CN109022416A - Hbv-dna检测单克隆质控参考株的制备 - Google Patents

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Abstract

一种用于医学领域的HBV‑DNA检测单克隆质控参考株的制备，其特征在于，取经手术切除的小块HBVDNA阳性肝肿瘤组织，剪成粥样，以0.25％胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化已剪成粥样的肝脏组织细胞30分钟，再进行融合前培养，并在融合前培养、肝细胞与sp2/0融合及融合细胞克隆筛选中均使用SV40LT培养基，从而提高了细胞融合率，制成能通过培养融合细胞而扩增HBV‑DNA的质控参考株。

Description

HBV-DNA检测单克隆质控参考株的制备
技术领域
本发明涉及医学领域一种HBV-DNA检测单克隆质控参考株的制备，主要用于乙肝病毒DNA检测的室内质量控制、室间质量评价及检测系统校准。
背景技术
目前乙型肝炎的诊断和疗效观察除了常规的肝脏功能评价和血清标志物检测外，主要依靠血清HBV-DNA的PCR定量检测。PCR检测HBV-DNA的影响因素多，为保证检测结果的准确性，每次检测必须同时以质控物进行验证，借助质控物检测结果与其原预定值限的比较，确定病例样本检测结果的可靠性。但现在使用的PCR检测质控物价格昂贵，使用周期短，加之有些PCR检测试剂盒并未提供定值质控品，为此，有必要研制理想的PCR检测质控物。
理想质控物的制备条件是：质控物基质与被测样本一致，质控物浓度接近诊断的决定性水平；单批可大量制备获取且稳定性好、靶值或预期结果已定；无已知的生物传染危险性。所以要研制质控物首先要解决的是与被测物同源样本的获取及其批量制备的问题。对于研制PCR检测HBV-DNA的质控物而言，关键是要设计能通过无限扩增HBV-DNA阳性肝细胞而无限扩增HBV-DNA的方法。申请人发现Bodnar等曾报道用端粒酶催化亚单位(hTERT)转染人体组织细胞，实现了永生化，也发现Kirchhoff等报道猴肾病毒的大T抗原(SV40LT)能被用于多种细胞的永生化建株，但Klyono、Jha、Ohnuki和Shay等报道用hTERT或SV40LT致细胞永生化的效率低，且SV40LT转染方法可使被转染细胞的部分染色体不稳定，特别是SV40LT诱发组织细胞永生化的几率很低，大约只有10-8～10-5，申请人也曾反复试验了以hTERT或SV40LT转染HBV-DNA阳性肝肿瘤细胞，以通过建立能无限扩增的肝肿瘤细胞系来无限扩增HBV-DNA，但均未达到预期结果，与文献有关永生化效率低的报道一致。
申请人经多年的试验、研究和文献检索，终于从单克隆抗体的制备技术中受到启发，发现Kohler等曾于1975年将具有抗体产生基因的B淋巴细胞与具有无限扩增性能的骨髓瘤细胞在体外融合，得到兼具骨髓瘤细胞无限繁殖和B淋巴细胞分泌抗体的杂交瘤细胞株，其中来源于B淋巴细胞的抗体产生基因随着杂交瘤的繁殖而扩增，因被用于单克隆抗体的产业化制备而获诺贝尔奖。申请人受上述单克隆抗体制备方法的启发，拟将含HBV-DNA但不能在体外无限生长的肝肿瘤细胞与能在体外无限生长的鼠sp2/0骨髓瘤细胞融合，制备同时植入两细胞全基因组、具有永生化特性的基因移植杂交株，使其中的HBV-DNA随杂交株的无限生长而扩增，进而经杂交株的传代培养、克隆筛选、HBV-DNA验证和克隆化扩增，制备与被测样本HBV-DNA一致的人源性单克隆质控参考株，用于乙肝病毒DNA检测的室内质量控制、室间质量评价及检测系统调试。但上述试验的结果又发现，含有HBV-DNA的肝肿瘤细胞融合率较低，所筛选到的含有HBV-DNA的杂交细胞少，仍不能达到“单批可大量制备获取”的理想质控物的首要制备条件。
发明内容
为了解决长期困绕的HBV-DNA检测质控物难制而贫乏的问题，本发明人提出了本发明。
本发明的目的是要提供乙肝病毒DNA检测单克隆质控参考株，另一目的是要提供乙肝病毒DNA检测单克隆质控参考株的制备方法。
本发明的目的是这样实现的：取经手术切除的小块HBVDNA阳性肝肿瘤组织，剪成粥样，以0.25％胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化30分钟，接种于从PT67细胞培养液过滤制备的含有SV40LT的培养基，培养24h，并在含SV40LT的培养基中与sp2/0进行细胞融合、单克隆筛选、传代扩增，经HBVDNA验证，制备能使HBVDNA随融合细胞的扩增而无限扩增的乙肝病毒DNA检测单克隆质控参考株。
HBVDNA检测是诊断乙型肝炎的常规方法，但要制备可用于其检测质量控制的理想质控物，首选的方法是通过扩增HBVDNA阳性肝细胞而扩增其胞内的HBVDNA。本发明曾试验了以EB病毒转染、猴肾病毒大T抗原基因(SV40LT)转染和端粒酶逆转录酶(hTERT)转染的方法，以通过建立能无限扩增的肝细胞系来制备HBVDNA，也曾试验了以HBVDNA阳性肝肿瘤细胞直接培养、扩增的方法制备HBVDNA以及以HBVDNA阳性肝肿瘤细胞与鼠sp2/0直接融合为杂交瘤细胞来制备HBVDNA，均未获得预期结果，所以本发明在反复试验未果的基础上，在肝细胞与鼠sp2/0融合前增加了0.25％胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化以及从PT67细胞培养液过滤制备的含有SV40LT的培养基培养肝细胞的步骤，并在后续的细胞融合和克隆筛选中均采用含有SV40LT的培养基，其效果是胶原酶能使肝细胞分离为单个细胞，胰蛋白酶能使部分胞壁蛋白消化而易于SV40LT转染，在融合的前、中和后均使用含有SV40LT的培养基从而使SV40LT转染肝细胞而延长肝细胞的存活期，有利于融合细胞的存活，提高了肝细胞的融合率。
具体实施方式
图1是本发明所制的融合细胞克隆图。
在图1中，HBVDNA阳性肝肿瘤细胞经0.25％胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化及SV40LT转染培养，在PEG的作用下，与鼠骨髓瘤细胞融合，经HAT筛选1～2周，在倒置显微镜下拍摄(40X)，得到杂交细胞克隆图。
下面结合图1，对本发明的实施方案作详细的描述。
1、待融合细胞
(1)待融合的肝细胞：手术切除的小块HBV-DNA阳性肝肿瘤组织。
(2)骨髓瘤细胞：鼠SP2/0瘤细胞，购自Sigma公司。
2、实验试剂
(1)DMEM培养基、HAT选择培养基和PEG购自Sigma公司；胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；DMSO(二甲基亚砜)为国产分析纯试剂。
(2)SV40LT病毒载体包装的PT67细胞：购自Gibco公司。
(3)0.25％胰蛋白酶和II型胶原酶：在0.25％胰蛋白酶中配入0.25％II型胶原酶，过滤除菌，4℃保存备用。
(4)SV40LT培养基：以10％FBS的DMEM培养基培养PT67细胞24～48h，以无菌操作过滤分离培养液，再加10％FBS，即为含SV40LT培养基。
(5)HAT培养基：按细胞融合说明书的HAT用量，将HAT配入本发明的SV40LT培养基。
(6)HT完全培养基：按细胞融合说明书的HT用量，将HT配入本发明的SV40LT培养基。
(7)10％FBS的DMEM培养基：常规细胞培养基。
3、融合细胞的准备
(1)HBV-DNA阳性肝肿瘤细胞：取经手术切除的小块HBV-DNA阳性肝肿瘤组织，剪成粥样，以0.25％胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化30分钟，分离消化细胞，接种于从PT67细胞培养液过滤制备的含SV40LT培养基，培养24h，以DMEM培养液调整总细胞数到1×108～2×108，以台盼兰染色、相差显微镜检查活细胞数，活细胞数高于80％者为合格。
(2)sp2/0细胞：融合前一周从液氮罐内取出冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)，立即放入37℃解冻。融化后加入适量完全培养液，1000r/m离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加DMEM培养液，置CO2培养箱培养，3～4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。融合时将SP2/0从培养瓶上吹下，转入离心管中，1000r/m离心5～10min，重复洗涤细胞2次，轻轻敲打混匀，取少量悬液计数，调整好密度，使融合时的密度为80％左右(应用最多的是Sp2/0细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链，细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h)。
4、细胞融合
在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后在无菌条件下将预热的1000μL的30％PEG3000在60s内沿管壁滴加到融合管中，同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25mL基础培养基在3～5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，以1500r/m离心5min，弃去上清，加入50mL HAT培养基，适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
5、融合细胞的筛选
观察96孔板中的细胞生长情况，7～10天后仅为有效融合的细胞能够生长，此时弃去HAT培养基，更换HT完全培养基，继续培养，可观察到圆形光亮的杂交细胞克隆(图1)。
6、杂交细胞的单克隆筛选和克隆化培养
(1)单克隆筛选(亚克隆法)：当细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，去除培养液，选择杂交细胞生长状态良好的培养孔，显微镜下标记细胞生长位置、大小，使用无菌枪头在标注的位置将细胞克隆吸取到新的含SV40LT培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到后面数孔，使后面每个孔中的细胞数为0～1个，37℃，5％CO2培养箱内培养约1周，显微镜下观察细胞生长情况，待后面(倒数)孔中的细胞克隆长满至孔底面积1/10以上时，选择(倒数)后面孔中的细胞再行单克隆筛选，制备单克隆杂交细胞。
(2)克隆化培养：将经上述亚克隆筛选的单克隆杂交细胞在10％FBS的DMEM培养基中传代培养，使杂交细胞扩增到所需细胞数量，以用于筛选肝细胞杂交株。
7、单克隆肝细胞杂交株的筛选
采用PCR等方法检测上述制备的各个肝细胞杂交株克隆，筛选含有目标HBV-DNA等乙肝病毒成份的单克隆细胞，进一步扩大培养。
8、单克隆质控参考株的制备
(1)进一步扩大培养所筛选的单克隆肝细胞杂交株。
(2)进一步准确检测单克隆肝细胞杂交株的HBV-DNA。
(3)配制、分装和标示含有HBV-DNA的单克隆肝细胞杂交株(质控参考株)，置-196℃液氮中冻存备用。
(4)每隔1个月取3支冻存的质控参考株，准确检测HBV-DNA，验证目标基因的稳定性。
(5)每隔1个月取3支冻存的质控参考株，进行复苏培养，观察细胞的存活率及传代培养情况，传5～10代后进行目标基因的检测，验证目标基因的稳定性，稳定者继续冻存。
9、质控参考株HBV-DNA的定值、分装及应用
(1)常规提取质控参考株的HBV-DNA。
(2)以提取液成份按1∶10、1∶100、1∶1000稀释所提取的HBV-DNA，检测3～4次，确定平均值或预期靶值。
(3)以0.5ml/支分装，于-70℃冰箱保存备用。
(4)质控参考株的均一性实验：任意抽取上述分装的质控样本各30支，进行编号。从每支样本中取200μl，共6ml充分混匀，用于批内不精密度的检测，共检测30次。另对1～30号样本分别进行检测，每份样本检测1次，计算测定(总)不精密度。该检测为同一人操作，同一条件下，1次上机完成。对混合样本检测30次的数据和30份样本的检测数据进行统计，将两组数据作方差齐性检验，批内精密度和总精密度差异无统计学意义。
(5)质控DNA样本的稳定性实验：分别取样本各20支，分为4组，每组5支HBV-DNA质控样本，分别按照以下条件放置：①室温(20～26℃)，3d；②冰箱冷藏(2～8℃)，5d；③-20℃14d；④-70℃(不同条件下稳定性对照组)。不同条件下放置的质控样本检测结果P值均＞0.05，差异无统计学意义。对质控物的稳定性进行长期监测，12个月不定期分别对制备的HBV-DNA监测12次，各组间无统计学差异，表明该质控样本长期保存的含量无明显变化。具有很好的稳定性和长期保存性。
(6)随机抽取20支样本-20℃冻存，12个月内不定期检测，每次抽取2支，复融，室温放置15min，漩涡振荡混匀。每份样本从核酸提取开始平行做2份。以-70℃冻存的样本作为长期保存稳定性对照组，与-20℃保存时的检测值作比较，监测质控样本长期保存时HBV-DNA的含量变化。
(7)质控物的生物安全性：将所用血清均按照常规方法进行56℃30min灭活备用，保证质控物无已知的生物传染性。
(8)用于室内质控及质控图的绘制：在同一反应条件下进行检测，每次平行测定3个反应，连续检测20日，确定其靶值，计算平均值、标准差及变异系数。
(9)用于室间质评：由质量管理部门定期用所制的质控物发送到各实验室，考核各实验室对质控物的检测结果。
10、本发明与传统方法的细胞融合效果比较
(1)传统(细胞融合)方法：将手术切除的肝脏组织剪成粥样，生理盐水清洗后接种于常规细胞培养基培养24h，取培养的肝细胞在常规细胞培养基中与sp2/0以PEG融合、HAT筛选细胞克隆，HBV-DNA鉴定，计数HBV-DNA阳性的克隆个数，并计算96孔板中融合细胞的总克隆个数，以总克隆个数除以96，计算细胞融合百分数，即融合率。
(2)本发明(细胞融合)方法：在传统方法的基础上，本发明先以0.25％胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化已剪成粥样的肝脏组织细胞30分钟再进行融合前培养，并在融合前培养、细胞融合和融合细胞(克隆)筛选中均使用SV40LT培养基，然后同传统方法计算融合率。
结果发现，本发明的肝细胞融合率比传统方法明显增加。如表1所示，3例肝细胞标本分别经本发明所述的方法实验，结果在96孔板中融合细胞的克隆个数总共为32个，而传统方法在96孔板中融合细胞的克隆个数总共为6个，两者有明显的差别，说明本发明的肝细胞融合率比传统方法明显增加，提高了细胞融合率，更能实现HBV-DNA检测单克隆质控参考株的批量制备。
表1 本发明与传统细胞融合方法HBV-DNA阳性肝细胞融合率的比较

Claims (4)

1.一种HBV-DNA检测单克隆质控参考株的制备，其特征在于，以0.25％胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化已剪成粥样的肝脏组织细胞30分钟再进行融合前培养，并在融合前培养、肝细胞与sp2/0融合及融合细胞克隆筛选中均使用SV40LT培养基，从而提高了细胞融合率，制成能通过培养融合细胞而扩增HBV-DNA的质控参考株。
2.根据权利要求1所述的HBV-DNA检测单克隆质控参考株的制备，其特征在于，所述质控参考株含有乙肝病毒成份。
3.根据权利要求1所述的HBV-DNA检测单克隆质控参考株的制备，其特征在于，所述质控参考株由HBV-DNA阳性肝细胞与sp2/0融合制成。
4.根据权利要求1、3所述的HBV-DNA检测单克隆质控参考株的制备，其特征在于，所述SV40LT培养基由过滤PT67细胞培养液、再加10％FBS制成。
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