CN1325638C - 高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制备方法 - Google Patents
高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制备方法，由以下步骤组成：(1)载体构建：载体pcDNA3经EcoR V线性化后用牛小肠碱性磷酸酶使其去磷酸化，重组克隆载体p3.6II经Pvu II酶切后获得1.1倍的HBV基因片段，以T4 DNA连接酶连接1.1倍HBV DNA片段和线性化的pcDNA3；转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经抗性筛选、酶切、测序鉴定重组质粒；(2)将含有1.1倍HBV DNA的重组载体利用尾静脉高压注射的方法导入动物体内，建立高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型；(3)模型鉴定。本发明的方法制作过程简单易行，能广泛推广应用；制作过程时间短，对实验动物的损伤小，动物死亡率低；获得的模型能高水平的表达HBsAg，亦能较高水平的表达HBeAg。模型可作为乙肝治疗药物的筛选平台，用于HBV感染的基础研究和临床相关研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种动物模型的制备方法，尤其涉及一种高表达HBsAg的且能较好模拟人类乙型病毒性肝炎的小鼠模型的制备方法。
背景技术
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的一种传染性疾病。目前全世界有大约4亿HBV慢性感染患者；在中国，HBsAg携带率达9.75％，慢性乙型肝炎病人约为3000万，其中10％～20％可发展为肝硬化，1％～5％可演变为肝细胞癌(hepatocellular.carcinoma，HCC)。乙型肝炎是一种免疫性疾病，目前对其发病机制尚不完全清楚；虽然借助细胞模型和动物模型进行了很多体外和体内研究，但是由于这些模型在各方面的限制和缺陷，一直没有取得突破性进展。
HBV感染有高度的种属和组织特异性，人和类人猿是HBV的天然宿主。其原因是病毒黏附以及病毒DNA转录及复制对细胞有严格的要求[参见：Tang H，McLachlan A.Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptorsis a critical determinant of viral tropism.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98：1841-1846.]。类人猿和黑猩猩作为HBV感染模型已得到公认，但价格昂贵，并涉及伦理问题，难以推广。
土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus，WHV)是肝炎病毒发现后第一种被详细描述的哺乳动物和鸟类黄病毒，WHV慢性感染后会发展成严重的肝炎和HCC，其特征性的病理损坏与人类感染HBV后类似。给新生的土拨鼠接种WHV，可获得慢性WHV感染土拨鼠模型[参见：Gerin JL. Experimental WHV infection of woodchucks：an animalmodel of hepadnavirus-induced liver cancer.Gastroenterol Jpn.1990 Sep；25 Suppl2：38-42.]。慢性WHV携带的土拨鼠平均寿命为29个月，最后几乎全部都发展为肝肿瘤。慢性携带WHV的土拨鼠成为HBV感染后抗病毒治疗临床前评价的有价值的动物模型，提供了有用的药代动力学和药效学结果。但是用土拨鼠作动物模型的局限是：WHV与HBV有一定差异，使对乙型肝炎的发病机制和机体应答的研究受到限制。
研究发现树鼩(Tree shrews，Tupaia belangeri chinenesis)可以感染HBV，树鼩感染后HBsAg血症者47％，平均持续7周，HBV DNA阳性率51％，持续41周以上；肝细胞HBV DNA阳性率67％，并存在复制型HBV DNA[参见：严瑞琪，苏建家，黄定瑞，等.人乙型肝炎病毒在树鼩的实验感染及其与HCC发生的关系.中山医科大学学报，1995，16：1-5.]。用感染HBV树鼩的血清可连续传代感染，这种感染传给下一代的平均感染率为94.0％；用乙肝疫苗后可以使88.89％的树鼩不受感染。通过接种不同量的HBV，发现树鼩对HBV感染敏感，认为树鼩可作为一种可靠而有用的动物模型，可用于研究HBV感染及HBV与HCC的关系[参见：Yan RQ，Su JJ，Huang DR，et al.Human hepatitis Bvirus and hepatocellular carcinoma.I.Experimental infection of tree shrewswith hepatitis B virus.J Cancer Res Clin Oncol，1996；122(5)：283-288.]。但国外也有不同报道，将新生树鼩和成年树鼩腹腔接种HBV阳性患者的血清，都在血清中检测到HBsAg，2～4周后血清中检测到抗HBs，抗HBc及抗HBe，而HBsAg消失，类似急性肝炎的病程。说明在树鼩感染HBV是一过性的，HBV的复制和表达水平不高。
鸭乙肝病毒(Duck hepatitis B virus，DHBV)与人HBV属于一个家族，鸭感染DHBV后可作为人类慢性HBV感染的一种动物模型，用于治疗性实验研究[参见：LofgrenB，Vickery K，Zhang YY，et al.2’3’-dideoxy-3’-fluoroguanosine inhibits duckhepatitis B virus in vivo.J Viral Hepat，1996；3(2)：61-65.]。但DHBV的感染过程及其引发的免疫反应与人类HBV感染有很大差别，相关研究结果仅供参考。
随着转基因技术的诞生，国内外许多学者相继建立了各种类型的HBV转基因小鼠(transgenic mouse，Tg鼠)模型[参见：Chisari FV，Pinkert CA，Milich DR，et al.Atransgenic mouse model of the chronic hepatitis B surface antigen carrier state.Science，1985；230(4730)：1157-1160.2.Hu YP，Hu WJ，Zheng WC，et al.Establishment of transgenic mouse harboring hepatitis B virus(adr subtype)genomes.World J Gastroenterol，2001；7(1)：111-114.]，受到各国学者的重视。将HBV目的基因显微注射到小鼠的受精卵，产生稳定整合HBV的小鼠。在目的基因的选取上，可以是HBV全长或超过其基因组的1.3倍HBV，也可以是HBV片段，如前s、s′、c和x基因，用于研究各基因及其表达产物在HBV生活史中的作用。HBV Tg鼠不仅可以研究HBV感染过程和感染后的免疫病理改变[参见：Walter E，Keist R，Niederost B，etal.Hepatitis B virus infection of tupaia hepatocytes in vitro and in vivo.Hepatology，1996，24：1-5.]，还有助于发展新的抗病毒治疗方法。相关研究发现在慢性HBV携带者由于树突状细胞的功能缺陷和缺乏一些必要的细胞因子，不能有效提呈HBsAg，不能清除病毒，导致持续感染[参见：Guidotti LG，Borrow P，Hobbs MV，et al.Viral cross talk：intracellular inactivation of the hepatitis B virus duringan unrelated viral infection of the liver.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：4589-4594.]。但是在所有的HBV Tg鼠都不能检测到细胞内cccDNA，而cccDNA是前基因组及各种长度RNA的转录模板，在HBV的复制过程中起着非常重要的作用，而目前抗病毒治疗主要是在反转录和复制水平抑制病毒DNA，而且HBV是整合在宿主染色体上的，没有经过和靶细胞受体结合穿透的过程，与自然感染不同，应用也受到限制。HBV可在小鼠体内进行复制并表达相关抗原，但由于Tg鼠处于对HBV的特异性耐受状态，并没有肝脏炎症的发生[参见：Farza H，Hadchouel M，Scotto J，et al.Replication andgene expression of hepatitis B virus in a transgenic mouse that contains thecomplete viral genome.J Virol，1988；62(11)；4144-4152.及Choo KB，Liew LN，Chong KY，et al.Transgenome transcription and replication in the liver andextrahepatic tissues of a human hepatitis B virus transgenic mouse.Virology，1991；182(2)：785-792.和Mancini M，Hadchouel M，Davis HL，et al.DNA-mediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surfaceantigen chronic carrier state.Proc Natl Acad Sci USA，1996；93(22)：12496-12501.]，这一缺陷限制了乙型肝炎及HBV相关HCC发病机制的深入研究。
为克服转基因鼠的缺陷，研究者寻求一种模拟HBV自然感染的动物模型。将UPA转基因小鼠和RAG-2基因剔除小鼠杂交，得到的后代被移植入人肝细胞。由于UPA是一种纤维蛋白酶原激活剂，它选择性地在肝细胞表达，使肝细胞中的蛋白质水解，造成UPA小鼠体内肝细胞持续损伤，产生肝再生刺激信号，有利于外源肝细胞的存活。而RAG-2基因剔除小鼠由于缺失重组活化基因RAG-2，T细胞和B细胞不能成熟，不具备完整的体液和细胞免疫功能，对外源肝细胞不排斥。二者杂交的后代兼有以上两种特征，可以支持HBV感染和表达[参见：Dandri M，Burda MR，Torok E，et al.Repopulation ofmouse liver with human hepatocytes and in vivo infection wth hepatitis B virus.Hepatology，2001，22：981-988.]。实验中采用脾内注射人肝细胞悬液，在小鼠血清和肝脏中均检测到HBV各种抗原和复制中间体。该模型可以用于HBV感染过程和治疗的研究，以及肝癌的发生机制，但因采用的是免疫缺陷鼠，不能作为机体和病毒相互作用特别是免疫清除机制的研究。
Wu等[参见：Wu CH，Ouyang EC，Walton C，Liver cell transplantation--novelanimal model for human hepatic viral infections.Croat Med J，2001；42(4)：446-450.]给新生期的大鼠移植人的肝细胞，然后再接种HBV，诱导了对人肝细胞的耐受而但对HBV感染敏感。通过蛋白印迹及免疫组织化学染色在肝组织中检测到能合成人白蛋白的人肝细胞，并且30％的细胞HBsAg及HBV DNA阳性，肝脏中存在共价闭环HBV DNA，这种嵌合了人肝细胞的耐受大鼠可作为HBV感染的动物模型。Galun等[参见：Galun E，Nahor O，Eid A，et al.Human interleukin-6 facilitates hepatitis B virus infectionin vitro and in vivo.Virology，2000；270(2)：299-309.]将正常小鼠进行致死剂量的射线照射，给予SCID鼠的骨髓细胞，然后移植预先经过HBV处理人的肝组织或肝细胞，这样构建的人-鼠嵌合模型血清中可测到HBV DNA。
Takahashi等[参见：Takahashi H，Fujimoto J，Hanada S，et al.Acute hepatitisin rats expressing human hepatitis B virus transgenes.Proc Natl Acad Sci U SA，1995；92(5)：1470-1474.]通过体内转染的方式建立了一种大鼠的动物模型，将HBV重组体(pHBV-HTD，adwR9亚型)阳离子脂质体包裹植入大鼠的肝脏，转染后3～7天，大多数大鼠可检测到HBV病毒颗粒及HBe抗原，2～3周后，血清中转氨酶水平升高、汇管区肝细胞死亡及淋巴细胞浸润，此时血清中检测不到HBV病毒颗粒，其组织及血清学变化类似于人类急性乙型肝炎，这种动物模型可用于研究HBV感染后的致病机制。将富含HBV的人血清经门静脉和尾静脉注入大鼠体内(Wistar大鼠，雄性，7只)，1～2月后，肝组织活检，分别用原位杂交和免疫组化的方法检测到肝细胞中HBV DNA、HBsAg呈阳性，HBV DNA、HBsAg位于肝细胞的胞浆，大多数阳性细胞分布于中央静脉、散在分布于肝小叶中，但未观察到肝细胞病变及炎症的发生，也未检测到病毒和抗原血症，通过这种方法建立了携带人HBV的大鼠实验动物模型[参见：Wang Y，Chen H，Wang F，etal.Rat as an animal model carrying human hepatitis B virus in hepatocytes.ChinMed J(Engl)，1996；109(9)：674-679.]。
Klein等[参见：Klein C，Bock Ct C，Wedemeyer H，et al.Inhibition of hepatitisB virus replication in vivo by nucleoside analogues and siRNA.Gastroenterology，2003；125(1)：9-18.]通过尾静脉给NMRI小鼠注射HBV重组体的裸DNA，结果发现HBV在肝脏特异性表达，10％的肝细胞表现为HBc和HBsAg阳性，血清中可检测到HBeAg、HBsAg和病毒DNA，并能诱导HBV特异性的细胞免疫应答。
综上所述，目前应用的胚胎期转HBV基因动物都对HBV的主要基因产物处于免疫耐受状态，不能引起明显的肝脏炎症；而DHBV、WHV与HBV的生物特性相差较大，研究结果不能直接应用于HBV感染的研究。小鼠饲养方便、繁殖周期短，是理想的实验动物。小鼠对HBV不易感，但HBV可在转基因小鼠体内复制。因此建立一种既能够严格模拟人类乙型病毒性肝炎又能便于推广应用的小鼠动物模型势在必行。
发明内容
针对现有技术存在问题，本发明的目的是克服现有技术中HBV感染动物模型的不足，提供一种包括1.1倍HBV基因的重组载体。
本发明的第二个目的是利用包括1.1倍HBV基因的重组载体，提供一种采用尾静脉高压注射技术制备高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的方法，利用本发明的方法建立的小鼠感染HBV的急性、慢性病毒性肝炎模型将有助于对HBV引发肝炎的发病机制、机体免疫反应、药物治疗等方面的研究。
本发明的高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制备方法，由以下步骤组成：
(1)载体构建：载体pcDNA3经EcoR V线性化后用牛小肠碱性磷酸酶使其去磷酸化，重组克隆载体p3.6II经PvuII酶切后获得1.1倍的HBV基因片段，以T4 DNA连接酶连接1.1倍HBV DNA片段和线性化的pcDNA3；转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经抗性筛选、酶切、测序鉴定重组质粒pcDNA3-HBV1.1；
(2)将含有1.1倍HBV DNA的重组载体pcDNA3-HBV1.1利用尾静脉高压注射的方法导入动物体内，建立高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型；
(3)模型鉴定。
其中，上述的1.1倍的HBV基因组(HBV-DNA)，含3，520个核苷酸，HBV-DNA分为负链即长链、正链即短链，其负链有4个开放读码框架(Open Reading Frame，ORF)：①S基因区，由S基因，前S2(pre-S2)基因、前S1(pre-S1)基因组成，分别编码HBsAg，pre-S、pre-S1及多聚人血清白蛋白受体(PHSA-R)；②C基因区，由前C基因和C基因组成，分别编码HBeAg及HBcAg；③P基因区，编码HBV-DNAp，并具有逆转录酶活性；④X基因区，编码HBxAg，并具有激活HBcAg基因的作用；所用1.1倍的HBV DNA包括了全长的4个ORF。
其中，上述的载体pcDNA3用于哺乳动物细胞表达，长约5.4kb，带有CMV早期启动增强子、多克隆位点及新霉素抗性基因；其多克隆位点上存在EcoR I、HindIII、XholI、EcoR V酶切位点，而CMV启动子则可在多种细胞内获得有效表达。pcDNA3载体中存在免疫激活序列，即两个氨苄抗性基因中的5’-AACGTT-3’序列。免疫激活序列是以CpG为基元的6碱基DNA序列，其中5’端为两个嘌呤、3’端为两个嘧啶时效应最强。免疫激活序列可刺激B细胞活化和抗体的产生，并可刺激淋巴细胞分泌IL-12、IFN-γ和IL-6，其中IL-12和IFN-γ可以促进依赖于TH1的细胞免疫应答；而IL-6则可以进一步促进B细胞活化和抗体的分泌，但以促进细胞免疫为主。
上述包括1.1拷贝HBV DNA的重组真核表达载体由重组克隆载体p3.6II经Pvu II酶切后获得1.1倍的HBV基因片段，再经T4连接酶连接到经酶切后的pcDNA3的EcoR V位点上。这样构建的重组载体既可以高效复制、表达HBV基因，又可激活机体免疫系统，能够诱发肝脏炎症。本室已经将此重组质粒转染肝癌细胞系BEL7402，结果证实可以高效的进行HBV基因的复制、转录，表达高水平的HBsAg、HBeAg，并可检测到病毒颗粒。因此，将这一载体用于小鼠体内基因转染建立肝炎模型，可以很好的模拟人类HBV感染所致肝炎的发生过程与机体免疫反应等。
一种含有1.1倍HBV DNA转染的小鼠模型，它是将含有1.1倍HBV DNA的重组载体利用尾静脉高压注射的方法导入动物体内。所述动物为小鼠。尾静脉高压注射法是本发明所用的关键技术。
尾静脉高压注射[参见：F Liu，YK Song and D Liu.Hydrodynamics-basedtransfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.Gene Therapy(1999)6，1258-1266.]作为一种新的体内基因转染方法，克服了原有的肌肉注射、门静脉注射裸DNA的缺点。目的基因主要在肝细胞中复制、表达，一次注射后基因表达持续时间达到一周，与门静脉注射相比不需手术，操作相对简便。由于转染的基因主要在肝细胞中复制、表达，对于HBV的研究尤其适用。利用这种方法制备乙肝小鼠模型，能够模拟人类乙肝的发病过程及免疫应答情况，为乙肝发病机制的研究、药物筛选与防治方案的选择提供良好的实验平台。
常规的尾静脉高压注射方法：先将小鼠置于高温环境，使尾静脉扩张；注射前用异氟烷麻醉，观察小鼠眼部反射消失；立即在5～8秒内将1.5～2.5ml液体(8～10％体重)经尾静脉匀速注射入小鼠体内，然后将小鼠置于25～28℃。质粒DNA用量为10～100μg，溶液可以是0.9％NS，PBS或Ringer液(147mM NaCl，4mM KCl，1.13mM CaCl2)；尾静脉注射使用26～27.5号针头。
本发明根据所用质粒和动物的实际情况对上述步骤作了改进：所述的尾静脉高压注射方法是先将小鼠置于红外灯下照射，并用75％的乙醇擦拭，使尾静脉扩张(更易于进行尾静脉高压注射)；注射前用乙醚麻醉，观察小鼠眼部反射消失；5秒内将1.4～2.0ml质粒pcDNA3-HBV1.1液体经尾静脉匀速注射入小鼠体内，然后将小鼠置于25～28℃待用。
所述的质粒pcDNA3-HBV1.1用量为20～50μg/ml，溶液使用0.9％NaCl溶液；尾静脉注射使用了儿科临床常用的0.55mm头皮针头，配合1～5ml注射器。
一次尾静脉高压注射后24h之内即可获得急性乙肝模型。在此基础上，本发明提出在首次注射7天后再次进行尾静脉高压注射，并可多次重复，可以获得慢性乙型肝炎模型。
本发明的特点是利用包括1.1倍HBV DNA的真核表达载体建立小鼠肝炎模型。本发明具有以下优点：
(1)制作过程简单易行，能广泛推广应用；
(2)制作过程时间短，对实验动物的损伤小，动物死亡率低；
(3)获得的模型能高水平的表达HBsAg，亦能较高水平的表达HBeAg。能够较好的模拟人类HBV的感染过程，从而为研究HBV感染的动物实验提供动物模型制作方法。
在本发明的基础上，可以利用此模型作为乙肝治疗药物的筛选平台，以及用于乙肝防治的基础研究与临床前实验，进一步研究HBV感染过程中机体免疫系统的变化，探讨乙型肝炎及其相关疾病(如HCC)发生的分子机制等。
附图说明
图1重组载体pcDNA3/1.1HBV的构建策略
图2重组载体pcDNA3/1.1HBV的酶切鉴定电泳图
(1)p3.6II、pcDNA3的酶切鉴定：自左至右依次为1.DL-2000分子量标准；2.pcDNA3以EcoR V酶切，得到线性DNA；3.DL-15000分子量标准；4.p3.6II以Pvu II酶切，得到两个片段，分别为3907bp、2822bp；5.p3.6II以BamH I酶切，线性DNA长度为6729bp；6.p3.6II
(2)pcDNA3/1.1HBV的连接鉴定：自左至右依次为1.pcDNA3/1.1HBV以BamH I酶切，得到6099bp、3254bp的两个片段；2.pcDNA3/1.1HBV以EcoR I酶切，线性DNA长度为9353bp；3.pcDNA3以EcoR I酶切；4.DL-15000分子量标准
图3重组载体pcDNA3/1.1HBV的测序图
图4重组载体pcDNA3/1.1HBV大量提取与纯化的电泳图
自左至右依次为：1.DL-15000分子量标准；2.纯化得到的质粒pcDNA3/1.1HBV；3~6.质粒提取与纯化过程中留取的样品
图5血清谷丙转氨酶(ALT)测定标准曲线
图6血清谷丙转氨酶(ALT)测定结果
图7 ELISA检测HBV抗原(HBsAg、HBeAg)
图8实时定量PCR检测HBV DNA含量
图9肝脏组织切片HE染色观察病理变化
可见肝组织弥漫性淋巴细胞浸润，部分有中性粒细胞浸润；肝细胞呈气球样变，部分细胞有坏死表现。
具体实施方式
制备本发明的包含1.1倍HBV DNA的重组真核表达载体及转染该载体的小鼠模型的方法大体包括如下步骤：
1.包括1.1拷贝HBV DNA的重组真核表达载体由重组克隆载体p3.6II经Pvu II酶切后获得1.1倍的HBV基因片段，再经T4连接酶连接到经酶切后的pcDNA3的EcoR V位点上。重组质粒构建策略见附图1。
2.用德国QIAGEN公司质粒大量提取纯化试剂盒获得纯化的重组质粒pcDNA3/1.1HBV。
3.重组质粒pcDNA3/1.1HBV经尾静脉高压注射进入小鼠体内，建立急性、慢性肝炎模型。
4.模型的鉴定。
采用多方面的指标，力求反映人类乙肝检查的各项指标。包括：
(1)血清谷丙转氨酶(ALT)等肝脏功能指标的测定：直接反映肝脏炎症的程度。
(2)ELISA检测HBV抗原(HBsAg，HBeAg)：反映HBV各抗原的表达水平。
(3)实时定量PCR检测HBV DNA含量：反映HBV DNA的复制水平。
(4)RT-PCR检测HBV基因转录水平。
(5)肝脏HE染色观察病理变化：目前临床诊断肝炎的金标准，直观的反映肝脏病变情况。
(6)肝脏免疫组化检测HBV抗原、抗体表达。
下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明，应该理解的是，所述的实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。
实施例1：重组质粒pcDNA3/1.1HBV的构建
1.材料
含1.1倍乙型肝炎病毒全基因的质粒p3.6II由中国科学院上海生物化学与细胞生物研究所的汪垣教授惠赠。质粒抽提试剂盒、DNA回收试剂盒为Qiagen公司产品。BioPhotometer定量仪为德国Eppendorf公司产品，凝胶自动成像系统为美国AmershamPharmacia Biotech公司产品，ZF-BI型紫外分光光度计由上海长明电子仪器厂制造，HZS-H型恒温水浴振荡器为哈尔滨市东联电子技术开发有限公司产品，数显电热恒温水浴箱(HH·W21·600S)由上海跃进医疗器械厂制造，LKB2103型电泳仪为德国LKB公司产品。
2.方法
(1)以Pvu II酶切质粒p3.6II，获得1.1倍HBV DNA片段：
在Ep管中依次加入双蒸水6μl、酶切缓冲液2μl、质粒p3.6II 10μl、Pvu II 2μl，总体积20μl。离心，37℃水浴3~4小时。加10×loading buffer 2μl终止反应。
(2)pcDNA3经EcoR V线性化后用牛小肠碱性磷酸酶使其去磷酸化。
(3)以T4 DNA连接酶连接1.1倍HBV DNA片段和线性化的pcDNA3：
1.1倍HBV DNA片段和线性化的pcDNA3各5μl，10×T4 buffer 2μl，10mmol/L ATP2μl，T4 DNA连接酶2μl，双蒸水4μl，共20μl，混匀。短暂离心，12℃过夜。
(4)氯化钙法转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，抗性筛选。
(5)酶切、测序鉴定重组质粒。
3.结果
经抗性筛选、酶切、测序鉴定获得大小、目的基因插入方向均正确的重组质粒pcDNA3/1.1HBV。电泳结果见附图2，测序结果见附图3。
实施例2：重组质粒pcDNA3/1.1HBV的扩增、提取与纯化
1.材料
(1)质粒：携带1.1拷贝HBV全基因组的重组质粒pcDNA3/1.1HBV由本实验室构建并保存。重组质粒pcDNA3/1.1HBV保存于大肠杆菌DH5α中。
(2)试剂：质粒大量提取试剂盒为德国QIAGEN公司产品。试剂盒包含QIAGEN-tip500 10个，Buffer P1 1×110ml，Buffer P2 1×110ml，Buffer P3 1×110ml，Buffer QBT 1×110ml，Buffer QC 3×240ml，Buffer QF 1×170ml，RNase A*1×11mg。
(3)仪器：凝胶自动成像系统为美国Amersham Pharmacia Biotech公司产品，ZF-BI型紫外分光光度计由上海长明电子仪器厂制造，HZS-H型恒温水浴振荡器为哈尔滨市东联电子技术开发有限公司产品，数显电热恒温水浴箱(HH·W21·600S)由上海跃进医疗器械厂制造，LKB2103型电泳仪为德国LKB公司产品，微型台式离心机(TGL-16G)为上海医用分析仪器厂制造，J2-21M/E低温高速离心机BECKMAN公司产品，Heraeus低温高速离心机(5804R)、BioPhotometer核酸分析仪(RS 232C)及真空干燥器(5301)均为Eppendorf公司产品。
2.方法
按照试剂盒提供说明书的操作步骤进行。具体如下：
(1)开始前将试剂盒提供的整管RNase A加入Buffer P1，使RNase A终浓度为100μg/ml.
(2)将保存的菌种接种到含有氨苄青霉素的LB(称为LA)固体培养基，挑取单菌落，接种到2～5ml LA液体培养基，37℃水浴振荡(300rpm)培养8小时。
(3)将上述菌液1ml转种到500～1000ml LA液体培养基，37℃水浴振荡(300rpm)培养12～16小时，使细菌数量达到3～4×109/ml，约等于3g/L培养基。
(4)收集到的菌液离心：6000rpm，15min，4℃。离心完毕，将离心管倒置，使上清流干。
(5)10ml Buffer P1重悬沉淀。
(6)加入10ml Buffer P2，颠倒混匀4～6次，室温放置～5min。
(7)加入10ml冰预冷的Buffer P3轻轻颠倒混匀4～6次，冰上放置15～20min。
(8)12,000rpm离心，30min，4℃。迅速转移上清至新的离心管。
(9)将上清再次离心，12,000rpm，15min，4℃。迅速转移上清至新的离心管。(保存120μl样品作电泳)
(10)用10ml Buffer QBT平衡QIAGEN-tip 500，依靠重力使之流过柱子。
(11)将第9步得到的上清加入QIAGEN-tip，使之利用重力流过柱子。(保存120μl样品作电泳)
(12)30ml Buffer QC洗QIAGEN-tip 2次。(保存240μl样品作电泳)
(13)15ml Buffer QF洗脱DNA，用50ml离心管收集洗脱液。(保存240μl样品作电泳)
(14)室温下加入10.5ml(0.7倍体积)的异丙醇，混匀，离心9500rpm，30min，4℃。小心去掉上清。
(15)室温下70％乙醇5ml洗沉淀，离心9500rpm，10min。小心去掉上清。
(16)沉淀置于空气中干燥5～10min，用合适的溶液溶解(例如生理盐水，pH 7.4；PBS，pH8.0或者10mMT ris·Cl，pH 8.5)。
(17)紫外分光光度计测定DNA浓度。
(18)1％琼脂糖凝胶电泳：上述收集的样品分别用1倍体积的异丙醇沉淀，70％的乙醇洗沉淀，10μl TE buffer(pH 8.0)重溶。取2μl上样电泳。
3.结果
(1)DNA浓度测定：1000μg/ml，500μl。OD260/280＝1.75
(2)2％琼脂糖凝胶电泳结果参见附图4。
实施例3：尾静脉高压注射建立小鼠肝炎模型
1.材料
(1)动物：SPF级BALB/c小鼠，4～6周龄，雄性，体重18～22g，由山东大学实验动物中心提供，饲养条件按照SPF级动物标准执行。
(2)试剂：经QIAGEN质粒大量提取试剂盒纯化的pcDNA3-HBV1.1，调整浓度为20～50μg/ml；生理盐水(0.9％NaCl溶液)。
(3)仪器：1ml及5ml注射器；0.55mm针头。
2.方法
(1)尾静脉高压注射：先将小鼠置于高温环境，使尾静脉扩张；注射前用乙醚麻醉，观察小鼠反射情况；5秒内将1.4～2.0ml液体经尾静脉匀速注射入小鼠体内，小鼠置于25～28℃。
(2)经内眦静脉窦取血：于第1、4、7、10天将小鼠用乙醚麻醉，1ml注射器由内眦静脉窦取血0.2～0.5ml，离心分离血清，用于各项指标的检测。
(3)处死小鼠：于第1、4、7、10天将小鼠摘眼球取血、颈椎脱臼处死。取肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺脏及胸腺，-80℃保存。
3.结果
成功的经尾静脉高压注射重组质粒pcDNA3/1.1HBV，小鼠没有因操作死亡；经血清谷丙转氨酶、乙肝表面抗原、e抗原测定，实时定量PCR检测HBV DNA以及肝脏病理证实小鼠肝炎模型建立成功。
实施例4：血清谷丙转氨酶(ALT)测定
1.材料
小鼠血清；丙氨酸氨基转移酶试剂盒(ALT/GPT，赖氏法)由潍坊3V生物工程有限公司生产(试剂1、2、3及标准液)。
2.方法
(1)配制0.4mol/LNaOH溶液：取10mol/L NaOH 40ml，用蒸馏水稀释至1000ml即为0.4mol/LNaOH溶液；
(2)建立标准曲线：
| 加入物(ml) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 生理盐水 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 |
| R1 | 0.50 | 0.45 | 0.40 | 0.35 | 0.30 | 0.25 |
| 标准液 | 0 | 0.05 | 0.10 | 0.15 | 0.20 | 0.25 |
| R2 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 |
| 混匀，37℃水浴20分钟 | ||||||
| 0.4mol/L NaOH | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| 相当于酶活力单位 | 0 | 28 | 57 | 97 | 150 | 200 |
混匀，室温放置10分钟，在505nm波长处，以0号管调零，1cm比色杯比色，记录各管吸光度，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
(3)测定：
| 加入物(ml) | 对照管(B) | 测定管(U) |
| 血清 | 0.1 | 0.1 |
| R1 | --- | 0.5 |
| 37℃水浴30分钟 | ||
| R2 | 0.5 | 0.5 |
| R1 | 0.5 | --- |
| 37℃水浴30分钟 | ||
| 0.4mol/L NaOH | 5.0 | 5.0 |
混匀，室温放置10分钟，在505nm波长处，以蒸馏水调零，测各管吸光度，以(AU-AB)之差查标准曲线得ALT活力单位。
3.结果
用本专利发明的方法建立的小鼠肝炎模型其血清ALT明显升高。标准曲线和标本测定动态结果见附图5及附图6。
实施例5：ELISA检测HBV抗原HBsAg、HBeAg
1.材料
小鼠血清，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)酶免试剂盒
2.方法
(1)配制工作用洗涤液：浓缩洗涤液20ml/瓶，用蒸馏水1∶20稀释后使用；
(2)加样：设空白对照1孔，阴、阳性对照各2孔，分别加阴、阳性对照各50μl和50μl待测样本于相应孔内；
(3)加酶：除空白对照孔外，每孔加1滴(50μl)酶标记物，轻轻振荡，用透明胶条将板孔封好；
(4)温育：37℃水浴30分钟；
(5)洗涤：扣去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置20秒，扣去洗涤液，重复4次后在吸水纸上拍干；
(6)显色：每孔加入底物液A、B各1滴，轻轻振荡封板后，置37℃水浴15分钟；
(7)结果判定：每孔加终止液1滴，用酶标仪检测(波长450nm)各孔OD值(空白孔调零)。
3.结果
检测到了高水平的HBsAg表达，较高水平的HBeAg表达。HBV抗原表达的动态变化见附图7。
实施例6：实时定量PCR检测HBV DNA含量
1.材料
小鼠血清标本，乙型肝炎病毒(HBV)荧光定量PCR检测试剂盒由上海申友生物技术有限责任公司生产；荧光检测使用美国伯乐公司生产的BIO-RAD iCycler。
2.方法
(1)试剂准备：按每个反应取HBV PCR反应液22μl，酶1μl计算加于—总的无菌离心管中，振荡混匀；用微量加样器在每一PCR反应管内加入23μl上述混匀的反应液，存于4℃。
(2)标本裂解(直接裂解法)：取20μl裂解缓冲液加入0.5ml离心管后，再分别加入20μl血清标本、阴性对照、临界对照、阳性对照，混匀。沸水浴10分钟，14000rpm离心10分钟，取上清2μl做PCR反应。
(3)PCR反应：在上述准备的PCR反应管中加入标本DNA 2μl，在PCR热循环仪iCycler上设定如下程序：
| 保温 | 40次循环 | 保温 |
| 37℃ 2分钟 | ①94℃10秒②55℃30秒 | 25℃恒温 |
| 94℃3分钟 | ③72℃40秒 |
55℃时收集荧光信号。
(4)反应完毕，存储结果，进行数据处理。
(5)每次试验均做标准曲线，将曲线相关系数控制在0.99以上。
3.结果
用本方法建立的小鼠乙肝模型HBV DNA阳性，复制拷贝数达到3.5×105。详见附图8。
Claims (7)
1.一种高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制备方法，由以下步骤组成：
(1)载体构建：载体pcDNA3经EcoR V线性化后用牛小肠碱性磷酸酶使其去磷酸化，重组克隆载体p3.6II经Pvu II酶切后获得1.1倍的HBV DNA，以T4 DNA连接酶连接1.1倍HBV DNA片段和线性化的pcDNA3；转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经抗性筛选、酶切、测序鉴定重组质粒pcDNA3-HBV1.1；
(2)将含有1.1倍HBV DNA的重组载体pcDNA3-HBV1.1利用尾静脉高压注射的方法导入动物体内，建立高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型；
(3)模型鉴定。
2.如权利要求1所述的一种高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制备方法，其特征是，所述的1.1倍的HBV DNA含3，520个核苷酸，通常HBV DNA分为负链即长链、正链即短链，其负链有4个开放读码框架(Open Reading Frame，ORF)：①S基因区，由S基因，前S2(pre-S2)基因、前S1(pre-S1)基因组成，分别编码HBsAg，pre-S、pre-S1及多聚人血清白蛋白受体(PHSA-R)；②C基因区，由前C基因和C基因组成，分别编码HBeAg及HBcAg；③P基因区，编码HBV-DNAp，并具有逆转录酶活性；④X基因区，编码HBxAg，并具有激活HBcAg基因的作用；所用1.1倍的HBV DNA包括了全长的4个ORF。
3.如权利要求1所述的一种高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制备方法，其特征是，所述的载体pcDNA3用于哺乳动物细胞表达，长约5.4kb，带有CMV早期启动增强子、多克隆位点及新霉素抗性基因；其多克隆位点上存在EcoR I、HindIII、Xhol I、EcoR V酶切位点，CMV启动子可在多种细胞内有效表达。
4.如权利要求3所述的一种高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制备方法，其特征是，所述的载体pcDNA3中存在免疫激活序列，即两个氨苄抗性基因中的5′-AACGTT-3′序列，所述免疫激活序列是以CpG为基元的6碱基DNA序列，其中5’端为两个嘌呤、3’端为两个嘧啶时效应最强。
5.如权利要求1所述的一种高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制备方法，其特征是，所述的尾静脉高压注射方法是将小鼠置于红外灯下照射，并用75％的乙醇擦拭，使尾静脉扩张；注射前用乙醚麻醉小鼠，观察小鼠眼部反射消失；5秒内将1.4～2.0ml质粒pcDNA3-HBV1.1液体经尾静脉匀速注射入小鼠体内，然后将小鼠置于25～28℃待用。
6.如权利要求5所述的一种高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制备方法，其特征是，所述的质粒pcDNA3-HBV1.1用量为20～50μg/ml，溶液使用0.9％NaCl溶液；尾静脉注射使用儿科临床常用的0.55mm头皮针头，配合1～5ml注射器。
7.如权利要求1所述的一种高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制备方法，其特征是，所述的模型鉴定采用如下指标：
(1)血清谷丙转氨酶(ALT)的测定——肝脏功能指标；
(2)HBV抗原HBsAg或HBeAg的ELISA检测；
(3)HBV DNA含量的实时定量PCR检测；
(4)HBV基因转录水平的RT-PCR检测；
(5)肝脏病理变化——HE染色观察；
(6)HBV抗原、抗体表达——肝脏免疫组化检测。
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