CH658256A5 - Vettori plasmidici ad espressione in bacillus subtilis e procedimento per la loro preparazione. - Google Patents

Description

La presente invenzione si riferisce a nuovi vettori plasmidici che permettono l'espressione in Bacillus subtilis di alti livelli di prodotti preteici codificati da DNA etcrologo; essa si riferisce inoltre ai mezzi che ne permettono la preparazione.

È nota la possibilità di isolare frammenti di DNA da organismi eucarioti e procarioti codificanti determinate proteine ed inserirli in microorganismi in modo tale da permetterne la replicazione, la trascrizione e la traduzione.

Infatti, secondo il brevetto statunitense N. 4 237 224, un processo per la preparazione di chimere biologiche prevede (i) il taglio del DNA eterologo per mezzo di un appropriato enzima di restrizione, (ii) l'inserimento dei frammenti così ottenuti, per mezzo di un secondo enzima detto iigasi, in un vettore, a sua volta tagliato dallo stesso enzima (iii) il trasferimento delle molecole ibride così formate in cellule ospiti attraverso un meccanismo di trasformazione, coniugazione o trasfezione, ed infine (iv) lo screening dei cloni ottenuti, così da identificare quelli che portano il DNA codificante per la particolare proteina cui si è interessati.

È inoltre noto che, affinchè una determinata proteina possa essere sintetizzata, la cellula necessita di specifiche sequenze (il promotore o la Shine-Dalgarno), presenti sul DNA, che permettano alla RNA polimerasi di trascrivere il DNA in mRNA ed ai ribosomi ed enzimi correlati di tradurre l'mRNA in proteine.

Poiché queste sequenze di riconoscimento possono differire da organismo a organismo, il modo migliore per assicurarsi l'espressione di una proteina etcrologa in una data cellula ospite, è quello di porre il gene strutturale della proteina sotto il controllo di sequenze di riconoscimento specifiche della cellula ospite.

Ora, per quanto riguarda la biologia molecolare dell'Esche-richia coli, sono note numerose pubblicazioni (ad esempio, riferimenti 1 e 2) che dimostrano la facilità di espressione ad alti livelli di proteine eterologhe una volta che i geni codificanti siano stati posti sotto il controllo di sequenze ben riconosciute dal sistema di trascrizione e traduzione della cellula ospite.

Tuttavia, il carattere patogeno del suddetto microorganismo fa prevedere una scarsa o, per lo meno, contrastata utilizzazione dei prodotti ottenuti suo tramite in campi quali, ad esempio, il farmaceutico o l'alimentare.

Risulta pertanto interessante far esprimere geni etcrologhi in 5 Bacillus subtilis, organismo che non presenta gli inconvenienti menzionati per l'E.coli e che, perciò, dimostra di possedere un elevato interesse da un punto di vista industriale.

In accordo con quanto detto la presente invenzione si riferisce appunto a nuovi vettori che possono essere utilizzati per la io sintesi di proteine eterologhe in Bacillus subtilis; essa inoltre comprende anche plasmidi bifunzionali, capaci di esprimersi sia in B.subtilis che in E.coli, che permettono la preparazione dei precidenti vettori.

Il summenzionato oggetto viene ottenuto secondo un meto-15 do che prevede di utilizzare un plasmide originariamente isolato in Staphilococcus aureus, previa opportuna modificazione che costituisce parte integrante della presente invenzione.

Il plasmide in questione (pE194), ampiamente studiato e la cui struttura primaria è stata parzialmente determinata (rif. 3, 20 4, 5, 6, 7 e 8), possiede sequenze di riconoscimento per il sistema di trascrizione e traduzione estremamente attive (rif. 5, 7 e 8) che permettono la sintesi di una metilasi che conferisce resistenza alla eritromicina. Il plasmide pE194 è stato modificato, come accennato, rispetto a quello noto in letteratura (e ciò co-25 stituisce un primo importante oggetto della presente invenzione) in quanto è stato utilizzato il promotore e la sequenza di Shine-Dalgarno del gene della metilasi come punto di riconoscimento rispettivamente della RNA-polimerasi e ribosomi, per la sintesi di proteine eterologhe in E.coli e B.subtilis. Così, la costruzione 30 di un sito di restrizione appena dopo la sequenza riconosciuta dai ribosomi rende possibile l'inserimento di un qualsiasi gene che viene in tal modo espresso sotto il controllo del promotore e della sequenza «Shine-Dalgarno» del gene della resistenza alla eritromicina; inoltre, come avviene per la metilasi (rif. 4 e 5), è 35 possibile indurre la sintesi della proteina etcrologa codificata dal gene clonato esponendo le cellule a dosi subinibenti di eritromicina.

L'impiego del plasmide pE194, modificato come detto, permette l'ottenimento di plasmidi ibridi derivati dall'accoppia-40 mento dello stesso con i plasmidi pUBl 10 e pBR322: tali plasmidi ibridi costituiscono il principale oggetto della presente invenzione.

Fra tutti, particolare importanza assumono i plasmidi pSM15, pSM16 e pSM17 che sono vettori di clonaggio in Bacil-45 lus subtilis e sono caratterizzati da un marcatore di resistenza alla Kanamicina, per cui possono essere selezionati, e da un sito EcoRI localizzato proprio alla fine della sequenza di riconoscimento dei ribosomi. In tale sito possono essere clonati frammenti di DNA ottenuti da DNA eterologo in seguito a taglio so con EcoRI. Trattando i vettori con l'enzima SI dopo linearizzazione con EcoRI, possono essere altresì clonati frammenti ottenuti da qualsiasi enzima che tagli (i) a «blunt end», (ii) a «sticky end», dopo trattamento con SI. Altra caratteristica riscontrabile nei suddetti plasmidi è data dalla possibilità di indurre la pro-55 teina etcrologa codificata dal DNA clonato con dosi subinibenti (0,02 jig/ml) di eritromicina per ottenere un'iperproduzionc. 11 plasmide pSM15 è descritto chiaramente nella mappa di fig. 1 e, approssimativamente, in fig. 2, nella quale è anche riportato lo schema dell'intero processo, che porta nel caso particolare, M> alla preparazione del plasmide pSM15.

Le sequenze della regione modificata in cui è stato inserito il sito EcoRI sono indicate a loro volta, in fig. 7 nella quale sone visibili anche le differenze dei plasmidi pSM16 e pSM17 rispetto al plasmide pSM15.

65 I plasmidi qui descritti, come detto, sono vettori per clonaggio di DNA eterologo permettendo, secondo opportune vie, l'incorporazione dei geni desiderati nella cellula ospite: tra i geni clonati, particolare menzione meritano quello della ß-latta-

3

658 256

masi, quello della iso-amilasi e quello della deidrofolato-redut-tasi.

Ripetiamo che i plasmidi oggetto della presente invenzione vengono ottenuti attraverso un metodo che prevede di utilizzare, come materiali di partenza, i plasmidi pE194 e pBR322 estratti rispettivamente, dai ceppi di Bacillus subtilis BD170 (rif. 4) e di Escherichia coli HB101 (rif. 9) entrambi facilmente ottenibili presso qualsiasi Laboratorio di Biologia Molecolare: ricordiamo anche il plasmide pBUllO utilizzato nel corso della preparazione, che è stato descritto nel riferimento 4.

Punto focale del metodo, oltre alla iniziale modifica del plasmide pE194, sono la preparazione e l'isolamento dei plasmidi pSM4 (fig. 3), pSM5 e pSM6 i quali sono capaci di esprimersi sia in B.subtilis che in E.coli e sono, pertanto, gli interessanti intermedi che permettono il finale ottenimento dei plasmidi pSM15, pSM16 e pSM17.

Nelle figure fino ad ora menzionate, come pure in quelle che seguiranno, sono indicati i siti in cui i vari enzimi di restrizione tagliano i plasmidi: tra i principali, oltre al sito EcoRI, citiamo BamHI, HindlII, XbaI e SstI, tutti in grando di linearizzare i plasmidi, avendo un solo sito di riconoscimento.

Altri oggetti dell'invenzione saranno noti ai tecnici del ramo dalla soprastante descrizione considerata in relazione ai disegni allegati, dove:

la figura 1 è una mappa restrittiva del plasmide pSM15; la figura 2 è una illustrazione schematica della costruzione del plasmide pSM15;

la figura 3 è una mappa restrittiva del plasmide pSM4; la figura 4 mostra il differente orientamento del frammento pEI94 rispetto a pBR322 nei plasmidi pSMI e pSM2;

la figura 5 è una illustrazione schematica della costruzione del plasmide pSM3 dal pSM2;

la figura 6 è una illustrazione schematica della riduzione della lunghezza di un frammento di DNA lineare operata da una azione combinata dagli emzimi ExoIII e SI;

la figura 7 è una illustrazione schematica del frammento pE194 contenente il promotore e la sequenza Shine-Dalgarno e della sua modificazione in pSM15, pSM16 e pSM17.

1. Preparazione dei plasmidi pE194 e pBR322

Il ceppo BD431 (pE194) di B.subtilis e il ceppo HB 101 (pBR322) E.coli sono stati usati per inoculare 1 lt ciascuno di LB (10 gr/lt Tryptone, 5 gr/lt Yeast extracts, 10 gr/lt NaCl). Le cellule sono state raccolte, mediante centrifugazione a 5000 rpm per 10 minuti, dopo crescita della durata di una notte a 32°C e 37°C rispettivamente.

Le cellule sono state lavate risospendendole in 1/2 del volume iniziale con una soluzione 25% saccarosio, 0,1 M NaCl, 0,05 M Tris-Cl (pH 7,5), ricentrifugate e risospese in 1/10 del volume iniziale (100 mi) con la medesima soluzione. Quindi, aggiunto lisozima ad una concentrazione finale di 0,5 mg/ml, le cellule sono state incubate a 37°C per 15 min.

Infine a ciascuno dei due tubi contenenti i 100 mi di risospensione cellulare furono aggiunti nell'ordine: 24 ml NaCl 5M, 6 mi 0,5 M EDTA pH 8,5 e 130 mi 2% SDS, 0,7 M NaCl. Il tutto è stato tenuto a 4°C per una notte.

N gorno seguente, le soluzioni sono state centrifugate a 8000 rpm in rotore Sorvall GSA per 45 min ed ai sopranatanti è stato aggiunto 1/10 di volume di una soluzione 3 M di sodio acetato e 2 volumi dietanolo 95%.

Le soluzioni sono state tenute a -20°C per 3 ore e quindi sono state centrifugate in rotore Sorvall GSA a 8000 rpm per 30 min.

I pellets sono stati risospesi in TES (30 mM Tris-CI pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA) ottenendo alla fine sia per la preparazione di pE194 che di pBR322 un volume finale di 24 mi. Ciascuna preparazione è stata quindi divisa in 4 tubi contenenti ciascuno: 6 mi di soluzione plasmidica, 2 mi di Bromuro di Eti-dio 1 mgr/ml e 7,35 gr di Cloruro di Cesio.

I tubi sono stati centrifugati a 40 000 rpm per 40 ore in rotore Beckman 70 Ti.

Al termine della corsa, in ciascun tubo erano ben visibili, sotto luce UV, due bande distinte rappresentanti una il DNA cromosomale e l'altra, l'inferiore, il DNA plasmidico.

Con una siringa sono state prelevate le bande inferiori e le soluzioni lavate 4 volte con alcool isopropilico e estensivamente dializzate contro tampone TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA pH 8,0).

Infine i due DNA plasmidici sono stati precipitati in etanolo a -20°C aggiungendo alle due soluzioni 1/10 di volume di una soluzione 3 M di Sodio Acetato e 2 volumi di 95% etanolo.

Dopo la centrifucazione a 10 000 rpm per 30 min in rotore Sorvall SS 34, i pellets sono stati lavati con 70% Etanolo, essiccati e risospesi in TE buffer in modo tale da ottenere una soluzione plasmidica di 100 gr/ml.

2. Preparazione del plasmide ibrido pEI94-pBR322

1 p.gr di pE194 e 1,4 jxgr di pBR322 sono stati miscelati e linearizzati con l'enzima di restrizione PstI, acquistato dalla BRL e utilizzato secondo le specifiche del fornitore, e quindi le reazioni sono state fermate aggiungendo un ugual volume di fenolo saturato con tampone TE. Dopo agitazione, il fenolo presente nelle fasi acquose è stato estratto tre volte con etere e quindi il DNA precipitato a -70°C per 10 min dopo aggiunta di 1/10 di volume di Na Acetato 3 M e 2 volumi di etanolo 95%. Il DNA è stato risospeso in 100 (il di una soluzione contenente 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 10 mM MgCh, 10 mM Ditiotreitolo, 50 M ATP. Sono quindi state aggiunte 0,05 U di ligasi T4, preparata secondo Weiss (10), e la reazione è stata condotta a 10°C per 4 ore.

5 ni della miscela di ligasi sono stati utilizzati per trasformare cellule di E.coli HB101 rese competenti con soluzione 0,1 M di CaCl2 (11).

La selezione è stata fatta piastrando 0,1 mi di cellule trasformate su piastre contenenti L agar + 15 jj.gr/ml di Tetraciclina e poi si è controllato che le colonie fossero Ampicillina sensibili (poiché, infatti, il taglio con PstI inattiva in pBR322 la ß-lattamasi che conferisce la resistenza alla Ampicillina, un inserimento nel sito PstI de pBR322 di una molecola di DNA rende inattiva la ß-lattamasi).

Da 6 colonie TcR, Amps sono stati purificati i plasmidi nel seguente modo:

1 mi di coltura O.N. di ciascun clone è stato centrifugato per 1 min in centrifuga Epperdorf tipo 5414. Le cellule sono state risospese in 1 mi 25% saccarosio, 0,1 M NaCl, 0,05 M Tris-CI pH 7,5 e ricentrifugate. Le cellule sono quindi state risospese in 100 (j.1 della medesima soluzione contenente 0,5 mg/ mi di lisozima ed incubate a 37°C per 15 min. Nell'ordine sono quindi stati aggiunti: 24 (il di una soluzione 5 M NaCl, 6 p.1 di 0,5 M EDTA pH 8,5 e 135 ni di 2% SDS, 0,7 M NaCl. Le soluzioni sono state conservate a 4°C per 3 ore e quindi centrifugate per 15 min in centrifuga Epperdorf 5414 a freddo.

I sopranatanti, dopo aggiunta di 2 |il di una soluzione di RNAsi pancreatica (10 mg/ml), sono stati incubati a 37°C per 15 min. Quindi si sono aggiunti 10 ßl di pronasi 10 mg/ml predigerita, a 37°C per mezz'ora, e di nuovo i campioni sono stati incubati a 37°C per 2 ore.

Infine ai campioni sono stati aggiunti 1/10 del volume di 3 M NaAcetato a 2 volumi di etanolo 95% ed i DNA precipitati a -70°C per 10 min.

Dopo centrifugazione, i pellets sono stati essiccati e quindi risospesi in 40 jil di tampone di reazione dell'enzima PstI (20 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 mM di MgCb, 50 mM Ammonio solfato). Dopo aggiunta di 1 unità di enzima ed incubazione a 37°C per 1 ora, i campioni sono stati caricati su gel di agarosio 0,8%

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

658 256

4

ed i DNA separati, applicando una differenza di potenziale di 30 volts per 15 ore.

La colorazione del gel con soluzione 0,5 y/ml di Bromuro di Etidio, metteva in evidenza come tutte e 6 le colonie analizzate, portassero un DNA plasmidico che in seguito a digestione con PstI, dava origine a due bande distinte che comigravano con le molecole linearizzate di pE194 e pBR322.

Questo stava ad indicare che i plasmidi erano in realtà composti dal pE194 e dal pBR322 legati tra loro nel sito PstI. Due cloni presi a caso dei sei sono stati ulteriormente studiati per analizzare l'orientamento della molecola di pE194 rispetto a pBR322.

Per far questo il DNA plasmidico estratto dai due cloni è stato linearizzato con l'enzima HindlII, che taglia nella regione del pBR322 ad una distanza dal sito PstI di 783 BP, ed in seguito sono stati tagliati con SstI che taglia nel pE194 ad una distanza di 1059 BP dal sito PstI. A secondo quindi dell'orientamento del pE194 rispetto al pBR322, dalla duplice digestione, ci si aspetta la comparsa su gel di agarosio di due bande di peso molecolare di 3,14 x IO6 e 2,2 x IO6 o di peso molecolare di 4,1 x 10« e 1,3 X IO6.

Dall'analisi su gel di agarosio si è constatato che un clone portava un plasmide che, in seguito al taglio con HindlII e SstI dava luogo a due frammenti di DNA di peso molecolare pari a 3,20 x IO6 e 2,32 x IO6, mentre l'altro clone aveva un DNA plasmidico su cui le medesime digestioni generavano due frammenti di 4,20 x 10° e 1,32 x IO6.

La cosa stava ad indicare che i due plasmidi, designati pSMl e pSM2, avevano differenti orientamenti (fig. 4).

3. Eliminazione del sito EcoRI sul plasmide pSM2

Il plasmide pSM2 porta un solo sito EcoRI nella regione del pBR322 (fig. 4). Allo scopo di elinimarlo, 1 ngr di pSM2 (10 (il) è stato digerito con 1 unità di enzima EcoRI in 30 ni di una soluzione 100 mM Tris-Cl pH 7,5, 5 mM MgCk, 2 mM mer-captoetanolo 50 mM NaCl per I ora a 37°C.

L'enzima è stato inattivato aggiungendo 30 [il di fenolo saturato con TE. Dopo eliminazione del fenolo dalla fase acquosa e precipitazione del DNA, secondo la metodica precedentemente descritta, il plasmide linearizzato è stato risospeso in 40 M-l di una soluzione 10 mM NaOAC-HOAC pH 4,13, 300 mM NaCl, 12 mM ZnS04 e quindi sono stati aggiunti 2 ni di enzima SI (11,7 U/nD.

L'enzima è stato fatto reagire per 1 ora a 15°C e quindi inattivato con l'aggiunta di una goccia di fenolo.

II DNA, dopo eliminazione del fenolo con tre estrazioni con etere, è stato precipitato a -70°C per 10 min aggiungendo 4 ni di 3 M NaOAC e 100 n' di 95% etanolo.

Il pellet, ottenuto dopo centrifugazione in centrifuga tipo Epperdorf 5414 per 10 min, è stato seccato e risospeso in 40 ni di una soluzione 50 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgCk, 10 mM Ditiotreitolo, 50 n M ATP.

A tali soluzioni è stata aggiunta 1 unità di ligasi T4 e la reazione condotta a 10°C per 12 ore.

Dopo inattivazione dell'enzima a 65°C per 10 min, 5 ni di miscela di reazione sono stati utilizzati per transformare 100 ni di cellule di E.coli HB101 rese competenti come precedentemente descritto.

Dalla trasformazione si sono ottenuti 44 cloni TcR. Tre di tali cloni sono stati ulteriormente analizzati e, dopo estrazione del plasmide da 1 mi di coltura, utilizzando il metodo di estrazione rapido già riportato, si è potuto constatare che due di essi portavano un plasmide che, in seguito a digestione con l'enzima EcoRI, non mostrava conversione della forma superavvolta in forma lineare, stando così ad indicare la perdita del sito EcoRI.

Uno di questi plasmidi, in seguito purificato da 1 lt di coltura è stato chiamato pSM3 (fig. 5').

4. Isolamento del frammento grande Hpal-SstI di pSM3

Come si vede nella fig. 5, il pSM3 porta un solo sito Hpal ed un solo sito SstI entrambi localizzati nella regione del pE194.

Il taglio del DNA di pSM3 con tali enzimi di restrizione genera due frammenti, uno di peso molecolare di 5 x IO5 e l'altro di 4,83 x IO6.

7 ngr di DNA di pSM3, purificati secondo la procedura precedentemente descritta per il pE194 ed il pBR322, sono stati tagliati con 7 U di enzima Hpal utilizzando il tampone consigliato dalla ditta fornitrice (BRL) in 100 ni di soluzione finale a 37°C per 1 ora e quindi, dopo inattivazione dell'enzima a 65°C per 10 min, sono stati aggiunti 1,8 ni di NaCl 5 M, 3 ni di Mer-captoetanolo concentrato e 7 U di SstI. La reazione è stata effettuata a 37°C per 1 ora e quindi l'enzima di nuovo inattivato a 65°C per 10 min.

Il DNA è stato trattato con fenolo, saturato con tampone TE, e precipitato aggiungendo 1/10 di volume di 3 M Na-Ace-tone e 2 volumi di Etanolo 95% a -70°C. Il precipitato è stato essiccato e quindi risospeso in 300 ni 30 mM Tris-Cl pH 8,1, 1 mM EDTA, 1 M NaCl.

Tale campione è stato caricato su 5 mi di un gradiente 5 a 20% di saccarosio e centrifugato a 40 000 rpm per 7,40 ore in rotore Beckman Sw 55,1.

Quindi sono state raccolte 23 frazioni da 6 gocce ciascuna e 15 jLtl di ciascuna frazione analizzata su un gel di agarosio allo 0,8%. Le frazioni dal 16 al 21 mostravano possedere la quasi totalità del frammento grande Hpal-SstI. Queste sono state raccolte insieme, il pool diluito con ugual volume di H2O ed il DNA precipitato a -20°C per 14 ore dopo aggiunta di 2 volumi di etanolo al 95%.

Dopo centrifugazione a 10 000 rpm per 30 min in rotore Sorvall SS34, il pellet è stato lavato con 70% etanolo, essiccato e risospeso in TE in modo da ottenere una concentrazione finale di DNA di 100 ngr/ml.

5. Attacco di un linker al frammento SstI-Hpal

Nell'esempio esplicativo come linker è stato usato quello portante il sito EcoRI. 1 ngr di frammento Sstl-Hpal (10 nO è

GGAATTCC „ stato utilizzato per l'attacco del linker EcoRI alla

CCT1AAGG

sua estremità «blunt end». In 50 ni di reazione contenenti 1 ngr di frammento, 50|i M ATP, 50 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgClî, 10 mM Ditiotreitolo, è stato aggiunto il linker EcoRI in un eccesso di 500 volte in molarità rispetto al frammento.

Sono quindi state aggiunte 2 U di ligasi T4 e la reazione è stata condotta a 10°C per 12 ore.

L'enzima è stato inattivato a 65°C per 10 min.

6. Preparazione del frammento dì DNA di pE194 portante le sequenze «Promotore» e «Shine-Dalgarno» del gene della metilasi

Per ottenere tale frammento, eliminando tutto il superfluo dalla parte 3' della sequenza Shine-Dalgarno, si è proceduto nel seguente modo.

10 jigr di pE194 sono stati digeriti in 150 n' di volume finale in 6 mM Tris-CI pH 7,6, 6 mM MgC^n 6 mM Mercaptoetanolo con 10 unità di HaelII per 1 ora a 37°C.

L'enzima è stato quindi inattivato aggiungendo un ugual volume di fenolo saturato con TE. Il fenolo disciolto nelle fasi acquose è stato eleminato con tre estrazioni con etere e quindi il DNA precipitato a -70°C per 10 min aggiungendo 20 ni di Na-Acetato 3 M e 400 ni di ETOH 95%. Dopo centrifugazione per 10 min in centrifuga Epperdorf 5414, il pellet è stato lavato con 100 ni di etanolo 70% ed essiccato sotto vuoto.

11 DNA è stato quindi risospeso in 40 ni di 100 mM Tris-Cl pH 7,6, 10 mM MgClj e, dopo aggiunta di 4 ni di ExoIII

5

10

ìs

20

25

30

35

40

45

50

55

<i0

65

5

658 256

(BRL, 25 unità/(il) la reazione è stata condotta a 20°C per 16 min.

In tali condizioni si eliminano circa 8-10 basi per minuto dalle estremità 3' (fig. 6).

La reazione è stata inattivata aggiungendo 40 jj.1 di una soluzione 200 mM NaOAC-HOAC pH 4,13, 600 mM NaCl, 24 mM ZnSC>4.

Quindi si sono aggiunti 3,5 (il di enzima SI (11,7 U/ßl) e la miscela di reazione è stata incubata a 15°C per 2,5 ore. L'enzima è stato inattivato aggiungendo una goccia di fenolo successivamente estratto con etere.

Il DNA è stato precipitato a -70°C per 10 min dopo aggiunta di 9 |il 3 M NaOAC e 250 |il Etanolo 95%, e quindi centrifugato in centrifuga Epperdorf 5414.

II pellet è stato essiccato e risospeso in 45 p.1 di TE. Allo scopo di eliminare i sali contaminanti, la soluzione è stata caricata su una colonna di 1 mi di G-50 Sephadex, portata precedentemente a secco con centrifugazione a 2000 rpm.

Il DNA è stato raccolto centrifugando di nuovo la colonnina a 2000 rpm per 2 min.

Ai 40 |il di soluzione raccolti, sono stati direttamente aggiunti 5 p.1 di sali per l'enzima SstI 10 volte concentrati (sali IX: 14 mM Tris-Cl pH 7,4, 6 mM MgCl2,90 mM NaCl, 2 mM Mer-captoetanolo) e 6 unità di enzima SstI (BRL).

Dopo incubazione a 37°C per un'ora, l'enzima è stato inattivato a 65°C per 10 min.

Il DNA così trattato è stato caricato su un gel 7,5% di acri-lammine a fianco del pBR322, digerito con Hpall, come standard di pesi molecolari, e separato applicando una differenza di potenziale di 100 volts per 3 ore. Dopo colorazione del gel con una soluzione di 0,2 ngr/ml di Bromuro di Etidio e visualizzazione sotto luce UV, il campione di DNA dava, come atteso, una serie di bande molto poco risolvibili che variavano da un numero di coppie di basi di circa 130 a circa 180, ed una serie di bande a peso molecolare molto più elevato.

Poiché la distanza del sito SstI dalla fine della sequenza di riconoscimento dei ribosomi (—GTT) è di 157 BP +4 singole basi (estremità «sticky end» del taglio con SstI), la regione di gel compresa tra la 13a e la 14a banda generata dal taglio di pBR322 con Hpall (rispettivamente 160 e 147 coppie di basi) è stata tagliata con una lama di rasoio.

Il DNA compreso nella frazione di gel così tagliato è stato eluilo con 0,8 mi di una soluzione 10 mM Mg-Acetato, 0,5 M NHU-Acetato, 0,1% SDS, 0,1 mM EDTA a 65°C per 14 ore, come descritto da Maxam e Gilbert (16).

Ai 0,8 mi di soluzione sono stati aggiunti 2 mi di etanolo 95% ed il DNA precipitato a -20°C per 24 ore.

Dopo centrifugazione a 10 000 rpm per 30 min in rotore Sorvall SS34, il pellet è stato lavato con 0,5 mi di etanolo 70%, essiccato sotto vuoto e quindi risospeso in 0,5 mi TE. Il Bromuro di Etidio ancora intercalato alla doppia elica di DNA è stato eliminato estraeandolo 4 volte con 1-Butanolo.

Alla fine dell'estrazione alcolica, il volume finale della soluzione acquosa era di 160 ni.

A questi sono stati aggiunti 18 p.1 di una soluzione 3 M di NaOAC, 2 ni di 1 M MgCl2 e 400 ni di 95% etanolo.

11 DNA è stato precipitato a -70°C per 10 min e centrifugato per 10 min in centrifuga Epperdorf 5414.

Dopo lavaggio del pellet con 100 ni di 70% etanolo e essiccamento sotto vuoto, il DNA è stato risospeso in TE portando-Io ad una concentrazione di 100 ngr/ml.

7. Legame del frammento del pE194 al frammento Hpal-SstI

di pSM3 e trasformazione

0,1 ngr del frammento del pE194 purificato come descritto al punto 6 è stato ligato con 1 ngr del frammento Hpal-SstI del pSM3 in 50 ni di miscela di ligasi contenenti 50 mM Tris-Cl pH

7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM Ditiotreitolo e 50 n M ATP con 4 unità di enzima T4 ligasi.

Dopo 4 ore di incubazione a 10°C, 10 ni di miscela di ligasi sono stati diluiti 10 volte nel medesimo tampone e, dopo aggiunta di altri 4 U di T4 ligasi, la reazione è stata condotta a 4°C per ulteriori 20 ore.

L'enzima è stato inattivato a 65°C per 10 min.

10 ni della miscela della ligasi diluita sono stati usati per trasformare 100 ni di cellule competenti di HB101, preparate come precedentemente descritto, selezionando per la resistenza alla tetraciclina (Te) su piastra di L agar + 15 ngr/ml di Te.

Dei 486 cloni ottenuti, 30 sono stati utilizzati per preparare il plasmide con la procedura rapida precedentemente descritta (vedi punto 2). Dopo la precipitazione con etanolo, ogni pellet è stato risospeso in 40 ni di EcoRI buffer 1 X (100 mM Tris-Cl pH 7,5, 5 mM MgCh, 50 mM NaCl, 2 mM Mercaptoetanolo) e i DNA sono stati incubati a 37°C per 30 min dopo aggiunta di 1 unità ciascuno di EcoRI.

Dopo inattivazione dell'enzima a 65°C per 10 min i campioni sono stati caricati su un gel di agarosio allo 0,8% e separati ad un voltaggio di 30 volts per 14 ore. Il gel è stato quindi colorato per 15 min in una soluzione di 0,5 ngr/ml di Bromuro di Etidio e visualizzato sotto luce UV.

21 dei 30 plasmidi ottenuti erano stati «linearizzati» dopo trattamento con l'enzima EcoRI, evidenziando la presenza del sito EcoRI nella loro sequenza.

Da 10 di questi cloni che mostravano aver acquisito il sito EcoRI, sono stati preparati i plasmidi da I lt di coltura, come precedentemente descritto.

Tutti i plasmidi sono stati analizzati con una serie di endo-nucleasi di restrizione (PstI, SstI, EcoRI, Hpal) e confrontati con i plasmidi pSM2, pBR322, pE194.

Dopo taglio con PstI tutti i plasmidi davano luogo a due frammenti di cui jl più grosso comigrava su gel di agarosio con il pBR322 linearizzato, mentre il più piccolo migrava leggermente più velocemente del pE194 come atteso. Inoltre il taglio con SstI e EcoRI sui 10 plasmidi originava frammenti il più grosso dei quali migrava leggermente più velocemente del pSM2 linearizzato e il più piccolo era di circa 160 BP come atteso.

1 10 plasmidi sono stati denominati pSM(4-13).

8. Sequenza del frammento piccolo EcoRI-PstI dei plasmidi pSM4, pSM5, pSM6

La doppia digestione con EcoRI e PstI del DNA dei plasmi-di ibridi ottenuti (es. pSM4, pSM5, ecc.) genera tre frammenti ben separabili su gel di agarosio. Il più piccolo di questi (BP 1220 ca.) porta le regioni «promotore» e «Shine-Dalgarno» del gene della metilasi di pE194.

Per determinare la distanza tra la «Shine-Dalgarno» ed il sito EcoRI (generato dal linker inserito), questo frammento, una volta purificato da gel di acrilammide come precedentemente riportato (punto 6) è stato clonato nel fago M13 (forma replicativa a doppia elica) e sequenziato secondo il metodo dei «didesossinucleotidi». Non si ritiene opportuno riportare le procedure in dettaglio poiché già estensivamente descritte (12, 13).

Dopo che il fago M13 è stato tagliato con EcoRI e PstI, si è preparato la seguente miscela di reazione:

4 ni M13mp9 (0,01 pmoli DNA), 4 ni del frammento EcoRI-PstI di pSM4, (o pSM5, pSM6) (0,03 pmoli DNA).

2 ni di una soluzione 500 mM Tris-Cl pH 7,5, 100 mM MgClì, 10 mM Ditiotreitolo, 2 ni 1 mM ATP, 7 n' H2O, I ni di ligasi T4 (50 unità/ml).

La reazione è stata condotta a 12,5°C per 18 ore.

2-5 ngr di DNA della miscela di ligasi sono stati usati per trasformare cellule di E.coli 71.18 (donatoci da R. Cortese) rese competenti con CaClz come precedentemente descritto.

Le placche bianche, portanti il fago in cui è stato inserito il

5

10

15

20

25

30

35

■10

45

50

55

60

65

658 256

frammento voluto, sono state selezionate su piastre YT agar (8 gr Bacto-tryptone, 8 gr Bacto Yeast Extract, 5 gr NaCl/1) dopo aggiunta, a 0,3 mi di cellule trasformate, di: 0,2 mi di cellule di E.coli 71.18 in fase esponenziale di crescita, 0,1 mi di IPTG (100 mM), 0,05 mi di Xgal (2Vo in Dimetil formammide), 3 mi di agar soffice.

La sequenza della regione prossimale al sito EcoRI dei tre plasmidi pSM4, pSM5 e pSM6 è riportata in fig. 7. I dati riportati indicano come il linker di EcoRI sia stato inserito in pSM4, pSM5 e pSM6 rispettivamente a 0,3 e 4 basi di distanza dall'ultima G della sequenza GAGGG ritenuta essere quella riconosciuta dall'RNA ribosomale 16 S e che facilita il legame dei ribosomi alI'RNA.

9. Eliminazione della sequenza di pBR322 dei plasmidi pSM4,

pSM5 e pSM6 ed inserimento del pUBllO nel sito XbaI

2 ngr di DNA di pSM4, pSM5 e pSM6 sono stati tagliati con l'enzima PstI in 50 |xl di una soluzione 20 mM Tris-CI pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM ammonio solfato, contenente 2 unità di enzima PstI.

Dopo 1 ora di incubazione a 37°C, l'enzima è stato inattivato a 65°C per 10 min.

Tutte e tre le miscele di reazione sono state caricate su gel di agarosio «low melting» e il DNA separato applicando una differenza di potenziale di 30 volts per 14 ore.

Dopo colorazione con Bromuro di Etidio come già descritto, il gel è stato esposto a luce UV, e tutti e 3 i DNA caricati hanno mostrato essere composti da due frammenti, il più grosse comigrante con il pBR322 linearizzato, il più piccolo con una mobilità elettroforetica leggermente più veloce del pEI94.

Questi ultimi frammenti più piccoli sono stati eluiti dal gel dopo asportazione della frazione di gel che li conteneva, mediante fusione a 65°C dell'agarosio e doppia estrazione con fenolo. Il DNA contenuto nella fase acquosa è stato precipitato due volte in Etanolo come già descritto.

Dopo essiccamento del pellet, il DNA è stato risospeso in TE ad una concentrazione finale di 20 ngr/ml.

0,1 ngr di tale DNA è stato Iigato con 0,05 unità di T4 ligasi in 20 ni di una soluzione 50 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgCh, 10 mM Ditiotreitolo, 100 n M ATP.

Dopo incubazione a 12°C per 18 ore, l'enzima è stato inattivato a 65°C per 10 min.

I plasmidi circolarizzati sono stati poi rilinearizzati tagliandoli con 0,1 unità di XbaI (che taglia in un solo sito in pE194) in 50 ni di una soluzione 6 mM Tris-Cl pH 7,6, 0,1 M NaCl, 6 mM MgCh per 1 ora a 37°C.

Infine dopo inattivazione con fenolo e precipitazione con alcool come già descritto, i DNA plasmidici sono stati legati con il plasmide pUBl 10 (14), a sua volta linearizzato con l'enzima XbaI ad una concentrazione di DNA nella miscela di ligasi di 100 ngr/ml.

Le tre miscele di ligasi sono state usate per trasformare cellule di B.subtilis BD 170 rese competenti come descritto da

Anagnostopoulus e Spizizen (15) selezionando su piastra di L agar contenenti 5 ngr/ml di Kanamicina (Km).

Da 10 delle colonie ottenute da ciascuna trasformazione, sono stati estrati i plasmidi con il metodo di estrazione rapida già descritto (punto 2) ed i plasmidi tagliati con l'enzima XbaI e confrontati con il DNA di pUBllO a sua volta tagliato con XbaI e con il DNA dei plasmidi pSM4, pSM5 e pSM6 tagliati con PstI.

Quelle colonie che mostravano possedere un plasmide che, dopo taglio con XbaI, dava origine a due frammenti, il più grande co-migrante con il DNA di pUBl 10 linearizzato con XbaI ed il più piccolo co-migrante con il frammento piccolo dei plasmidi pSM4, pSM5 e pSM6 tagliato con PstI, sono state usate per preparare i plasmidi da 1 lt di coltura.

Questi plasmidi, denominati pSM15, pSM16 e pSM17, dopo analisi con vari enzimi di restrizione resultavano essere composti nel seguente modo:

pSM15 : pUBllO + frammento piccolo PstI di pSM4 pSM16 : pUBllO + frammento piccolo PstI di pSM5 pSM17 : pUBllO + frammento piccolo PstI di pSM6

BIBLIOGRAFIA

1. Robert T.M., Kacich R. and Ptashne M. (1979) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76, 760-764

2. Talmadge K. and Gilbert W. (1980) Gene 12, 235-241

3. Iordanescu S. (1976) Arch. Roum. Path. Exp. Microbiol. 35, 111-118

4. Weisblum B., Graham, M.Y., Gryczan T. and Dubnau D. (1979) J. BacterioI 137, 635-643

5. Shivakumar A.G., Hahn, J. and Dubnau D. (1979) Plasmid 2, 279-289

6. Shivakumar A.G., Hahn J., Grandi, G., Kozlov, Y and Dubnau D. (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77, 3903-3907

7. Gryczan, T.J., Grandi, G., Hahn, J., Grandi, R. and Dubnau D. (1980) Nucl. Ac. Res. 8, 6081-6097

8. Horinouchi, S. ed altri (1982) J. BacterioI. 150, 804-814

9. Bolivar F., Rodriguez, R., Betlach, M.C. and Boyer, H.W. (1977) Gene 2, 75-93

10. Weiss, B. et al (1968) J. Biol. Chem. 243, 4543-4555

11. Dagert, M., and Ehrlich, S.D. (1979) Gene 6, 23-28

12. Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A.R. (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467

13. Messing, J., Crea, R. and Seeberg, P.H. (1981) Nucl. ac. Res. 9, 303-321

14. Gryczan, T.J., Contente, S., and Dubnau, D. (1978) 134, 318-329

15. Anagnostopoulus and Spizizien (1961) J. BacterioI 81, 741-746

16. Maxam, A., and Gilbert, W. (1977) Proc. Nati. Ac. Sci. USA 74, 560-564

17. Kuhn, S., et al. (1979) Molec. Gen. Genet. 167, 235-241.

6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

V

4 fogli disegni

Claims (6)

658 256

1. Piasmidi ibridi derivati dall'accoppiamento successivo del plasmide pE194 con il plasmide pBR322 e pUBl 10 in cui detto plasmide pE194 è modificato ponendo un sito di restrizione dopo la Shine-Dalgarno del gene della metilasi in una posizione che consenta il clonaggio e l'espressione di un gene etcrologo.

2. Piasmidi ibridi derivanti dall'accoppiamento del plasmide pUBl 10 con il plasmide pE194 modificato in accordo con la rivendicazione 1 utili come vettori di clonaggio in B.subtilis scelti fra pSM15, pSM16 e pSM17 caratterizzati da un marcatore di resistenza alla Kanamicina, da un sito EcoRI localizzato alla fine della sequenza di riconoscimento dei ribosomi e dalla possibilità di indurre la proteina etcrologa codificata dal DNA clonato con dosi subinibenti di eritromicina.

2

RIVENDICAZIONI

3. Plasmide pSM15 secondo la rivendicazione 2 costituito dall'accoppiamento del plasmide pUBllO con il frammento piccolo PstI del plasmide pSM4.

4. Plasmide pSMI6 secondo la rivendicazione 3 costituito dall'accoppiamento del plasmide pUBUO con il frammento PstI del plasmide pSM5.

5. Plasmide pSM17 secondo la rivendicazione 2 costituito dall'accoppiamento del plasmide pUBllO con il frammento piccolo PstI del plasmide pSM6.

6. Piasmidi pSM4, pSM5, pSM6 secondo una delle rivendicazioni 3 a 5 derivanti dalla modifica del plasmide pE194 capaci di esprimersi sia in B.subtilis che in E.coli.