CN103361315A

CN103361315A - 一种稳定表达hbv耐药变异株细胞系及其用途

Info

Publication number: CN103361315A
Application number: CN2012101036035A
Authority: CN
Inventors: 张继明; 张轶俊
Original assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Current assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2012-04-10
Filing date: 2012-04-10
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明属生物技术、微生物动物细胞系领域，涉及一种能够稳定表达HBV耐药变异株细胞系及其用途。本发明采用HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT，定点诱变为阿德福韦耐药基因型A181V后插入切除RSV启动子的pREP10构建成HBV真核表达质粒pREP-HBV-A181V，转染HepG2细胞后通过潮霉素筛选，建立耐药HBV细胞克隆株HepG2.HS181V。该细胞株的保藏编号：CGMCC No.5829，分类命名：人肝癌细胞株。该耐药HBV细胞克隆株能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内有HBV复制，并可以产生感染性HBV颗粒。该细胞系HepG2.HS181V表达HBsAg及HBeAg明显高于Hep2.2.15，细胞上清HBV颗粒水平低于HepG2.2.15。能用于筛选抗药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的HBV细胞模型的建立。

Description

一种稳定表达HBV耐药变异株细胞系及其用途

技术领域

本发明属生物技术、微生物动物细胞系领域，具体涉及一种能够稳定表达HBV耐药变异株细胞系及其用途。

背景技术

HBV细胞模型是筛选抗药物、研究其生物学特点及其与细胞间相互作用的必要工具，在研究有关发病机制、免疫机制、抗病毒药物的筛选中有重要的作用。本领域公知Hep2.2.15细胞是HBV细胞模型开发研究的里程碑，其用含2个HBV头对尾二聚体的pDolt-HBV-1重组载体转染HepG2细胞，经G418筛选后获得一个产高水平HBsAg和HBeAg的细胞克隆，其胞内外均能检测到HBV-DNA以及具有感染性的完整病毒颗粒。目前Hep2.2.15仍是应用最为广泛的HBV细胞模型。近年来以拉米夫定为代表的核苷类似物类抗HBV药物的临床应用在为慢性乙型肝炎(CHB)患者带来福音的同时，也带来了严重的耐药问题，因此，对于HBV耐核苷类药物的分子生物学机制的研究成为重中之重。在HBV耐药株逐年上升的临床背景下，HepG2.2.15显然已经不能完全满足对于耐核苷类药物HBV病毒株的研究，为研究HBV耐药的分子生物学机制以及新的抗HBV药物的筛选，需要建立一种能够稳定表达HBV耐药变异株细胞系。

现有技术公开了耐核苷类药物HBV的基因变异主要集中于反转录区(RT区)，研究显示，目前临床最广泛的耐药病毒株为rtM204V即YVDD变异，可以导致HBV对于拉米夫定(LAM)的敏感性明显下降，可低于对照野毒株越45倍左右。虽然阿德福韦(ADV)可以治疗LAM耐药患者，但ADV诱导的rtA181以及rtN236变异的耐药株相继在临床被发现，明显增加了治疗难度以及医疗成本。由于RT区核苷酸变异可能影响耐核苷类药物HBV变异株的复制能力，由HBV耐药变异株基因构建稳定表达HBV变异株细胞系的难度也相应增高。有学者在含核心启动子1.3-1.7倍体或外源性CMV启动子1.1倍体HBV真核表达载体直接诱变为耐药基因型转染HepG2细胞试图构建HBV变异株细胞系，但总体结果显示，HBV-DNA合成、HBsAg与HBeAg等病毒蛋白以及病毒颗粒释放水平明显低于Hep2.2.15细胞。至今仍未见有关适用目前严重的耐药问题研究的HBV变异株细胞系的报道。本申请在前期构建野生型以及LAM耐药变异型细胞系基础上构建了适合目前严重的耐药问题研究的耐ADV HBV细胞株。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够稳定表达HBV耐药变异株细胞系HepG2.HS181V。

本发明的进一步目的是提供该稳定表达HBV耐药变异株细胞系HepG2.HS181V的医用用途。该细胞系能用于筛选抗HBV药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的HBV细胞模型的建立。

本发明采用HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT(质粒由福建医科大学分子病毒实验室林旭教授馈赠)，其载体骨架为pREP10载体，HBV复制子为含cp启动子以及完整HBV前基因组的HBV1.2倍体，并定点诱变为阿德福韦耐药基因型A181V后插入切除RSV启动子的pREP10构建成HBV真核表达质粒pREP-HBV-A181V。将该质粒转染HepG2细胞后通过潮霉素筛选后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生，并与HepG2.2.15细胞株相比较，确立耐药HBV细胞克隆株HepG2.HS181V的建立。经检测，结果显示该耐药HBV细胞克隆株pREP-HBV-A181V能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内有HBV复制，并可以产生感染性HBV颗粒。与目前广泛使用的Hep2.2.15相比，该细胞系HepG2.HS181V表达HBsAg及HBeAg明显高于Hep2.2.15，细胞上清HBV颗粒水平与略低于HepG2.2.15。该细胞株已于2012年3月6日保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号：CGMCC No.5829，分类命名：人肝癌细胞株。

本发明中，所述的pREP10载体相对优势在于潮霉素Hygromycin抗性基因有利于细胞筛选工作以及EBNA-1基因转录蛋白能够上调含OriP复制原点的真核表达质粒中基因转录和表达。

本发明的细胞株HepG2.HS181V通过下述方法构建，

1.质粒转染HepG2细胞

①细胞培养：HepG2细胞以DMEM培养液培养，

②细胞转染：将处于生长对数期的细胞，以0.25％胰酶消化，吸去胰酶后，制成单个细胞悬液，计数，按5×10⁵细胞/孔的浓度接种至6孔培养板培养，待细胞融合，换无抗生素的培养液，备转染，将Opt iDMEM培养液与Lipofectamin2000转染试剂(Invitrogen)混合，同时将质粒DNA稀释于OptiDMEM培养液中，混匀后室温静置，将稀释的Lipofectamin2000与质粒DNA混和，室温静置，滴加入6孔板中，PBS清洗换培养液，继续培养；

2.潮霉素筛选细胞克隆

①转染后细胞扩大培养，并设空白对照(未转染HepG2细胞)，

②待细胞贴壁后加入潮霉素，

③每3天换液一次，

④待空白对照细胞死亡后观察细胞克隆生长情况，

⑤挑取细胞克隆，以潮霉素继续培养，

⑥待细胞克隆密度至60-70％后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，

⑦获取HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA阳性克隆株，传至6孔培养板以潮霉素继续培养；

3.细胞克隆的有限稀释

定量获得的阳性克隆细胞HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，细胞传至10代左右，行有限稀释法获取更纯净以及高水平表达蛋白细胞克隆，

将处于生长对数期的细胞，以0.25％胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数后细胞密度稀释为10cell/ml，接种96孔含潮霉素培养板，显微镜下观察每孔细胞数，标记只接种1cell的培养孔，继续培养，每周换液一次，2-3周后待细胞密度约60％左右后传至24孔培养板继续培养，待24孔中细胞密度至60-70％后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，将HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平较高的细胞克隆定义为pREP-HBV-A181V。

4.稳定表达A181V变异株的生物学特征及表型耐药分析

1)细胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平检测

HBsAg及HBeAg精确定量试剂盒采用Abbott公司Archipct HBsAg Reagentkit和Archipct HBeAg Reagent kit，HBV-DNA检测采用上海科华生物工程有限公司乙肝病毒核酸定量检测试剂盒，检测步骤按照试剂盒提供说明书，real-timePCR扩增仪采用ABI-7300；

2)细胞内病毒复制检测

细胞总DNA抽提，6孔板中细胞90％汇合度时加入400ul细胞裂解液，37℃过夜，加入等量的酚进行DNA抽提、沉淀后DNA溶解于TE，凝胶电泳后20XSSC转膜，southern-blot杂交，结果显示HBV杂交信号；

3)HBV YVDD变异株细胞表型耐药分析

10⁵cell/孔细胞密度接种12孔板，细胞贴壁后加入核苷类抗病毒药物，拉米夫定设浓度梯度，阿德福韦设浓度梯度，每个浓度梯度设复孔，隔天换液，第10天检测细胞上清HBV-DNA水平，细胞抽提胞内总DNA检测胞内HBV复制情况，

结果显示，细胞上清HBV-DNA水平随LAM浓度梯度升高10⁴下降至10³之下，对LAM敏感性较野生型明显下降。HBV-DNA随ADV浓度上升下降不明显，表明HBV对ADV耐药。

本细胞株具有以下生物学特性

1，该耐药HBV细胞克隆株pREP-HBV-A181V能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内有HBV复制，并可以产生感染性HBV颗粒；

2，与目前广泛使用的Hep2.2.15相比，该细胞系表达HBsAg及HBeAg明显高于Hep2.2.15，细胞上清HBV颗粒水平与略低于HepG2.2.15。

本发明的稳定表达HBV耐药变异株人肝癌细胞株HepG2.HS181V能用于筛选抗药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的HBV细胞模型的建立。

附图说明

图1：pREP-HBV-A181V HBV耐药变异细胞株上清HBsAg、HBeAg和HBV-DNA表达水平，HBsAg水平维持于60-80IU/ml之间，为Hep2.2.15细胞5-10倍左右；HBeAg水平60S/CO之间，为Hep2.2.15细胞5-10倍左右，HBV-DNA维持于10⁴-10⁵之间，略低于Hep2.2.15细胞，并随传代次数增加无明显下降。

图2：pREP-HBV-A181V HBV耐药变异细胞株耐药表型分析，细胞上清HBV-DNA水平随LAM浓度梯度升高10⁴下降至10³之下，但对LAM敏感性较野生型明显下降，HBV-DNA随ADV浓度上升下降不明显，提示HBV对ADV耐药。

图3：Southern-blot结果提示pREP-HBV-A181V胞内HBV复制较HepG2.2.15略高。

具体实施方式

实施例1

本发明的细胞株HepG2.HS181V通过下述方法构建，

1，质粒转染HepG2细胞

①细胞培养：HepG2细胞以DMEM培养液(Gibco公司，含10％小牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.03％谷氨酰胺)培养，

②细胞转染：将处于生长对数期的细胞，以0.25％胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数。按5×10⁵细胞/孔的浓度接种至6孔培养板，培养18-24小时后，待细胞约80-90％融合成片时，换新鲜无抗生素的培养液，准备转染。按照每孔转染2μg的量，将50μl OptiDMEM培养液与5μlLipofectamin2000转染试剂(Invitrogen)混合，同时将2μg质粒DNA稀释于50μl OptiDMEM培养液中，混匀后室温静置5分钟。将稀释的Lipofectamin2000与质粒DNA混和，室温静置20分钟。将混合物均匀滴加入6孔板中，6小时后用PBS清洗2遍后换新鲜培养液，继续培养；

2，潮霉素筛选细胞克隆

①转染后细胞培养24小时后扩大培养至10cm培养皿，并设空白对照(未转染HepG2细胞)，

②待细胞贴壁后加入潮霉素浓度至300ug/ml，

③每3天换液一次，

④约14-21天待空白对照细胞全部死亡后观察细胞克隆生长情况，

⑤挑取细胞克隆至24孔培养板，以潮霉素浓度150ug/ml继续培养，

⑥待24孔培养板中细胞克隆密度至60-70％后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，

⑦获取HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA阳性克隆共4株，将阳性克隆传至6孔培养板以潮霉素浓度150ug/ml继续培养；

3，细胞克隆的有限稀释

获得的阳性克隆中1株细胞克隆HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平较高，经定量后上清HBsAg为60-80IU/ml左右，HBeAg水平60S/CO左右，HBV-DNA水平维持于10⁴-10⁵copies/ml，细胞传至10代左右，行有限稀释法获取更纯净以及高水平表达蛋白细胞克隆，

将处于生长对数期的细胞，以0.25％胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数后细胞密度稀释为10cell/ml，接种96孔培养板，每孔150ul培养基(含潮霉素浓度150ug/ml)，显微镜下观察每孔细胞数，标记只接种1cell的培养孔，继续培养，每周换液一次，2-3周后待细胞密度约60％左右后传至24孔培养板继续培养，待24孔中细胞密度至60-70％后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，将HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平较高的细胞克隆定义为pREP-HBV-A181V，建立了稳定表达HBV耐药变异株HepG2.HS181V。4，稳定表达A181V变异株的生物学特征及表型耐药分析，

1)细胞上清HBsAg、HbeAg以及HBV-DNA水平检测

HbsAg及HbeAg精确定量试剂盒采用Abbott公司Archipct HbsAg Reagentkit和Archipct HbeAg Reagent kit，HBV-DNA检测采用上海科华生物工程有限公司乙肝病毒核酸定量检测试剂盒，检测步骤按照试剂盒提供说明书，real-timePCR扩增仪采用ABI-7300，检测结果如图1所示；

2)细胞内病毒复制检测

细胞总DNA抽提，6孔板中细胞90％汇合度时加入400ul细胞裂解液，37℃过夜(细胞裂解液1XSDS/Pronase buffer，2mg/ml pronase、50mM Tris.HClPh7.5、10mM EDTA、100mM NaCl、0.2％SDS)，加入等量的的酚进行DNA抽提、沉淀后DNA溶解于20ul TE。1.3％凝胶电泳后20XSSC转膜，southern-blot杂交。结果可见HBV杂交信号提示胞内HBV复制(如图3所示)。

3)HBV YVDD变异株细胞表型耐药分析

10⁵cell/孔细胞密度接种12孔板，细胞贴壁后加入核苷类抗病毒药物，拉米夫定设0、0.3uM、1uM、3uM、10uM、30uM 6个浓度梯度，阿德福韦设0、0.5uM、1uM、2uM、5uM、10uM 6个浓度梯度，每个浓度梯度设复孔，隔天换液，第10天检测细胞上清HBV-DNA水平，细胞抽提胞内总DNA检测胞内HBV复制情况，

结果显示，细胞上清HBV-DNA水平随LAM浓度梯度升高10⁴下降至10³之下，对LAM敏感性较野生型明显下降。HBV-DNA随ADV浓度上升下降不明显，表明HBV对ADV耐药(如图2所示)。

Claims

1.一种稳定表达HBV耐药变异株细胞系，其特征是，所述细胞为稳定表达HBV耐药变异株HepG2.HS181V，保藏编号：CGMCC No.5829，分类命名：人肝癌细胞株；具有以下生物学特性：

1)能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内有HBV复制，能产生感染性HBV颗粒；

2)表达HBsAg及HBeAg明显高于Hep2.2.15，细胞上清HBV颗粒水平低于HepG2.2.15。

2.权利要求1的稳定表达HBV耐药变异株细胞系在制备筛选抗HBV药物中的用途。

3.权利要求1的稳定表达HBV耐药变异株细胞系在制备HBV细胞模型中的用途。