CN102321627B - 一种人源trim25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的制备方法和应用，其步骤：A、hTRIM25基因的获取：参照人源TRIM25基因序列，设计一对引物；B、真核表达载体pCA-hTRIM25eGFP的构建：通过EcoRI和XhoI将hTRIM25连入pCA载体，获得pCA-hTRIM25。然后用SalI和XhoI分别酶切pEGFP-C1和pCA-hTRIM25，回收载体pEGFP-C1和含有启动子和hTRIM25片段并用T4ligase连接，提取重组质粒，分别通过EcoRI和HindIII酶切鉴定；C、稳定表达hTRIM25基因的BHK21-hTRIM25eGFP细胞株的构建：通过脂质体法Lipofectamine2000将pCA-eGFP和pCA-hTRIM25eGFPG转染BHK-21细胞，转染后筛选，通过间接免疫荧光和Westernblotting鉴定hTRIM25蛋白的表达，为BHK21-hTRIM25eGFP。该株在制备治疗或预防FMDV药物中的应用。构建的BHK21-hTRIM25eGFP细胞株能稳定表达hTRIM25蛋白；稳定表达hTRIM25基因的细胞株BHK21-hTRIM25eGFP能够抑制口蹄疫病毒复制；hTRIM25基因用来构建转基因小鼠和转基因猪等转基因动物。

Description

一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及病毒学和抗病育种领域。更具体涉及一种抑制口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDiseaseVirus，FMDV)增殖的TRIM25基因，同时还涉及一种抑制口蹄疫病毒增殖的TRIM25基因的制备方法，还涉及一种TRIM25基因在制备治疗或预防FMDV药物中的应用。

背景技术

我国是世界养猪第一大国。养猪业是我国畜牧业的主导产业，猪肉占肉类的67.7％，是我国人民动物蛋白质的最主要来源。猪病严重制约着我国养猪业发展。近年来，口蹄疫、猪繁殖与呼吸道综合征等重大疾病频频爆发，对我国养猪业造成巨大损失。口蹄疫的暴发不但影响到经济发展、国际贸易，而且对社会的稳定构成威胁，因此又称之为“政治经济病”。联合国粮农组织(FAO)和世界动物卫生组织(OIE)都将该病列为重要动物传染病，并列入重大跨国动物疫病的全球消灭计划。在国际上，口蹄疫(Foot-and-Mouth disease，FMD造成的经济损失巨大。如2001年2月由英国引发的FMD使得法国、爱尔兰、荷兰等欧盟国家相继暴发该病，南美的阿根廷也暴发FMD。英国在此期间共宰杀动物达450万头，由此造成的全部经济损失高达90亿英磅，而且2007年英国又发生两起FMD疫情。有经济报告分析，如果畜牧业十分发达的美国暴发FMD，当年的直接和间接损失将分别是40亿美元和400亿美元。

我国的FMD疫情非常严重。据统计资料表明，1999-2003年期间，我国发病动物总数达890616头(只)，遍及31个省、市、自治区，疫情暴发次数1129个，疫点数2375个。2003年4月份以后，O型FMD出现了我国罕见的基因型毒株，泛亚毒株又卷土重来。青海和新疆分别发现了A型和Asia I型FMD。新疆O型和Asia I型FMD同时流行，在病畜中还发现O型和Asia I型混合感染。2009-2010年猪O型FMD耿马毒在我国养猪场大面积的流行。而且各亚型之间无明显的交叉保护，增加了疫情的复杂性和控制难度，使防疫工作面临很大困难。因此如果能培育出抗FMD的猪新品种，将能从根本上解决FMD防控问题，而其关键是发掘抗FMDV复制的抗性基因。目前研究表明，FMDV对干扰素非常敏感，干扰素处理的细胞能够很好的抑制FMDV的增殖，因而激活干扰素信号通路的宿主信号分子具有抗FMDV复制的潜力。

三基序(Tripartite motif，TRIM)蛋白家族包括60多个成员，在生物学过程中发挥多种功能，如细胞分化、发育、发展、凋亡和免疫等(Quaderi et al.，1997；Avela et al.，2000)。TRIM蛋白具有共同的特征性的三基序，三个锌指结合区，一个RING指以及1～2个B-Box和一个环状的环区，因而称为RBCC(Boxden，1998)。C末端在不同的分子间存在差异，大多有一个或更多的特异区域来决定该TRIM蛋白特异功能。TRIM RING区域具有E3泛素化连接酶活性，介导不同底物的翻译后修饰。通过CC区自我关联，TRIM蛋白寡聚体化并充当支架组装成多蛋白复合物占特异的细胞层。最新研究表明，TRIM超家族中的多个成员由干扰素诱导表达，并且在参与了多种与天然免疫相关的生物过程。TRIM25RING E3泛素连接酶能使病毒RNA受体维甲酸诱导基因(retinoic acid-inducible gene-1，RIG-1)的N段泛素化，进而与下游MAVS结合激活宿主干扰素信号通路，启动IFN-β的产生，发挥抗病毒作用(McNab et al.，2011；Gack et al.，2007；Gack et al.，2008；Yoneyama and Fujita，2001)。

动物病毒性疫病的预防传统上主要通过疫苗的免疫预防接种，在动物疫病预防与控制中发挥着极其重要的作用。由于FMDV各亚型之间无明显的交叉保护，增加了疫情的复杂性和控制难度，使防疫工作面临很大困难。近年来随着转基因等生物技术的快速发展，动物的分子抗病育种得到长足的进步，可以从源头上控制疫病尤其是病毒性疾病的发生。分子抗病育种是控制疾病有效的策略之一，如将疫苗免疫和分子抗病育种结合在一起必将有助于动物疫病的控制。以人源FMDV(hFMDV)蛋白为研究对象，利用过表达hTRIM25蛋白的细胞株来评价hTRIM25对FMDV增值的影响，为FMDV的抗病毒育种提供优良的候选基因奠定基础。

发明内容

本发明的一个目的是在于提供了一种稳定表达人源TRIM25基因(hTRIM25)的细胞株BHK21-hTRIM25eGFP。该细胞可以稳定表达hTRIM25和绿荧光蛋白eGFP，用于体外研究TRIM25蛋白抗病毒活性的优良材料。

本发明的另一个目的是在于提供了一种稳定表达hTRIM25基因(hTRIM25)的细胞株BHK21-hTRIM25eGFP的制备方法，利用自身携带的绿荧光eGFP和抗性基因nero的G418，便于细胞株的筛选和建立。

本发明另一个目的是在于提供了一种抑制口蹄疫病毒(FMDV)增殖的hTRIM25基因的细胞株BHK21-hTRIM25eGFP在制备治疗或预防口蹄疫病毒(FMDV)药物(增殖上)中的应用。在BHK-21细胞上过表达hTRIM25，通过细胞病变程度可以直接评价该蛋白抗病毒活性。

本发明的还有一个目的是在于提供了一种hTRIM25基因在构建转基因小鼠和转基因猪等转基因动物中的应用。通过显微注射在体内稳定表达hTRIM25基因，为研究该蛋白的抗病毒活性提供材料。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的制备方法，其步骤是：

A、hTRIM25基因的获取：

参照人源TRIM25基因序列(NM_00508)，设计一对引物：

phTRIM25F(5’-TTTGAATTCCACCATGGCAGAGCTGTGC-3’)

phTRIM25R(5’-TTTCTCGAGTCACGTAGTAGAATCGAGACCGAG-3’)

提取Hela细胞RNA为模板，以通用引物扩增获得cDNA后，用特异引物phTRIM25F和phTRIM25R扩增hTRIM25基因，在其5‘端和3’端分别引入EcoRI和XhoI，便于进行亚克隆。其反应体系为：模板cDNA 5.0μL，10×LA buffer 5.0μL，phTRIM25F、phTRIM25R引物各1.0μL(终浓度为10pmol/L)，LA酶0.25μL，dNTPS 1.0μL，加ddH2O至50.0μL。按94℃作用3分钟；然后94℃作用30秒分钟，58℃退火30秒，72℃延伸3分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟的反应条件在PCR仪上进行扩增，扩增的PCR产物经0.8％(g/v)的琼脂糖凝胶电泳分析，一条大小1893bp带为hTRIM25基因。

B、真核表达载体pCA-hTRIM25eGFP的构建：

通过EcoRI和XhoI将hTRIM25连入pCA载体，获得pCA-hTRIM25。然后用SalI和XhoI分别酶切pEGFP-C1和pCA-hTRIM25，回收载体pEGFP-C1和含有启动子和hTRIM25片段并用T4ligase连接，提取重组质粒，分别通过EcoRI和HindIII酶切鉴定，结果表明成功获得pCA-hTRIM25eGFP(见图1B)。

C、稳定表达hTRIM25基因的BHK21-hTRIM25eGFP细胞株的构建：

通过脂质体法Lipofectamine 2000(Invitrogen)将pCA-eGFP和pCA-hTRIM25eGFPG转染BHK-21(baby hamster kidney，ATCC CCL10)细胞，转染36小时后用800μg/μL G418筛选，进行5轮后，通过间接免疫荧光和Western blotting鉴定hTRIM25蛋白的表达情况，并命名为BHK21-hTRIM25eGFP。

①间接免疫荧光鉴定hTRIM25蛋白的表达：

将BHK-eGFP和转染人源TRIM25的BHK-TRIM25eGFP细胞接种于24孔细胞培养板，待细胞长满单层，进行间接免疫荧光。多聚甲醛固定，一抗为抗V5单克隆抗体(Invitrogen)，二抗为抗鼠的Ig-G-RFP FITC。由于绿荧光蛋白与hTRIM25融合，所以细胞直接在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光信号，初步表明外源基因表达情况。进而用抗V5抗体进行间接免疫荧光，红色荧光信号表明hTRIM25的表达。一种分离的细胞株，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，表明成功构建细胞株BHK21-hTRIM25eGFP。

②Western blotting鉴定外源基因hTRIM25的表达：

收集长满单层BHK-eGFP和BHK-hTRIM25eGFP细胞，提取蛋白，进行SDS-PAGE和Western blotting检测。所用一抗为抗V5单克隆抗体(Invitrogen)，二抗是HRP标记的鼠抗兔单克隆抗体。结果在BHK21-hTRIM25eGFP细胞中有75KD的特异性阳性带，与hTRIM25蛋白大小相符，而正常BHK-eGFP细胞阴性，表明BHK21-hTRIM25eGFP细胞株中hTRIM25有效表达(如图2B)。

通过间接免疫荧光和Western blotting表明所建立BHK21-hTRIM25eGFP细胞株能稳定表达hTRIM25蛋白。由于hTRIM25蛋白理论上通过RING E3泛素连接酶使病毒RNA受体维甲酸诱导基因(retinoic acid-inducible gene-1，RIG-1)的N段泛素化，进而与下游MAVS结合激活宿主干扰素信号通路，启动IFN-β的产生，发挥抗病毒作用，进而通过抗病毒活性研究其生物功能。

一种稳定表达人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用，其应用过程是：

为了研究hTRIM25基因对FMDV增殖的影响，在96孔细胞培养板中分别接种BHK-eGFP和BHK-TRIM25-eGFP，0.8×10⁴cells/well。次日分别用O型FMDV进行病毒感染，感染剂量为100TCID₅₀(0.0125MOI)，每孔接种100μl，37℃，5％(v/v)CO2吸附1h。1h后吸弃上清，补加200μl维持液。分别在感染后不同的时间点观察病毒感染细胞情况并收集上清，进而测定TCID₅₀(如图3)。

一种抑制FMDV增殖的hTRIM25基因在转基因猪等转基因动物中的应用，其应用过程是：

为了在机体水平研究hTRIM25基因的抗病毒活性，利用pCA-hTRIM25eGFP，通过显微注射进行转基因猪的研究，图4为转基因猪第一代产仔猪的DNA检测结果。

本发明的有益效果是：

1.本发明所构建的BHK21-hTRIM25eGFP细胞株能稳定表达hTRIM25蛋白。

2.本发明是稳定表达hTRIM25基因的细胞株BHK21-hTRIM25eGFP能够抑制口蹄疫病毒复制。

3.本发明的hTRIM25基因可以用来构建转基因猪等转基因动物。

附图说明

图1为构建真核质粒pCA-eGFP和pCA-hTRIM25eGFPG的示意图以及酶切鉴定图

图1A为构建真核质粒pCA-eGFP和pCA-hTRIM25eGFPG的示意图。

图1B为利用EcoRI和HindIII分别进行酶切鉴定图。

图2为一种人源TRIM25基因在BHK21细胞中表达图谱示意图。

利用自身表达的绿荧光和抗V5标签的间接免疫荧光的鉴定BHK21-hTRIM25eGFP细胞株(2A)；

抗V5抗体进行Western-blotting进一步鉴定hTRIM25的表达，大小为75KDa(2B)。

图3为一种稳定表达人源TRIM25基因细胞株抑制口蹄疫病毒增殖的图谱示意图。

将BHK-eGFP和BHK21-hTRIM25eGFP细胞分别接种96孔细胞培养板，0.8×10⁴cells/well。次日用0.0125MOI O型和A型FMDV进行病毒感染，分别于感染后不同时间点观察细胞病变并取样测定病毒含量。结果表明在24h时，BHK21-hTRIM25eGFP细胞细胞病变很少，而BHK-eGFP细胞病变程度很严重，表现为细胞变圆，脱落(A)。测定结果不同时间点病毒含量(半数组织培养感染计量TCID₅₀，如B所示)，统计表明hTRIM25能显著抑制FMDV的增殖(C)。

图4为转基因母猪所产第一代仔猪样品DNA检测图。

通过显微注射胚胎于母猪受孕，所产仔猪耳部样品提取DNA进行PCR扩增外源基因hTRIM25结果图。

具体实施方式

实施例1：

一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的构建：

1、人源TRIM25基因的合成：

参照人源TRIM25基因序列(NM_00508)，设计一对引物

pTRIM25F (5’-TTTGAATTCCACCATGGCAGAGCTGTGC-3’)

pTRIM25R (5’-TTTCTCGAGTCACGTAGTAGAATCGAGACCGAG-3’)

提取Hela细胞RNA为模板，以通用引物扩增获得cDNA后，用特异引物phTRIM25F和phTRIM25R扩增hTRIM25基因，在其5‘端和3’端分别引入EcoRI和XhoI，便于进行亚克隆。其反应体系为：模板质粒cDNA5.0μL，10×LAbuffer 5μL，phTRIM25F、phTRIM25R引物各1.0μL(终浓度为10pmol/L)，LA酶0.25μL，dNTPS 1.0μL，加ddH2O至50μL。按94℃作用3分钟；然后94℃作用30秒分钟，58℃退火30秒，72℃延伸3分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟的反应条件在PCR仪上进行扩增，扩增的PCR产物经0.8％(g/v)的琼脂糖凝胶电泳分析，一条大小1893bp为hTRIM25基因。

2、真核表达载体pCA-hTRIM25eGFP的构建：

通过EcoRI和XhoI将hTRIM25连入pCA载体，获得pCA-hTRIM25。然后用SalI和XhoI分别酶切pEGFP-C1和pCA-hTRIM25，回收载体pEGFP-C1和含有启动子和hTRIM25片段并用T4ligase连接，提取重组质粒，分别通过EcoRI和HindIII酶切鉴定，结果表明成功获得pCA-hTRIM25eGFP(见图1B)。

3、稳定表达人源TRIM25基因的BHK21hTRIM25eGFP细胞株的构建：

用pCA-eGFP和pCA-hTRIM25eGFPG共转染BHK-21细胞，转染36小时后用800μg/μLG418进行筛选，进行多轮筛选后，通过间接免疫荧光和Western-blotting鉴定外源基因hTRIM25的表达情况。

(a)、间接免疫荧光鉴定hTRIM25的表达：

将BHK-eGFP和转染人源TRIM25的BHK-TRIM25eGFP细胞接种于24孔细胞培养板，待细胞长满单层，进行间接免疫荧光，具体步骤如下：

1.吸弃培养液，用PBS洗细胞3次，每次5min；

2.吸弃PBS，每孔加1ml 4％(v/v)多聚甲醛，室温摇床作用30分钟；

3.吸弃4％(v/v)多聚甲醛，用PBS洗细胞3次，每次10min；

4.吸干PBS，每孔加1ML0.2％(v/v)TrotonX-100的PBSA，冰上作用5min；

5.用PBS洗细胞3次，每次3min；

6.每孔加1ml 1％(g/v)BSA的PBS，室温作用封闭1h；

7.用PBS洗细胞1次，每次3min；

8.加入一抗(anti-V antibody 1∶200，)：300ul PBSA+1.5ul anti-V antibody，100ul/孔；

9.37℃作用1h(CO₂培养箱)；

10.用PBS洗细胞3次，每次3min；

11.加入二抗(抗鼠的Ig-G-RFP FITC antibody 1∶100)：300ul PBSA+3.0ul FITC antibody+6.0ul DAPI(500ug/ml)，100ul/孔；避光操作。

12.37℃作用1h(CO2培养箱)；

13.用PBS洗细胞3次，每次3min；

14.荧光显微镜下观察红荧光情况，结果见附图2A。

由于BHK-TRIM25eGFP细胞自身有绿荧光，所以在荧光显微镜下可以直接观察到绿色荧光信号。利用V5标签单克隆抗体，红荧光检测hTRIM25的表达，红色信号表明hTRIM25有效表达。另外蓝色为细胞核的染色情况。

(b)、Western blotting鉴定hTRIM25的表达：

将长满单层BHK-eGFP和BHK-TRIM25eGFP细胞收集，提取蛋白，12％SDS-PAGE电泳后利用抗体为抗V5(Invitrogen)的单克隆抗体进行Western blot检测。同时以β-actin为内参，结果表明BHK-TRIM25eGFP细胞有一条特异性条带，大小为75KD，与预期结果一直，而BHK-eGFP细胞阴性(附图2B)。

实施例2：

一种抑制FMDV增殖的TRIM25基因的细胞株BHK21-hTRIM25eGFP在制备治疗或预防FMDV药物中的应用，其应用过程是：

为了研究hTRIM25基因对FMDV增殖的影响，分别在感染后不同的时间点观察病毒感染细胞产生细胞病变(CPE)情况并收集上清，测定其病毒含量(TCID₅₀)。

1、FMDV感染细胞后形态学观察：

为了观察hTRIM25蛋白对FMDV增殖的影响，用相同剂量的FMDV(0.0125MOI)感染BHK21-hTRIM25eGFP和BHK-eGFP细胞，分别在感染后不同时间点观察病毒感染细胞所致细胞病变效应(CPE)(附图3A)。结果表明感染后6h可以发现BHK-eGFP细胞中有明显的细胞变圆，细胞间隙扩大。而BHK-hTRIM25eGFP细胞长势良好，直到感染后36h BHK-hTRIM25eGFP细胞才有的典型CPE。

2、病毒滴度的测定：

为了量化hTRIM25蛋白对FMDV的抑制效果，测定病毒感染后不同时间点样品中FMDV的滴度。具体操作如下：

将BHK-eGFP和BHK-hTRIM25eGFP细胞以0.8×10⁴cells/well量分别接种96孔细胞培养板，次日用0.0125MOI O型FMDV进行病毒感染，每孔接种100μl，各3个重复。37℃，5％CO₂吸附1h。1h后吸弃上清，补加200μl 2％胎牛血清的DMEM。分别在感染后不同时间点观察病毒感染细胞所致细胞病变效应并收集上清，进而测定各个时间点样品中病毒的滴度。按Reed-Muench法测定病毒半数组织细胞感染剂量(TCID₅₀)(结果见附图3B)。统计结果表明感染BHK-hTRIM25eGFP细胞组病毒含量一直低于BHK-eGFP细胞感染组，滴度低10³倍，表明hTRIM25能显著抑制FMDV的增殖(附图3C)。

实施例3：

一种抑制FMDV增殖的hTRIM25基因在构建转基因猪等转基因动物中的应用，其应用过程是：

为了在机体水平研究hTRIM25基因的抗病毒活性，利用pCA-hTRIM25eGFP，通过显微注射进行转基因猪的研究，图4为转基因猪第一代产仔猪的DNA检测结果。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明范围内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  华中农业大学

<120>  一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的制备方法和应用

<130>  一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的制备方法和应用

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  1893

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  1

atggcagagc tgtgccccct ggccgaggag ctgtcgtgct ccatctgcct ggagcccttc     60

aaggagccgg tcaccactcc gtgcggccac aacttctgcg ggtcgtgcct gaatgagacg    120

tgggcagtcc agggctcgcc atacctgtgc ccgcagtgcc gcgccgtcta ccaggcgcga    180

ccgcagctgc acaagaacac ggtgctgtgc aacgtggtgg agcagttcct gcaggccgac    240

ctggcccggg agccacccgc cgacgtctgg acgccgcccg cccgcgcctc tgcacccagc    300

ccgaatgccc aggtggcctg cgaccactgc ctgaaggagg ccgccgtgaa gacgtgcttg    360

gtgtgcatgg cctccttctg tcaggagcac ctgcagccgc acttcgacag ccccgccttc    420

caggaccacc cgctgcagcc gcccgttcgc gacctgttgc gccgcaaatg ttcccagcac    480

aatcggctgc gggaattttt ctgccccgag cacagcgagt gcatctgcca catctgcctg    540

gtggagcata agacctgctc tcccgcgtcc ctgagccagg ccagcgccga cctggaggcc    600

accctgaggc acaaactaac tgtcatgtac agtcagatca acggggcgtc gagagcactg    660

gatgatgtga gaaacaggca gcaggatgtg cggatgactg caaacagaaa ggtggagcag    720

ctacaacaag aatacacgga aatgaaggct ctcttggacg cctcagagac cacctcgaca    780

aggaagataa aggaagagga gaagagggtc aacagcaagt ttgacaccat ttatcagatt    840

ctcctcaaga agaagagtga gatccagacc ttgaaggagg agattgaaca gagcctgacc    900

aagagggatg agttcgagtt tctggagaaa gcatcaaaac tgcgaggaat ctcaacaaag    960

ccagtctaca tccccgaggt ggaactgaac cacaagctga taaaaggcat ccaccagagc   1020

accatagacc tcaaaaacga gctgaagcag tgcatcgggc ggctccagga gcccaccccc   1080

agttcaggtg accctggaga gcatgaccca gcgtccacac acaaatccac acgccctgtg   1140

aagaaggtct ccaaagagga aaagaaatcc aagaaacctc cccctgtccc tgccttaccc   1200

agcaagcttc ccacgtttgg agccccggaa cagttagtgg atttaaaaca agctggcttg   1260

gaggctgcag ccaaagccac cagctcacat ccgaactcaa catctctcaa ggccaaggtg   1320

ctggagacct tcctggccaa gtccagacct gagctcctgg agtattacat taaagtcatc   1380

ctggactaca acaccgccca caacaaagtg gctctgtcag agtgctatac agtagcttct   1440

gtggctgaga tgcctcagaa ctaccggccg catccccaga ggttcacata ctgctctcag   1500

gtgctgggcc tgcactgcta caagaagggg atccactact gggaggtgga gctgcagaag   1560

aacaacttct gtggggtagg catctgctac ggaagcatga accggcaggg cccagaaagc   1620

aggctcggcc gcaacagcgc ctcctggtgc gtggagtggt tcaacaccaa gatctctgcc   1680

tggcacaata acgtggagaa aaccctgccc tccaccaagg ccacgcgggt gggcgtgctt   1740

ctcaactgtg accacggctt tgtcatcttc ttcgctgttg ccgacaaggt ccacctgatg   1800

tataagttca gggtggactt tactgaggct ttgtacccgg ctttctgggt attttctgct   1860

Claims (2)

1.一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的制备方法，其步骤是：

A、hTRIM25基因的获取：

参照人源TRIM25基因序列，设计一对引物：

phTRIM25F：5’-TTTGAATTCCACCATGGCAGAGCTGTGC-3’；

phTRIM25R：5’-TTTCTCGAGTCACGTAGTAGAATCGAGACCGAG-3’；

提取Hela细胞RNA为模板，以通用引物扩增获得cDNA后，用特异引物phTRIM25F和phTRIM25R扩增hTRIM25基因，在其5’端和3’端分别引入EcoRI和XhoI，进行亚克隆，其反应体系为：模板cDNA 5.0μL，10×LA buffer 5.0μL，phTRIM25F、phTRIM25R引物各1.0μL，LA酶0.25μL，dNTPS 1.0μL，加ddH2O至50.0μL，按94℃作用3分钟；然后94℃作用30秒，58℃退火30秒，72℃延伸3分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟的反应条件在PCR仪上进行扩增，扩增的PCR产物经0.8%g/v的琼脂糖凝胶电泳，一条大小1893bp带为hTRIM25基因；

B、真核表达载体pCA-hTRIM25eGFP的构建：

通过EcoRI和XhoI将hTRIM25连入pCA载体，获得pCA-hTRIM25，然后用SalI和XhoI分别酶切pEGFP-C1和pCA-hTRIM25，回收载体pEGFP-C1和含有启动子和hTRIM25片段并用T4ligase连接，提取重组质粒，分别通过EcoRI和HindIII酶切鉴定，结果表明成功获得pCA-hTRIM25eGFP；

C、稳定表达hTRIM25基因的BHK21-hTRIM25eGFP细胞株的构建：

通过脂质体法Lipofectamine 2000将pCA-eGFP和pCA-hTRIM25eGFP转染BHK-21细胞，转染36小时后用800μg/μL G418筛选，进行5轮后，通过间接免疫荧光和Westernblotting鉴定hTRIM25蛋白的表达，为BHK21-hTRIM25eGFP；

①间接免疫荧光鉴定hTRIM25蛋白的表达：

将BHK-21-eGFP和转染人源TRIM25的BHK21-hTRIM25eGFP细胞接种于24孔细胞培养板，待细胞长满单层，进行间接免疫荧光，多聚甲醛固定，一抗为抗V5单克隆抗体，二抗为抗鼠的Ig-G-RFP FITC，绿荧光蛋白与hTRIM25融合，细胞直接在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号，用抗V5抗体进行间接免疫荧光，红色荧光信号表明hTRIM25的表达，构建细胞株BHK21-hTRIM25eGFP；

②Western blotting鉴定外源基因hTRIM25的表达：

收集长满单层BHK-21-eGFP和BHK21-hTRIM25eGFP细胞，提取蛋白，进行SDS-PAGE和Western blotting检测，一抗为抗V5单克隆抗体，二抗是HRP标记的鼠抗兔单克隆抗体，结果在BHK21-hTRIM25eGFP细胞中有75KD的特异性阳性带，与hTRIM25蛋白大小相符，正常BHK-eGFP细胞阴性，表明BHK21-hTRIM25eGFP细胞株中hTRIM25有效表达。

2.通过权利要求1所述的一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的制备方法所制得的细胞株在制备治疗或预防FMDV药物中的应用。

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