CN108324930A

CN108324930A - 白介素21（il-21）在制备抗乙型肝炎病毒药物制剂中的用途

Info

Publication number: CN108324930A
Application number: CN201710034888.4A
Authority: CN
Inventors: 谢幼华; 刘晶; 沈忠良; 潘少坤
Original assignee: Shanghai Keyuan Biological Medicine Science And Technology Co Ltd; Fudan University
Current assignee: Shanghai Keyuan Biological Medicine Science And Technology Co Ltd; Fudan University
Priority date: 2017-01-18
Filing date: 2017-01-18
Publication date: 2018-07-27

Abstract

本发明属基因工程和生物医药领域，涉及白介素21新的药用用途，具体涉及白介素21在制备抗乙型肝炎病毒制剂中的用途。本发明经实验证实，通过使用白介素21对乙型肝炎病毒慢性化感染小鼠模型进行干预，可以显著提高乙肝表面抗原（HBsAg）和乙肝e抗原（HBeAg）的转换率，同时能显著降低血清中乙型肝炎病毒DNA载量。白介素21可作为药物前体用于开发新类型抗乙型肝炎病毒药物。

Description

白介素21（IL-21）在制备抗乙型肝炎病毒药物制剂中的用途

技术领域

本发明属基因工程和生物医药领域，涉及白介素21（Interleukin-21，IL-21）新的药用用途，具体涉及白介素21在制备抗乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）药物制剂中的用途。

背景技术

现有技术公开了由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎以肝脏炎性病变为主，并可并发多器官损害。研究显示，HBV感染慢性化为慢性乙型肝炎（CHB）后，还能引发肝纤维化、肝硬化、原发性肝细胞癌（HCC）和肝衰竭，最终导致死亡。据统计显示，随着HBV疫苗的成熟和预防接种的推广，新发HBV感染率显著下降，但全球仍然有3.5亿左右HBV慢性携带者，每年约1百万患者死于HBV感染相关疾病（Lavanchy 2004）；中国属HBV感染高发区，约有1.2亿慢性携带者和3000万慢性乙型肝炎患者（Liu et al.2002）。研究显示，HBV易感宿主仅限于人及黑猩猩。由于动物伦理、经济成本等条件的限制，目前尚无常规实验动物模型能够有效模拟HBV感染、致病等过程。

Yang PL 等的工作（Yang PL et al. 2002）表明，将具有启动病毒转录复制能力的乙肝病毒1.3倍基因组（1.3 mer）插入质粒载体后，利用尾静脉高压水动力注射方法注射入免疫健全小鼠体内可建立HBV急性复制表达小鼠模型；上述模型由于小鼠血清中病毒抗原在注射后10天左右全部转阴，难以用于研究慢性乙型肝炎的形成机制，病毒被快速清除也使得该模型不适合进行抗HBV药物的研发。有研究使用免疫缺陷的小鼠（Yang PL et al.2002）或在质粒载体中引入腺相关病毒序列（Huang LR et al. 2012），能实现HBV在小鼠肝脏的持续性转录复制，然而由于对宿主免疫缺陷或HBV以外病毒序列的严格依赖，此种HBV持续模型同样不适合用于研究慢性乙型肝炎的形成机制或抗HBV药物的研发。

本申请前期的工作开发了一种HBV慢性化小鼠模型和建立该模型所使用的HBV毒株与方法。该HBV毒株为临床分离株（GenBank No. AF100309.1），其1.3拷贝基因组（核苷酸,nucleotide，nt955-3215/1-1950）克隆入通用质粒载体pUC18后命名为BPS；通过尾静脉高压水动力注射法将BPS注射于BALB/c或C57BL/6小鼠后，血清中能够持续检测到HBV的3个主要指标：表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核酸（HBV DNA），且上述指标持续阳性时间可达33周，注射后33周时阳性率可达50%。该模型可用于HBV持续性感染机制的研究，并为抗HBV药物筛选及评估提供重要的动物模型。（专利申请号：CN201610616043.1）

白介素21（Interleukin 21, IL-21）首先由Parrish-Novak报道（Parrish-Novak2000），其主要由激活的CD4+细胞表达和分泌，IL-21的受体IL-21R分布于免疫细胞和非免疫细胞，当IL-21与受体结合后，通过Jak/STAT 通路激活靶基因（Habib T 2002）。IL-21能诱导靶细胞的分化和增值；也能够调控免疫细胞如自然杀伤细胞和细胞毒T细胞，从而破坏感染的细胞（Johnson LD 2009）或肿瘤细胞。IL-21在维持具有功能的CD8+ T细胞免疫中具有重要作用。在慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（ lymphocytic choriomeningitisvirus ，LCMV）感染小鼠实验中，发现IL-21信号通路对于维持效应CD8+ T功能是必须的，同时在IL-21基因缺陷小鼠中，CD8+ T细胞数目显著下调（Yi J S 2009，Frohlich A 2009）。在通过抗病毒治疗慢性乙肝患者过程中，血清中高含量的IL-21可以作为HBeAg血清型转换的指标（Ma S W 2012）。

目前临床治疗慢性乙肝的药物仅限于α干扰素(interferon, IFN)和核苷（酸）类似物，其中，α干扰素（2种）具有抗病毒和免疫调节作用，以皮下注射方式给药，经α干扰素治疗后，HBeAg血清学转换率可达29%~32%，但HBsAg血清学转换率却低于10%；核苷（酸）类似物（5种）具有抑制HBV的逆转录作用，以口服方式给药，经核苷（酸）类似物治疗后血中HBV病毒载量显著下降，且有一定比例的HBeAg血清学转化，但很少出现HBsAg血清学转换；干扰素治疗存在的主要问题是患者应答率较低（仅20-30%的病人存在应答）和不良反应较大，核苷（酸）类似物治疗后易出现耐药，且无法清除肝细胞核中的cccDNA；等等。

基于现有技术中的现状及存在的不足，本申请的发明人拟提供新的治疗药物用于控制并且最终清除HBV，具体涉及白介素21（IL-21）在制备抗乙型肝炎病毒药物中的新的用途。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术中的现状及存在的不足，提供白介素21（IL-21）新的药用用途，具体涉及白介素21（IL-21）在制备抗乙型肝炎病毒制剂中的新的用途。本发明中利用小鼠模型实验验证白介素21（IL-21）可用于抗乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染。

本发明通过以下技术方案实现：

提供抗HBV用的IL-21过表达质粒pIL-21包括核酸序列NM_021782.2和质粒载体pCMV；

所述的过表达质粒pIL-21，通过基因工程方法可将其中核酸序列克隆至pCMV以外的其他质粒中；

所述的细胞因子IL-21表达质粒pIL-21或上述类似构建物，可通过尾静脉高压水动力方法注射入BPS小鼠模型及其他HBV动物模型中，作为抗HBV干预方式；

所述的细胞因子IL-21抗HBV干预方式是通过尾静脉高压水动力方法向小鼠体内注射pIL-21质粒实现，但不限于该导入途径，例如，可将pIL-21或上述类似构建物中的IL-21基因序列插入重组病毒载体后，以重组病毒的形式导入实验动物、感染肝细胞；

所述的细胞因子IL-21抗HBV干预方式是通过向小鼠体内注射携带IL-21基因的载体（质粒或病毒）实现，但不限于该导入途径，例如，可将IL-21基因在细胞系中过表达后制备纯化的蛋白，以IL-21蛋白的形式导入实验动物用于抗HBV治疗药物的应用。

本发明中，所述pIL-21质粒的干预（注射）量为1-25 μg，优选为25 μg；

其中，将所述pIL-21质粒1-25μg溶解于2ml PBS缓冲液中后，进行所述的干预，本发明的实施例中采用尾静脉高压水动力注射干预方式。

本发明中，所述细胞因子IL-21对BPS小鼠模型抗HBV干预4周后能显著提高HBV抗原转换率，以及能显著降低血清中HBV DNA载量。

本发明中，所述BPS小鼠模型为通过尾静脉高压水动力注射法将BPS注射于BALB/c或C57BL/6小鼠后，血清中能持续检测到HBV的3个主要指标（HBsAg、HBeAg和HBV DNA）的小鼠。

本发明中，所述BPS质粒为HBV 临床分离株（GenBank No. AF100309.1）的1.3拷贝基因组插入通用质粒pUC18后获得。

本发明公开了细胞因子IL-21在制备抗乙型肝炎病毒制剂中的用途，经实验证实，本发明所述的细胞因子IL-21在小鼠模型上具有抗HBV的干预治疗作用，试验结果显示，IL-21干预组与对照组比能显著提高HBV小鼠模型中HBV抗原血清学转换率并降低H BV DNA载量：经过两次干预直到观察期结束，IL-21干预治疗组HBsAg血清学转换率（66.67%，4/6）显著高于对照组转换率（16.67%，1/6）；干预治疗组小鼠HBeAg血清学转换率（66.67%，4/6）显著高于对照组（33.33%，2/6）；干预治疗组小鼠血清HBV DNA载量比对照组大约低1个数量级；以及，IL-21干预治疗后病毒抗原转阴的小鼠获得针对HBV的持久保护：干预治疗后实现HBV抗原转阴的小鼠再次进行二次病毒攻击时，病毒抗原（HBsAg和HBeAg）阳转率为0%（4/4）。

本发明经实验证实，通过使用白介素21对乙型肝炎病毒慢性化感染小鼠模型进行干预，可以显著提高乙肝表面抗原（HBsAg）和乙肝e抗原（HBeAg）的转换率，同时能显著降低血清中乙型肝炎病毒 DNA载量。白介素21可作为药物前体用于开发新类型抗乙型肝炎病毒药物。

本发明为进一步优化治疗方法和开发人体中IL-21在抗HBV治疗中的应用奠定了基础；所述的白介素IL-21尤其适于治疗哺乳动物个体（人或小鼠）中的由乙型肝炎病毒尤其是B基因型乙型肝炎病毒引起的乙型肝炎，其包括向所述个体施用细胞因子白介素IL-21。

与现有技术相比，如目前已批准上市的抗HBV的治疗药物仅两类：核苷（酸）类似物能显著降低HBV 病毒载量，但HBsAg血清转换率较低，且易于产生耐药；α干扰素有相对较高的HBsAg血清转换率，但不良反应较大等缺陷，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明提供的IL-21与α干扰素虽都是细胞因子，但属抗HBV治疗药物的新类型。为抗HBV治疗提供了新思路。

2、本发明提供的IL-21在小鼠模型抗HBV治疗中能显著提高HBV抗原转换率和降低HBV DNA载量，并且HBV抗原转阴个体获得针对HBV的持久保护。

附图说明

图1显示了 IL-21用于小鼠模型干预治疗HBV感染，

其中，10μg HBV表达质粒注射6-8周雄性BALB/c，注射后4周，眼眶采血ELISA检测HBsAg、HBeAg和HBV DNA拷贝数，筛选出HBV阳性小鼠后随机分成3组（每组6只），分别在4w.p.i和7 w.p.i.时注射25μg IL-21过表达质粒或对照质粒（Control），而后在多个时间点检测血清中HBsAg（A）、 anti-HBsAg（B）、HBeAg（C）和HBV DNA载量（D）。ELISA检测HBsAg、anti-HBsAg和HBeAg（C），其阈值为均为OD450 = 0.1，检测指标下限以虚线表示。组内抗原和抗体阳性率显示于A、B和C右栏。分别将4 w.p.i、8 w.p.i、12 w.p.i和14 w.p.i的每组中各小鼠血清混合后Taq-man探针法检测血清中HBV DNA拷贝数（D），检测下限为500拷贝/ml；w.p.i. 注射后周数，（weeks post-injection）；geq基因组相当量，（genome equivalent）。

图2 显示了 IL-21干预治疗后病毒抗原转阴的小鼠获得针对HBV的持久保护，

其中，实施例1中IL-21干预治疗后HBsAg阴性至少持续4周的小鼠（n=4）进行二次病毒攻击，再次尾静脉注射10μg BPS质粒，以实施例1中空载质粒对照组小鼠（n=3）为平行对照，之后在多个时间点检测血清中HBsAg（左）、anti-HBsAg（中）和HBeAg（右），ELISA检测HBsAg、anti-HBsAg和HBeAg，其阈值均为OD450 = 0.1，检测指标下限以虚线表示。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施方式中将采用免疫学、分子生物学、微生物学和重组DNA等常规技术，这些均是本领域技术人员所知的，这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N. Glover编辑，1985)；《寡核苷酸合成》(M.J. Gait编辑，1984)；以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C. Weir和C.C. Blackwell编辑，1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例1： IL-21在小鼠模型上抗HBV干预治疗的实验

将10μg HBV表达质粒溶于2ml PBS缓冲液中，通过尾静脉高压水动力法分别注射到40只雄性6-8周BALB/c小鼠中，在4 w.p.i时通过眼眶采血0.2ml。全血用抗凝剂处理，分离出来的血清分别用于HBsAg、anti-HBsAg、HBeAg和HBV DNA检测，其中N只为上述3个指标皆为抗原和核酸阳性且抗体阴性的小鼠，随机选取其中12只小鼠分成2组：IL-21治疗组（n=6）和对照组（n=6），在4 w.p.i和7 w.p.i两个时间点通过尾静脉高压水动力法分别注射25μgIL-21过表达质粒或对照质粒（Control），分别在8个时间点（4.7、5.4、6.8、8.3、9.7、11.1、12.5和14 w.p.i）通过眼眶采血0.2ml。全血用抗凝剂处理，分离出来的血清分别用于HBV相关指标的检测，其中上述8个时间点分离出来的血清均用于检测HBsAg（如图1A所示）、Anti-HBsAg（如图1B所示）和HBeAg（如图1C所示），每份血清单独检测；而只有3个时间点（8.28、12.5和14 w.p.i）的血清用于检测HBV DNA（如图1D所示），且检测时将每组（n=6）各小鼠血清混合后用Taqman探针法检测；

结果如图所示，注射HBV表达质粒4周后HBV 3个指标（HBsAg、HBeAg和HBV DNA）均阳性的12只小鼠血清中HBsAg水平在1.5左右（OD450，1:10稀释）；Anti-HBsAg水平在检测下线（OD450，1:10稀释）；HBeAg水平在0.45左右（OD450，1:10稀释）；HBV DNA在10⁵拷贝/毫升，因此，干预治疗前上述3个指标在IL-21治疗组和对照组中无显著性差异；

经过两次干预后（4 w.p.i和7 w.p.i.），IL-21治疗组小鼠血清中HBsAg显著下降；12.5w.p.i后对照组中的HBsAg先上升后下降，干预组在8.3 w.p.i HBsAg阳性小鼠比例下降到33.33%（2/6），对照组HBsAg阳性小鼠比例下降到83.33%(5/6)，IL-21干预治疗组HBsAg血清学转换率（66.67%，4/6）显著高于对照组转换率（16.67%，1/6）（图1A）；

IL-21干预组在9.7 w.p.i仅有一只小鼠（1/6）出现anti-HBsAg阳性；对照组也仅有一只小鼠（1/6）在8.28 w.p.i出现anti-HBsAg阳性，IL-21干预组（16.67%，1/6）和对照组（16.67%，1/6）之间anti-HBsAg血清学转化率无差异（图1B）；

经过两次干预后（4 w.p.i和7 w.p.i.），IL-21干预组小鼠血清中的HBeAg显著下降，并在11.10 w.p.i降至检测下线；对照组小鼠血清中HBeAg在4~9.7 w.p.i.波动较大，均值维持在0.5~1.2（OD450，1:10稀释）之间，之后显著下降，但平均值仍维持在0.3（OD450，1:10稀释）左右；IL21干预组小鼠的HBeAg阳性率在6.8 w.p.i下降到83.33%（5/6），在8.3 w.p.i下降到33.33%（2/6），之后维持在33.33%（2/6）；对照组小鼠的HBeAg阳性率直到11.1 w.p.i开始下降到83.33%（5/6），在14w.p.i下降到66.67%（4/6）；观察期结束后，IL-21干预组小鼠HBeAg血清学转化率（66.67%，4/6）显著高于对照组（33.33%，2/6）（图1C）；

经过两次干预后（4 w.p.i和7 w.p.i.），IL-21干预组小鼠血清中的HBV DNA迅速下降至10³拷贝/毫升以上，直到观察期结束一直维持在10³拷贝/毫升左右；对照组小鼠血清中的HBV DNA在12.5 w.p.i后略有下降，但依然维持在10⁴拷贝/毫升以上，IL-21干预组小鼠HBV DNA比对照组下降了大约1个数量级（图1D）。

实施例2： IL-21治疗后病毒抗原转阴的小鼠获得针对HBV的持久保护

从实施例1中IL-21干预组中随机选取观察期结束后抗原（HBsAg和HBeAg）持续阴性（>四周）的小鼠（n=4），同时随机选取对照组小鼠（n=3），将10μg HBV表达质粒BPS溶于2ml PBS缓冲液中，通过尾静脉高压水动力法分别注射到实验组和对照组小鼠中，分别在6个时间点（1天、2天、3天、1 w.p.i、2 w.p.i和3 w.p.i）通过眼眶采血0.2ml。全血用抗凝剂处理，分离的血清分别用于HBV相关指标的检测，上述6个时间点分离的血清均用于检测HBsAg、Anti-HBsAg和HBeAg，每份血清单独检测；

结果如图所示，二次注射HBV质粒BPS直到1 w.p.i内，IL-21干预组中所有小鼠的HBsAg（图2A左）和HBeAg（图2A右）部分小鼠（3/4）先上升再下降，1 w.p.i两个指标全部变为阴性直到观察期结束，阳性率为0%（4/4），IL-21干预组中有1只小鼠（25%，1/4）中anti-HBsAg转阳，其余3只小鼠（75%，3/4）的anti-HBsAg一直维持阴性；结果说明实施例1中的IL-21干预不仅在部分小鼠中实现HBV抗原血清学转换，而且该部分IL-21干预成功的小鼠获得了针对HBV的持久保护；

对照组小鼠的HBsAg注射BPS后1天和2天先下降，之后上升，1 w.p.i维持在稳定的水平（图2B左），阳性率为100%（3/3）；对照组小鼠的HBeAg在注射BPS后1-3天先上升（图2B右），之后下降至平均值0.2左右，HBeAg原阳性的小鼠观察期结束后依然为阳性，HBeAg原阴性的小鼠观察期结束后也依然为阴性；对照组小鼠的anti-HBsAg始终维持在阴性水平；

上述实验结果表明了细胞因子IL-21在小鼠模型上抗HBV干预治疗中的作用； IL-21干预能显著提高HBV小鼠模型中HBV抗原血清学转换率并降低HBV DNA载量： IL-21干预组HBsAg血清学转换率（66.67%，4/6）显著高于对照组转换率（16.67%，1/6）；干预组小鼠HBeAg血清学转换率（66.67%，4/6）显著高于对照组（33.33%，2/6）；干预组小鼠血清HBV DNA载量比对照组大约低1个数量级；IL-21干预后病毒抗原转阴的小鼠获得针对HBV的持久保护；所述的白介素IL-21可作为药物前体用于制备新型抗乙型肝炎病毒药物。

Claims

1.白介素21（IL-21）在制备抗乙型肝炎病毒药物制剂中的用途。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的乙型肝炎病毒为B基因型。

3.白介素21（IL-21）在制备用于治疗个体中的乙型肝炎的药物中的用途。

4.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的乙型肝炎由乙型肝炎病毒引起。

5.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的个体是哺乳动物。

6.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的个体是人。

7.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的个体是小鼠。

8.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的乙型肝炎病毒为B基因型。

9.按权利要求3所述的用途，其特征在于，其中所述治疗个体中的乙型肝炎包括向所述个体施用细胞因子白介素21（IL-21）。