CN104673834B

CN104673834B - 一种乙型肝炎病毒慢性转染模型的构建方法

Info

Publication number: CN104673834B
Application number: CN201410038436.XA
Authority: CN
Inventors: 周晓辉; 彭秀华; 任晓楠; 陈丽香; 徐春华; 方钟
Original assignee: SHANGHAI PUBLIC HEALTH CLINICAL CENTER
Current assignee: SHANGHAI PUBLIC HEALTH CLINICAL CENTER
Priority date: 2013-11-27
Filing date: 2014-01-26
Publication date: 2018-04-24
Anticipated expiration: 2034-01-26
Also published as: CN104673834A

Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种乙型肝炎病毒慢性转染模型的构建方法。本发明方法基于高压水动力法，转染HBV质粒至造模实验鼠（优先采用4～8周龄雄性C3H/HeN），构建HBV慢性转染模型；本发明方法构建获得的乙型肝炎病毒慢性转染模型能用于研究单个或多个基因在HBV发病进程中的具体作用机制，且不需要进行小鼠转基因修饰，无免疫耐受等限制，易于获取、且成本低廉，能解决相关技术领域长期缺乏适宜HBV动物模型的问题，本发明为进一步研究HBV生活史、慢性化机制以及为疫苗与新药的筛选提供良好的动物模型。

Description

一种乙型肝炎病毒慢性转染模型的构建方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及乙型肝炎病毒慢性转染模型，具体涉及一种乙型肝炎病毒慢性转染模型的构建方法。

背景技术

就乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）而言，全球范围内约有20亿感染者，其中3.5亿人成为慢性乙型肝炎病毒携带者，中国约有9000万乙型肝炎病毒携带者。据报道，乙型肝炎病毒慢性感染往往导致肝硬化、肝癌等危害相当严重的疾病；中国每年用于肝炎和肝病的直接医疗费用高达1000多亿元人民币。当前对该病的治疗措施包括核苷类药物如拉米呋定、阿德福韦酯等，但所述药物仅能在一定程度上抑制病毒复制且容易引起病毒耐药突变，而常规干扰素-α（IFN-α）及聚乙二醇化IFN-α只对部分患者（应答率不足30％）有效。因此，当前乙型肝炎仍是威胁我国人民生命健康最大的疾病之一，仍是本领域面临的一个严重的公共卫生问题。

研究显示，HBV是一种非细胞毒性的嗜肝病毒，属于嗜肝DNA病毒科。HBV基因组为3.2kb的松弛环状双链DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）分子，其两条链均不闭合，其中负链较长，含有病毒基因组的全长基因，通过转录和逆转录过程进行复制，有高度的宿主特嗜性和组织特异性。目前HBV确切的致病机理仍不清楚，其中一个重要的影响因素乃是是缺乏理想的乙型肝炎动物模型，该影响因素在很大程度上限制了相关的转化医学研究进展。因此，建立生物学背景清晰、可供模拟人类肝病过程、又易于获取、经济适用的实验模型显得非常迫切，其中包括小动物模型，一个合适的实验模型不仅有利于对其感染机制进行研究，也有助于研发疫苗及更加有效的治疗药物。

现有技术已有公开，针对HBV研究建立的动物感染模型，然而，现有的HBV感染动物模型均存在有较大的局限性。例如，黑猩猩为濒危动物且价格昂贵并涉及伦理学等问题，使用上受到严格限制；实际上，非人灵长类的实验研究在欧洲已经被禁止，美国NIH也不支持；树鼩尽管可感染HBV，但不能持续复制造成慢性感染，与临床实践存在有一定差距；利用其它嗜肝病毒如鸭乙肝病毒建立的感染模型也存在基因转录调控机制不同、禽类与人免疫系统相差较远等问题；通常采用的HBV小鼠模型如转基因小鼠模型、HBV感染人肝嵌合体小鼠模型、急/慢性HBV转染小鼠模型等具有各自的特征，在一定程度上促进了HBV相关研究，但是，这些小鼠模型在免疫致病、疫苗评价和药物筛选等方面仍然存在自身免疫耐受、缺乏免疫系统或者HBV复制水平低、成模率低等需要克服的问题。

有研究采用高压水动力法转染pT-MCS-HBV1.3质粒在B10.D2小鼠建立了HBV急性转染小鼠模型，但是持续时间短（少于15天）；Huang LR等（PNAS,2006;103:17862-7）采用高压水动力法转pAAV/HBV1.2在C57BL/6小鼠建立了慢性感染模型，血中病毒抗原可以维持超过6个月，但是慢性化率较低（<40％），而在BALB/c中则只能构建急性模型（病毒抗原1个月内清除）；Chang W等（World J Gastroenterol,2005;11:6631-7）曾用高压水动力法转染pHBV3.6质粒到8～12周的C3H/HeN小鼠，但也只能构建一个急性转染模型（病毒抗原仅能维持一周）；

综上所述，现有技术基于高压水动力法构建的乙型肝炎病毒转染慢性化成模率模型尚存在需要克服的问题以及有待进一步优化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙型肝炎病毒慢性转染模型的构建方法，以进一步获得理想的乙型肝炎病毒慢性转染模型。

本领域知悉，一些特殊品系动物的出现以及依托它们构建的人类重大疾病动物模型，是感染性疾病转化医学研究的必需工具。本发明的构建方法获得了一种乙型肝炎病毒转染C3H/HeN小鼠模型。

本发明方法采用高压水动力法转染pAAV/HBV1.2质粒到4～8周的C3H/HeN小鼠，结果显示使HBV慢性转染模型成模率明显提高：注射后24周C3H/HeN小鼠慢性化成模率可达90％；本发明方法构建获得的乙型肝炎病毒慢性转染模型能用于研究单个或多个基因在HBV发病进程中的具体作用机制，且不需要进行小鼠转基因修饰，无免疫耐受等限制，易于获取、且成本低廉，能解决相关技术领域长期缺乏适宜HBV动物模型的问题，本发明可为进一步研究HBV生活史、慢性化机制以及为疫苗与新药的筛选提供良好的动物模型。

具体而言，本发明的一种乙型肝炎病毒慢性转染模型的构建方法，其特征在于，基于高压水动力法，转染HBV质粒至造模实验鼠（优先采用4～8周龄雄性C3H/HeN），构建HBV慢性转染模型；其包括步骤：

1，制备HBV质粒质粒

利用大肠杆菌扩增HBV质粒，其包括pAAV/HBV1.2或1.3质粒，所使用载体为腺相关病毒载体pAAV，经过试剂盒抽提获得所需的质粒，并测定质粒浓度和纯度；

2，高压水动力法造模

取SPF级雄性C3H/HeN小鼠，将5～10μg pAAV/HBV1.2或1.3质粒溶于溶于8～12％（体积／小鼠体重）的PBS溶液，快速转染实验鼠；以同周龄C57BL/6小鼠作为对照；

3，监测病毒学指标在小鼠中持续存在的情况，评估慢性化造模成功与否。

本发明方法中，优先采用4～8周龄雄性C3H/HeN小鼠作为造模实验鼠；

本发明方法中的一个实施例中，采用经尾静脉途径3～10秒内快速转染溶有pAAV/HBV1.2或1.3质粒的PBS溶液至造模实验鼠；

本发明方法中，造模所用HBV质粒为含有HBV1.2或1.3HBV质粒(即HBV全基因组1.2拷贝或者1.3拷贝，具有复制能力)，所使用载体为腺相关病毒载体pAAV。

本发明方法中，所述的抽提获得所需的质粒无内毒素、蛋白质或基因组DNA污染。

本发明方法中，在转染质粒后的第三天，采小鼠血分离血清，经ELISA法血清中检测乙肝表面抗原（HBsAg)是否成阳性，以确定转染成功与否；

本发明方法中，在转染质粒16周后HBsAg仍阳性者，确定为HBV慢性转染成功模型。

本发明方法中采用的抽提所需质粒的试剂盒以及所用HBV质粒使用的腺相关病毒载体pAAV均为本领域已知技术。

本发明采用高压水动力法在3～5秒内经尾静脉途径转染小鼠8～12％（体积／小鼠体重）的溶液，其中含有不少于5微克的质粒DNA，由于瞬间的快速物理性冲击导致小鼠肝脏细胞膜通透性瞬间变大，质粒DNA可进入肝细胞内，实现基因的复制、表达。与现有技术的基于C57BL/6小鼠高压水动力法HBV慢性转染模型相比，其优势在于慢性化成模率明显提高：C3H/HeN小鼠转染24周后慢性化成模率仍可达90％，而现有技术的C57BL/6小鼠低于40％，因此，本方法可以较好地建立模拟HBV慢性进程的小鼠模型，为HBV的相关研究奠定基础。

附图说明

图1是.C57BL/6和C3H/HeN小鼠0-34周HBsAg阳性率比较，

其中显示，造模34周时，C3H/HeN小鼠HBsAg阳性率仍然达到90%，而C57BL/6在第24周时就已经将病毒全部清除。

图2是C57BL/6和C3H/HeN小鼠0-24周HBsAg定量结果比较，

其中显示，C3H/HeN小鼠血清中HBsAg含量一直维持在较高水平，C57BL/6小鼠血清中HBsAg含量一直较低，且到第24周时检测不到HBsAg。

图3是C57BL/6和C3H/HeN小鼠0-24周HBeAg结果比较，

其中显示，0-24周不同时间点HBeAg的动态变化，C3H/HeN小鼠均高于C57BL/6小鼠。

图4是C57BL/6和C3H/HeN小鼠0-24周HBV DNA定量检测结果比较，

其中显示，0-24周不同时间点HBV DNA的动态变化，C3H/HeN小鼠均高于C57BL/6小鼠，且呈现出先升高后下降的变化趋势，在第12周时达到峰值后又降低。

具体实施方式

实施例1

1）制备pAAV/HBV1.2或1.3质粒

利用大肠杆菌扩增pAAV/HBV1.2或1.3质粒，并经过试剂盒抽提获得所需的质粒，并测定质粒浓度和纯度；

2.高压水动力法造模

取SPF级4～8周龄雄性C3H/HeN小鼠10只，将5μg pAAV/HBV1.2或1.3质粒溶于溶于8％（体积／小鼠体重）的PBS溶液，快速转染实验鼠经尾静脉途径3～10秒内快速转染至小鼠；以同周龄C57BL/6小鼠作为对照；

3，监测病毒学指标在小鼠中持续存在的情况，评估慢性化造模成功与否，

在转染质粒后的第三天，采小鼠血分离血清，经ELISA法血清中检测乙肝表面抗原（HBsAg)是否成阳性，以确定转染成功与否；

在转染质粒16周后HBsAg仍阳性者，确定为HBV慢性转染成功模型。

实施例2

利用大肠杆菌扩增pAAV/HBV1.2或1.3质粒，并经过试剂盒抽提获得所需的质粒，测定质粒浓度和纯度，确定无内毒素、蛋白质、基因组DNA污染；

.取SPF级4～8周龄雄性C3H/HeN小鼠10只（以同周龄、同性别的C57BL/6小鼠作为对照），将10μg pAAV/HBV1.2或1.3质粒溶于12％（体积／小鼠体重）的PBS溶液，经尾静脉途径3～10秒内快速转染至小鼠，

在质粒注射后的第3天，采集小鼠眼底静脉丛血50μl，经ELISA法血清中检测HBsAg阳性与否，确定高压水动力尾静脉转染质粒成功与否，

对于质粒转染成功的小鼠，每周定期采眼底静脉丛血，持续24周以上，监测其HBsAg的阳性率，0-24周中取5个不同时间点的血清检测HBeAg动态变化、以及血清中的HBVDNA含量；

大于16周HBsAg检测仍呈现阳性的小鼠确定为慢性模型，并比较C57BL/6和C3H/HeN两种品系小鼠阳性率之间的差异；

结果显示，造模过程中C57BL/6和C3H/HeN小鼠均通过快速尾静脉途径转染10μgpAAV/HBV1.2质粒，造模34周时，C3H/HeN小鼠HBsAg阳性率仍然达到90%，而C57BL/6在第24周时就已经将病毒全部清除（如图1所示）；

C57BL/6和C3H/HeN小鼠0-24周HBsAg定量结果显示，C3H/HeN小鼠血清中HBsAg含量一直维持在较高水平，C57BL/6小鼠血清中HBsAg含量一直较低，且到第24周时检测不到HBsAg（如图2所示）；

C57BL/6和C3H/HeN小鼠0-24周不同时间点HBeAg的动态变化结果显示，C3H/HeN小鼠均高于C57BL/6小鼠（如图3所示）；

C57BL/6和C3H/HeN小鼠0-24周不同时间点HBV DNA的动态变结果显示，C3H/HeN小鼠均高于C57BL/6小鼠，且呈现出先升高后下降的变化趋势，在第12周时达到峰值后又降低（如图4所示）。

Claims

1.一种乙型肝炎病毒慢性转染模型的构建方法，其特征在于，基于高压水动力法，转染HBV质粒至造模实验鼠，构建HBV慢性转染模型；其包括步骤：

1)制备HBV质粒

利用大肠杆菌扩增HBV质粒，经过试剂盒抽提获得所需的质粒，并测定质粒浓度和纯度；所述HBV质粒为pAAV/HBV1.2或1.3质粒，所使用载体为腺相关病毒载体pAAV，该腺相关病毒载体pAAV中插入1.2或1.3拷贝的HBV全基因组，

2)高压水动力法造模

取SPF级4～8周龄雄性C3H/HeN小鼠，将5～10μg pAAV/HBV1.2或1.3质粒溶于8～12％体积/小鼠体重的PBS溶液，快速转染至实验鼠；以同周龄C57BL/6小鼠作为对照；

3)监测病毒学指标在小鼠中持续存在的情况，评估慢性化造模成功与否；所构建的HBV慢性转染模型，病毒维持长达16～24周。

2.按权利要求1所述的乙型肝炎病毒慢性转染模型的构建方法，其特征在于，所述的快速转染为经尾静脉途径3～10秒内快速转染溶有pAAV/HBV1.2或1.3质粒的PBS溶液至造模实验鼠。

3.按权利要求1所述的乙型肝炎病毒慢性转染模型的构建方法，其特征在于，所述的抽提获得所需的质粒无内毒素、蛋白质或基因组DNA污染。

4.按权利要求1所述的乙型肝炎病毒慢性转染模型的构建方法，其特征在于，在转染质粒后的第三天，采小鼠血分离血清，经ELISA法血清中检测乙肝表面抗原(HBsAg)是否呈阳性，以确定转染质粒成功与否。

5.按权利要求1所述的乙型肝炎病毒慢性转染模型的构建方法，其特征在于，在转染质粒16周后乙肝表面抗原(HBsAg)仍呈阳性者，确定为HBV慢性转染成功模型。

6.按权利要求1所述的乙型肝炎病毒慢性转染模型的构建方法，其特征在于，所述监测病毒学指标还包括HBV DNA指标。