CN103361314A

CN103361314A - 一种稳定高复制rtN236T耐ADV HBV变异株细胞系及其用途

Info

Publication number: CN103361314A
Application number: CN201210103594XA
Authority: CN
Inventors: 张继明; 张轶俊
Original assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Current assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2012-04-10
Filing date: 2012-04-10
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明属生物技术、微生物动物细胞系领域，涉及一种稳定高复制rtN236T耐ADV HBV变异株细胞系及其用途。本发明采用HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT，定点诱变为阿德福韦耐药基因型N236T后插入切除RSV启动子的pREP10构建成HBV真核表达质粒pREP-HBV-N236T，转染HepG2细胞后通过潮霉素筛选，建立耐药HBV细胞克隆株HepG2.HS236T。该细胞株的保藏编号：CGMCC No.5830，分类命名：人肝癌细胞株。该耐药HBV细胞克隆株pREP-HBV-N236T能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内HBV复制较高，并可以产生感染性HBV颗粒。该细胞系表达HBsAg及HBeAg明显高于Hep2.2.15，细胞上清HBV颗粒水平高于HepG2.2.15；能用于筛选抗药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的HBV细胞模型的建立。

Description

一种稳定高复制rtN236T耐ADV HBV变异株细胞系及其用途

技术领域

本发明属生物技术、微生物动物细胞系领域，具体涉及一种稳定高复制rtN236T耐ADV HBV变异株细胞系及其用途。

背景技术

HBV细胞模型在研究有关HBV发病机制、免疫机制、抗病毒药物的筛选中有重要的作用，尤其是研究其生物学特点及其与细胞间相互作用的必要工具。目前Hep2.2.15是目前应用最为广泛的HBV细胞模型。所述的Hep2.2.15细胞其用含2个HBV头对尾二聚体的pDolt-HBV-1重组载体转染HepG2细胞，经G418筛选后获得一个产高水平HBsAg和HBeAg的细胞克隆，其胞内外均能检测到HBV-DNA以及具有感染性的完整病毒颗粒。近年来以拉米夫定为代表的核苷类似物类抗HBV药物的临床应用在为慢性乙型肝炎(CHB)患者带来福音的同时，也带来了严重的耐药问题，因此，对于HBV耐核苷类药物的分子生物学机制的研究成为重中之重。在HBV耐药株逐年上升的临床背景下，HepG2.2.15显然已经不能完全满足对于耐核苷类药物HBV病毒株的研究，为研究HBV耐药的分子生物学机制以及新的抗HBV药物的筛选，需要建立一种能够稳定表达HBV耐药变异株细胞系。

目前已知耐核苷类药物HBV的基因变异主要集中于反转录区(RT区)，研究显示，当前临床最广泛的耐药病毒株为rtM204V即YVDD变异，可以导致HBV对于拉米夫定(LAM)的敏感性明显下降，可低于对照野毒株越45倍左右。虽然阿德福韦(ADV)可以治疗LAM耐药患者，但ADV诱导的rtA181以及rtN236变异的耐药株相继在临床被发现，明显增加了治疗难度以及医疗成本。由于RT区核苷酸变异可能影响耐核苷类药物HBV变异株的复制能力，由HBV耐药变异株基因构建稳定表达HBV变异株细胞系的难度也相应增高。有学者在含核心启动子1.3-1.7倍体或外源性CMV启动子1.1倍体HBV真核表达载体直接诱变为耐药基因型转染HepG2细胞试图构建HBV变异株细胞系，但总体结果显示，HBV-DNA合成、HBsAg与HBeAg等病毒蛋白以及病毒颗粒释放水平明显低于Hep2.2.15细胞。至今仍未见有关有适用于实验室及临床实践研究的HBV变异株细胞系的报道。本申请在前期构建野生型以及LAM耐药变异型细胞系基础上构建了适合当前实验室及临床实践研究的耐ADV HBV细胞株。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定高复制rtN236T耐ADV HBV变异株细胞系HepG2.HS236T。

本发明的进一步目的是提供该稳定高复制rtN236T耐ADV HBV变异株细胞系HepG2.HS236T的医用用途。该细胞系能用于筛选抗HBV药物、研究HBV生物学特点及建立与细胞间相互作用的HBV细胞模型。

本发明采用HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT(质粒由福建医科大学分子病毒实验室林旭教授馈赠)，其载体骨架为pREP10载体(该载体相对优势在于潮霉素Hygromycin抗性基因有利于细胞筛选工作以及EBNA-1基因转录蛋白能够上调含OriP复制原点的真核表达质粒中基因转录和表达)。所述HBV复制子为含cp启动子以及完整HBV前基因组的HBV1.2倍体，并定点诱变为阿德福韦耐药基因型N236T后插入切除RSV启动子的pREP10构建成HBV真核表达质粒pREP-HBV-N236T。将该质粒转染HepG2细胞后通过潮霉素筛选后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生，并与HepG2.2.15细胞株相比较后，确立耐药HBV细胞克隆株的建立。检测结果显示，该耐药HBV细胞克隆株pREP-HBV-N236T能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内HBV复制较高，并可以产生感染性HBV颗粒。与目前广泛使用的Hep2.2.15相比，该细胞系表达HBsAg及HBeAg明显高于Hep2.2.15，细胞上清HBV颗粒水平高于HepG2.2.15。该细胞株已于2012年3月6日保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号：CGMCC No.5830，分类命名：人肝癌细胞株。

本发明的细胞株HepG2.HS236T通过下述方法构建，

1.质粒转染HepG2细胞

①细胞培养：HepG2细胞以DMEM培养液，

②细胞转染：将处于生长对数期的细胞，以0.25％胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数，按5×10⁵细胞/孔的浓度接种至6孔培养板，待细胞融合成片时，换新鲜无抗生素的培养液，准备转染，将OptiDMEM培养液与Lipofectamin2000转染试剂(Invitrogen)混合，同时将质粒DNA稀释于OptiDMEM培养液中，混匀后室温静置，将稀释的Lipofectamin2000与质粒DNA混和，室温静置，滴加入6孔板中，PBS清洗换新鲜培养液，继续培养；

2.潮霉素筛选细胞克隆

①转染后细胞培养扩大培养，并设空白对照(未转染HepG2细胞)

②待细胞贴壁后加入潮霉素，l

③每3天换液一次，

④待空白对照细胞全部死亡后观察细胞克隆生长情况，

⑤挑取细胞克隆，以潮霉素继续培养，

⑥待细胞克隆密度至60-70％后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，

⑦获取HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA阳性克隆株，传至6孔培养板以潮霉素继续培养；

3.细胞克隆的有限稀释

定量获得的阳性克隆细胞HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，细胞传至10代左右，行有限稀释法获取更纯净以及高水平表达蛋白细胞克隆；

将处于生长对数期的细胞，以0.25％胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数后细胞密度稀释为10cell/ml，接种96孔培养板，显微镜下观察每孔细胞数，标记只接种1cell的培养孔，继续培养，每周换液一次，2-3周后待细胞密度约60％左右后传至24孔培养板继续培养，待24孔中细胞密度至60-70％后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，将HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平较高的细胞克隆定义为pREP-HBV-N236T；

4.高表达HBV N236T变异株的生物学特征及表型耐药分析

1)细胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平检测

HBsAg及HBeAg精确定量试剂盒采用Abbott公司Archipct HBsAg Reagent kit和Archipct HBeAg Reagent kit，HBV-DNA检测采用上海科华生物工程有限公司乙肝病毒核酸定量检测试剂盒，检测步骤按照试剂盒提供说明书，real-time PCR扩增仪采用ABI-7300；

2)细胞内病毒复制检测

细胞总DNA抽提，6孔板中细胞90％汇合度时加入400ul细胞裂解液，37℃过夜，加入等量的的酚进行DNA抽提、沉淀后DNA溶解于20ul TE，凝胶电泳后20XSSC转膜，southern-blot杂交，结果显示HBV杂交信号；

3)HBV YVDD变异株细胞表型耐药分析

10⁵cell/孔细胞密度接种12孔板，细胞贴壁后加入核苷类抗病毒药物，拉米夫定设浓度梯度，阿德福韦设浓度梯度，每个浓度梯度设复孔，隔天换液，第10天检测细胞上清HBV-DNA水平，细胞抽提胞内总DNA检测胞内HBV复制情况，

结果显示，细胞上清HBV-DNA水平随LAM浓度梯度升高10⁵下降至10⁴左右，对LAM敏感性较野生型明显下降。HBV-DNA随ADV浓度上升下降不明显，表明HBV对ADV耐药。

本细胞株具有以下生物学特性：

1)该细胞株能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内有HBV复制，能产生感染性HBV颗粒；

2)与目前广泛使用的Hep2.2.15相比，该细胞系表达HBsAg及HBeAg明显高于Hep2.2.15，细胞上清HBV颗粒水平低于HepG2.2.15。

本发明的稳定高复制rtN236T耐ADV HBV变异株人肝癌细胞株HepG2.HS236T能用于筛选抗HBV药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的HBV细胞模型的建立。

附图说明

图1：pREP-HBV-N236T HBV耐药变异细胞株上清HBsAg、HBeAg和HBV-DNA表达水平，HBsAg水平维持于80-100IU/ml之间，为Hep2.2.15细胞10倍左右；HBeAg水平90S/CO之间，为Hep2.2.15细胞10-15倍左右，HBV-DNA 维持于10⁵-10⁶之间，略高于Hep2.2.15细胞，并随传代次数增加无明显下降。

图2：pREP-HBV-N236T HBV耐药变异细胞株耐药表型分析，细胞上清HBV-DNA水平随LAM浓度梯度升高10⁵下降至10⁴左右，对LAM敏感性较野生型明显下降。HBV-DNA随ADV浓度上升下降不明显，提示HBV对ADV耐药。

图3：Southern-blot结果提示pREP-HBV-A181V胞内HBV复制明显高于HepG2.2.15

具体实施方式

实施例1

本发明的细胞株HepG2.HS236T通过下述方法构建

1，质粒转染HepG2细胞

①细胞培养：HepG2细胞以DMEM培养液(Gibco公司，含10％小牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.03％谷氨酰胺)培养，

②细胞转染：将处于生长对数期的细胞，以0.25％胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数。按5×10⁵细胞/孔的浓度接种至6孔培养板，培养18-24小时后，待细胞约80-90％融合成片时，换新鲜无抗生素的培养液，准备转染。按照每孔转染2μg的量，将50μl OptiDMEM培养液与5μl Lipofectamin2000转染试剂(Invitrogen)混合，同时将2μg质粒DNA稀释于50μl OptiDMEM培养液中，混匀后室温静置5分钟。将稀释的Lipofectamin2000与质粒DNA混和，室温静置20分钟。将混合物均匀滴加入6孔板中，6小时后用PBS清洗2遍后换新鲜培养液，继续培养；

2，潮霉素筛选细胞克隆

①转染后细胞培养24小时后扩大培养至10cm培养皿，并设空白对照(未转染HepG2细胞)，

②待细胞贴壁后加入潮霉素浓度至300ug/ml，

③每3天换液一次，

④约14-21天待空白对照细胞全部死亡后观察细胞克隆生长情况，

⑤挑取细胞克隆至24孔培养板，以潮霉素浓度150ug/ml继续培养，

⑥待24孔培养板中细胞克隆密度至60-70％后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，

⑦共获取HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA阳性克隆共4株，将阳性克隆传至6孔培养板以潮霉素浓度150ug/ml继续培养；

3，细胞克隆的有限稀释

获得的4株阳性克隆中1株细胞克隆HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平较高，经定量后上清HBsAg为80-100IU/ml左右，HBeAg水平90S/CO左右，HBV-DNA水平维持于10⁵-10⁶copies/ml，细胞传至10代左右，行有限稀释法获取更纯净以及高水平表达蛋白细胞克隆，

将处于生长对数期的细胞，以0.25％胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数后细胞密度稀释为10cell/ml，接种96孔培养板，每孔150ul培养基(含潮霉素浓度150ug/ml)。显微镜下观察每孔细胞数，标记只接种1cell的培养孔，继续培养，每周换液一次。2-3周后待细胞密度约60％左右后传至24孔培养板继续培养。待24孔中细胞密度至60-70％后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，将HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平较高的细胞克隆定义为pREP-HBV-N236T，建立了稳定高复制rtN236T耐ADV HBV变异株人肝癌细胞株HepG2.HS236T。

4，高表达HBV N236T变异株的生物学特征及表型耐药分析

1)细胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平检测

HBsAg及HBeAg精确定量试剂盒采用Abbott公司Archipct HBsAg Reagent kit和Archipct HBeAg Reagent kit，HBV-DNA检测采用上海科华生物工程有限公司乙肝病毒核酸定量检测试剂盒，检测步骤按照试剂盒提供说明书，real-time PCR扩增仪采用ABI-7300，检测结果如图1所示；

2)细胞内病毒复制检测

细胞总DNA抽提，6孔板中细胞90％汇合度时加入400ul细胞裂解液，37℃过夜(细胞裂解液1XSDS/Pronase buffer，2mg/ml pronase、50mM Tri s.HCl Ph7.5、10mM EDTA、100mM NaCl、0.2％SDS)，加入等量的的酚进行DNA抽提、沉淀后DNA溶解于20ul TE，1.3％凝胶电泳后20XSSC转膜，southern-blot杂交。结果如图3所示，HBV杂交信号提示胞内HBV复制，明显高于HepG2.2.15。

3)HBV YVDD变异株细胞表型耐药分析

10⁵cell/孔细胞密度接种12孔板，细胞贴壁后加入核苷类抗病毒药物，拉米夫定设0、0.3uM、1uM、3uM、10uM、30uM 6个浓度梯度，阿德福韦设0、0.5uM、1uM、2uM、5uM、10uM 6个浓度梯度，每个浓度梯度设复孔，隔天换液，第10天检测细胞上清HBV-DNA水平，细胞抽提胞内总DNA检测胞内HBV复制情况；

Claims

1.一种稳定高复制rtN236T耐ADV HBV变异株细胞系，其特征是，所述细胞为稳定高复制rtN236T耐ADV HBV变异株HepG2.HS236T，保藏编号：CGMCC No.5830，分类命名：人肝癌细胞株；具有以下生物学特性：

1)能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内有HBV复制，能产生感染性HBV颗粒；

2)表达HBsAg及HBeAg明显高于Hep2.2.15，细胞上清HBV颗粒水平低于HepG2.2.15。

2.权利要求1的稳定高复制rtN236T耐ADV HBV变异株细胞系在制备筛选抗HBV药物中的用途。

3.权利要求1的稳定高复制rtN236T耐ADV HBV变异株细胞系在制备HBV细胞模型中的用途。