CN105343898B

CN105343898B - 一种新型甲肝病毒动物模型的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN105343898B
Application number: CN201510836374.1A
Authority: CN
Inventors: 段招军; 李利利; 虞结梅; 庞立丽
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2015-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2018-11-27
Anticipated expiration: 2035-11-26
Also published as: CN105343898A

Abstract

本发明涉及医学生物学技术领域，具体讲，涉及一种新型甲肝病毒动物模型的构建方法及其应用。本发明的甲肝病毒病毒株的保藏编号为CGMCC NO.11200，甲肝病毒的全序列为SEQ ID NO:1，将该甲肝病毒定量后接种实验动物，从而制备得到所述的动物模型，实验动物为旱獭，并优选美洲旱獭和喜马拉雅旱獭。本发明还涉及该动物模型在甲肝病毒或人类甲肝病毒在体内感染过程、发病机理、药物筛选或疫苗评价研究中的应用。

Description

一种新型甲肝病毒动物模型的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及医学生物学技术领域，具体讲，涉及一种新型甲肝病毒动物模型的构建方法及其应用。

背景技术

动物模型是人们了解病毒复制、病毒感染自然史、病毒持续感染和致病的分子机制，研制有效抗病毒药物和疫苗的工具。我国是肝炎病毒感染较为严重的国家，对动物模型的需求很大。虽然病毒性肝炎已经在有限的疫苗和治疗性的策略中取得了一些进展,但有效的疫苗和治疗性药物研究仍处于起步阶段,这些均由于肝炎病毒的宿主范围非常狭窄,无有效的小型动物作为动物模型,供病原、疫苗和治疗性药物的研究。

甲肝病毒属小RNA病毒科，可引起甲型肝炎，是一种世界范围内流行的一种肠道传染病，感染对象以青少年及儿童为主，其大多表现为亚临床或隐性感染，仅少数人表现为急性甲型肝炎，主要传播途径主要是通过粪一口途径。甲肝病毒在体外较稳定，病毒颗粒在病人粪便中的数量可达到每毫升含10⁸个感染颗粒，且由于其耐酸、碱、高温及有机溶剂，在体外存活时间可长至30天以上，因此也增加了人们感染甲肝病毒的风险。

甲肝病毒在体外可以进行细胞培养，可培养于原狨猴肝细胞或恒河猴胚肾细胞FPhK6株中，也可在肝癌细胞株中增殖。病毒在组织培养细胞中虽可增殖，但不引起明显细胞病变，且增殖速度缓慢，每一代的传代时间长达一个月。因此甲肝病毒动物模型的建立尤为重要。目前对于甲肝病毒的动物模型主要为黑猩猩和狨猴，经口或静脉注射可使动物发生肝炎，并能在肝细胞中检出HAV。在潜伏期和急性期的早期，HAV可随粪便排出。恢复期血清中能检出HAV的相应抗体，但由于灵长类动物来源稀少，繁殖周期长、饲养管理困难、价格昂贵，对实验室的硬性条件要求较高等缺点，严重限制了该模型的普及和应用，从而制约着人们对HAV的进一步深入研究。

旱獭属于啮齿目(Rodentia)松鼠科(Sciuridae)动物，人工饲养管理模式与兔的类似，容易饲养，用该动物作为感染模型，可避免大型动物成本昂贵，对实验设施要求高，且周期长的缺点，是一种适合于建立动物模型的动物。目前已有多个研究成功采用旱獭建立旱獭肝炎病毒感染的动物模型，但尚无研究以旱獭为模型建立甲肝病毒的动物模型。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提出了一种新型甲肝病毒动物模型的构建方法。

本发明的第二发明目的在于提出了该甲肝病毒动物模型的应用。

为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种新型甲肝病毒动物模型的构建方法，此病毒株多聚蛋白区与已知人甲肝病毒氨基酸同源性为67％，同时可以定义为新的甲肝病毒血清型，该甲肝病毒病毒株的保藏编号为CGMCC NO.11200，甲肝病毒的全序列为SEQ ID NO:1，将该甲肝病毒定量后接种实验动物，从而制备得到所述的动物模型。

本发明的第一优选技术方案为：实验动物为旱獭，并优选美洲旱獭和喜马拉雅旱獭。

本发明的第二优选技术方案为：感染动物的方式为接触传播、口服、静脉注射、皮下注射或粘膜给药，并优选口服或静脉注射。本发明的接触传播优选将确诊发病动物与实验动物关在一个饲养笼中。

本发明的第三优选技术方案为：甲肝病毒的接种量为10⁷copies/ml的纯化病毒悬液0.2～0.5ml。

本发明的第四优选技术方案为：感染试验动物后饲养2～3个月并处死，并抽血、收集脏器对模型进行评估。

其中：评估的内容有：

(1)测定血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平和抗甲肝病毒抗体水平；

甲肝病毒抗体水平的测定方法为：将纯化病毒用包被液稀释，包被2h，加入脱脂奶粉封闭，待检测血清1:200稀释后加入包被好的板子，37℃1h；洗涤，加入兔抗旱獭IgG(1:3000)37℃，30min；洗涤，显色10min；终止反应，将板置于酶标仪中，450nm波长测定吸光度。

(2)建立甲肝病毒荧光定量PCR方法，评价粪便、血液和肝脏中病毒的载量；

荧光定量PCR的引物和探针如表1所示：

表1：

引物	序列号	核苷酸序列
			荧光定量PCR上游引物	SEQ ID NO:2	GTCCTCTTTAAGGCACTCAT
荧光定量PCR下游引物	SEQ ID NO:3	TGGGTCAGTCCATCTGGCAAG
			荧光定量PCR探针	SEQ ID NO:4	FAM-CATCTTCATTTCCCTGGCTCTCACC-MGB

(3)建立甲肝病毒负链特异性荧光定量方法，检测粪便、组织和血液中负链甲肝病毒RNA，判断甲肝病毒复制部位和时间变化趋势；

负链特异性荧光定量方法为：首先进行反转录，反转录的反应条件为：65℃5分钟，25℃10分钟，50℃50分钟，72℃15分钟；

然后进行荧光定量PCR；反应条件为：50℃2分钟,95℃10分钟,循环内95℃15秒，58℃30秒，共40个循环。

荧光定量PCR的引物和探针如表2所示：

表2：

(4)制备肝脏的病理切片，观察肝脏病理变化。

甲肝病毒动物模型的构建方法后：

(1)感染病毒后7、15、30、45、60、90天对采集模型动物静脉血，分离血清，血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶随时间变化持续升高；

(2)采用ELISA方法检测血清中HAV抗体水平：模型动物的血清中抗HAV抗体均为明显升高；

(3)采用荧光定量PCR检测粪便、血液和肝脏中病毒的载量：模型动物在3天开始时即开始排毒，在8～10天时达到高峰期，排毒量达到10⁹copies/ml，且持续排毒，说明病毒在体内复制出大量病毒颗粒，通过粪便排出体内；

(4)病理检测：将实验组旱獭分别在15、30、45、60、90天处死，收集其血液和肝脏，处死后肝脏用4％多聚甲醛固定，观察其肝脏病理变化，均有肝细胞颗粒变性；

(5)采用负链特异性的荧光定量方法对粪便和肝脏中的病毒负链RNA进行检测，动物模型的肝脏中有较高水平的病毒复制发生，并可通过粪便排出体外。

本发明还涉及该动物模型在所述甲肝病毒或人类甲肝病毒在体内感染过程、发病机理、药物筛选或疫苗评价研究中的应用。

下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明。

针对现有甲肝病毒动物模型只对黑猩猩和狨猴灵长类动物易感，而灵长类动物又因饲养管理复杂，饲养成本昂贵，数量少、以及维系生态平衡等诸多因素，进而难于获得HAV感染的致病机理及药物和疫苗的研究，本发明提出了一种构建甲肝病毒动物模型的方法和评价方法，本发明的模型建模方便，感染动物易于获得，并且成模率高，为甲肝病毒感染机制的研究和疫苗评价提供一种稳定可靠的动物模型。

本发明在获得一株甲肝病毒的全基因组序列，其序列为SEQ ID NO:1，并获得该病毒的全病毒颗粒，以此病毒为感染源，一次攻毒后，均表现出体温升高、产生甲肝病毒抗体、血液中谷丙转氨酶和谷草转氨酶升高、粪便中持续排毒的现象，排毒时间可达两个月之久，即成功建立该病毒的旱獭感染模型。

本发明模型的建立，对于研究甲肝病毒的致病机制具有重要的作用，例如甲肝病毒及人类甲肝病毒体内感染过程、发病机理等；本发明的动物模型在免疫学及药物和疫苗的研究方面也具有重要作用，可用于药物筛选或疫苗评价。

附图说明：

图1为本发明实施例1中甲肝病毒在对动物攻毒后血液中转氨酶含量变化图；

图2为本发明实施例1中甲肝病毒在对动物攻毒后粪便中病毒载量的变化图；

图3为本发明实施例1中肝脏病理分析结果，图A攻毒后旱獭肝脏病理分析结果，肝脏出现了细胞颗粒样变性；图B为正常未攻毒旱獭肝脏病理分析结果；

图4为本发明实施例1中粪便中病毒负链RNA检测结果；

图5为本发明实施例1中肝脏中病毒负链RNA检测结果。

保藏说明：

本发明中的甲型肝炎病毒株保藏编号为CGMCC NO.11200，分类命名为HepatitisA virus。保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2015年9月29日。

本发明的具体实施方式仅限于进一步解释和说明本发明，并不对本发明的内容构成限制。

具体实施方式

实施例1

1.实验动物的准备：1～3周岁的旱獭饲养；

2.病毒的准备和检测：取土拨鼠粪便加入PBS，制备1:10(W/V)的粪便悬液，加入PBS体积1/10的氯仿，震荡后8000rpm离心取上清液，除去固体杂质，上清液通过0.22μm滤器，尽可能除去颗粒物杂质，便悬液分装后储存于-80℃冰箱备用。

将上述便悬液提取核酸后采用上游引物SEQ ID NO:9；下游引物SEQ ID NO:10进行PCR扩增，并将扩增产物进行测序，确定为本发明中的新型甲肝病毒；引物序列如表3所示：

表3：

引物	序列号	核苷酸序列
			上游引物	SEQ ID NO:9	GATCCACAATATCCAGTTTGGG
下游引物	SEQ ID NO:10	CATGGTGTGCTACATTACTAGG

3.病毒的定量：便悬液提取核酸后，采用本发明中的引物和探针，探针法荧光定量PCR对样本甲肝病毒RNA定量后，将换算后将便悬液稀释至1×10⁷/ml后，储存于-80℃冰箱备用；4.旱獭分组：5只为实验组，标记为WC1、WC2、WC3、WC4、WC5，分别于7、15、30、45、60、90天处死，1只为对照组，在90天处死；

实验组旱獭静脉注射病毒悬液200μl，对照组一只旱獭静脉注射PBS 200μl，感染后的实验组和对照组旱獭在独立通风笼内饲养，以保证每只旱獭之间无交叉感染的可能，饲养一定时间后处死后对动物模型的建立进行评价；

5.旱獭接种病毒后模型评价方法及评价结果

1)接种后7、15、30、45、60、90天对采集旱獭静脉血，分离血清，用生化分析仪检测检测血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平；在不同天数收集的血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶出现异常，在第7天开始升高，在45天达到注射前的3倍，达到最高说明肝功能出现异常，在90天又有一些下降，结果见图1；

2)采用ELISA方法检测血清中HAV抗体水平：将纯化病毒用包被液(20mM NaHCO₃pH9.0)稀释，37℃包被2h，PBS-T洗板3次，每孔加入200μl 5％脱脂奶粉，37℃封闭1h，待检测血清1:200稀释后加入包被好的板子，37℃1h；PBS-T洗3次，加入100μl兔抗旱獭IgG(1:3000)37℃，30min；PBS-T洗3次，TMB显色10min；加入终止液50μl终止反应，将酶标板置于酶标仪中，450nm波长测定吸光度。结果显示5只实验组旱獭血清中检测到抗HAV抗体，对照组旱獭则为阴性。结果见表4；

表4：旱獭抗体ELISA结果

	#1	#2	#3	#4	#5	对照
							OD450	1.65	1.73	1.88	1.76	1.32	0.39

3)采用荧光定量PCR(探针法)检测血清中HAV RNA载量：采用AgPath-ID^TM One-Step RT-PCR Kit(ABI)进行荧光定量PCR，引物序列如表5所示。

20μl体系包括10μl 2X RT-PCR Buffer，25X RT-PCR Enzyme Mix 0.8μl，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物，0.5μl探针，总RNA 4μl，Nuclease-Free Water补至20μl。

反应条件：50℃30分钟，95℃10分钟，40个以下程序的循环：95℃15秒，58℃，30秒。

表5：

结果如下：感染后旱獭的在3天开始时即开始排毒，在8-10天时达到高峰期，排毒量达到10⁹copies/ml，且持续排毒，说明病毒在体内复制出大量病毒颗粒，通过粪便排出体内。其实验结果如图2所示。

4)病理检测：将实验组旱獭分别在15、30、45、60、90天处死，收集其血液和肝脏，对照组旱獭在90天处死收集肝脏，处死后肝脏用4％多聚甲醛固定，观察其肝脏病理变化，结果在5只中均有肝细胞颗粒变性，在45天处死的旱獭肝脏中其变化最为明显。其实验结果如图3所示，其中A为实验组，B为空白对照组。

5)采用负链特异性的荧光定量方法对粪便和肝脏中的病毒负链RNA进行检测，粪便中病毒负链RNA检测方法为：首先采用QIAamp MiniElute Virus spin kit提取粪便中病毒核酸，然后进行反转录，20μl体系包括1μl引物，1μl dNTP Mix，10μl总RNA，65℃5min，然后混合4μl 5×First-Strand Buffer，2μl DTT，0.5μl SS II，0.5μl RNase inhibitor(40U/ul)，Nuclease-Free Water补至20μl后25℃10分钟，50℃50分钟，72℃15分钟；最后采用TaqMan Universal Master Mix II，体系包括10μl TaqManUniversal Master Mix II，1μl上游引物，1μl下游引物，1μl探针，Nuclease-Free Water补至20μl，反应条件为50℃2分钟,95℃10分钟,循环：95℃15秒，58℃30秒，共40个循环。引物序列如表6所示：

表6：

肝脏中病毒负链RNA检测方法为：采用RNeasy Mini Kit提取肝脏中总RNA，然后以采用上述同粪便中病毒负链RNA相同的方法检测；

结果发现在其肝脏中有较高水平的病毒复制发生，并可通过粪便排出体外。其实验结果如图4和图5。图4为粪便中病毒负链RNA检测，图5为肝脏中病毒负链RNA检测结果。

Claims

1.一种甲肝病毒动物模型的构建方法，其特征在于，所述甲肝病毒病毒株的保藏编号为CGMCC NO.11200，所述的甲肝病毒的全序列为SEQ ID NO:1，将所述的甲肝病毒定量后接种实验动物，从而制备得到所述的动物模型。

2.根据权利要求1所述的甲肝病毒动物模型的构建方法，其特征在于，所述的实验动物为旱獭。

3.根据权利要求2所述的甲肝病毒动物模型的构建方法，其特征在于，所述的实验动物为美洲旱獭和喜马拉雅旱獭。

4.根据权利要求1所述的甲肝病毒动物模型的构建方法，其特征在于，所述感染动物的方式为接触传播、口服、静脉注射、皮下注射或粘膜给药。

5.根据权利要求4所述的甲肝病毒动物模型的构建方法，其特征在于，所述感染动物的方式为口服或静脉注射。

6.根据权利要求1所述的甲肝病毒动物模型的构建方法，其特征在于，甲肝病毒的接种量为10⁷copies/ml的纯化病毒悬液0.2～0.5ml。

7.根据权利要求1所述的甲肝病毒动物模型的构建方法，其特征在于，感染试验动物后饲养2～3个月并处死，并抽血、收集脏器对模型进行评估。

8.根据权利要求7所述的甲肝病毒动物模型的构建方法，其特征在于，所述评估的内容有：

(4)制备肝脏的病理切片，观察肝脏病理变化。

9.根据权利要求8所述的甲肝病毒动物模型的构建方法，其特征在于，

所述的甲肝病毒抗体水平的测定方法为：将纯化病毒用包被液稀释，包被2h，加入脱脂奶粉封闭，待检测血清1:200稀释后加入包被好的板子，37℃，1h；洗涤，加入稀释比例为1:3000的兔抗旱獭IgG，37℃，30min；洗涤，显色10min；终止反应，将板置于酶标仪中，450nm波长测定吸光度；

所述的荧光定量PCR方法为：上游引物序列为SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，下游引物引物序列为SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，探针序列为SEQ ID NO:4所示核苷酸序列，SEQID NO:4所示核苷酸序列的5’端有FAM基团修饰，3’端有MGB基团修饰；

所述的负链特异性荧光定量方法为：首先进行反转录，引物为SEQ ID NO:5所示核苷酸序列；然后进行荧光定量PCR，上游引物为SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，下游引物为SEQ IDNO:7所示核苷酸序列，探针序列为SEQ ID NO:8所示核苷酸序列，SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的5’端有荧光基团FAM修饰，3’端有荧光基团MGB修饰。

10.根据权利要求8所述的甲肝病毒动物模型的构建方法，其特征在于，

(1)感染病毒后7、15、30、45、60、90天采集模型动物静脉血，分离血清，血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶随时间变化持续升高；

(3)采用荧光定量PCR检测粪便、血液和肝脏中病毒的载量：模型动物在3天开始时即开始排毒，在8～10天时达到高峰期，排毒量达到10⁹copies/ml，且持续排毒；

11.如权利要求1所述的动物模型在阐述所述甲肝病毒或人类甲肝病毒在体内感染过程或发病机理中的应用。

12.如权利要求1所述的动物模型在药物筛选或疫苗评价中的应用，其特征在于，所述药物和疫苗针对权利要求1所述的甲肝病毒或人类甲肝病毒。