ES2313721T3 - Procedimiento de produccion de proteinas recombinantes, plasmidos y celulas modificadas. - Google Patents

Procedimiento de produccion de proteinas recombinantes, plasmidos y celulas modificadas. Download PDF

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A PLASMIDOS DE EXPRESION QUE COMPRENDEN UNA SECUENCIA DE ACIDO MUCLEICO DE INTERES BAJO EL CONTROL DE UN PROMOTOR DEL BACTERIOFAGO T7 Y UNA REGION ESTABILIZADORA QUE COMPRENDE TODA O PARTE DE LA REGION PAR DEL PLASMIDO RP4 O DE UN DERIVADO DE ESTA; Y A SU UTILIZACION PARA LA PRODUCCION DE PRODUCTOS RECOMBINANTES.

Description

Procedimiento de producción de proteínas recombinantes, plásmidos y células modificadas.
La presente invención se refiere a la producción de proteínas recombinantes en bacterias. Más particularmente, se refiere a un nuevo procedimiento que permite una producción elevada de proteínas recombinantes en bacterias que utiliza un sistema de expresión particularmente estable y eficaz que comprende un promotor del bacteriófago T7 y una región de estabilización. La presente invención se refiere igualmente plásmidos que se pueden usar en el procedimiento y a las proteínas recombinantes producidas de esta forma.
Las bacterias, y en particular la E. coli, se pueden usar para producir proteínas de varios orígenes, tanto procariotas como eucariotas. En particular, en la E. coli se pueden producir proteínas humanas. Para hacer esto se debe colocar el gen de estructura, o el ADNc del gen que codifica para la proteína en cuestión, detrás de las señales de expresión apropiadas (promotor y sitio de fijación de los ribosomas) reconocidos por el mecanismo de expresión de la E. coli. El sistema más eficaz usado en la E. coli es el sistema descrito por Studier (Studier et al., 1990). Este sistema consiste en la utilización de un promotor del fago T7 que es reconocido específicamente por la ARN polimerasa de este mismo bacteriófago (la E. coli no tiene per se ningún promotor reconocido por esta misma polimerasa). En este sistema de expresión, hay una inducción, por ejemplo en el IPTG, de la expresión del gen de la ARN polimerasa del fago T7 (estando este situado bajo el control de un promotor inducible, tal como el PlacUV5 de la E. coli). De esta inducción resulta la expresión del gen situado bajo el control del promotor del bacteriófago T7 reconocido por la polimerasa. Como la polimerasa no reconoce más que al promotor en dirección 5' del gen que debe ser expresado, este se expresa en general a un nivel muy grande (por encima de varias unidades porcentuales de las proteínas totales bacterianas). Hasta la fecha muchas publicaciones tienen en cuenta la utilización de este sistema descrito inicialmente por Studier (Studier et al., 1990).
Así, la solicitud EP0406738 describe un vector de expresión para producir aFGF que comprende el promotor T7.
Como se ha indicado anteriormente, las bacterias, y en particular la E. coli, se usan para la producción de proteínas humanas de interés farmacéutico. Si dichas proteínas se deben usar a continuación en diversas terapias, conviene prepararlas respetando las reglas de las Buenas Prácticas de Producción (BPL). Para hacer esto es indispensable tener un sistema de producción que sea reproducible y que asegure la obtención de un producto de calidad muy definida y que tenga una gran pureza. Uno de los aspectos importantes de un procedimiento de producción de una proteína de interés farmacéutico reside en la cepa que permite la producción de dicha proteína. En efecto, es preciso que esta cepa asegure un modo de producción reproducible tanto a nivel cualitativo como cuantitativo.
A nivel cualitativo, por ejemplo, conviene producir una proteína de homogeneidad total, es decir que tenga una secuencia primaria idéntica a la de la proteína natural. En efecto, si en una célula bacteriana, en el transcurso de la fermentación, se produjera una mutación puntual que modifique la secuencia codificada de la proteína que se quiere expresar, se originaría la producción de una proteína modificada mezclada con la proteína de secuencia silvestre. Una vez en humanos, esta proteína modificada podría desencadenar una reacción inmunitaria que podría ser muy nefasta para el tratamiento, o bien, durante un tratamiento posterior, desencadenar esta vez una reacción inmunitaria grave.
A nivel cuantitativo, se admite que un procedimiento debe ser reproducible. Esto constituye una garantía de la calidad del producto obtenido. Así, es preciso que haya entre los diferentes lotes de producción la misma tasa de síntesis de la proteína en cuestión por unidad de biomasa, en la misma unidad de tiempo, utilizando las mismas condiciones de cultivo y crecimiento. Un aspecto muy importante de esta reproducibilidad a nivel de la producción de la proteína reside en la presencia del plásmido que soporta la casete de expresión en las células bacterianas. Un procedimiento de fermentación es por lo tanto mejor cuanto mejor se controle que todas las células tengan el plásmido al final del cultivo (antes y después de la producción de la proteína). Para mantener el plásmido en las bacterias se añade en general en el medio de cultivo un antibiótico selectivo para la presencia del plásmido. Esto puede presentar varios problemas: el coste del antibiótico a nivel de la preparación del medio del fermentador; como el antibiótico no se puede esterilizar mediante autoclave, conviene añadirlo extemporáneamente al medio de cultivo; el antibiótico puede no ser estable y generar productos de transformación tóxicos en humanos, o al menos producir en algunos pacientes efectos secundarios no deseables; el antibiótico puede también, ser tóxico en sí mismo para los humanos, o al menos producir en algunos pacientes efectos secundarios no deseables. En los dos últimos casos, será necesario demostrar que en el producto purificado las trazas de los productos tóxicos que corresponden bien al antibiótico o bien a productos derivados, son inferiores, por dosis administrables, a los niveles susceptibles de producir efectos secundarios o tóxicos. Esto se traduce en estudios pesados y costosos.
La presente invención permite solucionar estos problemas. La presente invención proporciona, en efecto, un sistema de expresión particularmente eficaz en el que el antibiótico no es necesario para el mantenimiento del plásmido a lo largo de las generaciones bacterianas que se desarrollan en el fermentador. La presente invención reside en particular en la construcción de un sistema de expresión plasmídica en el que la expresión se hace gracias a un promotor del bacteriófago T7 y que comprende además una región estabilizadora. El sistema según la invención es particularmente ventajoso puesto que, contrariamente a lo que se ha observado para el sistema de Studier et al., permite mantener los plásmidos en todas las células bacterianas después de la inducción de la expresión de la proteína que se quiere expresar, en condiciones de cultivo en las que no hay antibiótico, es decir sin la presión de selección. Los plásmidos de Studier (Studier et al., 1990), después de la inducción de la expresión, no se encuentran más que en una fracción muy pequeña de las células. Es evidente que el sistema de la invención estabiliza de forma importante los plásmidos, lo que aumenta los niveles de producción de proteínas recombinantes y la reproducibilidad del procedimiento. La región estabilizadora usada para la construcción de plásmidos según la invención se deriva más precisamente del fragmento par del plásmido RP4.
Un primer objetivo de la invención se refiere por lo tanto a un plásmido de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de interés bajo el control de un promotor del bacteriófago T7 y una región estabilizadora que comprende toda o una parte de la región par del plásmido RP4 o de un derivado de esta, y que comprende además el operador lacO y el gen lacI^{q}.
Preferentemente, el promotor del bacteriófago T7 usado en los plásmidos de la presente invención es el promotor del gen 10.
Como se ha indicado anteriormente, la región de estabilización usada en los plásmidos de la invención se deriva del fragmento par del plásmido RP4 (Gerlitz et al., 1990). Este fragmento lleva diferentes funciones (en particular 5 genes denominados parA, parB, parC, parD y parE), y principalmente una proteína que debe tener una actividad recombinasa de sitio específico que permite probablemente resolver los dímeros plasmídicos (Eberl et al., 1994). Este fragmento par puede aislarse a partir del plásmido RP4 y ser clonado sobre los plásmidos de expresión de la presente invención, como se describe en los ejemplos. Además, este fragmento puede ser modificado antes o después de su introducción en los plásmidos de la invención. Así, la región estabilizadora de los plásmidos de la invención puede estar constituida por toda o por una parte de la región del plásmido RP4 o de un derivado de esta.
En particular, la región estabilizadora de los plásmidos puede estar constituida por el inserto PstI del plásmido pTUG3 o por los sub-fragmentos SphI-SphI-SphI del pOH23 o SphI-SphI-ClaI del pOH41 o SphI-SphI-BamHI del pGMA28 o SphI-SphI-BamHI del pGMA27 que han sido descritos por Gerlitz et al., 1990 o por cualquier sub-fragmento del inserto PstI del pTUG3 que contenga como mínimo el inserto SphI-SphI-BamHI del pGMA27. Mientras que el inserto PstI del pTUG3 contiene los genes parCBA-parDE y las regiones flanqueantes, los insertos del pGMA27 o pGMA28 no contienen más que los genes parCBA-parDE' y la región 5' flanqueante. La región estabilizadora puede estar constituida igualmente por los genes parDE o por el gen parD y su región promotora o por otro promotor como ha sido descrito por Roberts et al, 1994. Esta región se puede obtener a partir del fragmento StyI-ClaI contenido en el plásmido pTUG3. La región estabilizadora también puede estar constituida por cualquier combinación de los dos, tres o cuatro genes par contenidos en el plásmido pTUG3, por ejemplo parA-parD o patB-parB o parAC-parD o parBA-parDE con su región promotora o con otro promotor.
El término derivado de la región par comprende cualquier fragmento obtenido por modificación genética y/o química de la región par y apto para la obtención de plásmidos estables según la invención. En particular, estos derivados se pueden obtener por deleciones, mutaciones, adiciones, escisiones, ligaduras, etc. a nivel de la región par del plásmido RP4 según las técnicas conocidas por el experto. A continuación, la funcionalidad de los derivados se puede ensayar como se describe en los ejemplos (véase principalmente el ejemplo 2).
Ventajosamente, en los plásmidos según la presente invención, la región estabilizadora comprende una parte de la región par del plásmido RP4. En un modo particular de realización, la región estabilizadora está constituida por el fragmento comprendido entre los restos 6038 y 8499 de la secuencia SEQ ID Nº 1.
Los plásmidos de la invención comprenden además el operador lacO y el gen lacI^{q}. En efecto, se ha constatado que a pesar de la presencia del promotor del bacteriófago T7 específico de un polimerasa no presente en la E. coli, se produce sin inductor una expresión basal de la secuencia del ácido nucleico de interés. Esta expresión residual puede inducir cierta disminución en la estabilidad del plásmido. La presencia en los plásmidos de la invención del operador lacO y del gen lacI^{q} permite obtener ventajosamente una expresión más regulada de la secuencia de ácido nucleico y, en particular, inhibir cualquier expresión en ausencia de inductor. Los plásmidos que incorporan estos elementos presentan por lo tanto una estabilidad y un control de la expresión aumentados. Para obtener el efecto buscado, se coloca ventajosamente el operador lacO en dirección 3' del promotor del bacteriófago T7 y en dirección 5' de la secuencia de ácido nucleico de interés como se indica en los ejemplos. El gen lacI^{q} se inserta en el plásmido, preferentemente con su propio promotor, en una región no esencial para las propiedades buscadas del plásmido. Así, el gen se inserta preferentemente fuera de la región par y de la casete de expresión de la secuencia de ácido nucleico de interés. Las secuencias de este operador y del gen lacI^{q} se dan en la secuencia SEQ ID Nº 1. Se entiende que estos elementos pueden ser reemplazados por secuencias homólogas o que posean funciones equivalentes.
En un modo de realización particularmente preferido, los plásmidos según la invención comprenden igualmente un terminador de transcripción, situado en dirección 3' de la secuencia de ácido nucleico de interés. Ventajosamente, el terminador de transcripción utilizado es el del gen del bacteriófago T7 cuyo promotor se utiliza. Preferentemente se trata del terminador T\phi del bacteriófago T7.
La secuencia de ácido nucleico de interés presente en los plásmidos según la invención puede ser cualquier secuencia que codifique para una proteína de interés farmacéutico, agroalimentario o que pueda ser usada para la biocatálisis. Se puede tratar de un gen de estructura, de una secuencia de ADN complementario, de una secuencia sintética, semisintética, etc.
Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico codifica para una proteína de interés farmacéutico elegida por ejemplo entre las enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfocinas (interleucinas, interferones, TNF, etc.), los factores de crecimiento, los neurotransmisores o sus precursores o enzimas de síntesis, los factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofina, etc.; apolipoproteínas: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc., la distrofina o una minidistrofina, la proteína CFTR asociada a la mucoviscidosa, los genes supresores de tumores: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, etc. los genes que codifican para factores implicados en la coagulación: factores VII, VIII, IX, los genes que intervienen en la preparación del 'ADN, etc.
En un modo de realización particular de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico de interés codifica para un factor de crecimiento de filbroblastos ácido (aFGF). El ADNc de la forma natural del aFGF humano ha sido identificado, secuenciado y clonado (Jaye et al., 1986 y 1987). Este ADNc puede codificar para diferentes formas del aFGF, según la presencia de deleciones en la parte N-terminal y, principalmente, de las formas que comprenden 154, 140 o incluso 134 aminoácidos. Además, también se pueden producir variantes naturales o artificiales que resultan de modificaciones por deleción, mutación y/o adición de uno o varios pares de bases en la secuencia del gen natural (por ejemplo de una metionina N-terminal). En un modo de realización totalmente específico de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico de interés codifica para el aFGF (154). Como ejemplo específico se puede citar el plásmido pXL2435 que presenta la secuencia SEQ ID Nº 1.
Otro objetivo de la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de proteínas recombinantes. Más particularmente, el procedimiento de producción según la invención consiste en cultivar una bacteria que contiene:
-
un plásmido tal como el descrito anteriormente que lleva una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicha proteína, y
-
el gen de la ARN polimerasa del bacteriófago T7,
en condiciones que permiten la expresión de la secuencia del ácido nucleico.
Como se ha indicado anteriormente, el interés del sistema reside principalmente en la utilización de un promotor del bacteriófago T7 reconocido específicamente por la ARN polimerasa del mismo bacteriófago T7. La bacteria usada debe comprender por lo tanto, además del plásmido según la invención, una casete que permita la expresión de la ARN polimerasa del bacteriófago T7. Esta casete puede bien estar integrada en el genoma de la bacteria usada (cepa E. coli BL21,DE3), bien llevada por un segundo plásmido o un fago o bien estar presente en el plásmido de la invención. Ventajosamente, en la casete de expresión, el gen que codifica para la ARN polimerasa del bacteriófago T7 está situado bajo el control de un promotor inducible, tales como los promotores lac, trp o recA. Esto permite, en efecto, inducir de forma controlada la producción de la ARN polimerasa en la célula y, por lo tanto, controlar la expresión de la secuencia de ácido nucleico de interés colocado bajo el control del promotor específico de dicha ARN polimerasa. Preferentemente, el promotor inducible que controla la expresión de la ARN polimerasa del bacteriófago T7 es el promotor PlacUV5 de la E. coli, que es inducido específicamente en presencia de IPTG.
Como se indica con más detalle en los ejemplos, el procedimiento de la invención permite de este modo una producción de proteínas no modificadas con tasas elevadas y de forma reproducible. Este procedimiento permite por lo tanto una producción industrial de proteínas recombinantes de calidad farmacéutica.
El procedimiento según la presente invención está adaptado muy particularmente para la producción de factores de crecimiento de fibroblastos recombinantes (principalmente aFGF y bFGF). Así, un objetivo particular de la presente invención reside en un procedimiento de preparación de aFGF recombinante según el cual se cultiva una bacteria que contiene el plásmido pXL2435 y el gen de la ARN polimerasa del bacteriófago T7 en condiciones que permiten la expresión de la secuencia de ácido nucleico y se recupera el aFGF producido.
La presente invención se describirá más completamente mediante los ejemplos siguientes, que se deben considerar como ilustrativos y no limitativos.
Abreviaturas utilizadas
aFGF: factor de crecimiento ácido de fibroblastos
bp: par de bases
DO: densidad óptica
E. coli: Escherichia coli
IPTG: isopropiltio-\beta-D-galactósido
kb: kilobases
kDa: kilodaltons
Km: kanamicina
LB: medio de Luria-Bertani
PAGE-SDS: electroforesis en gel que contiene acrilamida, N,N'-metilenobisacrilamida y dodecilsulfato de sodio
T7: bacteriófago T7
Leyendas de las figuras
Figura 1
Construcción del plásmido pXL2435
A- Esquema de las construcciones: Los fragmentos AccI-NdeI de 3,2 kb del pET11a y de 2,8 kb del pXL2283 se han ligado para generar el plásmido pXL2434; el plásmido pXL2434 digerido con BglII se ha ligado con el fragmento BamHI de 2,4 kb del pXL2433 para crear el pXL2435.
B- Mapa del plásmido pXL2435: aFGF: gen que codifica para el aFGF; ampR: gen de resistencia a la ampicilina; Kmr: el gen de resistencia a la kanamicina; lacI^{q}: gen que codifica para una síntesis elevada del represor Lac; ori: origen de replicación de ColE1; parDE'parCBA: genes del locus par del RP4; pT7: promotor \phi10 del T7 y operador lacO; T\phi: terminador T\phi del T7. Las flechas indican la dirección de transcripción de los genes. Los sitios de las enzimas de restricción indicados son los que se han usado para las clonaciones. Las cifras escritas entre paréntesis corresponden a las posiciones de pares de bases sobre la secuencia SEQ ID Nº 1.
Figura 2
Visualización de la proteína aFGF producida por E. coli BL21, DE3 en ausencia de antibiótico y en presencia del plásmido pXL2283 o pXL2434 o pXL2435 después de inducción con IPTG. Los extractos celulares totales se depositan sobre gel. M: marcador de peso molecular que se indica en kDa, la flecha indica el peso molecular del aFGF.
Secuencia SEQ ID Nº 1: Secuencia nucleotídica del plásmido pXL2435 de 8501 bp. La posición 1 sobre la secuencia corresponde al sitio de ruptura de BglII del pET11a. El gen aFGF se sitúa entre las posiciones 108 a 575, el locus par entre las posiciones 6038 y 8499, es decir parE' de 8248 a 8499, parD de 8001 a 8252, parC de 7850 a 7557, parB de 7560 a 7027 y parA de 7066 a 6407; el promotor \phi10 del T7 entre las posiciones 20 y 36, lacO entre las posiciones 39 y 63, el terminador T\phi del T7 entre las posiciones 586 y 708 y el gen lacI^{q} entre las posiciones 5636 y 4554.
Técnicas generales de clonación, de biología molecular y de bioquímica
Los métodos clásicos de biología molecular tales como la centrifugación del ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio-bromuro de etidio, las digestiones con enzimas de restricción, la electroforesis sobre gel, la electroelución de los fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa, la transformación en E. coli, la precipitación de ácidos nucleicos, etc. se describen en la bibliografía (Sambrook et al., 1989). Las enzimas de restricción han sido suministradas por New-England Biolabs (Biolabs), Bethesda Reseach Laboratories (BRL) o Amersham Ltd (Amersham).
Para las ligaduras, se separan los fragmentos de ADN según su tamaño sobre geles de agarosa al 0,7%, se purifican por electroelución, se extraen con fenol, se precipitan en etanol y a continuación se incuban en un tampón Tris-HCl pH 7,4 50 mM, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en presencia de la ADN ligasa del fago T4 (Biolabs). Los ADN ligados o los ADN plasmídicos puros se usan para transformar la cepa que se ha hecho competente: E. coli BL21, DE3 [F-ompT hsdS_{B}(r_{B}^{-}m_{B}^{-}) gal dcm (DE3)] (Studier et al., 1990) y E. coli TG1 [\Delta(lac proA,B), supE, thi, hsdD5/ F traD36, proA^{+}, B^{+}, lacI^{q}, lacZ\DeltaM15] (Gibson, 1984). Los ADN plasmídicos se purifican según la técnica de lisis alcalina descrita por Sambrook et al., 1989.
Se usa el medio de cultivo LB para la parte bacteriológica (Sambrook et al., 1989). A continuación se extienden las diluciones de la suspensión bacteriana sobre placas con medio LB complementadas, si es necesario, con kanamicina a 50 mg/L.
Se usa el protocolo descrito por Studier et al., 1990 para producir aFGF mediante la cepa BL21, DE3 que lleva un plásmido de expresión del aFGF, (pXL2283 o pXL2434 o pXL2435 descrito en el ejemplo 1).
La producción del aFGF se cuantifica sobre extractos celulares totales. Después de la lisis de las bacterias, se depositan las muestras sobre un gel de SDS-PAGE al 15% que, después de la electroforesis, se colorea con azul de Coomassie (Denèfle et al., 1987). Con las muestras obtenidas de las cepas que producen el aFGF se observa una banda de un peso molecular aparente de 16 kDa. Se realiza una transferencia semiseca sobre membrana de nitrocelulosa (Sambrook et al., 1989), se trata la membrana según el protocolo del kit Vectastain (Biosys SA, France) para permitir una detección del aFGF inmunológico (anticuerpos anti-aFGF bovino obtenido en conejos y vendido por Sigma, France; y anti-IgG de conejo) colorimétrica mediante el complejo de avidina peroxidasa biotinilada. Se realiza otra transferencia semiseca sobre membrana Pro-Blott (Matsudaira, 1987), se colorea la membrana con azul de Coomassie y se escinde la banda de peso molecular aparente de 16 kDa. Esta parte de la membrana se somete a la degradación de Edman, 1956 mediante un microsecuenciador de Applied Biosystems modelo 477A que posee un analizador 120/7 en línea y que se utiliza según las instrucciones del fabricante.
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Ejemplo 1 Construcción de un plásmido estable y regulado de expresión del ADNc del aFGF humano.
Este ejemplo describe las construcciones realizadas para obtener un plásmido estable y muy regulado que permite la producción del aFGF en E. coli.
El ADNc de la forma natural del gen del aFGF humano (470 pb) (Jaye et al., 1986 y 1987) ha sido identificado, secuenciado y clonado en el vector de expresión pET9 (Studier et al., 1990) en los sitios NdeI y BamHI para generar el plásmido de expresión pMJ42, denominado en la parte siguiente de la presente memoria pXL2283 (véase la figura 1). El inserto NdeI-AccI de 2,8 kb del plásmido pXL2283 ha sido ligado con el fragmento NdeI-AccI de 3,2 kb del plásmido pET11a (Studier et al., 1990) para crear el plásmido de expresión pXL2434. Este plásmido es diferente del pXL2283 por la presencia del gen lacI^{q} y del operador lacO, lo que permite obtener una expresión más regulada del aFGF. A continuación se han introducido sitios BamHI en los extremos del fragmento parCBA-parDE' de 2,46 kb obtenido del plásmido pGMA28 (Gerlitz et al., 1990). Para esto, el fragmento SphI-SphI-BamHI de 2,46 kb del pGMA28 ha sido clonado en el plásmido pUC18 (Yanish-Perron et al., 1985) y digerido con SphI-BamHI para generar el plásmido pGMA60 (H. Schwab et al., comunicación personal). El fragmento de 2,46 kb HindIII-EcoRI del plásmido pGMA60 ha sido clonado a continuación en el plásmido pMTL22 (Chambers et al., 1988) y digerido con HindIII y EcoRI para generar el pXL2433. El inserto BamHI (parCBA-parDE') del plásmido pXL2433 ha sido introducido en el sitio BglII del plásmido pXL2434 para crear el plásmido pXL2435. En la figura 1 se representan un esquema de las construcciones y el mapa del plásmido pXL2435 y se describe la secuencia de 8501 pb del plásmido pXL2435 (SEQ ID Nº 1). Mientras que la secuencia descrita en el artículo de Gerlitz et al., 1990 solo es parcial (es necesario añadir 125 pares de bases en 3'), esta parte 3' de la secuencia ha sido verificada sobre los plásmidos pXL2433 y pXL2435 y sobre la secuencia SEQ ID Nº 1. En la tabla 1 se presenta un resumen de las características de los tres plásmidos de expresión.
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TABLA 1 Características de los plásmidos de expresión
1 
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Ejemplo 2 Estabilidad del plásmido de expresión durante la producción del aFGF
Este ejemplo describe la producción, en medio líquido, del aFGF a partir de una cepa de E. coli recombinante que posee un plásmido de expresión del aFGF, dependiente de la T7-polimerasa, y que se ha cultivado en ausencia de selección del plásmido. Después de la producción del aFGF, se sigue la presencia del plásmido por la resistencia de las bacterias a la kanamicina, cuyo gen de resistencia es llevado por los plásmidos descritos en el ejemplo 1. Por último, se caracteriza la proteína aFGF producida por métodos bioquímicos clásicos.
Ejemplo 2.1
Estabilidad del plásmido de expresión en ausencia de condiciones de inducción de la producción de aFGF
Se introducen los plásmidos pXL2283, pXL2434 y pXL2435 por transformación en la cepa BL21, DE3 (Studier et al., 1990). Entre los transformantes que se eligen sobre medio LB gelificado que contenía kanamicina, se han cultivado dos transformantes, elegidos al azar, durante 16 horas en medio LB líquido en presencia de kanamicina. El cultivo se ha diluido hasta 1/100 y se ha cultivado en medio LB en presencia de kanamicina hasta que la densidad óptica a 600 nm estuviera comprendida entre 0,2 y 0,6. Se ha realizado una dilución de los cultivos en 10 ml de medio hasta 1/100 en medio LB y se han cultivado las cepas hasta una DO comprendida entre 0,17 y 0,6. Esta dilución-crecimiento de bacterias, en el medio sin antibiótico a 37ºC, ha sido repetida seis veces y corresponde, en total, al número de generaciones de más de 30 que se ha obtenido después de dos días. Se han extendido las bacterias en medio LB gelificado. Después del crecimiento, se han seleccionado 100 clones en medios LB gelificado y LB que contenían Km. En la tabla 2 se indica la frecuencia de los clones resistentes a la Km después de al menos 30 generaciones sin presión de selección del plásmido.
Este ejemplo demuestra que el fragmento par del RP4 estabiliza el plásmido en ausencia de presión de selección, incluso aunque este efecto de estabilización solo sea moderado.
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Ejemplo 2.2
Estabilidad del plásmido de expresión en condiciones de inducción de la producción de aFGF
Las bacterias cultivadas durante al menos 30 generaciones en ausencia de antibiótico (como se ha descrito en el ejemplo 2.1) se han diluido hasta 1/100 en medio LB, cultivado durante 12 horas y a continuación diluido hasta 1/100 en medio LB. Cuando las bacterias han crecido hasta una DO de 0,5 a 0,8; se ha añadido 1 mM de IPTG y se han cultivado las bacterias durante 4 horas para permitir la producción de aFGF, lo que se cuantifica sobre los extractos celulares totales depositados sobre gel de SDS-PAGE al 15%, coloreado con azul de Coomassie (véase la figura 2). Se han extendido las bacterias en medio LB gelificado. Después del crecimiento, se han seleccionado 100 clones en medios LB gelificado y LB que contenían kanamicina. En la tabla 2 se indica la frecuencia de los clones resistentes a la kanamicina después de la producción del aFGF sin presión de selección del plásmido.
Este ejemplo demuestra sin ambigüedad que el fragmento par induce una estabilidad segregacional muy importante como consecuencia de la expresión del aFGF usando el sistema de expresión dependiente de la polimerasa del fago T7.
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TABLA 2 Porcentaje de clones resistentes a la kanamicina después de crecimiento solo o crecimiento (al menos 30 generaciones) y después expresión, sin presión de selección del plásmido
2 
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Ejemplo 2.3
Caracterización de la proteína aFGF producida en presencia del plásmido de expresión del aFGF
En las condiciones de inducción de la producción descritas en el ejemplo 2.2, la proteína aFGF obtenida se visualiza, véase la figura 2, sobre gel de PAGE-SDS al 15% coloreado con azul de Coomassie y migra con un peso molecular aparente de 16 kDa, según los datos bioquímicos descritos y la secuencia publicada (Jaye et al., 1986 y 1987). Además, esta proteína se revela por detección inmunológica colorimétrica usando anticuerpos anti-aFGF bovino. La secuencia N-terminal de la proteína producida con la cepa BL21, DE3 pXL2435 se ha determinado a continuación a partir del extracto total que se ha purificado por electroforesis PAGE-SDS, como se ha descrito en las técnicas generales de bioquímica. La secuencia obtenida es A-E-G-E-I-T-T-F-T-A-L-T (SEQ ID Nº 2), idéntica a la secuencia N-terminal de la proteína natural (Jaye et al., 1986) y la metionina terminal ha sido cortada con metionilaminopeptidasa de E. coli como ha sido descrito por Hirel et al., 1989.
Este ejemplo demuestra por lo tanto que la proteína producida mediante un plásmido de expresión estable en E. coli descrito en el ejemplo 2.2, es la proteína aFGF y que su secuencia N-terminal no está truncada.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: RHONE-POULENC RORER S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 20, avenue R. ARON
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: ANTONY
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 920165
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimiento de producción de proteínas recombinantes, plásmidos y células modificadas.
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
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(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
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(A)
TIPO DE SOPORTE: Cinta
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8501 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: circular
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
3
4
5
6
7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
9

Claims (18)

1. Plásmido de expresión caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico de interés bajo el control de un promotor del bacteriófago T7 y una región estabilizadora que comprende toda o una parte de la región par del plásmido RP4 o de un derivado de esta y porque comprende además el operador lacO y el gen lacI^{q}.
2. Plásmido según la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor del bacteriófago T7 es el promotor del gen 10.
3. Plásmido según la reivindicación 1, caracterizado porque la región estabilizadora comprende una parte de la región par del plásmido RP4.
4. Plásmido según la reivindicación 3, caracterizado porque la región estabilizadora está constituida por el fragmento comprendido entre los restos 6038 y 8499 de la secuencia SEQ ID Nº 1.
5. Plásmido según la reivindicación 1, caracterizado porque el operador lacO está situado en dirección 3' del promotor del bacteriófago T7 y en dirección 5' de la secuencia de ácido nucleico de interés.
6. Plásmido según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de interés codifica para una proteína de interés farmacéutico, agroalimentario o que se puede usar en biocatálisis.
7. Plásmido según la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de interés codifica para una proteína elegida entre las enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfocinas, los factores de crecimiento, los neurotransmisores o sus precursores o enzimas de síntesis, los factores tróficos, las apolipoproteínas, la distrofina o una minidistrofina, la proteína CFTR, los genes supresores de tumores, los genes que codifican para los factores implicados en la coagulación o los genes que intervienen en la reparación del ADN.
8. Plásmido según la reivindicación 7, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de interés codifica para un factor de crecimiento ácido de los fibroblastos (aFGF).
9. Plásmido según la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de interés codifica para el aFGF(154).
10. Plásmido pXL2435 que presenta la secuencia SEQ ID Nº 1.
11. Procedimiento de producción de una proteína recombinante, caracterizado porque se cultiva una bacteria que contiene:
-
un plásmido según una de las reivindicaciones 1 a 10 que lleva una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicha proteína, y
-
el gen de la ARN polimerasa del bacteriófago T7,
-
en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque el gen de la ARN polimerasa del bacteriófago T7 está colocado bajo el control de un promotor inducible.
13. Procedimiento según las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado porque el gen de la ARN polimerasa del bacteriófago T7 está integrado en el genoma de la bacteria utilizada.
14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque la bacteria se elige entre las cepas de E. coli.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque la bacteria es la cepa E. coli BL21, DE3.
16. Procedimiento según las reivindicaciones 11 a 15 para la producción de aFGF recombinante.
17. Procedimiento de preparación de aFGF recombinante, caracterizado porque se cultiva una bacteria que contiene el plásmido pXL2435 y el gen de la ARN polimerasa del bacteriófago T7 en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico y se recupera el aFGF producido.
18. Bacteria transformada por un plásmido según una de las reivindicaciones 1 a 10.
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