CN114731988B - 一种hbv感染的树鼩模型构建方法及树鼩模型 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种动物模型，公开了一种HBV感染的树鼩模型构建方法，其具体包括对以下步骤：步骤S1、对细胞株分别进行复苏、传代培养及冻存；步骤S2、制取HBV培养液；步骤S3、进行HBV活性评估并筛选HBV培养液有效滴度；步骤S4、获取感染HBV的培养基；步骤S5、筛选出有效HBV上清液浓度；步骤S6、设置实验分组；步骤S7、构建动物模型并根据实验数据得到实验结论。本发明通过构建HBV感染的树鼩模型，能够有效解决因缺乏HBV稳定有效的动物模型，致使对HBV持续感染、致病机制研究及抗病毒药物的开发和评价的相对滞后等问题，对乙型肝炎、肝纤维化、肝硬化及肝癌等疾病的进一步研究具有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种动物模型的构建，尤其涉及了一种HBV感染的树鼩模型构建方法及树鼩模型。
背景技术
乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）是乙型肝炎的病原体，属嗜肝 DNA病毒科，通过逆转录的方式进行自我复制，并受到病毒和宿主因子的精确调控。HBV 感染肝细胞可引起急慢性肝炎，甚至是严重的肝硬化和肝癌等，估计全世界慢性感染该病毒的人数超过 2.5 亿，严重危机人类的生命安全。中国是 HBV 感染的高危地区，有近1亿 HBV 携带者，其中 20％ ~30％患有肝硬化和肝癌等严重疾病，呈逐年递增趋势且中国HCC 的发生率占世界的 55%，约 90% 为乙肝肝炎相关的肝癌。HBV致病机制研究早已成研究热点，但该研究目前仍受到体内实验模型构建的限制。
自1965年至1979年国外相关学者研究发现HBV后正式予以命名，直至 1988 年国外学者才首次报道 国HBV-DNA 基因分型，不同的毒株长期与环境间的突变进化，导致了A－H 等 8 种分型。其中，HBV基因组包含4个相互重叠的开放读码框(Open reaadingframe,ORF):preS/S、preC/C、P和X，SORF 具有 HBS，preS1 和 preS2 基因，它们编码三种病毒包膜蛋白；P ORF 编码病毒聚合酶(HBP)；C ORF 包含负责病毒核心蛋白（HBC）和 HBe蛋白表达的 C 和前核基因；X 是 编码 HBV X 蛋白（HBX）的最小 ORF。ORF编码HBV各种蛋白包括：乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B surface antigen,HBsAg)、乙肝病毒核心抗原(Hepatitis B core antigen,HBcAg)及乙肝病毒Ｘ蛋白(Hepatitis B X antigen,HBx)等，其中 HBcAg 及 HBsAg属于结构蛋白，而 HBx属于调控蛋白。这些蛋白调控宿主细胞增殖、侵袭、分化、表观遗传特征、染色质稳定等，而HBX通过调节多种宿主因子的表达和活性来调节肿瘤发生，被认为是癌症的辅助因子。同时，目前研究发现乙肝病毒中HBx蛋白可能与基因型 C 和原发性肝癌 (HCC) 的高发生率有一定相关性，并且可以不依赖肝硬化的发生。
目前研究发现，HBV-DNA基因型不同，基因型的临床和病理特征也不同，基因型会影响慢性乙型病毒性肝炎的预后和抗病毒治疗的成功。目前慢性乙型病毒性肝炎已在亚洲的高流行人群中进行了深入研究，在亚洲HBV-DNA 基因型 B 和 C 基因型占主导地位，我国HBV-DNA 基因型 C和B型为主。近期王超、刘超等学者进行临床研究表明，在HBV-DNA 基因型与肝癌及HBV-DNA 载量的相关性研究中，HBV C 型在乙肝相关的肝癌患者中占有更高的比例和突变率，相较 B 型也有更高的突变率；在HBV-DNA基因分型与 HBV-DNA 载量的关系中 B 型HBV-DNA 载量水平明显低于 C 型和混合型。因此，进一步研究高致病亚型HBV感染，对乙肝临床治疗具有重大意义。
因HBV存在多亚型及突变情况，目前临床上尚未找到有效的治愈乙型肝炎的有效方法，加之乙型肝炎病程长，容易发展为肝硬化、肝癌，且早期肝癌无明显症状，以至于发现时已经达到晚期，失去最佳的手术时期。因此，急需完善相关体内外实验，进而明确HBV调控相关疾病的作用机制，对乙型肝炎实施有效的干预治疗。目前研究已发现，HepG2、Huh7、HepG2.215等细胞可以通过转染HBV质粒建立体外模型[17-18]，但HBV致病不仅受基因亚型影响，同时也因环境等变化而不同，因此需要进一步行体内实验研究，探索HBV的致病机制。在 HBV 感染机制研究过程中，由于缺乏有效的动物模型而无法深入开展相关体内实验，而建立稳定的HBV动物模型是促进病毒性肝炎、肝纤维化及肝癌研究的必经之路。
人类和少数灵长类动物是HBV的易感宿主,国外研究多采用与人类亲缘关系相近的长臂猿、黑猩猩等作为研究模型,进行HBV 感染机制、疫苗研发、药物筛选等研究。但是大型灵长类动物多属保护物种,价格昂贵,实验周期长,操作难度大,因而难以推广。而树鼩(Tupaia belangeri)是一种小型低等灵长类动物,相较大鼠、小鼠等常用实验动物,其解剖结构、生理机能、生化代谢和基因序列等方面都与人类更相近,并且价廉易获得、体型小易操作,作为HBV实验动物模型,受到越来越多的关注和研究。较多研究发现，土拔鼠、鸭、转基因小鼠等乙型肝炎动物模型存在较大的局限性，其不能直接感染HBV,且该类动物模型的肝炎病毒与HBV依旧存在一定的差异,仍不能完全模拟HBV的病理过程。2013年李文辉等研究发现，NTCP是HBV入侵肝细胞最重要也是必须的受体，乙肝病毒表面包膜大蛋白可通过肝脏胆酸转运蛋白(NTCP,钠离子-牛磺胆酸钠共转运多肽)关键受体结合区发生特异性结合,继而HBV入侵肝细胞，同时也观察到树鼩体内NTCP的表达。
目前HBV基因型较多，在环境等多因素的影响下，我国以B型和C型为主，所以在研究HBV感染时，高致病亚型HVB动物模型的构建更具有针对性，后期相关体内实验研究结果更接近国情，并对乙型肝炎、肝硬化及肝癌等疾病的进一步研究具有重大意义。
发明内容
本发明针对现有技术中缺乏 HBV 稳定有效的动物模型，提供了一种HBV感染的树鼩模型构建方法及树鼩模型。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
一种HBV感染的树鼩模型构建方法，其具体包括以下步骤：
步骤S1、对HepG 2.2.15细胞株、HepG 2细胞株及ITh 6.1细胞株分别进行复苏、传代培养及冻存；
步骤S2、采用胎牛血清培养基培养HepG 2.2.15细胞制取HBV培养液；
步骤S3、对步骤S2中制取的HBV培养液进行HBV活性评估并筛选HBV培养液有效滴度；
步骤S4、用有效滴度的HBV培养液配合胎牛血清培养基对ITh 6.1细胞进行培养，获取感染HBV的培养基；
步骤S5、在步骤S3筛选出的HBV培养液有效滴度基础上设置不同浓度的HBV上清液组，选取试验树鼩，根据体重，相同频次地经树鼩尾静脉注射，筛选出有效HBV上清液浓度；
步骤S6、设置实验分组：分别为实验观察组、长期实验观察组和对照组；
步骤S7、根据步骤S5筛选出的有效HBV上清液浓度，给实验观察组和长期实验观察组经树鼩尾静脉注射HBV上清液，给对照组经树鼩尾静脉注射无HBV上清液；
步骤S8、检测所有实验分组中树鼩均性HBV-DNA拷贝量、肝功能，观察4-8周后，对实验观察组、对照组进行麻醉，经股静脉获取静脉血，随后开腹获取肝脏组织予固定液及保存液处理；
步骤S9、对步骤S8中获取的静脉血进行检测，对肝脏组织进行处理，得到样本检测数据，通过统计方法进行分析，得出实验结论。
作为优选，所述的步骤S1中对细胞株进行复苏的方法具体包括以下步骤：
步骤S11、将细胞株冻存管于液氮中取出后，快速置于37℃水浴锅中进行复苏；
步骤S12、待细胞悬液完全融化后立即分装分别进行离心；
步骤S13、离心结束后去除上清液，并反复清洗细胞，重复离心去上清步骤；
步骤S14、将清洗后的细胞接种至含胎牛血清的完全培养基中，完善时间等标记后，置于培养箱中培养；
步骤S15、第二天观察细胞贴壁情况、细胞活力检测及对复苏后细胞的生长形态进行观察。
作为优选，所述的步骤S1中对细胞株进行传代培养的方法具体包括以下步骤：
步骤S16、当培养箱中细胞覆盖率80%-90%时，弃去培养基并用PBS润洗后予胰蛋白酶消化；
步骤S17、用胎牛血清的完全培养液终止, 并按照1:3进行传代培养, 定期观察拍照。
作为优选，所述的步骤S1中对细胞株进行冻存的方法具体为：离心收集冻存细胞，用冻存液将细胞稀释并分装至冻存管中，完善时间等标记后，使用异丙醇冻盒的逐级冷冻法将冷冻盒放于 － 80℃，次日将冻存细胞移至液氮中保存。
作为优选，步骤S2具体为采用胎牛血清培养基培养HepG 2.2.15细胞至汇聚率80%，弃去原培养基，予无血清培养基继续培养细胞48小时至汇聚率100%时，留取含 HBV培养液。
作为优选，步骤S2中还对制得的HBV培养液通过乙肝病毒基因分型 PCR 微板核酸杂交试剂盒明确HBV亚型。
作为优选，步骤S3具体为对HBV培养液进行浓缩后，设置不同滴度的HBV培养液分组，配合步骤S2中相同的胎牛血清培养基对HepG 2细胞进行培养，细胞汇聚率80%时弃去原培养基，予无HBV的胎牛血清继续培养至细胞汇聚率100%，获取培养基，检测各组HBV-DNA拷贝量，明确HepG 2.2.15细胞培养的HBV活性情况及HBV培养液有效滴度。
作为优选，步骤S4具体为用有效滴度的HBV培养配合步骤S2中相同的胎牛血清培养基对ITh 6.1细胞进行培养，细胞汇聚率80%时弃去原培养基，予无HBV的胎牛血清继续培养至细胞汇聚率100%，获取培养基，检测其HBV-DNA拷贝量，明确ITh6.1细胞是否感染HBV。
作为优选，步骤S9中静脉血检测包括对HBV-DNA拷贝量、胆红素、转氨酶以及白蛋白的检测；肝脏组织的处理包括病理切片染色和免疫组化。
一种HBV感染的树鼩模型，其采用前述的一种HBV感染的树鼩模型构建方法得到。
本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：
本发明通过构建HBV感染的树鼩模型，能够有效解决因缺乏 HBV 稳定有效的动物模型，致使对 HBV 持续感染、致病机制研究及抗病毒药物的开发和评价的相对滞后等问题，对乙型肝炎、肝纤维化、肝硬化及肝癌等疾病的进一步研究具有重大意义。
附图说明
图1是本发明实施例1中体外实验流程图。
图2是本发明实施例1中体内实验流程图。
图3是本发明实施例1中对肝脏组织病理切片HE染色10倍放大图。
图4是本发明实施例1中对肝脏组织病理切片HE染色20倍放大图。
图5是本发明实施例1中对肝脏组织病理切片HE染色40倍放大图。
图6是本发明实施例1中对肝脏组织病理切片Masson染色10倍放大图一。
图7是本发明实施例1中对肝脏组织病理切片Masson染色10倍放大图二。
图8是本发明实施例1中对肝脏组织免疫组化染色图。
图9是本发明实施例1中对肝脏组织cccDNA检测图。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种HBV感染的树鼩模型构建方法，如图1-图9所示，其具体包括以下步骤：
一、先进行体外实验，具体包括：
步骤S1、对HepG 2.2.15细胞株、HepG 2细胞株及ITh 6.1细胞株分别进行复苏、传代培养及冻存，其中HepG 2.2.15细胞株、HepG 2细胞株及ITh 6.1细胞株分别为
其中细胞株进行复苏的方法具体包括以下步骤：
步骤S11、将细胞株冻存管于液氮中取出后，快速置于37℃水浴锅中进行复苏；
步骤S12、待细胞悬液完全融化后立即分装分别进行离心；
步骤S13、离心结束后去除上清液，并反复清洗细胞，重复离心去上清步骤；
步骤S14、将清洗后的细胞接种至含胎牛血清的完全培养基中，完善时间等标记后，置于培养箱中培养；
步骤S15、第二天观察细胞贴壁情况、细胞活力检测及对复苏后细胞的生长形态进行观察。
对细胞株进行传代培养的方法具体包括以下步骤：
步骤S16、当培养箱中细胞覆盖率80%-90%时，弃去培养基并用PBS润洗后予胰蛋白酶消化；
步骤S17、用胎牛血清的完全培养液终止, 并按照1:3进行传代培养, 定期观察拍照。
对细胞株进行冻存的方法具体为：离心收集冻存细胞，用冻存液将细胞稀释并分装至冻存管中，完善时间等标记后，使用异丙醇冻盒的逐级冷冻法将冷冻盒放于 － 80℃，次日将冻存细胞移至液氮中保存。
步骤S2、采用胎牛血清培养基培养HepG 2.2.15细胞至汇聚率80%，弃去原培养基，予无血清培养基继续培养细胞48小时至汇聚率100%时，留取含 HBV培养液；
步骤S3、对步骤S2中制取的HBV培养液进行HBV活性评估并筛选HBV培养液有效滴度，具体为对HBV培养液进行浓缩后，设置不同滴度的HBV培养液分组，配合相同的胎牛血清培养基对HepG 2细胞进行培养，细胞汇聚率80%时弃去原培养基，予无HBV的胎牛血清继续培养至细胞汇聚率100%，获取培养基，检测各组HBV-DNA拷贝量等，明确HepG 2.2.15细胞培养的HBV活性情况及HBV培养液有效滴度范围；
步骤S4、用有效滴度的HBV培养液配合胎牛血清培养基对ITh 6.1细胞进行培养，细胞汇聚率80%时弃去原培养基，予无HBV的胎牛血清继续培养至细胞汇聚率100%，获取感染HBV的培养基，检测其HBV-DNA拷贝量等，明确ITh6.1细胞是否感染HBV。
二、再进行体内实验，具体包括：
步骤S5、在步骤S3筛选出的HBV培养液有效滴度基础上设置不同浓度的HBV上清液组，选取试验树鼩，根据体重，相同频次地经树鼩尾静脉注射，观察4-8周，并定期检测各树鼩HBV-DNA拷贝量、肝功能情况等，筛选出有效HBV上清液浓度；
步骤S6、设置实验分组：分别为实验观察组、长期实验观察组和对照组，其中实验观察组、长期实验观察组和对照组均采用8只树鼩；
步骤S7、根据步骤S5筛选出的有效HBV上清液浓度，给实验观察组和长期实验观察组经树鼩尾静脉注射HBV上清液，得到HBV感染的树鼩模型；
给对照组经树鼩尾静脉注射无HBV上清液，实验观察组、长期实验观察组和对照组的注射量均根据树鼩体重计算。
其中实验观察组每周注射2次，重复操作4-8周，长期实验观察组每周注射2次，重复操作大于8周，对照组每两天注射2次，重复操作4-8周；
步骤S8、每次周第二次注射操作后2天，检测所有实验分组中树鼩均性HBV-DNA拷贝量、肝功能，并动态记录实验动物一般情况（大小便、饮食、精神等）变化，观察4-8周后，对实验观察组8只树鼩、对照组随机6只树鼩进行麻醉，经股静脉获取静脉血（分别行抗凝和非抗凝处理），随后开腹获取肝脏组织予固定液及保存液处理；
步骤S9、对步骤S8中获取的静脉血进行检测，对肝脏组织进行处理，得到样本检测数据并进行初步评估，通过统计方法进行分析，得出实验结论，其中：
静脉血检测：包括HBV-DNA拷贝量、胆红素、转氨酶、白蛋白等指标；
肝脏组织：包括病理切片染色，免疫组化等。
本实施例中还提供了一种HBV感染的树鼩模型，其采用前述的一种HBV感染的树鼩模型构建方法得到。
本实施例通过HepG2.2.15细胞株的特性制取含HBV培养基，并对其进行HBV-DNA基因型检测，明确HepG2.2.15细胞株培养的HVB亚型；用含HBV培养基的胎牛血清培养基对HepG 2细胞进行培养，检测HBV-DNA拷贝量等，明确HepG 2.2.15细胞培养的HBV活性情况；同时用相同选培养基培养ITh 6.1细胞，检测HBV-DNA拷贝量等，评估HepG 2.2.15细胞培养的HBV体外直接感染树鼩肝细胞的能力；最后用明确高致病亚型的HBV直接感染树鼩，反复处理4-8周，观察树鼩血清HBV-DNA拷贝量、肝功能级肝纤维化分期等评估模型构建情，有效解决因缺乏 HBV 易感有效的小动物模型，致使对 HBV 持续感染、致病机制研究及抗病毒药物的开发和评价的相对滞后等问题，对乙型肝炎、肝纤维化、肝硬化及肝癌等疾病的进一步研究具有重大意义。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
Claims (7)
1.一种HBV感染的树鼩模型构建方法，其特征在于其具体包括以下步骤：
步骤S1、对HepG 2.2.15细胞株、HepG 2细胞株及ITh 6.1细胞株分别进行复苏、传代培养及冻存；
步骤S2、采用胎牛血清培养基培养HepG 2.2.15细胞制取HBV培养液；
步骤S3、对步骤S2中制取的HBV培养液进行HBV活性评估并筛选HBV培养液有效滴度；
步骤S4、用有效滴度的HBV培养液配合胎牛血清培养基对ITh 6.1细胞进行培养，获取感染HBV的培养基；
步骤S5、在步骤S3筛选出的HBV培养液有效滴度基础上设置不同浓度的HBV上清液组，选取试验树鼩，根据体重，相同频次地经树鼩尾静脉注射，筛选出有效HBV上清液浓度；
步骤S6、设置实验分组：分别为实验观察组、长期实验观察组和对照组；
步骤S7、根据步骤S5筛选出的有效HBV上清液浓度，给实验观察组和长期实验观察组经树鼩尾静脉注射HBV上清液，给对照组经树鼩尾静脉注射无HBV上清液；
步骤S8、检测所有实验分组中树鼩均性HBV-DNA拷贝量、肝功能，观察4-8周后，对实验观察组、对照组进行麻醉，经股静脉获取静脉血，随后开腹获取肝脏组织予固定液及保存液处理；
步骤S9、对步骤S8中获取的静脉血进行检测，对肝脏组织进行处理，得到样本检测数据，通过统计方法进行分析，得出实验结论；
所述的步骤S1中对细胞株进行复苏的方法具体包括以下步骤：
步骤S11、将细胞株冻存管于液氮中取出后，快速置于37℃水浴锅中进行复苏；
步骤S12、待细胞悬液完全融化后立即分装分别进行离心；
步骤S13、离心结束后去除上清液，并反复清洗细胞，重复离心去上清步骤；
步骤S14、将清洗后的细胞接种至含胎牛血清的完全培养基中，完善时间标记后，置于培养箱中培养；
步骤S15、第二天观察细胞贴壁情况、细胞活力检测及对复苏后细胞的生长形态进行观察；
所述的步骤S1中对细胞株进行传代培养的方法具体包括以下步骤：
步骤S16、当细胞培养瓶培养细胞覆盖率80%-90%时，弃去培养基并用PBS润洗后予胰蛋白酶消化；
步骤S17、用胎牛血清的完全培养液终止, 并按照1:3进行传代培养, 定期观察拍照。
2.根据权利要求1所述的一种HBV感染的树鼩模型构建方法，其特征在于：所述的步骤S1中对细胞株进行冻存的方法具体为：离心收集冻存细胞，用冻存液将细胞稀释并分装至冻存管中，完善时间标记后，使用异丙醇冻盒的逐级冷冻法将冷冻盒放于 － 80℃，次日将冻存细胞移至液氮中保存。
3.根据权利要求1所述的一种HBV感染的树鼩模型构建方法，其特征在于：步骤S2具体为采用胎牛血清培养基培养HepG 2.2.15细胞至汇聚率80%以上，弃去原培养基，予无血清培养基继续培养细胞48小时至汇聚率100%时，留取含 HBV培养液。
4.根据权利要求3所述的一种HBV感染的树鼩模型构建方法，其特征在于：步骤S2中还对制得的HBV培养液通过乙肝病毒基因分型 PCR 微板核酸杂交试剂盒明确HBV亚型。
5.根据权利要求1所述的一种HBV感染的树鼩模型构建方法，其特征在于：步骤S3具体为对HBV培养液进行浓缩后，设置不同滴度的HBV培养液分组，配合步骤S2中相同的胎牛血清培养基对HepG 2细胞进行培养，细胞汇聚率80%时弃去原培养基，予无HBV的胎牛血清继续培养至细胞汇聚率100%，获取培养基，检测各组HBV-DNA拷贝量，明确HepG 2.2.15细胞培养的HBV活性情况及HBV培养液有效滴度。
6.根据权利要求1所述的一种HBV感染的树鼩模型构建方法，其特征在于：步骤S4具体为用有效滴度的HBV培养配合步骤S2中相同的胎牛血清培养基对ITh 6.1细胞进行培养，细胞汇聚率80%时弃去原培养基，予无HBV的胎牛血清继续培养至细胞汇聚率100%，获取培养基，检测其HBV-DNA拷贝量，明确ITh6.1细胞是否感染HBV。
7.根据权利要求1所述的一种HBV感染的树鼩模型构建方法，其特征在于：步骤S9中静脉血检测包括对HBV-DNA拷贝量、胆红素、转氨酶以及白蛋白的检测；肝脏组织的处理包括病理切片染色和免疫组化。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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