CN105624153B - 一种引物组及其在扩增siv/shiv基因组中的应用与试剂盒 - Google Patents
一种引物组及其在扩增siv/shiv基因组中的应用与试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种引物组及其在扩增SIV/SHIV基因组的中的应用与试剂盒。本发明提供的引物组能够具有特异性的、稳定而准确的扩增出目标序列。经琼脂糖凝胶电泳检测，未见非特异性条带产生，未见拖尾或弥散现象产生。经测序后与Genbank中登录的SIVmac239全基因组序列比对，匹配度为100％，未见碱基置换或缺失(gap)。实验表明，本发明提供的引物组对SIV/SHIV基因组具有良好的灵敏性，在病毒拷贝数为100.5～1.0之间皆能起到良好的检测效果，分析认为灵敏性的差异性与病毒序列变异度有关。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种引物组及其在扩增SIV/SHIV基因组中的应用与试剂盒。
背景技术
艾滋病，又称为获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immune DeficiencySyndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的一类死亡率极高的传染性疾病，对全球、尤其是亚洲和非洲等广大发展中国家人民的生命健康安全威胁极大。HIV最独特的特征之一就是基因组的高变异性。基于基因变异，流行于全球的HIV-1分为四组，M组、O组、N组和P组，M组内又可分为A～J 10个亚型，各亚型间的基因离散率是20％～35％，同时，还有数十种循环重组型存在。病毒基因组基因分析在HIV研究的很多重大发现中扮演了重要角色，而且高水平的基因变异分析也是艾滋病广谱疫苗研发的重要障碍。因此，高水平的病毒基因获取技术对HIV研究至关重要。
SIV(Simian immunodeficiency virus)是一种猴免疫缺陷病毒，发现于非洲灵长类动物，与HIV-1病毒非常相似。SHIV(Simian-Human immunodeficiency virus)是人/猿嵌合免疫缺陷病毒，是应用分子生物学技术将HIV-1重要基因与SIV重组成的嵌合体病毒。由于恒河猴感染SIV和人感染HIV-1存在着相似性，继而发展出的症状也和AIDS相似，这些特点可以使SIV/恒河猴动物模型用于HIV/AIDS研究。因此，SIV、SHIV病毒基因组序列的获得及分析就显得尤为重要。
起初，人们使用普通PCR(Bulk PCR)扩增早期血浆病毒以获得SIV或SHIV病毒的基因组片段，然后进行Sanger测序。该方法具有简单、易操作及成本低等优势，也得到了急性期和早期病毒群体的大概复杂性。但是，由于SIV病毒或SHIV病毒的基因组序列长度较长，约为10000bp，普通的PCR技术往往存在重组、序列选择及扩增序列有限的问题，这就使扩增所获得的片段会产生一定的突变，降低了精确度，给后续序列分析造成困扰。
因此，需要进一步研究能够精确扩增SIV或SHIV病毒基因组的引物。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种引物组及其在扩增SIV/SHIV基因组中的应用与试剂盒，本发明提供的引物特异性好，精确度高、敏感性高。
本发明提供的引物组包括SEQ ID NO:1～4所示核苷酸序列的4条引物和/或SEQID NO:5～8所示核苷酸序列的4条引物。
本发明提供的引物组在扩增SIV/SHIV基因组的中的应用。
本发明提供的引物组根据SIVmac239全基因组序列(Genbank No.M33262)保守区设计，分别位于LTR和Pol区。其中，SEQ ID NO:1～4所示核苷酸序列的4条引物用于扩增SIV/SHIV基因组的5’半长(基因组全长的509位～6236位，共计5728bp)，SEQ ID NO:5～8所示核苷酸序列的4条引物用于扩增SIV/SHIV基因组的3’半长(基因组全长的5244位～10087位，共计4844bp)。以本发明提供引物组扩增得到的5’半长和3’半长存在重复序列，经测序后能够拼接获得完整的SIVmac239全基因组序列。
本发明提供的引物组能够具有特异性的、稳定而准确的扩增出目标序列。经琼脂糖凝胶电泳检测，未见非特异性条带产生，未见拖尾或弥散现象产生。经测序后与Genbank中登录的SIVmac239全基因组序列比对，匹配度为100％，未见碱基置换或缺失(gap)。
实验表明，本发明提供的引物组对SIV/SHIV基因组具有良好的灵敏性，在病毒拷贝数为100.5～1.0之间皆能起到良好的检测效果，分析认为灵敏性的差异性与病毒序列变异度有关。
本发明还提供了扩增SIV/SHIV基因组的试剂盒，包括本发明提供的的引物组。
本发明提供的引物组以质粒DNA为模板，也可以动物血浆逆转录来的病毒cDNA为模板。作为优选，以病毒cDNA为模板。因此，需提取病毒RNA逆转录制备cDNA。
本发明提供的试剂盒中还包括SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的逆转录引物。
本发明提供的试剂盒中还包括Superscript III酶和High Fidelity Taq酶。
其中，Superscript III酶为逆转录酶。
本发明提供的试剂盒中还包括巢式PCR常用的缓冲液、底物，例如：PCR buffer、Mg2+、dNTP。
本发明提供了扩增SIV/SHIV基因组的方法，其特征在于，包括：以待测样品的cDNA为模板，以本发明提供的引物组扩增。
在本发明实施例中，扩增采用巢式PCR分别扩增SIV/SHIV基因组的5’半长、3’半长。
本发明中SIV/SHIV基因组的5’半长的扩增包括：
步骤1：以待测样品的cDNA为模板，以SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物扩增，获得中间产物；
步骤2：以中间产物为模板，以SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列的引物扩增，获得SIV/SHIV基因组的5’半长。
退火温度(Annealing Temperature)为引物和模板结合时候的温度参数，当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度，它是影响PCR特异性的较重要因素。
作为优选，步骤1中扩增的退火温度为60℃～62℃，步骤2中扩增的退火温度为60℃。
优选的，步骤1中的扩增程序为：
或
优选的，步骤1中的扩增体系为：
优选的，步骤2中的扩增程序为：
优选的，步骤2中的扩增体系为：
在本发明中，SIV/SHIV基因组的3’半长的扩增包括：
步骤1：以待测样品的cDNA为模板，以SEQ ID NO:5～6所示核苷酸序列的引物扩增，获得中间产物；
步骤2：以所述中间产物为模板，以SEQ ID NO:7～8所示核苷酸序列的引物扩增，获得SIV/SHIV基因组的3’半长。
作为优选，步骤1中扩增的退火温度为64℃，步骤2中扩增的退火温度为60℃。
优选的，步骤1中的扩增程序为：
优选的，步骤1中的扩增体系为：
优选的，步骤2中的扩增程序为：
优选的，步骤2中的扩增体系为：
在本发明中待测样品为血浆、组织、细胞或质粒。
本发明提供了用于扩增SIV/SHIV基因组的引物组，该引物组能够有效扩增SIV或SHIV的基因组。本发明提供的引物组能够具有特异性的、稳定而准确的扩增出目标序列。经琼脂糖凝胶电泳检测，未见非特异性条带产生，未见拖尾或弥散现象产生。经测序后与Genbank中登录的SIVmac239全基因组序列比对，匹配度为100％，未见碱基置换或缺失(gap)。实验表明，本发明提供的引物组对SIV/SHIV基因组具有良好的灵敏性，在病毒拷贝数为100.5～1.0之间皆能起到良好的检测效果，分析认为灵敏性的差异性与病毒序列变异度有关。
附图说明
图1示实施例1扩增产物的电泳图；其中，泳道1～8依次示引物对1～8的扩增效果，泳道W示以水为阴性对照的电泳，泳道M示marker；
图2-a示实施例2各组引物以SIVmac239质粒为模板扩增产物(3’半长)的电泳图；其中泳道1～5依次示对照组1～5引物的扩增效果；泳道6示实验组1引物的扩增效果；泳道N示阴性对照，泳道P示阳性对照，泳道M示marker；
图2-b示实施例示表2各组引物以SIVmac239质粒为模板扩增产物(5’半长)的电泳图；其中泳道1～2依次示对照组6～7引物的扩增效果；泳道3示实验组2引物的扩增效果；泳道4～6示对照组8～10引物的扩增效果；泳道N示阴性对照，泳道P示阳性对照，泳道M示marker；
图3-a示表2各组引物以SHIV-KB9质粒为模板扩增产物(3’半长)的电泳图；其中泳道1～5依次示对照组1～5引物的扩增效果；泳道6示实验组1引物的扩增效果；泳道N示阴性对照，泳道P示阳性对照，泳道M示marker；
图3-b示表2各组引物以SHIV-KB9质粒为模板扩增产物(5’半长)的电泳图；其中泳道1～2依次示对照组6～7引物的扩增效果；泳道3示实验组2引物的扩增效果；泳道4～6示对照组8～10引物的扩增效果；泳道N示阴性对照，泳道P示阳性对照，泳道M示marker；
图4-a示表2实验组2引物对的退火温度检测；泳道N示阴性对照，泳道P示阳性对照，泳道M示marker；
图4-b示表2实验组1引物对的退火温度检测；泳道M示以SIVmac239质粒为模板；泳道K示以SHIV-KB9质粒为模板；泳道N示阴性对照，泳道P示阳性对照，泳道Mr示marker；
图5-a示以实验组2的引物组扩增不同模板的扩增效果，S1～S9示以不同毒株感染的细胞上清为模板的编号，其中，S1为SIVmac239感染的细胞上清为模板，S2为SIVmac239-973感染的细胞上清为模板，S3为SIVmac251感染的细胞上清为模板，S3为SHIV-CN97001感染的细胞上清为模板，S4为SHIV-chn19P7感染的细胞上清为模板，S5为SHIV-KB9感染的细胞上清为模板，S6为SHIV-162P3感染的细胞上清为模板，S7为SHIV-162P4感染的细胞上清为模板，S8为SHIV-1157ipd3N4感染的细胞上清为模板，S9为RT-SHIV.感染的细胞上清为模板；
图5-b示以实验组1的引物组扩增不同模板的扩增效果，S1～S9示以不同毒株感染的细胞上清为模板的编号，其中，S1为SIVmac239感染的细胞上清为模板，S2为SIVmac239-973感染的细胞上清为模板，S3为SIVmac251感染的细胞上清为模板，S3为SHIV-CN97001感染的细胞上清为模板，S4为SHIV-chn19P7感染的细胞上清为模板，S5为SHIV-KB9感染的细胞上清为模板，S6为SHIV-162P3感染的细胞上清为模板，S7为SHIV-162P4感染的细胞上清为模板，S8为SHIV-1157ipd3N4感染的细胞上清为模板，S9为RT-SHIV.感染的细胞上清为模板；
图6-a示以感染SIV的猴血浆为模板，以本发明提供的引物组扩增产物(3’半长)电泳图；
图6-b示以感染SIV的猴血浆为模板，以本发明提供的引物组扩增产物(5’半长)电泳图。
具体实施方式
本发明提供了一种引物组及其在扩增SIV/SHIV基因组中的应用与试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的酶、试剂或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本发明所用的质粒SIVmac239中包含SIV基因组的序列，SHIV-KB9中包含SHIV的基因组序列。本发明所采用的SIV/SHIV感染猴血清由中国医学科学院医学实验动物研究所采集分离。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
以SIVmac239质粒为模板，以表1记载的引物扩增。
表1引物序列
| 上游 | 下游 | 扩增片段长度 | |
| 引物对1 | SEQ ID NO:1 | SEQ ID NO:2 | 5728bp |
| 引物对2 | SEQ ID NO:9 | SEQ ID NO:10 | 5398bp |
| 引物对3 | SEQ ID NO:9 | SEQ ID NO:11 | 5381bp |
| 引物对4 | SEQ ID NO:3 | SEQ ID NO:4 | 5103bp |
| 引物对5 | SEQ ID NO:12 | SEQ ID NO:13 | 5022bp |
| 引物对6 | SEQ ID NO:14 | SEQ ID NO:6 | 4811bp |
| 引物对7 | SEQ ID NO:5 | SEQ ID NO:6 | 4842bp |
| 引物对8 | SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:8 | 4766bp |
扩增体系为：
扩增程序为：
扩增产物经1.2％TAE琼脂糖凝胶电泳，结果如图1，其中，泳道1～8依次示引物对1～8的扩增效果，泳道W示以水为阴性对照的电泳，泳道M示marker。如图所示，所得产物未见非特异性条带，未见弥散或拖尾现象。说明使用上述引物对扩增SIVmac239质粒，能够得到预期长度的PCR片段，8对引物对的特异性良好，扩增效率高，可用于病毒序列扩增。
实施例2
采用表2引物，以巢式PCR的方式扩增，第一轮扩增以SIVmac239培养上清为模板，第二轮扩增以第一轮的扩增产物为模板。实验设置2个实验组分别扩增基因组的3’半长和5’半长。另设10个对比组。
表2引物序列
扩增体系为：
扩增程序为：
各组实验经两轮PCR扩增所得产物经1.2％TAE琼脂糖凝胶电泳，结果如图2-a和图2-b。由图可知，实验组1提供的引物对最适用于扩增SIV基因组的5’端，而实验组2提供的引物最适宜用于扩增SIV基因组的3’端。其他引物在扩增时往往易产生非特异性条带。
将实验组1提供引物扩增得到的5’半长与实验组2提供的引物扩增得到的3’半长的扩增产物使用QiagenPCR存化试剂盒存化PCR产物，使用深度测序测定PCR产物序列。所有获得的序列使用Sequencher软件测序，进一步的分析使用CLUSTALW和MASE软件。实验组1和实验组2所提供的引物经巢式PCR后，所得扩增产物纯化后测序，序列与genbank上的SIVmac239序列(Genbank No.M33262)进行比对，比对结果显示，扩增序列与参考序列完全一致，未见碱基的置换或缺失。且扩增片段中未见宿主基因组序列。
实施例3
采用实施例2中表2引物，以巢式PCR的方式扩增，第一轮扩增以SIVmac239质粒为模板，第二轮扩增以第一轮的扩增产物为模板。实验设置2个实验组分别扩增基因组的3’半长和5’半长。另设10个对比组。
扩增体系为：
扩增程序为：
各组实验经两轮PCR扩增所得产物经1.2％TAE琼脂糖凝胶电泳，结果如图3-a和图3-b。由图可知，实验组1提供的引物对最适用于扩增SIV基因组的5’端，而实验组2提供的引物最适宜用于扩增SIV基因组的3’端。对照组引物在扩增时往往易产生非特异性条带。
将实验组1提供引物扩增得到的5’半长与实验组2提供的引物扩增得到的3’半长的扩增产物使用QiagenPCR存化试剂盒存化PCR产物，使用深度测序测定PCR产物序列。所有获得的序列使用Sequencher软件测序，进一步的分析使用CLUSTALW和MASE软件。实验组1和实验组2所提供的引物经巢式PCR后，所得扩增产物纯化后测序，序列与genbank上的SIVmac239序列(Genbank No.M33262)进行比对，比对结果显示，扩增序列与参考序列完全一致，未见碱基的置换或缺失。且扩增片段中未见宿主基因组序列。
实施例4
以SIVmac239和SHIV-KB9病毒为模板，进行巢式PCR扩增。
取实施例2表2中记载的实验组2的引物对，考察退火温度。结果如图4-a。结果说明，第1轮的最佳退火温度是64℃，第2轮的最佳退火温度是60℃。
取实施例2表2中记载的实验组1的引物对，考察退火温度。结果如图4-b。结果说明，第1轮的最佳退火温度是60～62℃，第2轮的最佳退火温度是60℃。
实施例5
将SIV病毒和SHIV病毒分别经10倍梯度稀释，浓度梯度为10-1、10-2、10-3、10-4。分别以本发明提供的实验组1和实验组2的引物对进行扩增，获得浓度的有效范围。判断方法的敏感性。结果如图5-a～图5-b。结果显示，本发明提供的引物组在模板浓度为100.5-1.0之间有效。
实施例6
以实施例2表2实验组1和实验组2的引物扩增感染SIV的猴血浆样品，结果如图6-a～图6-b。结果显示，本发明提供的引物组能够成功扩增SIV病毒的全基因组，且不会产生非特异性条带。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种引物组，其特征在于，包括由SEQ ID NO:1~4所示核苷酸序列组成的4条引物和/或由SEQ ID NO:5~8所示核苷酸序列组成的4条引物。
2.权利要求1所述的引物组在制备扩增SIV/SHIV基因组的试剂中的应用。
3.一种扩增SIV/SHIV基因组的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括由SEQ ID NO:9所示核苷酸序列组成的逆转录引物。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括Superscript III酶和HighFidelity Taq酶。
6.非治疗与诊断目的的扩增SIV/SHIV基因组的方法，其特征在于，包括：以待测样品的cDNA为模板，以权利要求1所述的引物组扩增。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增采用巢式PCR分别扩增SIV/SHIV基因组的5’半长、3’半长。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述SIV/SHIV基因组的5’半长的扩增包括：
步骤1：以待测样品的cDNA为模板，以SEQ ID NO:1~2所示核苷酸序列的引物扩增，获得中间产物；
步骤2：以所述中间产物为模板，以SEQ ID NO:3~4所示核苷酸序列的引物扩增，获得SIV/SHIV基因组的5’半长。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述SIV/SHIV基因组的3’半长的扩增包括：
步骤1：以待测样品的cDNA为模板，以SEQ ID NO:5~6所示核苷酸序列的引物扩增，获得中间产物；
步骤2：以所述中间产物为模板，以SEQ ID NO:7~8所示核苷酸序列的引物扩增，获得SIV/SHIV基因组的3’半长。
10.根据权利要求6~9任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样品为血浆、组织、细胞或质粒。
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