JP7149000B2 - 眼内悪性リンパ腫の補助的診断法 - Google Patents

眼内悪性リンパ腫の補助的診断法 Download PDF

Info

Publication number
JP7149000B2
JP7149000B2 JP2020562506A JP2020562506A JP7149000B2 JP 7149000 B2 JP7149000 B2 JP 7149000B2 JP 2020562506 A JP2020562506 A JP 2020562506A JP 2020562506 A JP2020562506 A JP 2020562506A JP 7149000 B2 JP7149000 B2 JP 7149000B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mutation
cd79b
gene
btg2
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2020562506A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020138435A1 (ja
Inventor
和城 田岡
綾子 唐川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC filed Critical University of Tokyo NUC
Publication of JPWO2020138435A1 publication Critical patent/JPWO2020138435A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7149000B2 publication Critical patent/JP7149000B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

本発明は、眼内悪性リンパ腫の補助的診断法に関する。より具体的には、眼内悪性リンパ腫に特異的な遺伝子変異を指標とする補助的診断方法に関する。
眼内悪性リンパ腫は、脳中枢神経系へ60-80%と高率に播種し、5年生存率は30%から40%と眼疾患の中でも最も生命予後の悪い難治性疾患である（非特許文献１）。現在のところ、年間100万人に4.6人の希少疾患であることもあり、標準治療は世界的および本邦においても確立されていない。
眼内悪性リンパ腫の診断は、診断自体が困難であるとされ、診断における平均期間は1年以上という報告がある。また、得られる検体が微量であり、組織診断が出来ないことから、通常のリンパ腫における病理診断が困難である。そのため、これまでに、IgHクローナリティ(免疫グロブリンH鎖)遺伝子再構成）、Il10/IL6、細胞診の特異度、感度を用いて診断確率を向上させてきた。近年では、MYD88やCD79Bの遺伝子変異が眼内悪性リンパ腫に認められることが報告されている。しかしながら、微量な検体から効率よく診断する診断方法は未だ確立されていない。
上記診断方法とは別に、眼内悪性リンパ腫の標的遺伝子解析についても研究が進められている。眼内悪性リンパ腫の約7割でMYD88におけるL265P変異が検出され、約35％でCD79Bにおける Y196（F、E、D、CおよびN）変異をみとめている（非特許文献２～非特許文献５）。しかしながら、高率に眼内悪性リンパ腫と補助診断できる遺伝子診断方法は未だ確立されてない。
Grimmら, Ann Oncol. 2007; 18: 1851-1855. Yoneseら, E Eur J Haematol. 2019 Feb;102(2):191-196. Lauraら, JAMA Ophthalmol. 2018 Oct 1;136(10):1098-1104. Rajaら, Retina. 2016 Mar;36(3):624-628. Bonzheimら, Blood. 2015 Jul 2;126(1):76-79.
上記事情に鑑み、本発明は、眼内悪性リンパ腫に特異的な遺伝子変異を検出することを含む、眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法の提供を目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、これまでに知られている眼内悪性リンパ腫特異的な遺伝子変異以外の検索を行ったところ、眼内悪性リンパ腫特異的な変異遺伝子として新規にBTG2およびPIM1を見出した。
さらに、本発明者らは、眼内悪性リンパ腫の遺伝子解析のために調製できるDNA量が非常に微量であることに鑑み、この点を解決すべく、複数の遺伝子変異を同時に検出可能とするために、デジタルPCR（digital PCR；digital polymerase chain reaction）等による解析の前に、微量検体由来のサンプルDNAをmultiplex PCR法などにより前増幅することによって、1回のデジタルPCR等による解析で複数の変異遺伝子が同時に検出可能となることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の（１）～（９）である。
（１）被験者由来の検体において、以下の（Ａ）ないし（Ｉ）のいずれかの遺伝子変異の1または複数を検出することを含む、眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法。
（Ａ）CD79Bのc.586T>A変異、
（Ｂ）CD79Bのc.586T>C変異、
（Ｃ）CD79Bのc.587A>C変異、
（Ｄ）CD79Bのc.587A>G変異、
（Ｅ）BTG2のc.133G>A変異、
（Ｆ）BTG2のc.142G>A変異、
（Ｇ）MYD88のc.794T>C変異、
（Ｈ）MYD88のc.728G>A変異、および
（Ｉ）PIM1のc.550C>T変異
（２）前記遺伝子変異が、少なくとも、前記（Ｅ）、（Ｆ）または（Ｉ）のいずれかであることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）被験者由来の検体において、以下の（ａ）ないし（ｉ）のいずれかの遺伝子変異の1または複数を検出することを含む、眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法
（ａ）CD79Bタンパク質のY196Nのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
（ｂ）CD79Bタンパク質のY196Hのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
（ｃ）CD79Bタンパク質のY196Sのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
（ｄ）CD79Bタンパク質のY196Cのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
（ｅ）BTG2タンパク質のA45Tのアミノ酸置換を伴うBTG2遺伝子変異、
（ｆ）BTG2タンパク質のE48Kのアミノ酸置換を伴うBTG2遺伝子変異、
（ｇ）MYD88タンパク質のL265Pのアミノ酸置換を伴うMYD88遺伝子変異、
（ｈ）MYD88タンパク質のS243Nのアミノ酸置換を伴うMYD88遺伝子変異、および
（ｉ）PIM1タンパク質のL184Fのアミノ酸置換を伴うPIM1遺伝子変異
（４）前記遺伝子変異が、少なくとも、前記（ｅ）、（ｆ）または（ｉ）のいずれかであることを特徴とする上記（３）に記載の方法。
（５）前記遺伝子変異の検出を、デジタルPCR法により検出することを特徴とする上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の方法。
（６）上記（５）の検出を行う前に、予め検体由来のDNAを増幅することを特徴とする（５）に記載の方法。
（７）前記検体が眼内液、髄液、末梢血または骨髄であることを特徴とする上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の方法。
（８）眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法を実施するためのキット。
（９）以下の（Ａ）ないし（Ｉ）のいずれかの遺伝子変異の1または複数を検出するためのプローブおよび／またはプライマーを含むことを特徴とする上記（８）に記載のキット。
（Ａ）CD79Bのc.586T>A変異、
（Ｂ）CD79Bのc.586T>C変異、
（Ｃ）CD79Bのc.587A>C変異、
（Ｄ）CD79Bのc.587A>G変異、
（Ｅ）BTG2のc.133G>A変異、
（Ｆ）BTG2のc.142G>A変異、
（Ｇ）MYD88のc.728G>A変異、
（Ｈ）MYD88のc.794T>C変異、および
（Ｉ）PIM1のc.550C>T変異
本発明により、微量検体による眼内悪性リンパ種特異的な変異遺伝子およびその変異の検出が可能となる。従って、本発明による診断補助方法を実施することで、予後不良とされる眼内悪性リンパ種の確度の高い診断が可能となる。
これまでのMYD88やCD79Bの遺伝子変異では、眼内悪性リンパ腫の70%程度しか補助診断の役割を果たしていなかった。本発明にかかる方法は、4遺伝子9箇所の変異箇所の検出により、症例の96%を網羅できており、MYD88やCD79B だけでなく、BTG2、PIM1変異遺伝子の4つの疾患特異的遺伝子変異を用いることで高率に診断を補助できる補助的診断方法である。従って、BTG2、PIM1変異遺伝子を含む、本明細書よって初めて開示された新規な疾患特異的遺伝子を用いることでこれまで病理組織学的解析、病理細胞診では十分に診断できなかった症例に対して、補助診断として有用である。
さらに、眼内悪性リンパ腫は、得られる検体量が微量であるため遺伝子解析が困難であったが、本発明において、multiplex PCR法を用いて、DNAの前増幅を行うことで、微量な検体量から変異遺伝子を検出する系を確立した。この増幅系を用いることで、微量な検体であってもデジタルPCR法等による測定可能となる。
眼内悪性リンパ種症例のデジタルPCR解析結果の代表例。プローブ6（BTG2 c.142G>A E48K）を用いて解析を行った。
本発明の第１の実施形態は、被験者由来の検体において、以下の（Ａ）ないし（Ｉ）のいずれかの遺伝子変異の1または複数を検出することを含む、眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法である。
（Ａ）CD79B（CD79b Molecule）のc.586T>A変異、
（Ｂ）CD79Bのc.586T>C変異、
（Ｃ）CD79Bのc.587A>C変異、
（Ｄ）CD79Bのc.587A>G変異、
（Ｅ）BTG2（BTG Anti-proliferation Factor 2）のc.133G>A変異、
（Ｆ）BTG2のc.142G>A変異、
（Ｇ）MYD88（MYD88 Innate Immune Signal Transduction Adaptor；Myeloid Differentiation Primary Response 88）のc.794T>C変異
（Ｈ）MYD88のc.728G>A変異、および
（Ｉ）PIM1（Pim-1 Proto-oncogene, Serine/Threonine kinase）のc.550C>T変異
より具体的には、本発明の第１の実施形態は、前記（Ａ）ないし（Ｉ）のいずれかの遺伝子変異の1または複数を検出することを含み、遺伝子変異が検出されたときに、当該被験者は眼内悪性リンパ種であると判定し、眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法である。第１の実施形態における遺伝子検出工程において、少なくとも前記（Ｅ）、（Ｆ）または（Ｉ）のいずれか１つの遺伝子変異を検出することが好ましい。
本発明の第２の実施形態は、被験者由来の検体において、以下の（ａ）ないし（ｉ）のいずれかの遺伝子変異の1または複数を検出することを含む、眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法
（ａ）CD79Bタンパク質のY196Nのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
（ｂ）CD79Bタンパク質のY196Hのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
（ｃ）CD79Bタンパク質のY196Sのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
（ｄ）CD79Bタンパク質のY196Cのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
（ｅ）BTG2タンパク質のA45Tのアミノ酸置換を伴うBTG2遺伝子変異、
（ｆ）BTG2タンパク質のE48Kのアミノ酸置換を伴うBTG2遺伝子変異、
（ｇ）MYD88タンパク質のL265Pのアミノ酸置換を伴うMYD88遺伝子変異、
（ｈ）MYD88タンパク質のS243Nのアミノ酸置換を伴うMYD88遺伝子変異、および
（ｉ）PIM1タンパク質のL184Fのアミノ酸置換を伴うPIM1遺伝子変異
より具体的には、本発明の第２の実施形態は、前記（ａ）ないし（ｉ）のいずれかの遺伝子変異の1または複数を検出することを含み、遺伝子変異が検出されたときに、当該被験者は眼内悪性リンパ種であると判定し、眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法である。第１の実施形態における遺伝子検出工程において、少なくとも前記（ｅ）、（ｆ）または（ｉ）のいずれか１つの遺伝子変異を検出することが好ましい。
なお、本明細書においては遺伝子名を表す場合には、遺伝子名に下線を付し、その遺伝子産物を表す場合には、遺伝子名に下線を付さずに記載する、または遺伝子名の後に「タンパク質」を記載することとする。
本実施形態において、遺伝子変異を検出する方法は、いかなる方法であってもよく、特に限定はしないが、例えば、デジタルPCR法、allele-specific PCR（ASPCR）法、metagenomic deep sequencing法などを挙げることができる。特に、検体量が微量の場合には、上記例示した解析を行う前に、検体から抽出した微量DNAを、予めPCR法（例えばmultiplex PCR法、デジタルPCR法を用いたmultiplex PCR法）で増幅（前増幅）し、得られた増幅産物を使用して上記解析を行うことで、効率的な検出が可能となり、複数の遺伝子変異箇所を一度に検出することが可能となる。また、ある程度の検体量が確保できる場合には、サンガーシークエンスや次世代シークエンス（next generation sequencing：NGS）などを用いても遺伝子変異の検出が可能である。
本実施形態において、被験者由来の検体は、眼内悪性リンパ種由来の染色体DNAが含まれている検体であればよく、特に限定はしないが、例えば、眼内液（例えば、硝子体液および前房水液など）、髄液、末梢血および骨髄などを挙げることができる。
本発明の第３の実施形態は、本実施形態にかかる方法を実施するためのキットである。第３の実施形態にかかるキットには、少なくとも、前記（Ａ）ないし（Ｉ）のいずれか、または、前記（ａ）ないし（ｉ）のいずれかの遺伝子変異を検出するために必要な要素が含まれる。特に、第２の実施形態のキットには、少なくとも、前記（Ｅ）、（Ｆ）または（Ｉ）のいずれか１つの遺伝子変異、あるいは、前記（ｅ）、（ｆ）または（ｉ）のいずれか１つの遺伝子変異を検出するために必要な要素が含まれることが好ましい。上記要素としては、特に限定はしないが、例えば、デジタルPCRやシークエンスを行うための、プライマーやプローブなどを挙げることができる。
本明細書が英語に翻訳されて、単数形の「a」、「an」および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものも含むものとする。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、本実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
１．方法
１－１．硝子体液の検体処理とDNA抽出
眼内悪性リンパ腫と診断された患者の硝子体手術により得た硝子体液中に細胞を48 μmのナイロンメッシュのフィルターに通過させ、MACS bufferで洗浄し、1500 rpm、4℃で5分間遠心分離した。MACS bufferで更に2回洗浄し、2500rpm、4℃で5分間遠心分離し上清を破棄した。下液をAllPrep DNA/RNA Micro Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)を用いてDNA抽出した。
上記眼内悪性リンパ種の診断は、以下の基準を用いて行った；（１）細胞診クラス４以上であること、または（２）細胞診クラス3、（３）IL10/IL6>1、（４）IgH遺伝子再構成（PCR法）陽性（LSIメディエンス）、（５）FACSでkappa/lambda ratio >3 or<05) (Davis et al, Am J Ophthalmol 2005, 140:822-29：Sagoo et al, Surv Ophthalmol 2014, 59:503-16)の（２）から（５）の4項目中2項目以上陽性であること。なお、細胞診クラス３とは異型性があり、悪性の疑いあり、クラス４とは悪性細胞の可能性が高いものをいう。
１－２．変異遺伝子および解析箇所の選定
本実施例ではいくつかの眼内悪性リンパ腫と関連する候補遺伝子（CD79B、BTG2、MYD88および PIM1など）および変異箇所を選定し、表１に示す通り4遺伝子9箇所を解析箇所として選出した。4遺伝子9箇所はすべて一塩基置換である。
Figure 0007149000000001
１－３．プライマーおよびプローブの作成
MYD88 L265P以外の4遺伝子8箇所のプローブおよびプライマー配列は、Custom TaqMan（登録商標）Assay Design Tool（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いて合成した。MYD88 L265Pのプローブおよびプライマーは、中枢性悪性リンパ腫のMYD88 L265P検出を行った既報と同じ配列を設計した。
プライマーおよびプローブ配列（FAMは変異体のプローブ、VICは野生型のプローブを表す）を以下に示す。また、表２および表３には、各遺伝子の変異領域とDigital PCR解析のためのプライマーおよびプローブの設定位置を示す（なお、表２および表３に示す配列領域は、CD79B（c.586T>A、c.586T>C、c.587A>C、c.587A>G：配列番号３３）、BTG2（c.133G>A、c142G>A：配列番号３４）、MYD88（c.794T>c：配列番号３５、c.728G>A：配列番号３６）およびPIM1（c.550C>T：配列番号３７）として配列表に示す）。表２および３において、変異箇所を[T/A]（TからAへの変異）、[A/C]（AからCへの変異）などのように示した。
＜プライマー配列＞
CD79B c.586T>A
Forward；5’- GGGCCTGCCCCTCTC -3’（配列番号１）
Reverse；5’- AGCAAGGCTGGCATGGA -3’（配列番号２）
CD79B c.586T>C
Forward；5’- GGGCCTGCCCCTCTC -3’（配列番号１）
Reverse；5’- AGCAAGGCTGGCATGGA -3’（配列番号２）
CD79B c.587A>C
Forward；5’- CTGACCCCGAGGACTCAGA -3’（配列番号３）
Reverse；5’- GGCTGGCATGGAGGAAGA -3’（配列番号４）
CD79B c.587A>G
Forward；5’- CTGACCCCGAGGACTCAGA -3’（配列番号３）
Reverse；5’- GGCTGGCATGGAGGAAGA -3’（配列番号４）
BTG2 c.133G>A
Forward；5’- GAGCAGAGGCTTAAGGTCTTCA -3’（配列番号５）
Reverse；5’- GGCATGCGCTCACCTG -3’（配列番号６）
BTG2 c.142G>A
Forward；5’- GAGCAGAGGCTTAAGGTCTTCAG -3’（配列番号７）
Reverse；5’- AGGCCCCTCGGCATG -3’（配列番号８）
MYD88 c.794T>C
Forward；5’- CCTTGGCTTGCAGGT -3’（配列番号９）
Reverse；5’- TCTTTCTTCATTGCCTTGT -3’（配列番号１０）
MYD88 c.728G>A
Forward；5’- GGTGGTGGTTGTCTCTGATGATTAC -3’（配列番号１１）
Reverse；5’- TGAGTGCAAATTTGGTCTGGAAGT -3’（配列番号１２）
PIM1 c.550C>T
Forward；5’- GAAAACATCCTTATCGACCTCAATCG -3’（配列番号１３）
Reverse；5’- CGTGTAGACGGTGTCCTTGAG -3’（配列番号１４）
＜プローブ配列＞
CD79B c.586T>A
FAM；5’- AGATCACACCTTCGAGGTA -3’（配列番号１５）
VIC；5’- AAGATCACACCTACGAGGTA -3’（配列番号１６）
CD79B c.586T>C
FAM；5’- TCACACCTGCGAGGTA -3’（配列番号１７）
VIC；5’- AAGATCACACCTACGAGGTA -3’（配列番号１８）
CD79B c.587A>C
FAM；5’- CTTACCTCGTCGGTGTGA -3’（配列番号１９）
VIC；5’- TCCTTACCTCGTAGGTGTGA -3’（配列番号２０）
CD79B c.587A>G
FAM；5’- CTTACCTCGTGGGTGTG -3’（配列番号２１）
VIC；5’- CCTTACCTCGTAGGTGTG -3’（配列番号２２）
BTG2 c.133G>A
FAM；5’- CTCCAGGAGACACTCA -3’（配列番号２３）
VIC；5’- CTCCAGGAGGCACTCA -3’（配列番号２４）
BTG2 c.142G>A
FAM；5’- CACTCACAAGTGAGCG -3’（配列番号２５）
VIC；5’- CACTCACAGGTGAGCG -3’（配列番号２６）
MYD88 c.794T>C
FAM；5’- TGGGGATCGGTCGC -3’（配列番号２７）
VIC；5’- TGGGGATCAGTCGCTT -3’（配列番号２８）
MYD88 c.728G>A
FAM；5’- CACATTCCTTGTTCTGCA -3’（配列番号２９）
VIC；5’- CACATTCCTTGCTCTGCA -3’（配列番号３０）
PIM1 c.550C>T
FAM；5’- AAGTCGATGAACTTGAG -3’（配列番号３１）
VIC；5’- AAGTCGATGAGCTTGAG -3’（配列番号３２）
Figure 0007149000000002
Figure 0007149000000003
１－４．遺伝子変異の検出
デジタルPCR解析において、複数の遺伝子変異の有無を確認する場合、これまで各遺伝子変異について、各々デジタルPCR解析を行うことが必須であったが、これには解析に十分なDNA量が必要であった。しかし、発明者らは、微量なDNA量しか得ることができない微量検体から、複数の遺伝子変異を、同時に検出可能なデジタルPCR解析の検出系を初めて確立した。すなわち、微量検体より抽出した微量DNAを、デジタルPCRのドロップレット内で、multiplex PCR法を応用して前増幅することで、増幅効率を上げ、解析箇所として選定した4遺伝子9箇所を、一度のデジタルPCR解析で検出することに成功した。具体的には、以下の方法となる。
１－４－１．前増幅
デジタルPCR解析に当たり、DNA総量が10 ngに満たない場合、既報を参考にmultiplex PCR法による前増幅を行った。multiplex PCRは、各プライマーの終濃度が5μMになるよう調整し、Master mixである2xddPCR SuperMix For Probe (no dUTP; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)を用い、鋳型DNA、5μMのプライマー、nuclease free waterを含め20μlになるように調整した。この調整液20μlにDroplet Generator オイル For Probe (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)を70μl加え、QX200 Droplet Generator (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)にてドロップレットを作成した。このドロップレットを、MiniAmp Thermal Cycler applied biosystems (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を用いて、95℃で10分反応させた後、94℃30秒と60℃1分を10サイクル行い、98℃で10分反応させ、PCRによる前増幅を行った。
１－４－２．アンプリコンの精製
前増幅後のアンプリコンをDNA Clean & Concentrator -5 Kit（Zymo Research, Irvine, CA, USA）を用いて精製し、最終量が20 μlとなるように調整した。
１－４－３．デジタルPCR解析
前増幅し生成したアンプリコンを鋳型として、以下のようにドロップレットを作製後、デジタルPCR解析を行い、蛍光強度を読み取り解析した。
まず、プローブ7（MYD88 c.794T>C L265P）のアッセイについては、溶出した20 μlのアンプリコンの内5 μlを、それ以外の8アッセイについては溶出した20 μlのアンプリコンを10倍希釈した5 μlを鋳型DNAとして用い、この鋳型DNAに、2xddPCR SuperMix For Probe（no dUTP；Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）、TaqMan Assay 40x（Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA；FAMまたはVICのプローブ8 μM、各プライマー36 μMのミックス）、nuclease free waterを加え、全量が20 μlになるように調整した。この調整液20 μlにDroplet Generator オイル For Probe（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）を70 μl加え、QX200 Droplet Generator（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）にてドロップレットを作成した。このドロップレットを、MiniAmp Thermal Cycler applied biosystems（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いて、95℃で10分反応させた後、94℃30秒と60℃1分を40サイクル行い、98℃で10分反応させ、QX200 Droplet Reader（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）にて蛍光強度を読み取り、QuantaSoft Software version 1.7（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）にて解析した。
２．結果
デジタルPCR解析により、28例の眼の検体から変異遺伝子の検出を行った。プローブ6 （BTG2 c.142G>A E48K）を用いて解析した眼内悪性リンパ腫の代表的な解析結果を、図１に示す。本解析結果では、FAM陽性ドロップレットを多数みとめ、変異有りと判定できた。デジタルPCR解析結果から、変異遺伝子ごとに、変異をみとめた症例数と変異率を求めたところ、CD79Bは37%、BTG2は15%、MYD88は79%、PIM1は26%で変異をみとめ、眼内悪性リンパ腫と診断された症例の96%の症例で、4遺伝子9箇所のいずれかに少なくとも1つの変異が認められた。
以上の結果はから、MYD88やCD79B だけでなく、BTG2、PIM1変異遺伝子を用いることで、高率に眼内悪性リンパ腫の診断を補助できる補助的診断方法と考えられた。
本発明の方法を用いることで、眼内悪性リンパ種の診断確度が顕著に上昇すると考えられる。従って、本発明は、医療分野における利用が期待される。

Claims (6)

  1. 被験者由来の検体において、以下の（Ａ）ないし（Ｉ）のいずれかの遺伝子変異の1または複数を検出することを含み、前記検出する遺伝子変異の少なくとも１つは、以下の（Ｅ）、（Ｆ）または（Ｉ）のいずれかである、眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法。
    （Ａ）CD79Bのc.586T>A変異、
    （Ｂ）CD79Bのc.586T>C変異、
    （Ｃ）CD79Bのc.587A>C変異、
    （Ｄ）CD79Bのc.587A>G変異、
    （Ｅ）BTG2のc.133G>A変異、
    （Ｆ）BTG2のc.142G>A変異、
    （Ｇ）MYD88のc.794T>C変異、
    （Ｈ）MYD88のc.728G>A変異、および
    （Ｉ）PIM1のc.550C>T変異
  2. 被験者由来の検体において、以下の（ａ）ないし（ｉ）のいずれかの遺伝子変異の1または複数を検出することを含み、前記検出する遺伝子変異の少なくとも１つは、以下の（ｅ）、（ｆ）または（ｉ）のいずれかである、眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法
    （ａ）CD79Bタンパク質のY196Nのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
    （ｂ）CD79Bタンパク質のY196Hのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
    （ｃ）CD79Bタンパク質のY196Sのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
    （ｄ）CD79Bタンパク質のY196Cのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
    （ｅ）BTG2タンパク質のA45Tのアミノ酸置換を伴うBTG2遺伝子変異、
    （ｆ）BTG2タンパク質のE48Kのアミノ酸置換を伴うBTG2遺伝子変異、
    （ｇ）MYD88タンパク質のL265Pのアミノ酸置換を伴うMYD88遺伝子変異、
    （ｈ）MYD88タンパク質のS243Nのアミノ酸置換を伴うMYD88遺伝子変異、および
    （ｉ）PIM1タンパク質のL184Fのアミノ酸置換を伴うPIM1遺伝子変異
  3. 前記遺伝子変異の検出を、デジタルPCR法により検出することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
  4. 請求項３の検出を行う前に、デジタルPCRのドロプレット内で、multiplex PCRにより、予め検体由来のDNAを増幅することを特徴とする請求項３に記載の方法。
  5. 前記検体が眼内液、髄液、末梢血または骨髄であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
  6. 眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法を実施するためのキットであって、少なくとも以下の（Ｅ）、（Ｆ）または（Ｉ）のいずれかの遺伝子変異を検出するためのプローブおよび／またはプライマーを含むことを特徴とする、前記キット。
    （Ｅ）BTG2のc.133G>A変異、
    （Ｆ）BTG2のc.142G>A変異、
    （Ｉ）PIM1のc.550C>T変異
JP2020562506A 2018-12-28 2019-12-27 眼内悪性リンパ腫の補助的診断法 Active JP7149000B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862785732P 2018-12-28 2018-12-28
US62/785,732 2018-12-28
PCT/JP2019/051482 WO2020138435A1 (ja) 2018-12-28 2019-12-27 眼内悪性リンパ腫の補助的診断法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2020138435A1 JPWO2020138435A1 (ja) 2021-11-04
JP7149000B2 true JP7149000B2 (ja) 2022-10-06

Family

ID=71126290

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020562506A Active JP7149000B2 (ja) 2018-12-28 2019-12-27 眼内悪性リンパ腫の補助的診断法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP7149000B2 (ja)
WO (1) WO2020138435A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7423090B2 (ja) * 2022-04-07 2024-01-29 学校法人藤田学園 不明熱患者のｂ細胞リンパ腫診断補助キットおよび情報提供方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BONZHEIM I. et al.，High frequency of MYD88 mutations in vitreoretinal B-cell lymphoma: a valuable tool to improve diagnostic yield of vitreous aspirates, Blood, 2015, Vol. 126, No. 1, pp. 76-79
CANI AK. et al.，Next generation sequencing of vitreoretinal lymphomas from small-volume intraocular liquid biopsies: new routes to targeted therapies, Oncotarget, 2017, Vol. 8, No. 5, pp. 7989-7998
DUBOIS S. et al.，Next-Generation Sequencing in Diffuse Large B-Cell Lymphoma Highlights Molecular Divergence and Therapeutic Opportunities: a LYSA Study, Clin. Cancer Res., 2016, Vol. 22, No. 12, pp. 2919-2928
KARUBE K. et al.，Integrating genomic alterations in diffuse large B-cell lymphoma identifies new relevant pathways and potential therapeutic targets，Leukemia, Epub 2017 Sep 5, Vol. 32, pp. 675-684

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2020138435A1 (ja) 2021-11-04
WO2020138435A1 (ja) 2020-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rishniw et al. Discrimination between six species of canine microfilariae by a single polymerase chain reaction
Roberts et al. Comparison of microscopy, culture, and conventional polymerase chain reaction for detection of Blastocystis sp. in clinical stool samples
Schneider et al. Development of a new PCR protocol for the detection of species and genotypes (strains) of Echinococcus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues
Nikmanesh et al. Genotyping of Echinococcus granulosus isolates from human clinical samples based on sequencing of mitochondrial genes in Iran, Tehran
JP2010521156A (ja) Ｈｉｖ薬物耐性バリアントの検出のためのシステムおよび方法
JP6160015B2 (ja) アシネトバクター属菌の遺伝子型タイピング法及びこれに用いるプライマーセット
CN109182600B (zh) 一种同步检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒1型的荧光定量pcr试剂盒
CN108048565A (zh) 一种检测ApoE基因多态性的引物及其检测方法和应用
WO2023279042A2 (en) Compositions and methods for detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 variants
JP7149000B2 (ja) 眼内悪性リンパ腫の補助的診断法
CN101182585A (zh) 一种鉴别hbv基因突变类型的方法及其专用芯片与试剂盒
CN105177152B (zh) 检测hla-b*51等位基因的方法和引物
Roelandse-Koop et al. Rapid HLA-B27 screening with real-time TaqMan PCR: a clinical validation in the Dutch population
KR102076343B1 (ko) 실시간 lamp법을 이용한 아데노바이러스 55형 검출용 조성물 및 이의 용도
CN112609006B (zh) 人类白细胞抗原一步测序分型方法及其应用
CN107988210A (zh) 一种快速提取血液和口腔拭子基因组dna的方法
CN105567867B (zh) 人类免疫缺陷病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
JP7065976B2 (ja) マルチコピー遺伝子を用いたツツガムシ病の診断方法
Ayed et al. Molecular differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar from Tunisian food handlers with amoeba infection initially diagnosed by microscopy.
CN107385116B (zh) 一种检测1型人类免疫缺陷病毒的方法及其专用成套试剂
CN105316350B (zh) 结核分枝杆菌EmbB突变基因及其用途
JP4670039B2 (ja) アポリポタンパクｅ遺伝子多型検出方法
CN103923981A (zh) Hla-b*27等位基因检测方法及其试剂盒
JP3351773B2 (ja) Ｈｉｖ−１のサブタイプ決定法
CN106929605B (zh) 一种能同时检测和鉴别口蹄疫和水泡性口炎的检测试剂盒及引物和探针

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210630

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220408

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220606

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20220902

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20220915

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7149000

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150