2、一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因的慢病毒Lentivirus-sIFITM3在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用，其步骤是：
为了评价sIFITM3蛋白抑制口蹄疫病毒增殖活性，进而在动物机体上观察其抑制病毒增值情况。选取FMDV敏感的1～2日龄乳鼠，设4组，每组10只乳鼠。利用慢病毒Lentivirus系统来免疫乳鼠。首先通过肌肉注射相同剂量的纯化的3×107TU/ml Lentivirus-sIFITM3(50μl/只)和Lentivirus(对照组)，48小时后分别用5MLD50和20MLD50的FMDV进行攻毒。攻毒后观察乳鼠的死亡情况，连续观察8天。
结果显示sIFITM3蛋白对5MLD50保护率为90％，对照组为40％(如图5A所示)；sIFITM3蛋白对20MLD50保护率为50％，对照组为20％(如图5B所示)。结果表明在机体水平上sIFITM3蛋白能有效是抑制FMDV复制感染，使机体抵御FMDV的感染。
3、一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因的真核质粒pCA-sIFITM3在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用，其步骤是：
为了进一步评价sIFITM3蛋白抑制口蹄疫病毒增殖活性，进而利用真核质粒pCA系统来免疫乳鼠，在动物机体上观察其抑制病毒增值情况。选取FMDV敏感的1～2日龄乳鼠，设4组，每组10只乳鼠。在用5MLD50或20MLD50的FMDV进行攻毒前48小时，用5.0μgpCA-sIFITM3和pCA分别肌肉注射乳鼠，攻毒后观察乳鼠的死亡情况，连续观察8天。
结果显示sIFITM3蛋白对5MLD50保护率为100％，对照组为40％(如图6A所示)；sIFITM3蛋白对20MLD50保护率为60％，对照组为10％(如图6B所示)。结果再次表明在机体水平上sIFITM3蛋白能有效是抑制FMDV复制感染，使机体抵御FMDV的感染。
实施例3：一种抑制口蹄疫病毒增殖的sIFITM3基因在转基因猪等转基因动物中的应用，其应用过程是：
为了评价sIFITM3基因具有潜在的育种价值，在机体水平研究sIFITM3基因的抗病毒活性。利用AccI和HindIII酶切真核质粒pCA-sIFITM3，回收含有启动子、sIFITM3和polyA的2606bp片段于转基因专用TE中，终浓度为2μg/ml。然后通过常规的方法进行显微注射(于政权。转基因小鼠乳腺表达具有抗菌活性重组溶菌酶的研究，中国农业大学，博士学位论文)进行转基因小鼠/猪的研究。获得的小鼠提取其尾部DNA，用sIFITM 3F(5’-tttgaattccaccatgaactgcgct-3’)和sIFITM 3R(5’-tttctcgagtcagatcatcgga-3’)进行PCR扩增，在115个F0代转基因小鼠中2和8号小鼠是阳性，能够扩出438bp的目的带。图7为转基因小鼠第一代DNA检测结果。
尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明范围内。
Claims (5)
1.一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因的制备方法，其步骤是
A、猪IFITM3基因的合成：设计引物，提取猪的淋巴结组织RNA，进行RT-PCR扩增sIFITM3基因，其引物序列如下：sIFITM 3F： 5’-tttgaattccaccatgaactgcgct -3’；sIFITM 3R： 5’-tttctcgagtcagatcatcgga -3’；利用两步法进行扩增，首先反转录得到cDNA，模板进行PCR扩增，其反应体系为：模板质粒0.25μL，1 0×LA buffer 5μL，pTRIM25F、pTRIM25R引物各1.0μL，LA 酶 0.25μL，dNTPS 1.0μL，加ddH2O 至50μL，按94℃作用3分钟；然后94℃作用30秒分钟， 58℃退火30秒，72℃延伸3分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟的反应条件在PCR仪上进行扩增，扩增的PCR产物经0.8%g/v的琼脂糖凝胶电泳分析，一条大小438bp片段；通过XbaI和XhoI将sIFITM3亚克隆于的真核表达载体pCA中，获得载体pCA-sIFITM3，大小为5151bp，转化大肠杆菌DH-5α,置-80℃保存，利用pCA-sIFITM3转染BHK-21细胞，通过共聚焦显微镜观察该蛋白表达于细胞膜；
B、表达sIFITM3基因的慢病毒的构建以及纯化：sIFITM3基因在哺乳动物细胞中表达，慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞均有感染，将外源基因整合到宿主染色体上，在细胞机体细胞上持久稳定地表达，利用ViraPowerTM HiPerformTM Lentiviral Expression Systems来建立携带sIFITM3基因的慢病毒，获得表达sIFITM3的慢病毒Lentivirus, 首先通过XbaⅠ和XhoⅠ酶将sIFITM3亚克隆入慢病毒转移载体pLentiV7.3/V5-TOPO相应位点，构建质粒pLV7.3-sIFITM3，构建稳定表达sIFITM3的细胞系，通过XhoⅠ和XmaI将绿荧光蛋白基因eGFP置于sIFITM3的下游进行，构建质粒pLV7.3-sIFITM3eGFP，然后与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG，通过脂质体法Lipofectamine 2000 共转染293ft细胞，存在VSVG，转染后48h通过显微镜观察到典型的细胞融合，72h后收集上清，同时补加生长液，12h后再次收集上清液，获得HIV假型病毒，为Lentivirus- sIFITM3eGFP，用同样的方法将eGFP亚克隆于pLentiV7.3/V5-TOPO获得转移质粒pLV7.3-eGFP与包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293ft细胞获得慢病毒Lentivirus-eGFP；将收集的上清液2000rpm/min离心5分钟，通过0.45μm的滤膜，过滤之后进行超速离心，获得慢病毒Lentivirus- sIFITM3eGFP和Lentivirus-eGFP；
C、稳定表达sIFITM3基因的BHK21-sIFITM3eGFP细胞系的构建：构建稳定表达sIFITM3的BHK-21细胞系，利用Lentivirus-sIFITM3eGFP和LentiviruseGFP分别转导BHK-21细胞，通过绿荧光进行克隆筛选，通过RT-PCR和Western blotting鉴定sIFITM3的表达，为BHK21- sIFITM3eGFP。
2.权利要求1所述的一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因的细胞系BHK21- sIFITM3eGFP在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用。
3.权利要求1所述的一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因的慢病毒Lentivirus-sIFITM3在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用。
4.权利要求1所述的一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因的真核质粒pCA- sIFITM3在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用。
5.权利要求1所述的一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪IFITM3基因在口蹄疫抗病药物育种中的应用。
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