CN113355458A - 一种hiv全基因组拼接和原发感染者中劣势耐药株的检测方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种HIV全基因组拼接和原发感染者中劣势耐药株的检测方法、试剂盒及其应用，本发明首次建立一种针对我国常用抗病毒药物相关的主要耐药位点、敏感的HIV原发感染者中劣势耐药株的检测方法以及试剂盒，所述检测方法以及试剂盒具有快速高效、敏感特异、造价低、利于推广使用等优点，不仅能够应用于临床上HIV原发感染者中劣势耐药株的检测，而且能够在我国HIV/AIDS的防控工作中发挥重要的作用，具有很好的应用价值。

Description

一种HIV全基因组拼接和原发感染者中劣势耐药株的检测方 法、试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体而言，涉及一种HIV全基因组拼接和原发感染者中劣势耐药株的检测方法、试剂盒及其应用。
背景技术
艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的慢性致死性的传染病，由于艾滋病具有传染性和高致死性，因此已经成为世界范围内重点防控的主要疾病之一。HIV是一种带有包膜的反转录病毒，与其他反转录病毒一样，被包裹在和两个基因编码的蛋白外壳中，而其复制由基因编码的反转录酶、蛋白酶等指导完成，HIV进入人体后，选择性地入侵人体免疫系统的CD4+T淋巴细胞和巨噬细胞，在细胞内经逆转录机制合成cDNA，形成整合前复合体并整合进入宿主细胞的基因组DNA中。HIV主要传播方式包括母婴传播、性接触传播、血液传播等，可导致人体免疫功能受损，目前尚无可治愈AIDS的药物与可预防的疫苗。
自1995年Ho D.D.和George M.Shaw关于HIV病毒动力学的研究成果给抗病毒治疗带来了突破，高效抗逆转录病毒疗法(Highly active antiretroviral therapy，HAART)被认为是有效的艾滋病治疗方式。然而，抗逆转录病毒治疗(Antiretroviral treatment，ART)存在一定的缺陷：由于易整合入患者遗传物质内进入潜伏状态，病毒药物不能完全清除患者体内的病毒，因此需要长期服药，在此过程中，由于依从性、遗传特性、药物相互作用等原因，复制过程产生的耐药突变位点，发生基因突变，即发生所谓的“继发性耐药”，形成耐药毒株，在人群中传播，从而降低治疗的有效率。耐药问题是目前阻碍HIV感染者ART成功的主要障碍。此外，HIV的耐药相关突变也可以由耐药毒株携带者直接传播给从未接受过抗病毒治疗的新感染者，使这些患者从一开始就获得“原发性耐药”，被称为传播耐药(Transmitted Drug Resistance，TDR)，TDR可以显著增加患者初始抗病毒治疗失败的风险。
为了取得理想的抗病毒治疗效果，美国健康和人类服务部(Department ofHealth and Human Service，DHHS)抗病毒治疗指南建议：所有新发感染者在抗病毒治疗前都应进行TDR检测。但是，临床上常有未发现带有TDR的患者同样发生了不能用其他原因解释的初始抗病毒治疗失败，给临床医生造成困扰。既往研究发现，发生继发耐药的患者在停药后，由于失去了药物的选择性压力，野毒株会快速增长而适应性较差的耐药病毒株则逐渐转变成低水平复制的劣势耐药株(Minority Variants)持续存在，由于这些劣势耐药株的频次较低，常规耐药检测方法往往漏检。当再次暴露到相关药物后，这种劣势耐药株会快速复制，导致临床上的治疗失败，近年来，越来越多的证据表明，原发耐药患者中TDR同样会逐渐衰减为频次较低的劣势病毒株。
近年来，原发耐药已成为备受关注的全球性的公共卫生问题。在我国抗病毒治疗药物相对短缺的情况下，了解我国HIV原发感染者中常用抗病毒药物相关的劣势耐药株流行状况及其对抗病毒治疗的临床影响意义重大，不仅为临床医生正确判读原发耐药检测结果，合理选择抗病毒治疗方案，减少初始抗病毒治疗失败风险提供保障，所得数据也将为我国原发耐药检测策略的制定提供重要依据。目前，我国关于艾滋病耐药检测技术市场相对空白，在技术层面上，艾滋病耐药检测主要有基因型和表型两种方法，我国常用的HIV基因型耐药检测的方法主要有ViroSeq和In-house，两种方法均具有明显的局限性，首先，二者均采用属于第一代测序技术的Sanger测序法，这种检测技术不仅价格昂贵、低通量，且需要4-8周才能够出结果，Sanger测序法检测HIV药物耐受性突变的敏感性低，仅为20％，因此面对HIV这种高突变率病毒存在检出率不足等问题。
发明内容
鉴于此，为了解决现有技术存在的上述问题，本发明建立了一种针对我国常用抗病毒药物相关的主要耐药位点、敏感的HIV原发感染者中劣势耐药株的检测方法以及试剂盒，所述检测方法利用新一代的高通量测序技术(NGS)建立。本发明提供的检测方法以及试剂盒，具有快速高效、敏感特异、造价低、利于推广使用等优点，不仅能够应用于临床上HIV原发感染者中劣势耐药株的检测，而且能够在我国HIV/AIDS的防控工作中发挥重要的作用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种用于检测HIV全基因组和/或HIV劣势耐药株和/或HIV基因组的基因型和/或HIV全基因组的耐药突变位点的序列组。
进一步，所述序列组包括RT-PCR的引物序列、测序的接头序列；
优选地，所述RT-PCR的引物序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2所示；
优选地，所述测序的接头序列如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:194所示；
优选地，所述耐药基因的耐药突变位点位于HIV基因组的Pol基因上；
更优选地，所述Pol基因包含逆转录酶基因和蛋白酶基因；
优选地，所述耐药突变位点为抗病毒药物相关的耐药突变位点；
更优选地，所述抗病毒药物包括拉米夫定、阿巴卡韦、齐多夫定、恩曲他滨、替诺福韦、依非韦伦、依曲韦林；
更优选地，所述耐药突变位点包括I54、M184、K65、K103、Y181。
HIV属于病毒科慢病毒属中的人类慢病毒组，为直径100-120nm的球形颗粒，由核心和包膜两部分组成；核心由衣壳蛋白(CA，p24)所组成，衣壳内包括两条完全一样的病毒单股正链RNA、核壳蛋白(NC)和病毒复制所必需的酶类，含有逆转录酶(RT，p51/p66)、整合酶(IN，p32)和蛋白酶(PR，p10)；HIV最外层为包膜，来源于宿主细胞膜的膜质结构，其中嵌有外膜糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白gp41；包膜结构之下的是基质蛋白(MA，p17)，形成一个病毒内壳；HIV基因组全长约9.7×103bp，含有3个结构基因(gag、pol和env)、2个调节基因(tat反式激活因子和rev毒粒蛋白表达调节因子)和4个辅助基因(nef负调控因子、vpr病毒蛋白r、vpu病毒蛋白u和vif病毒感染因子)；HIV是一种变异性很强的病毒，各基因的变异程度不同，env基因变异率最高；我国以HIV-1为主要流行株，已发现的有A、B(欧美B)、B’(泰国B)、C、D、F、G、H、J和K共10个亚型，还有不同流行重组型(CRFs)，目前流行的HIV-1主要亚型是AE重组型和BC重组型，在本发明中所述HIV为HIV-1。
本发明的第二方面提供了一种用于检测HIV全基因组和/或HIV劣势耐药株和/或HIV基因组的基因型和/或HIV全基因组的耐药突变位点的试剂盒。
进一步，所述试剂盒包含如下试剂：
RT-PCR扩增试剂：如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2所示的扩增引物；
文库制备试剂：如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:194所示的接头序列；
优选地，所述耐药突变位点为抗病毒药物相关的耐药突变位点；
更优选地，所述抗病毒药物包括拉米夫定、阿巴卡韦、齐多夫定、恩曲他滨、替诺福韦、依非韦伦、依曲韦林；
更优选地，所述耐药突变位点包括I54、M184、K65、K103、Y181。
本发明的第三方面提供了一种HIV的检测方法。
进一步，所述方法包括方法A1和/或方法A2：
方法A1：一种敏感的HIV全基因组和/或HIV劣势耐药株的检测方法；
方法A2：一种敏感的HIV基因组的基因型和/或HIV全基因组的耐药突变位点的检测方法；
所述方法A1和A2均包括如下步骤：
(1)病毒核酸提取：提取待测样本中的HIV病毒RNA；
(2)引物设计和PCR扩增：采用本发明第一方面所述的RT-PCR的引物序列进行HIV基因组的扩增；
(3)文库制备：采用本发明第一方面所述的接头序列进行文库制备；
(4)测序分析：上机测序，并拼接序列上传分析，生成报告。
进一步，步骤(1)中所述的待测样本包括血浆、血清、尿液。
进一步，步骤(1)中所述的提取方法包括(但不限于)：磁珠纯化、纯化柱纯化、酚氯仿提取。
在本发明的实施例中，本发明采用Qiagen病毒RNA mini试剂进行HIV病毒RNA的提取。
进一步，步骤(2)中所述的HIV基因组的扩增包含HIV基因组的Pol基因的扩增；
优选地，所述的Pol基因包含逆转录酶基因和蛋白酶基因。
进一步，步骤(3)中所述的文库制备包括DNA片段化/末端修复/dA尾添加、接头连接、连接产物磁珠纯化、文库扩增与纯化。
进一步，DNA片段化的方法包括(但不限于)：超声破碎方法、酶切打断方法。
在本发明的实施例中，本发明采用酶切打断方法对长片段DNA进行酶切。
进一步，所述接头连接是将上述步骤得到的产物末端连接上特定接头。
进一步，所述连接产物磁珠纯化是对上述步骤得到的产物进行纯化。
进一步，所述文库扩增与纯化是对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集并进行进一步的纯化。
进一步，步骤(4)中所述的上机测序采用新一代高通量测序(NGS)技术进行；
优选地，步骤(4)中所述的报告中包括测序基本情况、病毒型别、变异的计算；
更优选地，所述测序基本情况包括Total reads数、HIV-mapping reads数、区段覆盖度、平均深度；
更优选地，所述变异的计算包括对每个位点的碱基变异及相应的氨基酸变异进行计算，并计算每个稳点测序深度与变异位点种类与占比情况。
进一步，所述方法还包括将检测发现的耐药突变提交斯坦福大学耐药数据库，得到抗HIV药物敏感性报告；
优选地，根据HIV药物敏感性报告中的耐药评分的高低，将各个耐药突变的耐药程度分为高度耐药、中度耐药、低度耐药、潜在耐药和敏感(不耐药)五种等级。
进一步，本发明提供的用于HIV劣势耐药株和/或HIV基因组的基因型和/或HIV基因组的耐药突变位点的检测方法是一种针对我国常用的抗病毒药物相关的主要耐药突变位点的敏感的检测方法(敏感性在1％左右)。
进一步，所述抗病毒药物包括拉米夫定、阿巴卡韦、齐多夫定、恩曲他滨、替诺福韦、依非韦伦、依曲韦林；
进一步，所述耐药突变位点包括I54、M184、K65、K103、Y181。
进一步，本发明提供的HIV检测方法是针对HIV基因组全序列设计的扩增引物，加上高效逆转录体系和高保真Taq酶扩增体系，仅需要少量RNA便可方便快速地扩增出HIV基因组的Pol区域，简单快速建库，应用新一代高通量测序(NGS)进行测序分析，快速检测HIV药物耐受性突变，不仅可检测耐药基因指导临床上HIV的用药，还能通过序列比对分析检测病毒蛋白酶和逆转录酶基因耐药性位点的潜在突变，实现对病毒耐药性的预测。
进一步，本发明提供的HIV检测方法操作简单，核酸转录和扩增单管操作，“一步法”获得HIV基因组的Pol区域，具有扩增效率高，覆盖度均匀，高深度测序耐药位点全覆盖的特点。
本发明的第四方面提供了本发明第一方面所述的序列组在制备用于检测HIV全基因组和/或HIV劣势耐药株和/或HIV基因组的基因型和/或HIV全基因组的耐药突变位点的试剂盒中的应用。
本发明的第五方面提供了本发明第一方面所述的序列组或本发明第二方面所述的试剂盒在如下任一方面的应用：
(1)HIV全基因组拼接和溯源；
(2)HIV耐药性的鉴定和/或预测；
(3)HIV亚型的鉴定；
(4)HIV准种的鉴定；
(5)艾滋病抗病毒治疗效果评估和/或预测。
相对于现有技术，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明首次构建了一种HIV原发感染者中劣势耐药株的检测方法以及试剂盒，相对于目前常用的成本较高的高通量测序方法而言，本发明提供的检测方法以及试剂盒具有造价低、简便可行、利于推广使用等优点，此外，还具有敏感、特异、快速和高效等优势；
(2)本发明所述的敏感的检测HIV原发感染者中劣势耐药株的方法以及试剂盒，能够同时对我国常用的抗病毒药物相关的3-5个HIV耐药突变位点进行检测，由于多个HIV耐药位点之间存在相互作用，因此，该试剂盒能够得出更加可靠的结论，且敏感性在1％左右；
(3)本发明所述的敏感的检测HIV原发感染者中劣势耐药株的方法以及试剂盒是针对HIV基因组全序列设计的扩增引物，加上高效逆转录体系和高保真Taq酶扩增体系，仅需要少量RNA便可方便快速地扩增出HIV基因组的Pol区域，简单快速建库，应用新一代高通量测序(NGS)进行测序分析，快速检测HIV药物耐受性突变；
(4)本发明所述的敏感的检测HIV原发感染者中劣势耐药株的方法以及试剂盒操作简单，核酸转录和扩增单管操作，“一步法”获得HIV基因组的Pol区域，具有扩增效率高，覆盖度均匀，高深度测序耐药位点全覆盖的特点；
(5)本发明所述的敏感的检测HIV原发感染者中劣势耐药株的方法以及试剂盒，不仅可检测耐药基因指导临床上HIV的用药，还能通过序列比对分析检测病毒蛋白酶和逆转录酶基因耐药性位点的潜在突变，实现对病毒耐药性的预测，为临床医生正确判读原发耐药检测结果，合理选择抗病毒治疗方案，减少初始抗病毒治疗失败风险提供保障，所得数据也将为我国原发耐药检测策略的制定提供重要依据。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示的是实施例中利用本发明所述的检测HIV原发感染者中劣势耐药株的方法检测受试者样本中HIV劣势耐药株的技术路线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1患者样本中病毒核酸提取
HIV-1病毒RNA核酸的提取采用Qiagen病毒RNA迷你试剂，具体的操作流程在试剂盒的说明书中有详细说明。
1、材料收集
随机选择在医院门诊进行抗病毒治疗的HIV感染者40例，包括抗病毒治疗成功的患者及抗病毒治疗失败的患者各20例。
(1)入选标准：
①TDR阴性；②初次抗病毒治疗；③治疗时间6个月以上；④治疗依从性良好(按时服药率在95％以上)；⑤治疗方案为TDF(或AZT)+3TC+EFV(或NVP)；⑥签署抗病毒治疗知情同意书。
(2)排除标准：
①有其他严重相关合并症的患者；②合并HBV、HCV等感染的患者。
(3)抗病毒治疗成功的判定标准：
治疗24周，HIV病毒载量维持在200cpies/mL以下。
(4)抗病毒治疗失败的判定标准：
治疗24周，两次HIV病毒载量检测在200cpies/mL以上。
2、实验方法
(1)吸取560μL准备好的buffer AVL(含有carrier RNA)到1.5mL离心管中，根据样品的实际量按比例调整buffer AVL-carrier RNA；
(2)将140μL血浆，血清，尿液，培养细胞上清液或是无细胞体液加入到装有bufferAVL-carrier RNA的离心管中，涡旋15秒，混匀，为保证裂解效率，一定要彻底混匀，形成均一溶液；
(3)室温放置10min(10min即可，延长时间不会增加产物质量，Buffer AVL可以使潜在的污染和RNase失活)；
(4)瞬时离心，将盖子上的液滴收集至管底；
(5)样品中加入560μL无水乙醇(96％～100％)，涡旋15s，充分混匀，然后瞬时离心，将盖子上的液滴收集至管底(只可以用无水乙醇，因为其他乙醇会降低产量和纯度，不要用变性乙醇，因为其中含有其他物质，如果样品量大于140μL，按比例增加乙醇的量，该步骤要充分混匀，形成均一溶液，以保证产量)；
(6)吸取630μL上步中的溶液小心的加入column(已装入到2mL离心管中)中，注意不要碰到柱子的边缘，盖上盖子，6000×g离心1min，将column放入新的2mL离心管中，弃去旧的收集管(每一个column都要盖上，以防交叉污染)；
(7)小心的打开column的盖子，重复第6步(如果样品量超过了140μL，那么重复此步骤，直到所有的裂解液都上柱)；
(8)小心的打开column的盖子，加入500μL buffer AW1，盖上盖子，6000×g离心，1min，将column放入新的2mL收集管(Kit提供)中，弃去旧的收集管(即使样品量大于140μL，也无需增加buffer AW1的量)；
(9)小心的打开column盖子，加入500μL buffer AW2，盖上盖子，全速离心(20,000×g)，3min，接着进行第(11)步，或者先进行第(10)步，以避免buffer AW2残留，然后再进行第(11)步(buffer AW2残留会影响下游实验，有些离心机在减速时会发生振动，导致回流，使得buffer AW2接触到column，将column和收集管从离心机里拿出来时也可能会导致该现象产生，因此，最好先进行第(10)步)；
(10)推荐：将column放入新的2mL收集管(Kit中未提供)中，弃去旧的收集管，全速离心；
(11)将column放在1.5mL离心管(kit中未提供)中，弃去旧的收集管，小心的打开column，加入60μL室温的buffer AVE；
盖上盖子，室温放置1min，6000×g离心1min(单次60μL buffer AVE可以洗脱膜上90％的病毒RNA，每次40μL buffer AVL，洗两次，可以将产物量提高10％，用小于30μL的buffer洗脱，将会降低产物量，也不会提高产物浓度，病毒RNA在-20℃或-70℃下可以稳定保存1年)。
实施例2基因扩增RT-PCR反应和检测
使用提取的核酸进行
Figure BDA0003105271720000102
超灵敏度HIV耐药基因扩增试剂盒进行扩增反应，所述扩增HIV耐药基因的正向引物和反向引物分别如下：
正向引物：TCACTCTTTGGCAACGACCC(SEQ ID NO:1)；
反向引物：GGAGTCTTTCCCCATATTACTATGCTTTC(SEQ ID NO:2)；
如果病毒RNA在-20℃或-70℃下保存，则在使用前需要先取出解冻，然后将扩增Buffer、引物、无核酸酶水常温解冻，
Figure BDA0003105271720000103
超灵敏度HIV耐药基因扩增试剂盒保存待用，反应体系见表1，扩增程序见表2；
表1基因扩增RT-PCR反应体系
Figure BDA0003105271720000101
表2扩增程序
Figure BDA0003105271720000111
实施例3扩增产物凝胶电泳质控及PCR产物的纯化与定量
按照常规的琼脂糖凝胶电泳流程进行检测，合格的扩增产物送去测序。
1、扩增产物凝胶电泳质控操作步骤如下：
(1)解冻DNA mass ladder和琼脂糖凝胶6X Loading Buffer平衡至室温，用之前的方法离心10-15秒；
(2)配制1％的琼脂糖凝胶，加入DNA染料Goldview，终浓度为5％；
(3)以配制50mL 1％的琼脂糖凝胶为例，取0.5g分子纯度的琼脂糖，加入50mL 1倍稀释TAE，再加入2.5μL的DNA染料DNA(Green)；
(4)将制备好的琼脂糖凝胶放在电泳槽中；
(5)在电泳槽中加足够的1×TAE，使其覆盖过凝胶；
(6)按如下比例混合样本：
a)每一份样本取5μL PCR产物；
b)1μL的6×buffer。
2、PCR产物纯化与定量
PCR产物纯化：
切胶回收或者磁珠片段筛选，建议将DNA稀释在无核酸酶H2O中进行片段化，具体操作步骤如下：
(1)加入50μL分选磁珠(1X)，涡旋混匀，室温孵育5min；
(2)瞬离，磁力架上放置5min，小心移除上清；
(3)加入200μL Fresh 80％乙醇，室温孵育30sec，小心移除上清；
(4)重复步骤(3)，总计漂洗两次；
(5)开盖，室温干燥(不超过5min)；
(6)加入30μL ddH2O，涡旋混匀，室温静置5min；
(7)瞬离，磁力架上放置5min，吸取20μL上清至新的离心管中。
Qubit对产物进行定量，决定建库片段化效果与接头对应稀释的比例，本方法兼容PCR产物input范围为1～500ng，并记录PCR产物纯化后产量的范围。
实施例4文库制备
对长片段DNA采取酶切打断方法，操作方法在说明书中有详细记载；需严格控制反应体系内DNA投入量与文库扩增循环数，反应体系见表3，接头序列信息见表4(其中，Aaptor1-Aaptor96的序列分别为SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:194)，热循环程序设置见表5。
表3反应体系
Figure BDA0003105271720000121
Figure BDA0003105271720000131
表4接头序列信息
Figure BDA0003105271720000132
Figure BDA0003105271720000141
表5热循环程序设置
Figure BDA0003105271720000142
1、DNA片段化/末端修复
将-20℃储存的无核酶水(Green:D1)置于室温用于下一步骤中，试剂用量见表6，片段化指导过程见表7。
表6试剂用量
Figure BDA0003105271720000143
Figure BDA0003105271720000151
表7片段化指导
插入目的片段长度 片段化时间(X)
200bp 30min
300bp 20min
400-500bp 10min
从PCR仪中取出试剂管，离心收集并置于冰上。
2、接头连接
该步骤将上述步骤1的产物末端连接特定接头，连接预混液所用的试剂及用量见表8，具体步骤如下：
(1)从-20℃取出接头板并置于冰上解冻，离心收集后置于冰上；
(2)Reagent E1 Mix用移液器吹吸混匀，离心收集后置于冰上；
(3)将每个样品片段化产物的全部15μL中，加入接头6μL，混匀；
(4)根据表8制备连接混合液；
(5)在步骤(3)的混匀液中加入9μL连接预混液，总体积30μL，用移液器缓慢吹吸彻底混匀，离心收集后置于冰上，立即进行温育；
(6)将试剂管放入预热的PCR仪里运行程序2(接头连接；见表5)：25℃-30分钟，70℃-10分钟，保持在10℃；
(7)从PCR仪中取出试剂管，离心收集后置于冰上。
表8连接预混液
试剂 Reagent L1 Mix Reagent E1 Mix
1X反应体积 2.25μL 6.75μL
3、文库扩增
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集，详细步骤如下：
(1)取出Agencourt磁珠和Reagent L1 Mix放于试验台(室温)用于后续步骤；
(2)冰上解冻Reagent E2 Mix扩增混合液，混匀，离心收集后置于冰上；
(3)取70μL Reagent E2 Mix加入到接头连接的产物中，总体积100μL，移液器混匀，离心收集后置于冰上；
(4)将试剂管放入预热的PCR仪里运行程序3(文库扩增；见表5)，PCR循环数指导(N)见表9；
72℃-2分钟，95℃-3分钟，N(98℃-20秒，65℃-30秒，72℃-30秒)，72℃-1分钟，保持在4℃。
表9扩增PCR
起始量(ng) PCR循环数(N)
10-100 6-9
100-500 4-6
4、文库纯化
(1)取出NuQuant定量试剂用于后续步骤；
取出稀释的标准品Reagent I1 Mix，涡旋振荡彻底混匀，离心，室温避光放置；取出定量缓冲液Reagent G Mix室温解冻，涡旋振荡彻底混匀，离心，置于试验台上；
(2)确保Agencourt磁珠使用前完全达到室温；
(3)制备70％乙醇溶液；
(4)涡旋振荡重悬磁珠，确保使用前磁珠彻底重悬，重选后不要离心；
(5)在每个样品中加入适当体积的重悬磁珠，移液器吹吸至少10次完全混匀，设置移液器为总体积的70％；
(6)室温放置10分钟；
(7)把试管转移到磁力架上，至少5分钟至磁珠溶液完全清澈；
(8)小心移除上清，并注意不要搅乱磁珠；
(9)从磁力架上取下试剂管；
(10)每个样本中加入50μL DNA重悬缓冲液(Reagent J1 Mix)，移液器吹吸彻底混匀；
(11)在每个样本中加入相应体积的磁珠悬液，移液器吹吸至少10次完全混匀，设置移液器为总体积的70％；
(12)室温放置10分钟；
(13)把试管转移到磁力架上，至少5分钟，至溶液完全清澈；
(14)小心移除上清，并注意不要搅乱磁珠。
5、文库混样和评估
(1)根据NuQuant的浓度混样，计算示例：
V1＝(C2/N*V2)/C1，C＝浓度，N＝混样数量，V＝体积，见下表10；
(2)需要使用拼接软件将所得序列拼接成consensus的序列，报告病毒型别；
(3)对每个位点的碱基变异及相应的氨基酸变异进行计算，并计算每个稳点测序深度与变异位点种类与占比情况；
(4)将序列提交到
Figure BDA0003105271720000171
Analyzer软件完成。
表10文库混样
Figure BDA0003105271720000172
实施例5序列分析及报告、对抗病毒药物进行敏感性的预测
1、序列分析及报告
(1)测序基本情况，Total reads数，HIV-mapping reads数，区段覆盖度与平均深度；
(2)需要使用拼接软件将所得序列拼接成consensus的序列，报告病毒型别；
(3)对每个位点的碱基变异及相应的氨基酸变异进行计算，并计算每个稳点测序深度与变异位点种类与占比情况；
(4)将序列提交到
Figure BDA0003105271720000181
Analyzer软件完成。
得到利用上述本发明建立的敏感的耐药突变检测方法对40例感染者基线血浆标本进行我国主要抗病毒药物相关耐药位点的劣势耐药株检测的结果。
3、对抗病毒药物进行敏感性的预测
将各个患者使用新测序方法检测所发现的耐药突变提交到斯坦福大学耐药数据库(http://hivdb.stanford.edu/)，得到20种美国食品药品监督管理局认证的抗HIV药物敏感性报告。依据耐药评分的高低，将各个TDR突变的耐药程度划分为高度耐药、中度耐药、低度耐药、潜在耐药和敏感(不耐药)五种等级。
4、统计方法
使用SPSS 14.0软件进行，率的比较采用卡方检验，P值小于0.05作为显著性差异的标准。
5、实验结果
采用本发明建立的敏感的耐药突变检测方法对40例抗病毒治疗的HIV感染者(包括抗病毒治疗成功的患者及抗病毒治疗失败的患者各20例)的血浆样本进行检测，得到的结果见表11，结果显示，20例抗病毒治疗失败的患者中均存在耐药突变位点(见样本编号1-20)；而20例抗病毒治疗成功的感染者中均不存在耐药突变位点(见样本编号21-40)，但是其中有2例抗病毒治疗成功的感染者有潜在耐药的风险；表明了抗病毒治疗失败的患者体内由于耐药株(耐药突变位点)的存在而导致抗病毒治疗的失败，进一步表明了本发明建立的敏感的耐药突变检测方法不仅可检测耐药突变位点，还能通过序列比对分析检测病毒蛋白酶和逆转录酶基因耐药性位点的潜在突变，实现对病毒耐药性的预测，所述方法的敏感性在1％左右，为减少HIV感染者初始抗病毒治疗失败的风险提供了保障。
表11采用本发明建立的敏感的耐药突变检测方法对40例感染者基线血浆标本进行我国主要抗病毒药物相关耐药位点的劣势耐药株检测的结果
Figure BDA0003105271720000191
Figure BDA0003105271720000201
Figure BDA0003105271720000211
Figure BDA0003105271720000221
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京微未来科技有限公司
<120> 一种HIV全基因组拼接和原发感染者中劣势耐药株的检测方法、试剂盒及其应用
<141> 2021-06-08
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcactctttg gcaacgaccc 20
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggagtctttc cccatattac tatgctttc 29

Claims (10)

1.一种用于检测HIV全基因组和/或HIV劣势耐药株和/或HIV基因组的基因型和/或HIV全基因组的耐药突变位点的序列组，其特征在于，所述序列组包括RT-PCR的引物序列、测序的接头序列；
优选地，所述RT-PCR的引物序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2所示；
优选地，所述测序的接头序列如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:194所示；
优选地，所述耐药基因的耐药突变位点位于HIV基因组的Pol基因上；
更优选地，所述Pol基因包含逆转录酶基因和蛋白酶基因；
优选地，所述耐药突变位点为抗病毒药物相关的耐药突变位点；
更优选地，所述抗病毒药物包括拉米夫定、阿巴卡韦、齐多夫定、恩曲他滨、替诺福韦、依非韦伦、依曲韦林；
更优选地，所述耐药突变位点包括I54、M184、K65、K103、Y181。
2.一种用于检测HIV全基因组和/或HIV劣势耐药株和/或HIV基因组的基因型和/或HIV全基因组的耐药突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如下试剂：
RT-PCR扩增试剂：如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2所示的扩增引物；
文库制备试剂：如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:194所示的接头序列；
优选地，所述耐药突变位点为抗病毒药物相关的耐药突变位点；
更优选地，所述抗病毒药物包括拉米夫定、阿巴卡韦、齐多夫定、恩曲他滨、替诺福韦、依非韦伦、依曲韦林；
更优选地，所述耐药突变位点包括I54、M184、K65、K103、Y181。
3.一种HIV的检测方法，其特征在于，所述方法包括方法A1和/或方法A2：
方法A1：一种敏感的HIV全基因组和/或HIV劣势耐药株的检测方法；
方法A2：一种敏感的HIV基因组的基因型和/或HIV全基因组的耐药突变位点的检测方法；
所述方法A1和A2均包括如下步骤：
(1)病毒核酸提取：提取待测样本中的HIV病毒RNA；
(2)引物设计和PCR扩增：采用权利要求1中所述的RT-PCR的引物序列进行HIV基因组的扩增；
(3)文库制备：采用权利要求1中所述的接头序列进行文库制备；
(4)测序分析：上机测序，并拼接序列上传分析，生成报告；
优选地，所述耐药突变位点为抗病毒药物相关的耐药突变位点；
更优选地，所述抗病毒药物包括拉米夫定、阿巴卡韦、齐多夫定、恩曲他滨、替诺福韦、依非韦伦、依曲韦林；
更优选地，所述耐药突变位点包括I54、M184、K65、K103、Y181。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的待测样本包括血浆、血清、尿液。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的HIV基因组的扩增包含HIV基因组的Pol基因的扩增；
优选地，所述的Pol基因包含逆转录酶基因和蛋白酶基因。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的文库制备包括DNA片段化/末端修复/dA尾添加、接头连接、连接产物磁珠纯化、文库扩增与纯化。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的上机测序采用新一代高通量测序(NGS)技术进行；
优选地，步骤(4)中所述的报告中包括测序基本情况、病毒型别、变异的计算；
更优选地，所述测序基本情况包括Total reads数、HIV-mapping reads数、区段覆盖度、平均深度；
更优选地，所述变异的计算包括对每个位点的碱基变异及相应的氨基酸变异进行计算，并计算每个稳点测序深度与变异位点种类与占比情况。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将检测发现的耐药突变提交斯坦福大学耐药数据库，得到抗HIV药物敏感性报告；
优选地，根据HIV药物敏感性报告中的耐药评分的高低，将各个耐药突变的耐药程度分为高度耐药、中度耐药、低度耐药、潜在耐药和敏感(不耐药)五种等级。
9.权利要求1所述的序列组在制备用于检测HIV全基因组和/或HIV劣势耐药株和/或HIV基因组的基因型和/或HIV全基因组的耐药突变位点的试剂盒中的应用。
10.权利要求1所述的序列组或权利要去2所述的试剂盒在如下任一方面的应用：
(1)HIV全基因组拼接和溯源；
(2)HIV耐药性的鉴定和/或预测；
(3)HIV亚型的鉴定；
(4)HIV准种的鉴定；
(5)艾滋病抗病毒治疗效果评估和/或预测。
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