DE69831571T2

DE69831571T2 - Erhöhung des produktions von proteinen in gram-positive mikroorganismen

Info

Publication number: DE69831571T2
Application number: DE69831571T
Authority: DE
Inventors: J. Wilhelmus QUAX; M. Robert CALDWELL
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1997-07-16
Filing date: 1998-07-15
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2018-07-16
Also published as: JP2001510051A; DK1571217T3; EP1571217B1; CA2296707A1; AU8489598A; DE69831571D1; ATE426670T1; ATE304599T1; EP0990039B1; EP0990039A1; WO1999004019A1; DK0990039T3; EP1571217A1; DE69840695D1; CA2296707C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Expression von Proteinen in grampositiven Mikroorganismen and insbesondere grampositive Mikroorganismus-Disulfidbindungsisomerasen. Die vorliegende Erfindung stellt Expressionsvektoren, Verfahren und Systeme für die Produktion von Proteinen in grampositiven Mikroorganismen zur Verfügung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Grampositive Mikroorganismen, wie beispielsweise Mitglieder der Gruppe Bacillus, werden zum Teil wegen ihrer Fähigkeit, ihre Fermentationsprodukte in die Kulturmedien zu sekretieren, für die Fermentation im Industriemaßstab verwendet. Bei grampositiven Bakterien werden sekretierte Proteine über eine Zellmembran und eine Zellwand exportiert und dann in die externen Medien abgegeben, wobei gewöhnlich ihre native Konformation erhalten wird.
Die Faltung von Polypeptidketten hängt von der Unterstützung der molekularen Begleiter und Faltungskatalysatoren ab, wie beispielsweise von Disulfidbindungsisomerasen, die bestimmte Schritte der Faltung beschleunigen. (Hartl u.a., 1995, Current Opinion in Structural Biology, 5: 92–102). Disulfidbindungsisomerasen können Proteine durch Katalyse bestimmter Isomerisationsschritte, die die Faltungsrate von einigen Proteinen begrenzen können, kovalent modifizieren (PCT/US93/09426).
Die Disulfidbindungsisomerase katalysiert Thiol/Disulfid-Austauschreaktionen und fördert die Disulfidbildung, Isomerisation oder Reduktion, wodurch die Bildung der richtigen Disulfidpaarungen erleichtert wird, und kann eine allgemeinere Rolle bei der Verhinderung und vorzeitigen Missfaltung von neu translozierten Ketten haben. Disulfidbindungsisomerase steht direkt mit den neu synthetisierten sekretorischen Proteinen in Wechselwirkung und wird für die Faltung von naszierenden Polypeptiden im endoplasmatischen Retikulum (ER) von eukaryontischen Zellen benötigt.
Trotz der Fortschritte beim Verstehen von Teilen des Proteinsekretionsmechanismus in prokaryontischen Zellen müssen der vollständige Mechanismus der Proteinsekretion und die Mechanismen, die im Zusammenhang mit der richtigen Faltung von sekretierten Proteinen, insbesondere für grampositive Mikroorganismen, stehen, noch vervollständigend aufgeklärt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Kapazität des Sekretionsmechanismus eines grampositiven Mikroorganismus kann ein einschränkender Faktor oder Engpass für die Sekretion von richtig gefalteten Proteinen oder Polypeptiden und die Produktion von Proteinen mit der richtigen Konformation in sekretierter Form werden, insbesondere wenn die Proteine rekombinant eingeführt und durch die Wirtszelle überexprimiert werden. Die vorliegende Erfindung stellt ein Mittel zum Mildern dieses Engpasses zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung einer Bacillus subtilis-Disulfidbindungsisomerase, Dsb1, die in einer bisher nicht beschriebenen, translatierten genomischen DNA durch eine allumfassende Aminosäurehomologie mit einer E. coli-Disulfidbindungsisomerase identifiziert wurde. Es wurde für die E. coli-Disulfidbindungsisomerase mit der Hinterlegungsnummer P 30018 und ID-Nummer DSBB-ECOLI beobachtet, dass Cysteinreste bei 41, 44, 104 und 130 wichtig für die Aktivität waren. Diese Reste werden in B. subtilis Dsb1 konserviert und sind in der 2 angegeben. Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auch auf dem Vorhandensein von potentiellen Transmembranüberbrückungsbereichen in Dsb1.
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen für B. subtilis Dsb1 zur Verfügung. Die Aminosäuresequenz für B. subtilis Dsb1 ist in der 1 gezeigt. Die Nukleinsäuresequenz, die für B. subtilis Dsb1 kodiert, ist in der 1 gezeigt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch verbesserte Verfahren zur Sekretion von richtig gefalteten Proteinen von grampositiven Mikroorganismen zur Verfügung. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Sekretion eines Proteins in einem grampositiven Mikroorganismus zur Verfügung, das die folgenden Schritte umfasst: Erhalten einer grampositiven Mikroorganismus-Wirtszelle, die eine für Dsb1 kodierende Nukleinsäure enthält, wobei die Nukleinsäure unter der Kontrolle der Expressionssignale steht, die in der Lage sind, die Disulfidbindungsisomerase in einem grampositiven Mikroorganismus zu exprimieren, wobei der Mikroorganismus weiter eine Nukleinsäure umfasst, die für das Protein kodiert; und Züchten des Mikroorganismus unter Bedingungen, die für eine Expression der Disulfidbindungsisomerase und eine Expression und Sekretion des Proteins geeignet sind. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Protein homolog oder tritt natürlich im grampositiven Mikroorganismus auf. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Protein heterolog bezüglich des grampositiven Mikroorganismus.
Die vorliegende Erfindung stellt Expressionsvektoren und Wirtszellen zur Verfügung, die eine isolierte Nukleinsäure umfassen, die für eine grampositive Dsb1 kodiert. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Wirtszelle, die eine für Dsb1 kodierende Nukleinsäure umfasst, gentechnisch verändert, um ein gewünschtes Protein, wie beispielsweise ein Enzym, einen Wachstumsfaktor oder ein Hormon, zu erzeugen. In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Enzym aus der Gruppe bestehend aus Proteanen, Carbohydrasen, einschließlich Amylasen, Cellulasen, Xylanasen, Reduktasen und Lipasen; Isomerasen, wie beispielsweise Racemasen, Epimerasen, Tautomerasen oder Mutasen; Transferasen, Kinasen und Phosphatasen, Acylasen, Amidasen, Esterasen, Oxidasen ausgewählt. In einer weiteren Ausführungsform wird die Expression der Disulfidbindungsisomerase Dsb1 mit der Expression von anderen Komponenten des Sekretionsmechanismus abgestimmt. Andere Komponenten des Sekretionsmechanismus, d.h. Translokasen, SecA, SecY, SecE und/oder andere Sekretionsfaktoren, die dem Fachmann bekannt sind, werden vorzugsweise in der Expression in einem optimalen Verhältnis zu Dsb1 moduliert. Zum Beispiel kann es wünschenswert sein, mehrere Sekretionsfaktoren zusätzlich zu Dsb1 zu überexprimieren, um die Sekretionsmuster optimal zu verbessern.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Nukleinsäure (SEQ ID NO: 1) und abgeleitete Aminosäuresequenz für Dsb1 (SEQ ID NO: 2).
2 zeigt eine Aminosäurenanordnung der E. coli-Disulfidbindungsisomerase (SEQ ID NO: 3) mit der Nukleinsäure für Dsb1 (YOLK). Die Cysteinreste, die E. coli-Cysteinresten bei 41, 44, 104 und 130 entsprechen, die, wie festgestellt wurde, für die Aktivität der E. coli-Disulfidbindungsisomerase wichtig sind, sind in den 2, 3 und 4 markiert.
3 zeigt ein Hydrophilieschema für Dsb1 (YOLK).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Definitionen
Wie hier verwendet, umfasst die Gattung Bacillus alle Mitglieder, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich aber nicht ausschließlich B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothemophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus und B. thuringiensis.
Die vorliegende Erfindung stellt neue Dsb1-Disulfibindungsisomerasen zur Verfügung, die von grampositiven Organismen erhältlich sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der grampositive Organismus Bacillus. In einer anderen Ausführungsform stammt der grampositive Organismus von B. subtilis. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „B. subtilis Dsb1" oder „B. subtilis-Disulfidbindungsisomerase 1" auf die in der 1 gezeigte Aminosäuresequenz. Die vorliegende Erfindung umfasst Aminosäurevarianten von B. subtilis Dsb1, die in der 1 offenbart und in der Lage sind, eine Proteinfaltung und/oder -sekretion allein oder in Kombination mit anderen molekularen Faktoren, wie beispielsweise Sekretionsfaktoren, zu modulieren.
Wie hier verwendet, betrifft „Nukleinsäure" eine Nukleotid- oder Polynukleotidsequenz und Fragmente oder Teile davon und die DNA oder RNA genomischen oder synthetischen Ursprungs, die doppelsträngig oder einzelsträngig sein kann, je nachdem ob sie den Sense-Strang oder Antisense-Strang repräsentiert. Wie hier verwendet, betrifft „Aminosäure" Peptid- oder Proteinsequenzen oder Teile davon. Ein „B. subtilis-Polynukleotidhomolog" oder „Polynukleotidhomolog", wie es hier verwendet wird, betrifft ein Polynukleotid, das mindestens 80%, mindestens 90% und mindestens 95% Identität mit B. subtilis Dsb1 hat oder das in der Lage ist, mit B. subtilis Dsb1 unter den Bedingungen hoher Stringenz zu hybridisieren und das für eine Aminsäuresequenz kodiert, die in der Lage ist, die Sekretion des grampositiven Mikroorganismus zu modulieren, von dem sie abgeleitet ist. Moduliert, wie es hier verwendet wird, betrifft die Fähigkeit einer Disulfidbindungsisomerase, den Sekretionsmechanismus so abzuwandeln, dass eine Proteinsekretion geändert wird.
Die Begriffe „isoliert" oder „gereinigt", wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf eine Nukleinsäure oder Aminosäure, die von mindestens einer Komponente, mit der sie natürlich verbunden ist, entfernt wird.
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff „heterologes Protein" ein Protein oder Polypeptid, das nicht natürlich in einer grampositiven Wirtszelle auftritt. Beispiele für heterologe Proteine umfassen Enzyme, wie beispielsweise Hydrolasen, einschließlich Proteasen, Cellulasen, Amylasen, andere Carbohydrasen, Reduktasen und Lipasen; Isomerasen, wie beispielsweise Racemasen, Epimerasen, Tautomerasen oder Mutasen; Transferasen, Kinasen und Phosphatasen. Das heterologe Gen kann therapeutisch signifikante Proteine oder Peptide kodieren, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren, Cytokine, Liganden, Rezeptoren und Inhibitoren, sowie Vakzine und Antikörper. Das Gen kann für kommerziell wichtige industrielle Proteine oder Peptide kodieren, wie beispielsweise Proteasen, Carbohydrasen, wie beispielsweise Amylasen und Glucoamylasen, Cellulasen, Oxidasen und Lipasen. Das interessante Gen kann ein natürlich auftretendes Gen, ein mutiertes Gen oder ein synthetisches Gen sein.
Der Begriff „homologes Protein" betrifft ein Protein oder Polypeptid, das nativ oder natürlich in einer grampositiven Wirtszelle vorkommt. Die Erfindung umfasst Wirtszellen, die das homologe Protein über rekombinante DNA-Technologie erzeugen. Die vorliegende Erfindung umfasst eine grampositive Wirtszelle mit einer Deletion oder Unterbrechung der Nukleinsäure, die für das natürlich auftretende homologe Protein, wie beispielsweise eine Protease, kodiert, und mit einer Nukleinsäure, die für das homologe Protein oder eine Variante davon kodiert, welche wieder in eine rekombinante Form überführt wird. In einer anderen Ausführungsform erzeugt die Wirtszelle das homologe Protein.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung stellt neue grampositive Mikroorganismus-Disulfidbindungsisomerasen Dsb1 und Verfahren zur Verfügung, die dazu verwendet werden können, in grampositiven Mikroorganismen die Verengung für die Sekretion von Proteinen in ihrer nativen oder natürlich auftretenden Konformation zu verbessern, insbesondere wenn die Proteine rekombinant eingeführt und durch die Wirtszelle überexprimiert werden. Die vorliegende Erfindung stellt die Disulfidbindungsisomerase Dsb1, die von Bacillus subtilis abgeleitet ist, zur Verfügung.
I. Dsb1-Nukleinsäure und Aminosäuresequenzen
Nukleinsäure
Das Dsb1-Polynukleotid, das die in der 1 gezeigte Sequenz aufweist, kodiert für die Bacillus subtilis-Disulfidbindungsisomerase Dsb1. Die Bacillus subtilis-Dsb1 wurde über eine FASTA-Suche von nicht beschriebenen, translatierten Bacillus subtilis-Genomsequenzen unter Verwendung einer E. coli-Disulfidbindungsisomerase identifiziert. Die vorliegende Erfindung stellt grampositive Dsb1-Polynukleotide zur Verfügung, die zum Steigern der Sekretion von erwünschten heterologen oder homologen Proteinen oder Polypeptiden allein oder zusammen mit Faktoren in einem grampositiven Mikroorganismus in ihrer nativen oder natürlich auftretenden Konformation verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung umfasst neue B. subtilis Dsb1-Polynukleotidhomologe, die für die grampositive Mikroorganismus-Dsb1 kodieren, welche mindestens 80% oder mindestens 90% oder mindestens 95% Identität mit B. subtilis Dsb1 aufweist, solange das Homolog für ein Protein kodiert, das in der Lage ist, durch Modulieren der Sekretion in einem grampositiven Mikroorganismus zu funktionieren. Wie dem Fachmann verständlich ist, kann aufgrund der Degeneration des genetischen Codes eine Vielzahl von Polynukleotiden, d.h. Dsb1-Polynukleotidvarianten, die Bacillus subtilis-Disulfidbindungisomerase Dsb1 kodieren. Die vorliegende Erfindung umfasst alle diese Polynukleotide.
Grampositive Mikroorganismuspolynukleotidhomologe von B. subtilis Dsb1 können durch Nukleinsäurehybridiserung einer grampositiven Mikroorganismusnukleinsäure entweder genomischen oder cDNA-Ursprungs identifiziert werden. Die Polynukleotidhomologsequenz kann durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder Amplifikation unter Verwendung von B. subtilis Dsb1-Sonden, Teilen oder Fragmenten erfasst werden, die in der in den Figuren gezeigten Nukleotidsequenz offenbart sind.
Die grampositiven Mikroorganismus-Dsb1-Polynukleotidhomologe können in der Lage sein, mit einem Teil oder der ganzen B. subtilis-Dsb1 unter Bedingungen von dazwischen liegender bis maximaler Stringenz zu hybridisieren. Die Hybridisierungsbedingungen beruhen auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nukleinsäure-Bindungskomplexes, wie in Berger und Kimmel gelehrt (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Bd. 152, Academic Press, San Diego, CA), und verleihen eine definierte „Stringenz", wie nachfolgend erläutert.
Die „maximale Stringenz" erfolgt typischerweise bei etwa Tm –5°C (5°C unter der Tm der Sonde); eine „hohe Stringenz" bei etwa 5°C bis 10°C unter Tm; eine „dazwischen liegende Stringenz" bei etwa 10°C bis 20°C unter Tm; und eine „niedrige Stringenz" bei etwa 20°C bis 25°C unter Tm. Wie dem Fachmann verständlich ist, kann eine maximale Stringenzhybridisierung dazu verwendet werden, identische Polynukleotidsequenzen zu identifizieren oder zu erfassen, während eine dazwischen liegende oder niedrige Stringenzhybridisierung dazu verwendet werden kann, Polynukleotidsequenzhomologe zu identifizieren oder zu erfassen.
Der Begriff „Hybridisierung", wie er hier verwendet wird, soll „das Verfahren, bei dem sich ein Nukleinsäurestrang mit einem komplementären Strang durch Basenpaarung verbindet", umfassen (Coombs J (1994), Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, NY).
Das Amplifikationsverfahren, wie es bei den Polymerasekettenreaktions(PCR)-Verfahren durchgeführt wird, ist in Dieffenbach CW und GS Dveksler beschrieben (1995), PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY). Eine Nukleinsäuresequenz von mindestens etwa 10 Nukleotiden und so viele wie etwa 60 Nukleotide von der Dsb1- und Dsb2-Nukleotidsequenz der 1, vorzugsweise etwa 12 bis 30 Nukleotide und besonders bevorzugt etwa 20–25 Nukleotide, kann als Sonde oder PCR-Primery verwendet werden.
Aminosäuresequenzen
Das B. subtilis-Dsb1-Polynukleotid, wie es in der 1 gezeigt ist, kodiert für B. subtilis-Dsb1. Die vorliegende Erfindung umfasst neue grampositive Mikroorganismus-Aminosäurevarianten der B. subtilis-Dsb1-Aminosäuresequenz, die mindestens 80% identisch, mindestens 90% identisch und mindestens 95% identisch mit B. subtilis Dsb1 sind, solange die Aminosäuresequenzvariante in der Lage ist, in einem grampositiven Mikroorganismus zu funktionieren.
B. subtilis Dsb1 wurde mit einer FASTA-Aminosäuresuche von translatierten genomischen B. subtilis-DNA-Sequenzen gegenüber einer E. coli-Disulfidbindungsisomeraseaminosäuresequenz entdeckt (FASTA-Suche Version 1.0, ausgegeben am 11. Juni 1997), wobei die Parameter die Scoring-Matrix waren: GenRunData: blosum50.cmp; variable pamfactor used; gap creation penalty: 12; und gap extension penalty: 2). Aminosäurenanpassungen sind in den 2 und 3 gezeigt. Das Hydrophilieprofil für B. subtilis-Dsb1, das in der 3 gezeigt ist, zeigt potentielle Membranüberbrückungsbereiche.
II. Expressionssysteme
Die vorliegende Erfindung stellt Expressionssysteme für die erhöhte Produktion und Sekretion von erwünschten heterologen oder homologen Proteinen in grampositiven Mikroorganismen zur Verfügung.
a. Kodierende Sequenzen
In der vorliegenden Erfindung umfasst der Vektor mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure, die für eine grampositive Mikroorganismus-Dsb1 kodiert und vorzugsweise mehrere Kopien aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der grampositive Mikroorganismus Bacillus. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der grampositive Mikroorganismus Bacillus subtilis. In einer bevorzugten Ausführungsform können Polynukleotide, die für B. subtilis-Dsb1 kodieren, oder Fragmente davon oder Fusionsproteine oder homologe Polynukleotidsequenzen, die für Aminosäurevarianten von Dsb1 kodieren, dazu verwendet werden, rekombinante DNA-Moleküle zu erzeugen, die die Expression von Dsb1 bzw. Aminosäurevarianten davon in grampositiven Wirtszellen führen. In einer bevorzugten Ausführungsform gehört die Wirtszelle zur Gattung Bacillus. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle B. subtilis.
Wie dem Fachmann verständlich ist, kann es vorteilhaft sein, Polynukleotidsequenzen zu erzeugen, die nicht natürlich auftretende Kodons haben. Kodons, die von einer bestimmten grampositiven Wirtszelle bevorzugt werden (Murray E u.a. (1989) Nuc Acids Res 17: 477–508), können zum Beispiel ausgewählt werden, um die Expressionsrate zu erhöhen oder rekombinante RNA-Transkripte mit erwünschten Eigenschaften, wie beispielsweise einer längeren Halbwertszeit als Transkripte, die von einer natürlich auftretenden Sequenz stammen, zu erzeugen.
Geänderte grampositive Dsb1-Polynukleotidsequenzen, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, umfassen Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von unterschiedlichen Nukleotidresten, was zu einem Polynukleotid führt, das für dasselbe bzw. ein funktionsmäßig gleichwertiges Dsb1-Homolog kodiert. Wie hier verwendet, wird eine „Deletion" als eine Änderung entweder der Nukleotid- oder Aminosäuresequenz definiert, bei der ein oder mehr Nukleotid- bzw. Aminosäurereste fehlen.
Wie hier verwendet, ist eine „Insertion" oder „Addition" die Änderung in einer Nukleotid- oder Aminosäuresequenz, die im Vergleich zur natürlich auftretenden grampositiven Dsb1 zur Addition von ein oder mehr Nukleotiden bzw. Aminosäureresten geführt hat.
Wie hier verwendet, resultiert „Substitution" aus dem Austausch von einem oder mehr Nukleotiden oder Aminosäuren durch unterschiedliche Nukleotide bzw. Aminosäuren.
Das kodierte Protein kann auch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten zeigen, die eine stille Änderung erzeugen und zu einer funktionsmäßig äquivalenten grampositiven Dsb1-Variante führen. Absichtliche Aminosäuresubstitutionen können auf der Grundlage einer ähnlichen Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der Reste erfolgen, solange die Variante die Fähigkeit behält, die Sekretion zu modulieren. Zum Beispiel umfassen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren beinhalten Lysin und Arginin; und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophiliewerten umfassen Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin.
Die Dsb1-Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können so ausgeführt werden, dass sie das Klonieren, die Aufbereitung und/oder Expression des Genprodukts modifizieren. Zum Beispiel können Mutationen mit Verfahren eingeführt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, z.B. ortsgerichtete Mutagenese, um neue Schnittstellen einzuführen und so beispielsweise die Glycosylierungsmuster zu ändern oder die Kodonpräferenz zu wechseln.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein Dsb1-Polynukleotid mit einer heterologen Sequenz ligiert werden, um für ein Fusionsprotein zu kodieren.
Ein Fusionsprotein kann auch so ausgeführt werden, dass es eine Spaltstelle enthält, die zwischen der Dsb1-Nukleotidsequenz und der heterologen Proteinsequenz angeordnet ist, so dass das Dsb1-Protein gespalten und durch Reinigen vom heterologen Teil entfernt werden kann.
b. Vektorsequenzen
Expressionsvektoren, die bei der Expression der Disulfidbindungsisomerasen der vorliegenden Erfindung in grampositiven Mikroorganismen verwendet werden, umfassen mindestens einen mit einem grampositiven Dsb1 verbundenen Promotor, wobei der Promotor in der Wirtszelle funktionsfähig ist. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Promotor ein Wildtyp-Promotor für die ausgewählte Disulfidbindungsisomerase, und in einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Promotor zwar heterolog bezüglich der Disulfidbindungsisomerase, aber in der Wirtszelle noch immer funktionsfähig.
Zusätzliche Promotoren, die mit der heterologen Nukleinsäure verbunden sind, die für gewünschte Proteine oder Polypeptide kodiert, können über rekombinante DNA-Verfahren eingeführt werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Wirtszelle in der Lage, ein heterologes Protein oder Polypeptid zu überexprimieren und eine Nukleinsäure, die für ein oder mehr Disulfidbindungsisomerasen kodiert, wird rekombinant eingeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die für Dsb1 kodierende Nukleinsäure stabil in das Mikroorganismusgenom eingebaut. In einer anderen Ausführungsform wird die Wirtszelle so ausgeführt, dass eine Disulfidbindungsisomerase der vorliegenden Erfindung überexprimiert wird und die Nukleinsäure, die für das heterologe Protein oder Polypeptid kodiert, über rekombinante DNA-Verfahren eingeführt wird. Die vorliegende Erfindung umfasst grampositive Wirtszellen, die auch in der Lage sind, andere Disulfidbindungsisomerasen zu überexprimieren, die dem Fachmann bekannt sind, oder in Zukunft identifiziert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Expressionsvektor eine multiple Klonierungsstellenkassette, die vorzugsweise mindestens eine Endonukleasen- Schnittstelle umfasst, die für den Vektor einzigartig ist, um eine leichtere Nukleinsäurehandhabung zu ermöglichen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor auch ein oder mehr selektierbare Marker. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff selektierbarer Marker auf ein Gen, das zur Expression im grampositiven Wirt, der eine leichtere Auswahl der den Vektor enthaltenden Wirte ermöglicht, in der Lage ist. Beispiele für solche selektierbaren Marker umfassen Antibiotika, wie beispielsweise Erythromycin, Actinomycin, Chloramphenicol und Tetracyclin, sind aber nicht darauf beschränkt.
c. Transformation
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure, die für mindestens eine grampositive Disulfidbindungsisomerase der vorliegenden Erfindung kodiert, in eine grampositive Wirtszelle über einen Expressionsvektor eingeführt, der in der Lage ist, in der Wirtszelle zu replizieren. Geeignete replizierende Plasmide für Bacillus sind in Molecular Biological Methods for Bacillus, Hrsg. Harwood und Cutting, John Wiley & Sons, 1990 beschrieben; siehe Kapitel 3 über Plasmide. Geeignete replizierende Plasmide für B. subtilis sind auf der Seite 92 angegeben.
In einer anderen Ausführungsform wird die Nukleinsäure, die für einen grampositiven Mikroorganismus Dsb1 kodiert, stabil in das Mikroorganismusgenom integriert. Bevorzugte grampositive Wirtszellen stammen von der Gattung Bacillus. Eine andere bevorzugte grampositive Wirtszelle ist B. subtilis. Mehrere Strategien sind in der Literatur für das direkte Klonieren von DNA in Bacillus beschrieben worden. Die Plasmid-Marker-rescue-Transformation beinhaltet die Aufnahme eines Donorplasmids durch kompetente Zellen, die ein teilweise homologes internes Plasmid tragen (Contente u.a., Plasmid 2: 555–571 (1979; Haima u.a. Mol. Gen. Genet. 223: 195–191 (1990); Weinrauch u.a., J. Bacteriol. 154(3): 1077–1087 (1983), und Weinrauch u.a., J. Bacteriol. 169(3): 1205–1211 (1987)). Das hereinkommende Donorplasmid wird mit dem homologen Bereich des internen „Helfer"-Plasmids in einem Verfahren neu kombiniert, das die chromosomale Transformation imitiert.
Die Transformation durch Protoplasttransformation wird für B. subtilis in Chang und Cohen, (1979) Mol. Gen. Genet 168: 111–115; für B. megaterium in Vorobjeva u.a., (1980) FEMS Microbiol. Letters 7: 261–263; für B. amyloliquefaciens in Smith u.a. (1986) Appl. Und Env. Microbiol. 51: 634; für B. thuringiensis in Fisher u.a., (1981) Arch. Microbiol. 139: 213–217; für B. sphaericus in McDonald (1984), J. Gen. Microbiol. 130: 203; und B. larvae in Bakhiet u.a., (1985) 49: 577 beschrieben. Mann u.a. (1986, Current Microbiol. 13: 131–135) berichtet über die Transformation von Bacillus-Protoplasten und Holubova, (1985), Folia Microbiol. 30: 97) offenbart Verfahren zum Einführen von DNA in Protoplasten mit DNA enthaltenden Liposomen.
III. Identifizierung der Transformanten
Obwohl die Gegenwart/das Fehlen der Markergenexpression anzeigt, dass auch das interessante Gen vorhanden ist, sollte seine Gegenwart und Expression bestätigt werden. Zum Beispiel können, wenn die für Dsb1 kodierende Nukleinsäure in eine Markergensequenz eingeführt wird, rekombinante Zellen, die das Insert enthalten, durch das Fehlen der Markergenfunktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Markergen hintereinander mit Nukleinsäure, die für die Disulfidbindungsisomerase unter der Kontrolle eines einzelnen Promotors kodiert, angeordnet werden. Die Expression des Markergens in Ansprechung auf die Induktion oder Auswahl zeigt gewöhnlich auch die Expression der Disulfidbindungsisomerase an.
Alternativ können Wirtszellen, die die kodierende Sequenz für eine Disulfidbindungsisomerase enthalten und das Protein exprimieren, durch eine Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, identifiziert werden. Diese Verfahren umfassen die DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung und Proteinbioassay- oder Immunassay-Verfahren, die Technologien auf der Grundlage von Membranen, Lösungen oder Chips für die Detektion und/oder Quantifizierung der Nukleinsäure oder des Proteins aufweisen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Das Vorhandensein der Dsb1-Polynukleotidsequenz kann durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder Amplifikation mit Sonden, Teilen oder Fragmenten, die vom B. subtilis-Dsb1-Polynukleotid stammen, erfasst werden.
IV. Sekretionsassays
Mittel zum Bestimmen der Sekretionsniveaus eines heterologen oder homologen Proteins in einer grampositiven Wirtszelle und zum Erfassen der sekretierten Proteine umfassen das Verwenden von entweder polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die für das Protein spezifisch sind. Beispiele umfassen den Enzym vermittelten Immunosorbentassay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA) und die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Diese und andere Assays werden unter anderem in Hampton R. u.a. (1990, Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN) und Maddox DE u.a. (1983, J Exp Med 158: 1211) beschrieben.
Eine große Auswahl von Markierungen und Konjugationsverfahren sind dem Fachmann bekannt und können in verschiedenen Nuklein- und Aminosäureassays verwendet werden. Mittel zur Herstellung markierter Hybridisierungs- oder PCR-Sonden zum Erfassen von bestimmten Polynukleotidsequenzen umfassen das Oligolabeling, die Nick-Translation, die Endmarkierung oder PCR-Amplifikation mit einem markierten Nukleotid. Alternativ kann die Nukleotidsequenz oder jeder Teil davon für die Herstellung einer mRNA-Sonde in einen Vektor kloniert werden. Solche Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt, im Handel erhältlich und können dazu verwendet werden, um RNA-Sonden in vitro durch Addition einer geeigneten RNA-Polymerase, wie beispielsweise T7, T3 und markierte Nukleotide, zu synthetisieren.
Eine Anzahl von Firmen, wie beispielsweise Pharmacia Biotech (Piscataway NJ), Promega (Madison WI) und US Biochemical Corp (Cleveland OH) liefern kommerzielle Kits und Protokolle für diese Verfahren. Geeignete Reportermoleküle oder Markierungen umfassen die Radionuklide, Enzyme, fluoreszente, chemilumineszente oder chromogene Mittel sowie Substrate, Kofaktoren, Inhibitoren, magnetische Partikel und dergleichen. Zu den Patenten, die die Verwendung von solchen Markierungen lehren, gehören die US-Patente 3 817 837, 3 850 752, 3 939 350, 3 996 345, 4 277 437, 4 275 149 und 4 366 241. Auch können rekombinante Immunglobuline hergestellt werden, wie im US-Patent Nr. 4 816 456 gezeigt.
V. Reinigung von Proteinen
Grampositive Wirtszellen, die mit Polynukleotidsequenzen transformiert sind, die für das heterologe oder homologe Protein kodieren, können unter Bedingungen kultiviert werden, die für die Expression und Wiedergewinnung des kodierten Proteins aus der Zellkultur geeignet sind. Das Protein, das durch eine rekombinante grampositive Wirtszelle erzeugt wird, die eine Disulfidbindungsisomerase der vorliegenden Erfindung umfasst, wird in die Kulturmedien sekretiert. Andere rekombinante Konstruktionen können die heterologen oder homologen Polynukleotidsequenzen mit der Nukleotidsequenz verbinden, die für eine Polypeptiddomäne kodiert, was die Reinigung von löslichen Proteinen erleichtert (Kroll DJ u.a. (1993) DNA Cell Biol 12: 441–53).
Solche die Reinigung erleichternden Domänen umfassen Metallchelierungspeptide, wie beispielsweise Histidin-Tryptophan-Module, die die Reinigung über immobilisierte Metalle ermöglichen (Porath J (1992) Protein Expr Purif 3: 263–291), Protein-A-Domänen, die die Reinigung über immobilisiertes Immunglobulin ermöglichen, und die Domäne, die in dem FLAGS-Extensions/Affinitäts-Reinigungssystem verwendet wird (Immunex Corp. Seattle WA), sind aber nicht darauf beschränkt. Der Einschluss einer spaltbaren Linkersequenz, wie beispielsweise Faktor XA oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego CA), zwischen der Reinigungsdomäne und dem heterologen Protein kann dazu verwendet werden, die Reinigung zu erleichtern.
VI. Verwendungen der vorliegenden Erfindung
Genetisch veränderte Wirtszellen
Die vorliegende Erfindung stellt genetisch veränderte Wirtszellen zur Verfügung, die eine Nukleinsäure umfassen, die für grampositive Mikroorganismen-Dsb1 kodieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäure stabil in den Mikroorganismus integriert. In einer anderen Ausführungsform hat die Dsb1 die in der 1 gezeigte Nukleinsäuresequenz. Die Wirtszelle kann die Nukleinsäure umfassen, die für die zusätzlichen Sekretionsfaktoren kodieren.
In der bevorzugten Ausführungsform wird die Wirtszelle genetisch verändert, um ein gewünschtes Protein oder Polypeptid zu erzeugen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle ein Bacillus. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle Bacillus subtilis.
In einer alternativen Ausführungsform wird eine Wirtszelle genetisch verändert, um eine grampositive Dsb1 zu erzeugen.
Polynukleotide
B. subtilis-Dsb1-Polynukleotide oder ein Teil davon liefern die Grundlage zum Erfassen des Vorhandenseins von grampositiven Mikroorganismuspolynukleotidhomologen durch Hybridisierungsverfahren und PCR-Technologie.
Demgemäß besteht ein Aspekt der vorliegenden Erfindung darin, eine Nukleinsäurenhybridisierung und PCR-Sonden vorzusehen, die von B. subtilis-Dsb1 stammen, die dazu verwendet werden kann, andere grampositive Mikroorganismuspolynukleotidsequenzen, einschließlich genomische und cDNA-Sequenzen, zu erfassen.
Beispiel I
Erstellen einer genomischen Bibliothek
Das nachfolgende Beispiel veranschaulicht das Erstellen einer Bacillus-Genombibliothek.
Die genomische DNA von Bacillus-Zellen wird, wie in Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1, herausgegeben von Ausubel u.a., John Wiley & Sons, Inc., 1987, Kapitel 2.4.1 gelehrt, erstellt. Im Allgemeinen werden die Bacillus-Zellen von einer gesättigten flüssigen Kultur lysiert und die Proteine durch Verdau mit Proteinase K entfernt. Zellwandtrümmer, Polysaccharide und übrige Proteine werden durch selektive Präzipitation mit CTAB entfernt und hochmolekulargewichtige genomische DNA wird aus dem sich ergebenden Überstand durch Isopropanolpräzipitation wieder gewonnen. Wenn außergewöhnlicher eine genomische DNA erwünscht ist, wird ein zusätzlicher Schritt des Reinigens der genomischen Bacillus-DNA auf einem Cäsiumchloridgradienten zugesetzt.
Nach dem Erhalten der gereinigten genomischen DNA, wird die DNA einem Sau3A-Verdau unterzogen. Sau3A erkennt die 4-Basenpaarstelle GATC und erzeugt Fragmente, die mit mehreren geeigneten Phagenlambda- und Cosmidvektoren kompatibel sind. Die DNA wird einem teilweisen Verdau unterzogen, um die Chance zum Gewinnen von zufälligen Fragmenten zu erhöhen.
Die teilweise verdaute genomische Bacillus-DNA wird vor dem Klonieren in einen Vektor einer Größenfraktionierung auf einem 1%igen Agarosegel unterzogen. Alternativ kann die Größenfraktionierung auf einem Saccharosegradienten verwendet werden. Die genomische DNA, die vom Größenfraktionierungsschritt erhalten wird, wird von der Agarose durch Reinigung entfernt und in einen Klonierungsvektor ligiert, der für die Verwendung in einer Wirtszelle geeignet ist und in die Wirtszelle transformiert wird.
Beispiel II
Erfassen einer grampositiven Mikroorganismus-Disulfidbindungsisomerase
Das folgende Beispiel beschreibt das Erfassen einer grampositiven Mikroorganismus-Dsb1.
DNA, die von einem grampositiven Mikroorganismus stammt, wird gemäß den Verfahren hergestellt, die in Current Protocols in Molecular Biology, Kap. 2 oder 3 offenbart sind. Die Nukleinsäure wird einer Hybridisierung und/oder PCR-Amplifikation mit einer Sonde oder einem Primer, der von Dsb1 stammt, unterzogen.
Die Nukleinsäurensonde wird durch Kombination von 50 pmol Nukleinsäure mit 250 mCi [gamma ³²P] Adenosintriphosphat (Amersham, Chicago IL) und T4-Polynukleotidkinase (DuPont NEN^(R), Boston MA) markiert. Die markierte Sonde wird mit Sephadex G-25 superfeiner Harzsäule (Pharmacia) gereinigt. Ein Teil davon, der jeweils 10⁷ Counts pro Minute enthält, wird in einer typischen, auf einer Membran basierenden Hybridisierungsanalyse einer Nukleinsäureprobe entweder genomischen oder cDNA-Ursprungs verwendet.
Die DNA-Probe, die einem Restriktionsendonukleaseverdau unterworfen wird, wird auf einem 0,7%igen Agarosegel fraktioniert und auf Nylonmembranen übertragen (Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham, NH). Die Hybridisierung wird 16 Stunden lang bei 40 Grad C durchgeführt. Um nicht spezifische Signale zu entfernen, werden die Blots nacheinander bei Raumtemperatur unter immer stringenteren Bedingungen bis zu 0,1 × Saline Sodium Citrate und 0,5% Natriumdodecylsulfat gewaschen. Die Blots werden für mehrere Stunden einem Film ausgesetzt, der Film wird entwickelt und die Hybridisierungsmuster werden visuell verglichen, um Polynukleotidhomologe von B. subtilis-Dsb1 zu erfassen. Die Homologe werden einer bestätigenden Nukleinsäuresequenzierung unterzogen. Die Verfahren für die Nukleinsäuresequenzierung sind auf dem Fachgebiet bekannt. Herkömmliche enzymatische Verfahren verwenden das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase, SEQUENASE^® (US Biochemical Corp. Cleveland, OH) oder Taq-Polymerase, um die DNA-Ketten von einem Oligonukleotidprimer zu erweitern, der wieder mit der interessanten DNA-Matritze verbunden wird.

Claims

Expressionsvektor, umfassend eine Nukleinsäure, die für eine grampositive Mikroorganismus-Disulfidisomerase kodiert, die mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 aufweist, wobei die Nukleinsäure unter der Kontrolle von Expressionssignalen steht, die in der Lage sind, die Disulfidisomerase in einem grampositiven Mikroorganismus zu überexprimieren.
Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei die Disulfidisomerase mindestens 90% Identität mit SEQ ID NO: 2 aufweist.
Expressionsvektor nach Anspruch 2, wobei die Disulfidisomerase mindestens 95% Identität mit SEQ ID NO: 2 aufweist.
Expressionsvektor nach Anspruch 3, wobei die Disulfidisomerase die Sequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist.
Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei die Nukleinsäure die Sequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist.
Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei der grampositive Mikroorganismus ein Bacillus ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei das Bacillus aus der Gruppe bestehend aus B. subtilis, B licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus und Bacillus thuringiensis ausgewählt ist.
Grampositive Wirtszelle, umfassend den Expressionsvektor nach Anspruch 1.
Wirtszelle nach Anspruch 8, die ein Bacillus ist.
Wirtszelle nach Anspruch 9, wobei der Bacillus aus der Gruppe bestehend aus B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus und Bacillus thuringiensis ausgewählt ist.
Wirtszelle nach Anspruch 9, wobei die Wirtszelle in der Lage ist, ein heterologes Protein zu exprimieren.
Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei das heterologe Protein aus der Gruppe bestehend aus Hormon, Enzym, Wachstumsfaktor und Cytokin ausgewählt ist.
Wirtszelle nach Anspruch 12, wobei das heterologe Protein ein Enzym ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, wobei das Enzym aus der Gruppe bestehend aus Proteasen, Carbohydrasen, Reduktase und Lipasen; Isomerasen, Transferasen, Kinasen und Phosphatasen ausgewählt ist.
Verfahren zur Sekretion eines Proteins in einem grampositiven Mikroorganismus, umfassend die Schritte des Erhaltens einer grampositiven Mikroorganismus-Wirtszelle, die einen Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst, wobei der Mikroorganismus weiter eine Nukleinsäure umfasst, die für das Protein kodiert; und des Züchtens des Mikroorganismus unter Bedingungen, die für die Expression der Disulfidbindungsisomerase und die Expression und Sekretion des Proteins geeignet sind.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Protein homolog zur Wirtszelle ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Protein heterolog zur Wirtszelle ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der grampositive Organismus ein Bacillus ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Bacillus aus der Gruppe bestehend aus B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus und Bacillus thuringiensis ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das heterologe Protein aus der Gruppe bestehend aus Hormon, Enzym, Wachstumsfaktor und Cytokin ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das heterologe Protein ein Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Enzym aus der Gruppe bestehend aus Proteasen, Carbohydrasen, Reduktase und Lipasen; Isomerasen, Transferasen, Kinasen und Phosphatasen ausgewählt ist.