JP3696247B2 - 組換えタンパク質、プラスミド及び修飾細胞を生産するためのプロセス - Google Patents

Description

本発明は、細菌内での組換えタンパク質の生産に係わる。本発明は、更に特に、細菌内での組換えタンパク質の生産の増大を可能にし、特に、安定的及び効率的であり且つバクテリオファージＴ７プロモーターと安定化領域（stabilizing region）とを含む発現系を使用する、新規の方法に係わる。更に、本発明は、この方法で使用することが可能なプラスミドと、この方法で生産する組換えタンパク質にも係わる。
細菌、特にＥ．ｃｏｌｉを、原核生物と真核生物の両方からの様々な起源のタンパク質を生産するために使用することが可能である。特に、ヒトタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ内で生産することが可能である。これを行うためには、構造遺伝子、又は、目的タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ発現機構（expression machinery）によって認識される適切な発現シグナル（プロモーター及びリボソーム付着部位）の下流側に位置させなければならない。Ｅ．ｃｏｌｉで使用される最も効率の高い系は、Ｓｔｕｄｉｅｒによって述べられている系である（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、１９９０）。この系は、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識されるファージＴ７プロモーターを使用することを必要する（Ｅ．ｃｏｌｉは、それ自体としては、この特定のポリメラーゼによって認識されるプロモーターを全く持たない）。この発現系は、ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子の発現の（例えばＩＰＴＧによる）誘導を伴う（この遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉのＰｌａｃＵＶ５のような誘導プロモーターの制御を受ける）。この誘導の結果として、上記ポリメラーゼによって認識される、バクテリオファージＴ７プロモーターの制御下に置かれる遺伝子の発現が生じる。このポリメラーゼは、発現させられる遺伝子の上流に位置するプロモーターだけを認識するので、その遺伝子は一般的に非常に高いレベル（細菌タンパク質全体の数％以上）で発現する。現在では、非常に多数の出版物が、Ｓｔｕｄｉｅｒが最初に報告した（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、１９９０）この系の使用の事例を提供する。
上記のように、細菌、特にＥ．ｃｏｌｉを、医薬的に興味のあるヒトタンパク質を生産するために使用する。上記タンパク質を様々な治療に使用することになっている場合には、Ｇｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＰＰ）のルールに従ってタンパク質を調製することが好ましい。これを行うためには、再現性があり、且つ、高度に規定された品質と極めて高い純度を有する生産物を得ることを確実なものにする生産系が入手可能であることが不可欠である。医薬的に興味のあるタンパク質を生産するための方法の重要な特徴の１つは、このタンパク質を生産するために使用する菌株である。従って、この菌株は、その生産様式が質的且つ量的に再現可能であることを確保できるような菌株であることが必要である。
質的レベルでは、例えば、全体的に均質であるタンパク質、即ち、天然タンパク質の一次配列と同一である一次配列を有するタンパク質を生産することが適切である。例えば、発現させられるべきタンパク質のコード化配列を修飾する点突然変異が、万一、発酵過程中に細菌細胞内で生じれば、このことは、未変性（native）配列を有するタンパク質と混合した修飾タンパク質を生産する結果になるだろう。人間に対する投与の際には、この修飾タンパク質は、治療にとって非常に有害となる恐れがある免疫反応を生じさせる可能性があり、又は、さもなければ、後続の治療において、その治療時点で深刻な免疫反応を生じさせる可能性がある。
量的レベルでは、方法に再現性がなければならないことは、認められている事実である。これは、得られる生産物の品質の証明となる。従って、個々の生産バッチにおいて、バイオマス単位当たりで合成される目的タンパク質の量が、同一の培養及び増殖条件を使用する時に、同一の時間単位において同一であるべきである。このタンパク質生産の再現性の非常に重要な特徴は、発現カセットを有するプラスミドが細菌細胞内に存在することである。培養の終了時（タンパク質の生産の前及び後）に細胞全てがそのプラスミドを依然として収容したままである場合には、より一層発酵方法が制御される。細菌中にプラスミドを維持するために、プラスミドの存在に対する選択を生じさせる抗生物質を培地に加えることが一般的である。このために、次のような様々な問題点が生じ得る。即ち、発酵培地を調製するための抗生物質のコストが高い；こうした抗生物質を高圧滅菌で不活化することが不可能であるので、その使用の直前に培地に加えることが好ましい；上記抗体が不安定である可能性があり、このために、人間の体内で有毒である形質転換産物、又は少なくとも特定の患者においては望ましくない副作用を生じさせる恐れがある形質転換産物を産生する可能性がある；更に、その抗生物質自体が、人間の体内で有毒であるか又は少なくとも特定の患者においては望ましくない副作用を生じさせる可能性もある。後者の２つの場合には、精製産物中に含まれる、抗生物質に相当する又はその抗生物質から誘導される生産物に相当する毒性生産物の微少存在量が、投与すべき用量を基準として、副作用又は毒性作用を生じさせる可能性がある含量よりも少ないことを実証することが必要だろう。このことは、面倒で高コストの作業を必然的に伴う。
本発明は、これらの問題点を解決する。従って、本発明は、発酵槽内で細菌の世代が相互に継承する間にプラスミドを維持するために抗生物質の存在を必要としない、特に効率的な発現系を提供する。本発明は、特に、バクテリオファージＴ７プロモーターによって発現を生じさせ且つ安定化領域を更に含む、プラスミド発現系の構築に係わる。本発明による発現系では、Ｓｔｕｄｉｅｒ他の発現系の場合に認められる状況とは違って、発現させるべきタンパク質の発現が誘導された後で、抗生物質が存在しない（即ち、全く選択圧がない）培養条件において、全ての細菌細胞内にプラスミドが維持されることが可能になるので、本発明の発現系は特に有利である。Ｓｔｕｄｉｅｒのプラスミド（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、１９９０）は、発現の誘導後は、細胞中の非常に小さなフラクションの中にだけ存在するにすぎない。本発明の発現系がプラスミドに対する強力な安定化作用を有し、それによって、組換えタンパク質の生産レベルを増大させ、本発明の方法の再現性を増大させることは明らかである。更に明確に述べれば、本発明によるプラスミドを構築するために使用する安定化領域は、プラスミドＲＰ４のｐａｒフラグメントに由来する。
本発明は、第１に、バクテリオファージＴ７プロモーターの制御下にある目的核酸配列及びプラスミドＲＰ４のｐａｒ領域の全体もしくは一部分又はこの領域の誘導体の全体もしくは一部分を含む安定化領域を含む発現プラスミドに係わる。
好ましくは、本発明のプラスミドで使用するバクテリオファージＴ７プロモーターは、第１０遺伝子（the 10 gene）に対するプロモーターである。
上記のように、本発明のプラスミドで使用する安定化領域は、プラスミドＲＰ４のｐａｒフラグメントに由来する（Ｇｅｒｌｉｔｚ他、１９９０）。このフラグメントは、様々な機能（特に、ｐａｒＡ、ｐａｒＢ、ｐａｒＣ、ｐａｒＤ、ｐａｒＥと呼ばれる５個の遺伝子）と、特に、プラスミド二量体を分割することを可能にすると考えられる部位特異性リコンビナーゼ活性とを有すると推定されるタンパク質（Ｅｂｅｒｌ他、１９９４）を有する。このｐａｒフラグメントは、実施例に示すように、プラスミドＲＰ４から単離し、本発明の発現プラスミドの中にクローニングすることが可能である。更に、本発明のプラスミドの中にこのフラグメントを導入する前又は後に、このフラグメントを修飾することが可能である。従って、本発明のプラスミドの安定化領域は、プラスミドＲＰ４のｐａｒ領域の全体もしくは一部分、又は、この領域の誘導体の全体もしくは一部分から成ることが可能である。
特に、このプラスミドの安定化領域は、プラスミドｐＴＵＧ３由来のＰｓｔＩ挿入断片から成るか、又は、ｐＯＨ２３由来のサブフラグメントＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ、もしくは、ｐＯＨ４１由来のＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ−ＣｌａＩ、もしくは、ｐＧＭＡ２８由来のＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ、もしくは、ｐＧＭＡ２７由来のＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ（これらは、Ｇｅｒｌｉｔｚ他（１９９０）によって記載されている）から成るか、又は、ｐＧＭＡ２７由来のＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ挿入断片を少なくとも含むｐＴＵＧ３由来のＰｓｔＩ挿入断片のいずれかのサブフラグメントから成ることが可能である。ｐＴＵＧ３由来のＰｓｔＩ挿入断片がｐａｒＣＢＡ−ｐａｒＤＥ遺伝子とフランキング領域とを有するが、ｐＧＭＡ２７又はｐＧＭＡ２８の挿入断片はｐａｒＣＢＡ−ｐａｒＤＥ′遺伝子と５′フランキング領域だけを有するにすぎない。更に、該安定化領域は、ｐａｒＤＥ遺伝子又はｐａｒＤ遺伝子と、そのプロモーター領域、又は、Ｒｏｂｅｒｔｓ他（１９９４）によって既に報告されている別のプロモーターとから成ることも可能である。この領域を、プラスミドｐＴＵＧ３内に含まれるＳｔｙＩ−ＣｌａＩフラグメントから得ることが可能である。該安定化領域は、プラスミドｐＴＵＧ３中に含まれる２個、３個、又は、４個のｐａｒ遺伝子（例えば、ｐａｒＡ−ｐａｒＤ、もしくは、ｐａｒＢ−ｐａｒＤ、もしくは、ｐａｒＡＣ−ｐａｒＤ、もしくは、ｐａｒＢＡ−ｐａｒＤＥ）と、これら自体のプロモーター領域又はこれらとは別のプロモーターとの組合せのいずれかから成ることも可能である。
術語「ｐａｒ領域の誘導体」は、ｐａｒ領域の遺伝的及び／又は化学的修飾によって得られ且つ本発明による安定プラスミドを得ることが可能なあらゆるフラグメントを含む。特に、こうした誘導体は、当業者に公知の方法によって行うプラスミドＲＰ４のｐａｒ領域内での欠失変異、突然変異、付加、切断、連結反応等によって得ることが可能である。その後で、この誘導体の機能効率（functional efficiency）を、実施例で説明する通りに試験することが可能である（特に、実施例２を参照されたい）。
本発明によるプラスミド内の安定化領域は、プラスミドＲＰ４のｐａｒ領域の一部分を含むことが有利である。１つの特定の実施様態では、安定化領域は、配列番号：１の配列の残基６０３８と残基８４９９の間に含まれるフラグメントから成る。
好ましい実施態様では、これに加えて、本発明のプラスミドは更に、ｌａｃＯオペレーターとｌａｃＩ ^q遺伝子を含む。従って、Ｅ．ｃｏｌｉ中に存在しないポリメラーゼに対して特異的であるバクテリオファージＴ７プロモーターの存在にも係わらず、目的核酸配列の基礎発現（basal expression）が誘導物質なしに生じることが認められた。この残余発現（residual expression）は、プラスミドの安定性の幾分かの低下を生じさせる可能性がある。本発明のプラスミド内にｌａｃＯオペレーターとｌａｃＩ ^q遺伝子が存在することによって、有利なことに、より適切に調節された形で上記核酸配列の発現を得ることと、特に、誘導物質の不在下であらゆる発現を抑制することとが可能になる。従って、これらの要素を組み入れたプラスミドは、より高い安定性と、より高度の発現制御とを示す。実施例に示すように、所期の効果を得るために、ｌａｃＯオペレーターをバクテリオファージＴ７プロモーターの下流で且つ目的核酸配列の上流に位置させることが有利である。ｌａｃＩ ^q遺伝子を、プラスミド内に、そのプラスミドの所期特性にとって不可欠ではない領域中に（好ましくはそれ自体のプロモーターと共に）挿入する。従って、この遺伝子を、ｐａｒ領域と目的核酸配列の発現カセットとの外側に挿入することが好ましい。このオペレーターの配列とｌａｃＩ ^q遺伝子の配列は配列番号：１の配列中にある。これらの要素を、相同であるか又は同等の機能を有する配列で置き換えることが可能であることを理解されたい。
特に好ましい実施態様では、本発明によるプラスミドは、目的核酸配列の下流に位置した転写ターミネーターも含む。使用する転写ターミネーターが、そのプロモーターを使用するバクテリオファージＴ７遺伝子のターミネーターであることが有利である。この転写ターミネーターがバクテリオファージＴ７のＴΦターミネーターであることが好ましい。
本発明によるプラスミド内に存在する目的核酸配列は、医薬分野又はアグリフード（ａｇｒｉｆｏｏｄ）分野に関連するタンパク質又は生体触媒のために使用することが可能なタンパク質をコードするあらゆる配列であることが可能である。この配列は、構造遺伝子、相補的ＤＮＡ配列、合成又は半合成配列等であることが可能である。
上記核酸配列が、例えば、酵素、血液産物、ホルモン、リンホカイン（インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ等）、成長因子、神経伝達物質又はその前駆体又はそれを合成するための酵素、栄養因子（trophic factor）：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロピン（pleiotrophin）等；アポリポタンパク質：ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ等、ジストロフィン（dystrophin）又はミニジストロフィン（minidystrophin）、嚢胞性線維症に関連したＣＦＴＲタンパク質、腫瘍サプッレサー遺伝子：ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ等、凝固（coagulation）に関連した因子をコードする遺伝子：因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ及びＩＸ、ＤＮＡ修復に関連した遺伝子等の中から選択する、医薬関連のタンパク質をコードすることが好ましい。
本発明の特定の実施態様では、目的核酸配列が酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）をコードする。ヒトａＦＧＦ遺伝子の未変性形態（native form）のｃＤＮＡは、既に同定され、配列決定され、クローニングされている（Ｊａｙｅ他、１９８６及び１９８７）。このｃＤＮＡは、Ｎ末端部分の欠失の存在に応じて様々な形態のａＦＧＦをコードすることが可能であり、特に、１５４、１４０、又は、１３４アミノ酸を含む形態のａＦＧＦをコードすることが可能である。更に、天然又は人工の変異型を生産することも可能であり、こうした変異型は、固有遺伝子配列（native gene sequence）中の１つ以上の塩基対の欠失、突然変異、及び／又は付加による修飾の結果として得られる（例えば、Ｎ末端メチオニン）。本発明の特有の実施態様の１つでは、目的核酸配列がａＦＧＦ（１５４）をコードする。配列番号：１の配列を有するプラスミドｐＸＬ２４３５を、特定例として取り上げることが可能である。
本発明は、更に、組換えタンパク質を生産するためのプロセスにも係わる。更に明確に述べると、本発明による生産プロセスは、
−上記タンパク質をコードする核酸配列を有する上記の通りのプラスミド、及び、
−バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を含む細菌を、上記核酸配列の発現を可能にする条件の下で培養することにある。
上記のように、本発明の発現系の重要点は、特に、同じバクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識されるバクテリオファージＴ７プロモーターの使用にある。従って、使用する細菌は、本発明によるプラスミドに加えて、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を可能にするカセットを含まなければならない。このカセットは、使用する細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ菌株 ＢＬ２１，ＤＥ３）のゲノムの中に組み込まれるか、第２のプラスミドもしくはファージに含まれるか、又は、本発明のプラスミド上に存在することが可能である。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を、発現カセット中において、ｌａｃ、ｔｒｐ、又は、ｒｅｃＡプロモーターのような誘導プロモーターの制御下に置くことが有利である。これによって、制御された形で細胞内でのＲＮＡポリメラーゼ生産を誘導することが可能になり、従って、目的核酸配列の発現を制御することが可能になり、この核酸配列は、上記ＲＮＡポリメラーゼに対して特異的である上記プロモーターの制御下に置かれる。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を制御する誘導プロモーターは、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＰｌａｃＵＶ５プロモーターであり、このプロモーターは、ＩＰＴＧの存在下で特異的に誘導される。
従って、下記の実施例で更に詳細に示すように、本発明のプロセスは、非修飾タンパク質を高レベルで且つ再現可能な形で生産することを可能にする。従って、このプロセスは、工業規模で医薬品質の組換えタンパク質を生産することを可能にする。
本発明によるプロセスは、組換え繊維芽細胞成長因子（特に、ａＦＧＦとｂＦＧＦ）の生産に特に適している。従って、本発明は、特に、組換えａＦＧＦを調製するためのプロセスに係わり、このプロセスでは、プラスミドｐＸＬ２４３５とバクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子とを有する細菌を、該核酸配列の発現を可能にする条件の下で培養し、それによって生産されるａＦＧＦを回収する。
本発明を下記の実施例によって更に詳細に説明するが、こうした実施例は本発明を単に例示するにすぎないものであって、本発明を限定するものと見なされてはならない。
使用略語
ａＦＧＦ：酸性繊維芽成長因子
ｂｐ：塩基対
ＯＤ：光学密度
Ｅ．ｃｏｌｉ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＩＰＴＧ：イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド
ｋｂ：キロベース
ｋＤａ：キロダルトン
Ｋｍ：カナマイシン
ＬＢ：Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地
ＰＡＧＥ−ＳＤＳ：アクリルアミド、Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド、及び、ドデシル硫酸ナトリウムを含むゲルを使用する電気泳動
Ｔ７：バクテリオファージＴ７
図面の説明
図１
プラスミドｐＸＬ２４３５の構築
Ａ−構築図：
ｐＥＴ１１ａからの３．２ｋｂ ＡｃｃＩ−ＮｄｅＩフラグメントとｐＸＬ２２８３からの２．８ｋｂ ＡｃｃＩ−ＮｄｅＩフラグメントとを連結させ、プラスミドｐＸＬ２４３４を生産した。ｐＸＬ２４３５を生産するために、Ｂｇ１ＩＩで消化したプラスミドｐＸＬ２４３４を、ｐＸＬ２４３３からの２．４ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントに連結させた。
Ｂ−プラスミドｐＸＬ２４３５の地図：
ａＦＧＦ：ａＦＧＦをコードする遺伝子、
Ａｍｐｒ：アンピシリンに対する耐性のための遺伝子、
Ｋｍｒ：カナマイシンに対する耐性のための遺伝子、
ｌａｃＩ ^q：Ｌａｃレプレッサーの高合成をコードする遺伝子、
ｏｒｉ：ＣｏｌＥｌ複製起点、
ｐａｒＤＥ′ｐａｒＣＢＡ：ＲＰ４ ｐａｒ遺伝子座の遺伝子、
ｐＴ７：Ｔ７ Φ１０プロモーターとｌａｃＯオペレーター、
ＴΦ：Ｔ７ ＴΦターミネーター
矢印は、遺伝子が転写される方向を示す。図に示す制限酵素部位は、クローニングのために使用した制限酵素部位である。括弧の中の数字は、配列番号：１の配列上の塩基対としての位置に相当する。
図２
ＩＰＴＧによる誘導の後で、抗生物質の不在下で且つプラスミドｐＸＬ２２８３、ｐＸＬ２４３４、又は、ｐＸＬ２４３５の存在下で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１，ＤＥ３によって生産されるａＦＧＦタンパク質の説明。
全細胞抽出物をゲル上に充填する。「Ｍ」は、ｋＤａで表した分子量を有する分子量マーカーである。矢印は、ａＦＧＦの分子量を示す。配列番号：１は、８５０１ｂｐプラスミドｐＸＬ２４３５のヌクレオチド配列である。この配列上の位置１は、ｐＥＴ１１ａのＢｇｌＩＩ切断部位に相当する。ａＦＧＦ遺伝子は位置１０８と位置５７５との間に位置し、ｐａｒ遺伝子座は位置６０３８と位置８４９９との間に位置する。即ち、ｐａｒＥ′が８２４８から８４９９に位置し、ｐａｒＤが８００１から８２５２に位置し、ｐａｒＣが７８５０から７５５７に位置し、ｐａｒＢが７５６０から７０２７に位置し、ｐａｒＡが７０６６から６４０７に位置する。Ｔ７ Φ１０プロモーターが位置２０と位置３６との間に位置し、ｌａｃＯが位置３９と位置６３の間に位置し、Ｔ７ ＴΦターミネーターが位置５８６と位置７０８の間に位置し、ｌａｃＩ ^q遺伝子が位置５６３６と位置４５５４の間に位置する。
一般的クローニング、分子生物学的及び生化学的方法
塩化セシウム／臭化エチジウム勾配中でのプラスミドＤＮＡの遠心分離、制限酵素消化、ゲル電気泳動、アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの電気溶出、Ｅ．ｃｏｌｉ中への形質転換、核酸沈降等のような標準的な分子生物学的方法は、文献中で説明されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）。制限酵素は、Ｎｅｗ−Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）、又は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｔｄ．（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から供給された。
連結反応のためには、ＤＮＡフラグメントを、０．７％アガロースゲル上でこれらのフラグメントのサイズに応じて分離させ、電気溶出で精製し、フェノールで抽出し、エタノールで沈殿させ、その後で、ファージＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で、［５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＡＴＰ］緩衝液中でインキュベートする。受容能力をもたせた菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１，ＤＥ３［Ｆ^- ｏｍｐＴ ｈｓｄＳ _B （ｒ_B ^-ｍ_B ^-） ｇａｌ ｄｃｍ(ＤＥ３)］（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、１９９０）とＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１［Δ（ｌａｃ ｐｒｏＡ，Ｂ），ｓｕｐＥ，ｔｈｉ，ｈｓｄＤ５／Ｆ′ ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡ ⁺ ，Ｂ ⁺ ，ｌａｃＩ ^q，ｌａｃＺΔＭ１５］（Ｇｉｂｓｏｎ、１９８４）を形質転換するために、連結させたＤＮＡ又は純粋なプラスミドＤＮＡを使用する。プラスミドＤＮＡの試料を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）によって述べられているアルカリ溶菌法（alkaline lysis technique）で精製する。
ＬＢ培地を細菌学的区分のために使用する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）。その後で、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを必要に応じて追加したＬＢ培地プレート上に、細菌懸濁液の希釈液を塗抹する。
ａＦＧＦを発現させるためのプラスミド（実施例１で説明する通りのｐＸＬ２２８３、ｐＸＬ２４３４、又は、ｐＸＬ２４３５）を含む菌株ＢＬ２１，ＤＥ３を用いてａＦＧＦを生産するために、Ｓｔｕｄｉｅｒ他（１９９０）によって述べられているプロトコルを使用する。
ａＦＧＦの生産を全細胞抽出物に関して測定する。細菌を溶菌し終わった後に、試料を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードし、電気泳動後に試料をクーマシーブルーで染色する（Ｄｅｎｅｆｌｅ他、１９８７）。ａＦＧＦを生産している菌株から得られる試料は、１６ｋＤａの見掛け分子量を有するバンドを示す。ニトロセルロースメンブラン上への半乾燥転移（semi-dry transfer）を行い（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）、その後で、アビジン／ビオチニル化ペルオキシダーゼ複合体を使用するａＦＧＦの比色分析免疫学的（Ｓｉｇｍａ（Ｆｒａｎｃｅ）から市販されている、ウサギから得た抗ウシａＦＧＦ抗体と、抗ウサギＩｇＧ）検出を可能にするために、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎキット（Ｂｉｏｓｙｓ ＳＡ，Ｆｒａｎｃｅ）に添付されたプロトコルに従って、上記メンブランを処理する。Ｐｒｏ−Ｂｌｏｔｔメンブラン上への別の半乾燥転移を行い（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ、１９８７）、そのメンブランをクーマシーブルーで染色し、見掛け分子量が１６ｋＤａであるバンドを切り出す。このメンブランの断片に対して、オンライン１２０／７アナライザーを有するｍｏｄｅｌ ４７７Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒをその装置の製造者の指示に従って使用して、Ｅｄｍａｎ（１９５６）分解を行う。
実施例１
ヒトａＦＧＦのｃＤＮＡを発現させるための安定し且つ調節されたプラスミドの構築
この実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でａＦＧＦを生産するための安定し且つ高度に調節されたプラスミドを得る目的で行った構築を説明する。
ヒトａＦＧＦ遺伝子の未変性形態（nateve form）のｃＤＮＡ（４７０ｂｐ）（Ｊａｙｅ他、１９８６及び１９８７）を同定し、配列決定し、発現ベクターｐＥＴ９（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、１９９０）にＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位とにおいてクローニングし、後でｐＸＬ２２８３と呼ぶ発現プラスミドｐＭＪ４２を生産した（図１を参照されたい）。発現プラスミドｐＸＬ２４３４を創造するために、プラスミドｐＸＬ２２８３からの２．８ｋｂ ＮｄｅＩ−ＡｃｃＩ挿入断片をプラスミドｐＥＴ１１ａ（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、１９９０）からの３．２ｋｂ ＮｄｅＩ−ＡｃｃＩフラグメントと連結させた。このプラスミドは、より高度に調節された形でａＦＧＦが発現されることを可能にするｌａｃＩ ^q遺伝子とｌａｃＯオペレーターも有するという点で、ｐＸＬ２２８３とは異なっている。その後で、ＢａｍＨＩ部位を、プラスミドｐＧＭＡ２８（Ｇｅｒｌｉｔｚ他、１９９０）から得られた２．４６ｋｂ ｐａｒＣＢＡ−ｐａｒＤＥ′フラグメントの末端に導入した。これを行うために、ｐＧＭＡ２８からの２．４６ｋｂ ＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをプラスミドｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ他、１９８５）にクローニングし、このプラスミドをＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩで消化し、プラスミドｐＧＭＡ６０（Ｈ．Ｓｃｈｗａｂ他、personal communication）を生産した。その後で、プラスミドｐＧＭＡ６０からの２．４６ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをプラスミドｐＭＴＬ２２（Ｃｈａｍｂｅｒｓ他、１９８８）にクローニングし、ｐＸＬ２４３３を生産するためにＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとで消化した。プラスミドｐＸＬ２４３５を創造するために、プラスミドｐＸＬ２４３３からのＢａｍＨＩ（ｐａｒＣＢＡ−ｐａｒＤＥ′）挿入断片をプラスミドｐＸＬ２４３４のＢｇｌＩＩ部位の中に導入した。プラスミドｐＸＬ２４３５の構築図と地図とを図１に示し、プラスミドｐＸＬ２４３５の８５０１ｂｐ配列を説明する（配列番号：１）。Ｇｅｒｌｉｔｚ他（１９９０）による論文で記載されている配列は部分的なものにすぎないが（１２５塩基対が３′末端に付加されることになっている）、この配列の３′部分を、プラスミドｐＸＬ２４３３とｐＸＬ２４３５とに関して検証し、配列番号：１の配列に関して検証した。これら３つの発現プラスミドの特徴の要約を次の表１に示す。

実施例２
ａＦＧＦ生産時の発現プラスミドの安定性
この実施例では、Ｔ７ポリメラーゼ依存性であるａＦＧＦ発現のためのプラスミドを含む組換えＥ．ｃｏｌｉ菌株（プラスミドに対する選択なしに培養される）からのａＦＧＦの液体培地中での生産を説明する。ａＦＧＦの生産の後に、プラスミドの存在を、カナマイシンに対する細菌の耐性によって検出し、この細菌の耐性遺伝子は実施例１で説明したプラスミドに含まれる。最後に、生産され終わったａＦＧＦタンパク質を、標準的な生化学的方法でキャラクタリゼーションする。
実施例２．１
ａＦＧＦ生産を誘導するための条件が存在しない場合の発現プラスミドの安定性
プラスミドｐＸＬ２２８３、ｐＸＬ２４３４、及び、ｐＸＬ２４３５を、形質転換によってＢＬ２１，ＤＥ３菌株の中に導入する（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、１９９０）。カナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で選択した形質転換細胞の中からランダムに２つの形質転換細胞を採取し、カナマイシンの存在下で液体ＬＢ培地中で１６時間培養する。培養を１／１００に希釈し、６００ｎｍでの光学密度が０．２から０．６の範囲内となるまで、カナマイシンの存在下でＬＢ培地中で培養する。この培養をＬＢ培地１０ｍＬ中に１／１００に希釈し、菌株を０．１７から０．６の範囲内のＯＤまで培養する。抗生物質を含まない培地中での３７℃での細菌の増殖とこの希釈を６回繰り返し、２日の期間の後には合計で３０世代を越える世代に相当する。細菌をＬＢ寒天上に塗抹する。細菌が増殖した後に、１００個のクローンを、ＬＢ寒天及びＫｍ含有ＬＢ寒天上に線状に接種する。表２は、プラスミドに対する選択圧なしに、少なくとも３０世代後に、Ｋｍに対して耐性があるクローンが出現することを示す。
この実施例は、ＲＰ４ ｐａｒフラグメントが、その安定化効果が中程度であるにすぎないとしても、選択圧の不在下で上記プラスミドを安定化させるということを実証する。
実施例２．２
ａＦＧＦ生産を誘導するための条件の下での発現プラスミドの安定性
（実施例２．１で説明した通りの）抗生物質の不在下で少なくとも３０世代に亙って培養した細菌を、ＬＢ培地中で１／１００に希釈し、１２時間培養し、その後で再びＬＢ培地中で１／１００に希釈する。細菌が０．５から０．８のＯＤに増殖した時に、１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、ａＦＧＦを生産するために細菌を４時間培養し、このａＦＧＦを、クーマシーブルーで染色した１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードした全細胞抽出物に関して測定する（図２を参照されたい）。細菌をＬＢ寒天上に塗抹する。細菌が増殖し終わった後に、１００個のクローンを、ＬＢ寒天及びカナマイシン含有ＬＢ寒天上に線状に接種する。表２は、プラスミドに対する選択圧なしに、ａＦＧＦを生産し終わった後にカナマイシンに対して耐性があるクローンが出現することを示す。
この実施例は、ｐａｒフラグメントが、ファージＴ７ポリメラーゼ依存性発現系を使用するａＦＧＦ発現後に、非常に高い分離安定性を生じさせるということを明確に実証する。

実施例２．３
ａＦＧＦを発現させるためのプラスミドの存在下で生産されるａＦＧＦタンパク質のキャラクタリゼーション
実施例２．２で説明した誘導条件下でａＦＧＦタンパク質を生産する場合、得られるａＦＧＦタンパク質を、クーマシーブルーで染色した１５％ＰＡＧＥ−ＳＤＳゲル上で視覚化すると（実施例２参照）、このａＦＧＦタンパク質は、既に報告されている生化学的発見と公開されている配列（Ｊａｙｅ他、１９８６及び１９８７）とに従って、見掛け分子量１６ｋＤａで泳動する。更に、このタンパク質を、抗ウシａＦＧＦ抗体を使用する比色分析免疫学的検出によって確認する。その後で、菌株ＢＬ２１，ＤＥ３ ｐＸＬ２４３５によって生産されるタンパク質のＮ末端配列を、一般的な生化学的方法で説明される通りのＰＡＧＥ−ＳＤＳ電気泳動で精製した全抽出物を使用して決定した。得られた配列は、Ａ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｉ−Ｔ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ａ−Ｌ−Ｔ（配列番号：２）である。この配列は、未変性タンパク質のＮ末端配列（Ｊａｙｅ他、１９８６）と同一であり、Ｈｉｒｅｌ他（１９８９）によって説明されている通りに、末端メチオニンがＥ．ｃｏｌｉメチオニルアミノペプチダーゼによって切断された。
従って、この実施例は、実施例２．２で説明した通りにＥ．ｃｏｌｉ中で安定している発現プラスミドを使用して生産するタンパク質が、ａＦＧＦタンパク質であることと、そのＮ末端配列が切りつめられていないことを実証する。
配列表
（２）配列番号：１に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ：８５０１
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：環状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ
（ｉｘ）配列：配列番号：１

（２）配列番号：２に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ：１２
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（ｉｘ）配列：配列番号：２

Claims (18)

1. バクテリオファージＴ７プロモーターの制御下にある目的核酸配列及び：
   （ｉ）プラスミドＲＰ４のｐａｒ領域；
   （ｉｉ）前記プラスミドＲＰ４のｐａｒ領域の一部分であって、該ｐａｒ領域の一部分は少なくとも配列番号：１の配列の残基６０３８から残基８４９９までの核酸配列を有するフラグメントを含む、前記一部分；又は
   （ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の核酸配列に対して１個又は数個の核酸の欠失、挿入、置換又は付加を有する前記（ｉ）又は（ｉｉ）の誘導体であって、発現プラスミドを安定化し得る前記誘導体；
   を含む安定化領域を含むことを特徴とする発現プラスミド。
2. 前記バクテリオファージＴ７プロモーターが第１０遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項１に記載のプラスミド。
3. 前記安定化領域がプラスミドＲＰ４のｐａｒ領域の前記一部分を含むことを特徴とする請求項１に記載のプラスミド。
4. 更にｌａｃＯオペレーターとｌａｃＩ^q遺伝子とを含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のプラスミド。
5. 前記ｌａｃＯオペレーターがバクテリオファージＴ７プロモーターの下流で且つ目的核酸配列の上流に位置することを特徴とする請求項４に記載のプラスミド。
6. 前記目的核酸配列が、医薬関連又はアグリフード関連のタンパク質又は生体触媒として使用可能なタンパク質をコードすることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のプラスミド。
7. 前記目的核酸配列が、酵素、血液産物、ホルモン、リンホカイン、成長因子、神経伝達物質、又はその前駆体もしくはそれを合成するための酵素、栄養因子、アポリポタンパク質、ジストロフィンもしくはミニジストロフィン、ＣＦＴＲタンパク質、腫瘍サプッレサー遺伝子、凝固に関連した因子をコードする遺伝子、又は、ＤＮＡ修復に関連した遺伝子の中から選択するタンパク質をコードすることを特徴とする請求項６に記載のプラスミド。
8. 前記目的核酸配列が酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）をコードすることを特徴とする請求項７に記載のプラスミド。
9. 前記目的核酸配列がａＦＧＦ（１５４）をコードすることを特徴とする請求項８に記載のプラスミド。
10. 配列番号：１の配列から成るプラスミド。
11. 組換えタンパク質を生産するためのプロセスであって、
    −前記タンパク質をコードする核酸配列を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のプラスミド、及び、
    −バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を含む細菌を、前記核酸配列の発現を可能にする条件の下で培養することを特徴とする前記プロセス。
12. 前記バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を、誘導プロモーターの制御下に置くことを特徴とする請求項１１に記載のプロセス。
13. 前記バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を、使用する細菌のゲノムの中に組み込むことを特徴とする請求項１１又は１２に記載のプロセス。
14. 前記細菌をＥ．ｃｏｌｉ菌株の中から選択することを特徴とする請求項１１から１３のいずれか一項に記載のプロセス。
15. 前記細菌がＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１，ＤＥ３であることを特徴とする請求項１４に記載のプロセス。
16. 組換えａＦＧＦを生産するための請求項１１から１５のいずれか１項に記載のプロセス。
17. 請求項１０に記載のプラスミドと、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子とを含む細菌を、目的核酸配列の発現を可能にする条件の下で培養し、生産されるａＦＧＦを回収することを特徴とする組換えａＦＧＦを調製するためのプロセス。
18. 請求項１から１０のいずれか一項に記載のプラスミドによって形質転換された細菌。

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