ES2699652T3 - Fago genéticamente modificado y uso del mismo - Google Patents

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Abstract

Una célula anfitriona bacteriana que comprende un fago genéticamente modificado en la que - se inserta un sistema de expresión, dicho sistema de expresión comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína, dicha proteína que induce adicionalmente la expresión de una biomolécula de interés, y - se suprimen los genes int, S, R, Rz, Xis, y en la que dicho fago genéticamente modificado se integra en el genoma de dicha célula anfitriona bacteriana, y en la que el fago es el fago lambda, el fago 434, el fago phi80, el fago phi81, el fago HK97, o el fago P21.

Description

DESCRIPCIÓN
Fago genéticamente modificado y uso del mismo
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de producción de biomoléculas de interés en sistemas biológicos. Específicamente, la presente invención se refiere a un fago genéticamente modificado integrado en el genoma de una célula anfitriona bacteriana, y uso del mismo con el fin de evitar la contaminación de fago del caldo de cultivo y/o lisis bacteriana.
Antecedente de la invención
Las células bacterianas son sistemas de elección para la producción de biomoléculas, especialmente de proteínas objetivo. Entre otras ventajas, los sistemas bacterianos son fáciles de utilizar y permiten la producción rápida de grandes cantidades de proteínas en un volumen limitado de cultivo.
Uno de los sistemas bacterianos utilizado amplia y habitualmente es el sistema de expresión del bacteriófago T7. Este sistema bacteriano fue descrito en el documento US 4,952,496. En este sistema, el gen que codifica la proteína objetivo se coloca bajo el control de un promotor T7 y se transforma en un anfitrión bacteriano, usualmente E. coli, que comprende un fago lisógeno DE3 lambda integrado. El fago lisógeno lambda DE3 lleva el gen que codifica la polimerasa de ARN T7 bajo el control de un promotor lacUV5. Cuando se cultiva en un medio que contiene IPTG, se induce la expresión de la polimerasa de ARN T7, y permite la expresión de la proteína objetivo. El documento US 2003/003472 divulga, una cepa de E. coli: 5HT71, producida por lisogenización de HB101 con ADE3.
Debido a la integración del gen de la polimerasa de ARN T7 (gen 1 de T7) dentro de la secuencia del gen Int, el fago DE3 Lambda debe ser defectuoso en su capacidad para ingresar en la fase lítica. Sin embargo, la lisis bacteriana se observa durante algunas producciones de proteínas y en ausencia de cualquier otro fago, lo que sugiere que el fago DE3 puede recuperar sus propiedades líticas. La lisis bacteriana y aún más, la presencia de fagos infecciosos en el caldo de cultivo es altamente problemático porque (i) compromete el uso de proteínas objetivo producidas para algunas aplicaciones, tales como, por ejemplo, aplicaciones farmacéuticas, (ii) el proceso de descontaminación con el fin de eliminar cualquier rastro de fagos requiere el cierre de las líneas de producción y la renovación completa de los lotes de cultivo y (iii) reduce dramáticamente el rendimiento de la proteína recombinante.
Los fagos A modificados se describieron en la técnica. Sternberg et al., 1979 (Virology, 96: 129-142) se refieren a vectores P1-A híbridos, en los que se elimina el gen int, y que comprenden una supresión del 6% que elimina el ADN entre los genes P y Q lambda. Padukone et al., 1990 (Biotechnology pogress, 6: 277-282) describen vectores derivados de bacteriófagos A para la expresión de genes clonados estables, en los que dichos vectores comprenden una inactivación del gen S. Miao et al., 1993 (Biotechnology progress, 9: 153-159) describe la infección de células de E. coli con un fago lambda (ACE6), en el que se suprime el gen int y en el que el gen S contiene la mutación de lisis Sam7. Lin et al., 1998 (Biotechnology and bioengineering, 57: 529-535) se refieren a un bacteriófago A que comprende una mutación en el gen Q y al uso del mismo para producir proteínas recombinantes en el sistema de E. coli. Dorgai et al, 1998 (J.Mol. Biol. 277: 1059-1070) estudian la especificidad de recombinación de la integrasa de fagos lambda y HK022 en secuencias de ácidos nucleicos att y secuencias de proteínas Int. En particular, Dorgai et al, 1998, describen una bacteria lisogénica RW721 que lleva un profago Sam7 A y se eliminó para att, Int e imm. Christensen et al, 2001 (Mol. Biotechnology, 17: 219-224) describen vectores de expresión del bacteriófago A que comprenden un sistema de expresión derivado del bacteriófago T7 con mutación en el gen Q. El documento US 2002/090678 se refiere a un método para producir biomoléculas, en las que las células bacterianas de la cepa productora están infectadas con un bacteriófago A que comprende mutación en uno de los genes N, Q y/o R de fase tardía. El documento WO 2006/091483 se refiere a sistemas de vectores de expresión para uso en la expresión de genes exógenos bajo el control del promotor de la polimerasa T7. Dicho vector de expresión comprende genes Q, S, E o R inactivados. Sin embargo, el uso de estos fagos A modificados todavía se pueden asociar con la lisis de las células anfitrionas y la posterior contaminación del medio.
Se han descrito métodos alternativos para el uso de un fago:
El documento WO03/050240 describe un sistema de expresión para producir una proteína objetivo en una célula anfitriona que comprende un gen que codifica la polimerasa de ARN T7 integrada utilizando recombinación homóloga. Sin embargo, el sistema del documento WO03/050240 es difícil de implementar, debido al tamaño del gen de la polimerasa de ARN T7 y debido al hecho de que la recombinación homóloga no es fácil de hacer en todas las cepas de E. coli (como lo mencionaron Phue et al., Biotechnology and Bioengineering, 101, 831-836, 2008). En consecuencia, el número de células transformadas que llevan la integración de la polimerasa de ARN T7 permanece muy bajo o no se obtienen estas células. Más aún, utilizando una recombinación homóloga, es necesario utilizar un marcador selectivo para seleccionar las bacterias que contienen la integración del gen de la polimerasa de ARN T7. Este marcador no será utilizable para otra etapa de selección y podría no ser deseado para el uso final de la cepa. Por ejemplo, los marcadores selectivos que se utilizan a menudo son genes de resistencia a los antibióticos, pero se recomienda evitar estos genes en producciones biofarmacéuticas. Por lo tanto, se requiere una etapa adicional para eliminar el gen de resistencia a los antibióticos de la cepa y no siempre es posible hacerlo.
El documento WO2008/139153 describe otro sistema de expresión, en el que la célula anfitriona se transforma con un plásmido que comprende un casete de expresión para la polimerasa de ARN de T7. Sin embargo, debido al uso de un plásmido, las células anfitrionas se deben mantener en condiciones selectivas para asegurarse de que aún comprenden el plásmido. Adicionalmente, los plásmidos se someten con frecuencia a recombinación, lo que altera el sistema de expresión.
Por lo tanto, subsiste la necesidad de un método novedoso para producir una biomolécula de interés, en el que, cuando se utiliza un fago, el cultivo no se contamine por fagos infecciosos o se lisan involuntariamente durante el crecimiento o la producción de proteínas.
Por lo tanto la presente invención proporciona un fago genéticamente modificado que no recupera sus propiedades líticas durante el cultivo, permitiendo de esta manera la producción de una biomolécula de interés sin contaminación por fagos.
Resumen
Un objeto de la invención es una célula anfitriona bacteriana que comprende un fago genéticamente modificado en el que
- se inserta un sistema de expresión, dicho sistema de expresión comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína, dicha proteína induce adicionalmente la expresión de una biomolécula de interés, y
- se suprimen los genes int, S, R, Rz, Xis,
en la que se integra fago genéticamente modificado en el genoma de dicha célula anfitriona bacteriana, y en la que el fago es el fago lambda, el fago 434, el fago phi80, el fago phi81, el fago HK97, o el fago P21.
En una realización, el gen Q se inactiva adicionalmente.
En una realización, el promotor comprendido en el sistema de expresión es inducible.
En otra realización de la invención, el sistema de expresión es el sistema de expresión T7.
En una realización, dicho fago es uno de los fagos P11 o P13, en el que
- P11 comprende la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, R, Rz, Xis y Int, y
- P13 comprende la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, R, Rz, Q, Xis y Int.
En una realización de la invención, la célula anfitriona es una enterobacteria, preferiblemente E. Coli, más preferiblemente BL21.
En otra realización de la invención, la célula anfitriona como se describió en este documento anteriormente comprende adicionalmente la inactivación de por lo menos uno de los genes tonA, galK, araB, araA, lon, ompT, rcsA, hsdR, mrr, endA y recA.
En otra realización de la invención, la célula anfitriona como se describió en este documento anteriormente comprende la inserción del gen ccdB.
Otro objeto de la invención es un kit que comprende la célula anfitriona como se describió en este documento anteriormente y un plásmido que comprende el gen ccdA.
Otro objeto de la invención es un proceso para preparar una célula anfitriona como se describió en este documento anteriormente, que comprende infectar una célula anfitriona con un fago genéticamente modificado como se describió en este documento anteriormente, y utilizar un fago ayudante para complementación.
Otro objeto de la invención es un proceso para producir una biomolécula de interés, que comprende
- cultivar una célula anfitriona que comprende como se describió en este documento, en la que dicha célula anfitriona comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la biomolécula de interés,
- expresar dicha biomolécula de interés.
Descripción detallada
La presente invención se refiere a una célula anfitriona bacteriana que comprende un fago genéticamente modificado, en la que se limita la capacidad del fago para recuperar sus propiedades líticas.
El alcance de la presente invención se determina por las reivindicaciones. Las siguientes realizaciones son realizaciones que caen dentro de las restricciones de las reivindicaciones.
Los inventores se centraron en la modificación genética de un fago. Sorprendentemente, los inventores mostraron que no era posible suprimir todas las secuencias víricas del fago integrado, ya que la viabilidad de las bacterias infectadas se vio gravemente comprometida en ese caso. En particular, los inventores mostraron que la supresión de un fragmento de ADN que comprende las secuencias de codificación del gen ral y el gen N conduce a la muerte de la célula anfitriona (véanse los EJEMPLOS). Este resultado fue sorprendente porque no se sabe que los genes ral y N estén involucrados en el estado lisogénico; el gen N solo se describe como esencial para el crecimiento lítico. Por el contrario, en el estado lisogénico, un represor del fago, llamado CI o C2, bloquea la expresión de N y ral.
De esta manera la presente invención se refiere a una célula anfitriona bacteriana que comprende un fago genéticamente modificado en la que
- se inserta un sistema de expresión, y
- se suprimen los genes Int, Xis, R, S, y Rz y opcionalmente en el que se inactiva el gen Q.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes R.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactiva el gen Q.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Int.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Xis.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S y Int.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S y Xis.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S y R.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S y Rz.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S y Q se inactivan.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes R y Rz.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes R y Int.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes R y Xis.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes R y Q.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Q y Rz.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Q y Int.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Q y Xis.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, Int y Xis.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, Int y Rz.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, Int y R.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, Xis y Rz.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, Xis y R.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, R y Rz.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, R y Q.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, Q y Rz.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, Q y Int.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, Q y Xis.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes R, Int y Xis.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes R, Int y Rz.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes R, Xis y Rz.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes R, Q y Rz.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes R, Xis y Q.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes R, Int y Q.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Q, Int y Rz.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Q, Int y Xis.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Q, Xis y Rz.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, Int, Xis y Rz.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, Int, Xis y R.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, Int, R y Rz.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, R, Xis y Rz.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes R, Rz, Xis y Int.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Q, R, Rz y S.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Q, R, Rz y Int.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Q, R, S y Int.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Q, Rz, S y Int.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Q, R, Rz y Xis.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Q, R, S y Xis.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Q, Rz, S y Xis.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Q, R, Int y Xis.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Q, Rz, Int y Xis.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes Q, S, Int y Xis.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, R, Rz, Xis y Int.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, R, Q, Rz y Xis.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, R, Q, Rz y Int.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, R, Q, Xis y Int.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, Q, Rz, Xis y Int.
De acuerdo con la divulgación, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes R, Q, Rz, Xis y Int.
En una realización, el fago genéticamente modificado comprende un sistema de expresión y se inactivan los genes S, R, Q, Rz, Xis y Int.
Ejemplos de fagos que se pueden utilizar en la invención incluyen, pero no se limitan a, los fagos lambda (A), fago similar a lambda y lambdoides. El fago Lambda, también conocido como colifago lambda, es un virus que infecta a Escherichia coli. Lambda es un bacteriófago temperado. Los fagos similares a Lambda forman una familia de bacteriófagos y virus arquéales que se caracterizan por largas colas no contráctiles. Los fagos lambdoides son parientes naturales del fago lambda. La mayoría de ellos crecen en E. coli, pero algunos provienen de otras células anfitrionas, tales como, por ejemplo, Salmonella typhimurium. Estos fagos pueden tener el mismo orden genético que lambda.
Los ejemplos de fagos de tipo lambda y lambdoides que se podrían utilizar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, colifago 434, phi80, phi81, HK97, P21 y P22.
En una realización, el fago es lambda (Fago lambda de enterobacteria, número de acceso NC_001416). La organización del genoma del fago lambda se muestra en la tabla 1 a continuación.
Tabla 1
Inicio Fin Nombre Descripción_________________________________ 191 736 nu1 Proteína de empaque de ADN
711 2636 A Proteína de empaque de ADN
2633 2839 W proteína de unión de cabeza y cola
2836 4437 B componente de cápside
4418 5737 C componente de cápside
5132 5737 nu3 proteína de ensamble de cápside
5747 6079 D proteína de estabilización de ADN de cabeza
6135 7160 E componente de cápside
7202 7600 Fi Proteína de empaque de ADN
7612 7965 Fii proteína de unión de cabeza y cola
7977 8555 Z componente de cola
8552 8947 U componente de cola
8955 9695 V componente de cola
9711 10133 G componente de cola
10115 10549 T componente de cola
10542 13103 H componente de cola
13100 13429 M componente de cola
13429 14127 L componente de cola
14276 14875 K componente de cola
14773 15444 I componente de cola
15505 18903 J cola: proteína de especificidad del anfitrión
18965 19585 lom membrana de anfitrión externa
19650 20855 orf-401 Proteína de fibra de cola
20767 20147 orf206b proteína hipotética
21029 21973 orf-314 Fibra de cola
21973 22557 orf-194 Proteína de ensamble de fibra putativa
23918 22686 ea47 ea47
25399 24509 ea31 ea31
26973 25396 ea59 ea59
28882 27812 int proteína de integración
29078 28860 xis Excisionasa
29285 29118 hipotética proteína hipotética
29655 29374 ea8.5 ea8.5
30395 39847 ea22 ea22
31024 30839 orf61 proteína hipotética
31196 31005 orf63 proteína hipotética
31351 31169 orf60a proteína hipotética
32028 31348 exo exonucleasa
32810 32025 bet bet
33232 32816 gam proteína Gam de inhibidor de nucleasa de anfitrión 33330 33187 kil proteína de muerte de anfitrión
33463 33299 cIII proteína antiterminativa
35582 33494 ea10 Proteína de unión a ADN de cadena sencilla putativa 35582 33930 ral proteína de alivio de restricción
34357 34271 orf28 proteína hipotética
34482 35036 lambdap48 Proteína B de exclusión de superinfección
35582 34560 N regulador de gen temprano
36259 35825 rexb proteína de exclusión
37114 36275 rexa proteína de exclusión
37940 37227 cI represor
38023 38135 cro antirrepresor
38360 38653 cII activador transcripcional
Inicio Fin Nombre Descripción
38686 39585 O Proteína de replicación de ADN
39582 40283 P Proteína de replicación de ADN
40280 40570 ren proteína de exclusión ren
40644 41084 NinB NinB
41081 41953 NinC Proteína NinC
41950 42123 NinD Proteína NinD
42090 42272 NinE Proteína NinE
42269 42439 NinF Proteína NinF
42429 43043 NinG Proteína NinG
43040 43246 NinH Proteína NinH
43224 43889 NinI Proteína NinI
43886 44509 Q regulador de gen tardío
44621 44815 orf-64 proteína hipotética
45186 45509 S Proteína de lisis celular
45493 45969 R endolisina
45966 46427 Rz proteína de lisis celular
46186 46368 Rz1 Proteína Rz1
46752 46459 bor Precursor de proteína Bor
47575 47042 lambdap78 proteína de envoltura putativa
47738 47944 lambdap79 proteína hipotética
En la presente invención, la posición de los residuos dentro de la secuencia del fago lambda se refiere a NC_001416.
En otra realización, el fago es lambda DE3 (número de acceso EU078592). El fago Lambda DE3 es un fago lambda D69 modificado, que comprende el gen que codifica la polimerasa de ARN T7 bajo el control de un promotor lacUV5. La lista de los genes llevados por la secuencia de Lambda DE3 y su posición se muestran en la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2
Inicio Fin Nombre Descripción
341 1423 lacI represor de operón de lactosa
1546 1995 lacZ Fragmento de terminal N de beta-galactosidasa
2026 4677 1 Polimerasa de ARN dirigida a ADN T7
5804 5586 xis excisionasa
6011 5844 hipotética Proteína hipotética
6381 6100 ea8.5 ea8.5
7121 6573 ea22 ea22
7750 7565 hipotética Proteína hipotética
7922 7731 hipotética Proteína hipotética
8077 7895 hipotética Proteína hipotética
8754 8074 exo exonucleasa
9536 8751 bet Bet
9958 9542 gam proteína Gam de inhibidor de nucleasa de anfitrión 10056 9913 kil proteína de muerte de anfitrión
10189 10025 cIII proteína antiterminativa
10630 10262 ea10 proteína de unión a ADN de cadena sencilla putativa 11013 10813 ral proteína de alivio de restricción
11083 10997 hipotética Proteína hipotética
11391 11092 N proteína N de regulación probable (regulador de gen temprano)
12356 11706 C2 Proteína C2 represora
12437 12622 cro Proteína cro reguladora (Antirrepresor)
12738 13037 cII proteína antiterminativa
13070 13969 O Proteína de replicación de ADN
13966 14667 P Proteína de replicación de ADN
14664 15467 ren Proteína de exclusión ren
15464 16087 Q regulador de gen tardío
16199 16393 hipotética Proteína hipotética
16764 17087 S proteína de lisis celular
17071 17547 R proteína de lisis celular
17544 18005 Rz proteína de lisis celular
18330 18037 Bor Precursor de proteína Bor
19153 18620 putativa proteína de envoltura putativa
19316 19522 hipotética Proteína hipotética
Inicio Fin Nombre Descripción__________________________ 20270 20815 nu1 Proteína de empaque de ADN
20790 22715 A Proteína de empaque de ADN
22712 22918 W proteína de unión de cabeza y cola
22915 24516 B componente de cápside
24497 25816 C componente de cápside
25826 26158 D proteína de estabilización de ADN de cabeza
26214 27239 E componente de cápside
27281 27679 Fi Proteína de empaque de ADN
27691 28044 Fii proteína de unión de cabeza y cola
28056 28634 Z componente de cola
28631 29026 U componente de cola
29034 29774 V componente de cola
29790 30212 G componente de cola
30194 30628 T componente de cola
30621 33182 H componente de cola
33179 33508 M componente de cola
33508 34206 L componente de cola
34356 34955 K componente de cola
34853 35524 I componente de cola
35585 38983 J cola: proteína de especificidad del anfitrión
39045 39665 lom Membrana de anfitrión externa
39730 40935 cola proteína de fibra de cola
41109 41372 cola fibra de cola
42175 41237 ea59 ea59
En la presente invención, la posición de los residuos dentro de la secuencia del fago Lambda DE3 se refiere a EU078592.
Como se utiliza en este documento, un "sistema de expresión" se refiere a una molécula de ADN lineal o circular compuesta por un fragmento que codifica una secuencia de ácidos nucleicos unida operativamente a un fragmento adicional para la transcripción del sistema.
El fragmento adicional incluye un promotor y una secuencia de codón de parada. El sistema de expresión puede contener adicionalmente uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores de selección y una secuencia que codifica un sitio de unión a ribosoma.
"Unido operativamente" significa que los fragmentos están dispuestos para funcionar como se supone que funcionan, por ejemplo, una vez que la transcripción comienza en el promotor, pasa a través del fragmento codificado para detener el codón.
"Promotor" en el significado de la presente invención es un elemento de control de la expresión que permite la unión de la polimerasa de ARN y el inicio de la transcripción.
En una realización de la invención, la secuencia de ácidos nucleicos está bajo el control de un promotor "fuerte". Un promotor fuerte se caracteriza por una alta afinidad de unión de la secuencia promotora a una polimerasa de ARN, usualmente la polimerasa de ARN correspondiente de origen natural, por una parte, y la tasa de formación de ARNm por esa polimerasa de ARN por otra parte.
En una realización preferida, la secuencia de ácidos nucleicos está bajo el control de un "promotor inducible". Un "promotor inducible" es un promotor que puede estar regulado por factores externos, por ejemplo la presencia de una molécula inductora (también denominada "inductor") o la ausencia de una molécula represora, o factores físicos como el aumento o la disminución de la temperatura, la osmolalidad o el valor de pH. Los diferentes promotores y los respectivos principios de inducción fueron revisados por Makrides et al. (Microbiological Reviews, 1996, (60)3: 512­ 538). Ejemplos de promotores inducibles que se pueden utilizar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, el promotor tac o trc, el promotor lac o lacUV5 (todos inducibles por lactosa o su análogo IPTG (isopropiltiol-pD-galactosida)), el promotor araBAD estrechamente regulable (PBAD; Guzman et al., 1995, inducible por arabinosa), el promotor trp (inducible por la adición de ácido p-indol acrílico o la inanición del triptófano, reprimible por la adición de triptófano), el promotor lambda pL (A) (inducción por un aumento de la temperatura), el promotor phoA (inducible por inanición con fosfato), el PprpB (inducción con propionato) u otros promotores adecuados para la expresión de proteínas recombinantes, todos los cuales utilizan polimerasa de ARN de E. coli.
Entre los promotores inducibles se encuentran aquellos que muestran un comportamiento de expresión "permeable". Dichos promotores (llamados "promotores permeables") son, en principio, inducibles, pero muestran no obstante también una expresión basal sin ser inducidos externamente. Los promotores inducibles que muestran una expresión permeable en condiciones no inducidas se pueden comportar de manera similar a los promotores constitutivos (es decir, son activos de manera constante y continua o se pueden activar o potenciar como resultado de ciertas condiciones de cultivo). Los promotores permeables pueden ser particularmente útiles para procesos de cultivo operados continuamente. Ejemplos de promotores permeables son el promotor T7 y el promotor trp.
En una realización de la invención, el promotor también puede ser constitutivo, es decir, un promotor que controla la expresión sin la necesidad de inducción por un lado, o la posibilidad de represión por otro lado. Por lo tanto, hay una expresión continua y constante en un cierto nivel. Como ejemplo, el promotor de HCD constitutivo fuerte (Poo et al., Biotechnology Letters, 2002, 24:1185-1189; Jeong et al., Protein expression and purification, 2004, 36:150-156) puede aplicarse para la expresión constitutiva.
En una realización, el sistema de expresión comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que induce la expresión de la biomolécula de interés. De forma ventajosa, la expresión de la biomolécula de interés se induce en condiciones particulares, tales como, por ejemplo, bajo selección.
Ejemplos de dichas secuencias de ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, el gen que codifica la polimerasa de ARN T7, gen T71. En este caso, la expresión de la polimerasa de ARN T7 induce la expresión de la biomolécula de interés colocada bajo el control de un promotor T7.
Preferiblemente, el sistema de expresión es el sistema de expresión T7. El sistema de expresión T7 se describió en el documento US4,952,496, que se incorpora aquí como referencia. El sistema de expresión T7 comprende un fragmento de ADN del fago T7, que contiene la secuencia de codificación completa para la polimerasa de ARN T7 (es decir, el gen 1 de T7). Se eliminó cualquier promotor activo natural del gen 1 de T7 y se insertó un promotor lacUV5 inducible antes de la secuencia de codificación. El promotor lacUV5 se induce mediante la adición de IPTG al medio de cultivo.
De acuerdo con otra realización, el sistema de expresión comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la biomolécula de interés.
Con respecto a la biomolécula de interés, no existen limitaciones. Puede ser, en principio, cualquier secuencia de aminoácidos, secuencias de ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, ADN o ARN. Ejemplos de secuencias de aminoácidos incluyen polipéptidos, proteínas o péptidos que se producen en una escala de fabricación, por ejemplo una biomolécula industrial o una biomolécula terapéutica.
Ejemplos de biomoléculas que se pueden producir por el método de la invención son, sin limitación, enzimas, proteínas reguladoras, receptores, péptidos, por ejemplo hormonas peptídicas, citoquinas, proteínas de membrana o transporte.
Las biomoléculas de interés también pueden ser antígenos utilizados para la vacunación, vacunas, proteínas de unión a antígenos, proteínas inmunoestimulantes, alérgenos, anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos o derivados. Los derivados de anticuerpos se pueden seleccionar del grupo de anticuerpos de cadena sencilla (scFv), fragmentos Fab, fragmentos Fv, anticuerpos de dominio único (VH o fragmento VL), anticuerpos de dominio como anticuerpos de dominio único de camélidos (VHH, nanocuerpos) u otros formatos de anticuerpos como se describe por ejemplo en Andersen and Reilly (Current Opinion in Biotechnology, 2004, 15: 456-462) o Holliger and Hudson (Nature Biotechnology, 2005 (23) 9: 1126-1136).
Las biomoléculas de interés en la presente invención también se pueden ejemplificar por proteínas (antígeno vírico), por ejemplo, proteína de cubierta, proteína del núcleo, proteasa, transcriptasa inversa, integrasa, y así sucesivamente, codificadas en el genoma de un virus patógeno, por ejemplo, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, I-HV, influenza, y así sucesivamente; factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de células madre (SCF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento transformante (TGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento similar a insulina (IGF), y así sucesivamente; citoquinas tales como factor de necrosis tumoral, interferón, interleucina, y así sucesivamente; factores hematopoyéticos tales como eritropoyetina, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos, factor estimulante de colonias de macrófagos, trombopoyetina, y así sucesivamente; hormonas peptídicas tales como la hormona de liberación de hormona luteinizante (LB-RH), hormona liberadora de tirotropina (TRH), insulina, somatostatina, hormona del crecimiento, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), hormona estimulante de melanocitos (MSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH), hormona luteinizante (LU), hormona estimulante de folículo (FSH), vasopresina, oxitoxina, calcitonina, hormona paratiroidea (PTH), glucagón, gastrina, secretina, pancreozimina, colecistoquinina, angiotensina, placenta lacto8en humana, gonototropina coriónica humana (HCG), ceruleina, motilina, y así sucesivamente; péptidos analgésicos tales como encefalina, endorfina, dinorfina, kiotorfina, y así sucesivamente; enzimas tales como superóxido dismutasa (SOD), uroquinasa, activador del plasminógeno de tejido (TPA), asparaginasa, calicreína, y así sucesivamente; neurotransmisores peptídicos tales como bombesina, neutrotensina, bradiquinina, sustancia P, péptido amiloide de Alzheimer (AD), SOD1, presenilina 1 y 2, renina, Dsunucleina, amiloide A, amiloide P, activina, anti-HER-2, bombesina, encefininasa, inhibidores de proteína, enzimas terapéuticas, antitripsina D 1-, inhibidor de tripsina de mamíferos, inhibidor de tripsina pancreática de mamíferos, calcitonina, factor de hipertrofia cardíaca, cardiotrofinas (tales como cardiotrofina-1), proteínas CD (tales como CD-3, CD-4, CD-8) y CD-19), CFTR, CTNF, DNasa, gonadotropina coriónica humana, péptido asociado a gonadotropina de ratón, citoquinas, transtirretina, amilina, lipoproteínas, linfoquinas, lisozima, una hormona del crecimiento (que incluyen hormona del crecimiento humano), hormona de crecimiento bovino, factor de liberación de hormona del crecimiento, hormona paratiroidea, hormona estimulante de la tiroides, factores de crecimiento, factor de crecimiento neurotrófico derivado del cerebro, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (tales como D FGF y D FGF), factor de crecimiento similar a insulina I y II, des (1-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro), proteínas de unión al factor de crecimiento similar a insulina, factor de crecimiento nervioso (tal como NGF-D), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptores para hormonas de crecimiento o factores de crecimiento, factor de crecimiento transformante (TGF) (como TGF-D, TGF-D 1, TGF-D2, TGF-D3, TGF-D4 o TGF-D5), factores neurotróficos (tales como neurotrofina-3, -4, -5, o -6), gelsolina, glucagón, calicreínas, sustancia inhibidora de mulleriana, factores neurotróficos, p53, proteína A o D, prorelaxina, cadena A de relaxina, cadena B de relaxina, factores reumatoides, rodopsina, una albúmina sérica (tal como albúmina de suero humano), inhibina, insulina, cadenas de insulina, cadena A de insulina, cadena D de insulina, receptor de insulina, proinsulina, hormona luteinizante, integrina, interleucinas (IL) (tales como IL-1 a IL-10, IL-12), IL-13), eritropoyetina, trombopoyetina, fibrilina, hormona estimulante del folículo, factores de coagulación (tales como factor VIIIC, factor IX, factor de tejido y factor de von Willebrands), factores anticoagulantes (tales como proteína C, factor natriurético auricular, surfactante pulmonar), un activador del plasminógeno (tales como el activador del plasminógeno de tejido humano o uroquinasa), trombina, factor de necrosis tumoral D o D, deshidrogenasa de cetoácido D, adrenesinas, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), colágeno, factores estimulantes de colonias (CSF) (tales como M-CSF, GM-CSF y G-CSF), factor de aceleración de desintegración, receptores de asentamiento, interferones (tales como interferón-alfa, -gamma y -beta), queratina, factores osteoinductivos, PRNP, proteínas reguladoras, superóxido dismutasa, proteínas de membrana de superficie, proteínas de transporte, receptores de células T, antígenos tales como inmunotoxinas gpl20(HIb), péptido natriurético auricular, proteína exocrina de vesícula seminal, D 2-microglobulina, PrP, precalcitonina, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 6, ataxina 7, huntingtina, receptor de andrógenos, proteína de unión a CREB, gpl 20, p300, CREB, API, ras, NFAT, jun, fos, proteína asociada a atrofia palidolusiana dentaorubral, una proteína microbiana (por ejemplo, proteína de unión a maltosa, transportador ABC, glutatión S transferasa, tiorredoxina, D-lactamasa), proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja, una enzima tal como el superóxido dismutasa, asparaginasa, arginasa, arginina desaminasa, adenosina desaminasa, ribonucleasa, catalasa, uricasa, bilirrubina oxidasa, tripsina, papaína, fosfatasa alcalina, beta-glucoronidasa, nucleósido de purina fosforilasa o batroxobina, un opioide, por ejemplo endorfinas, encefalinas u opioides no naturales, una hormona o neuropéptido, por ejemplo calcitonina, glucagón, gastrinas, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), colecistoquininas, hormona lutenizante, hormona de liberación de gonadotropina, gonadotropina coriónica, factor de liberación de corticotropina, vasopresina, oxitocina, hormonas antidiuréticas, hormona estimulante de la tiroides, hormona de liberación de tirotropina, relaxina, prolactina, péptido YY, neuropéptido Y, polipéptido pancreático, leptina, CART (transcripción regulada de cocaína y anfetamina), un péptido relacionado con CART, perilipina, melano-cortinas (hormonas estimulantes de melanocitos) tales como MC-4, hormonas concentradas de melanina, péptidos natriuréticos, adrenomedulina, endotelina, secretina, amilina, péptido intestinal vasoactivo (VIP), polipéptido activador de adenilato ciclasa de pituaria (PACAP), bombesina, péptidos similares a la bombesina, timosina, proteína de unión a heparina, CD4 soluble, factor de liberación hipotalámico y análogos de melanotoninas o funcionales de los mismos. En otra realización de la invención, la proteína objetivo puede ser una enzima de procesamiento tal como proteasas (por ejemplo, enterocinasa, caspasas de tripsina como serina proteasas), lipasa, fosfatasa, glicosil hidrolasas (por ejemplo, manosidasas, xilosidasas, fucosidasas), quinasa, mono o dioxidasa, peroxidasa, transglutaminasa, carboxipeptidasa, amidasa, esterasa y fosfatasa.
Las fuentes preferidas para dichos polipéptidos de mamíferos incluyen fuentes humanas, bovinas, equinas, porcinas, de lupinos y roedores, siendo particularmente preferidas las proteínas humanas.
La biomolécula de interés de la presente invención también abarca variantes de la proteína mencionada anteriormente. Estas variantes abarcan, por ejemplo, una proteína que tiene la misma actividad que la proteína mencionada anteriormente y que comprende una secuencia de aminoácidos con, en la secuencia de aminoácidos de la proteína mencionada, uno o más aminoácidos suprimidos, sustituidos, insertados y/o agregados. Dicha proteína puede ser ejemplificada por una proteína que tiene la misma actividad que la proteína mencionada anteriormente y que comprende una secuencia de aminoácidos con, en la secuencia de aminoácidos de la proteína mencionada anteriormente, uno o más aminoácidos suprimidos, sustituidos, insertados y/o agregados. Se pueden llevar a cabo dos o más tipos diferentes de modificaciones seleccionadas de supresión, sustitución, inserción y adición.
La biomolécula de interés de la presente invención también abarca "péptidos parciales" de la proteína mencionada anteriormente. Un péptido parcial de la proteína se puede ejemplificar mediante un péptido parcial que comprende una secuencia de aminoácidos en la que una porción de la secuencia de aminoácidos de la proteína mencionada se ejecuta ininterrumpidamente, en la que el péptido parcial tiene preferiblemente la misma actividad que dicha proteína. Dicho péptido parcial se puede ejemplificar mediante un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 20 y preferiblemente por lo menos 50 de los residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína mencionada anteriormente. Este polipéptido contiene preferiblemente la secuencia de aminoácidos que corresponde a la región que está involucrada con la actividad de la proteína mencionada anteriormente. Adicionalmente, el péptido parcial utilizado en la presente invención también puede ser un péptido parcial dado por una modificación de este polipéptido en el que 1 o una pluralidad de residuos de aminoácidos (por ejemplo, aproximadamente 1 a 20, más preferiblemente aproximadamente 1 a 10 , e incluso más preferiblemente, aproximadamente 1 a 5) se suprime de, se sustituye en, se inserta en, y/o se agrega a su secuencia de aminoácidos. El péptido parcial utilizado en la presente invención también se puede utilizar como un antígeno para la producción de anticuerpos.
En una realización de la invención, la biomolécula de interés se selecciona del grupo que comprende hormona de crecimiento humana, insulina humana, hormona estimulante del folículo, factor VIII, eritropoyetina, factor estimulante de colonias de granulocitos, alfa-glactosidasa A, alfa-L-iduronidasa, N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa, Dornase alfa, activador del plasminógeno de tejido, glucocerebrosidasa, interferón, factor de crecimiento similar a insulina 1 , somatotropina bovina, somatotropina porcina, quimiosina bovina y proteína de envoltura del virus de la hepatitis B. La biomolécula de interés también abarca polipéptidos modificados o proteínas que se han sometido a modificaciones postraduccionales y posteriores a la exportación en el periplasma, tal como ciclación, glicosilación, fosforilación, metilación, oxidación, deshidratación y división proteolítica.
En una realización, la biomolécula de interés es una enzima para metabolizar una biomolécula en el medio extracelular (denominada en este documento "biomolécula extracelular"). En una realización, la biomolécula extracelular comprende un polisacárido o un lípido. En una realización de la invención, el polisacárido comprende alginato, pectina, celulosa, celobiosa, laminarina o una mezcla de los mismos. En una realización de la invención, el lípido comprende un ácido graso, un glicolípido, un lípido betaína, un glicerolípido, un fosfolípido, un glicerolfosfolípido, un esfingolípido, un lípido de esterol, un lípido de prenol, un sacarolípido, un policetido o una mezcla de los mismos. En una realización de la invención, la biomolécula de interés es una enzima que convierte el polisacárido en un monosacárido, un oligosacárido, o ambos.
En una realización de la invención, la biomolécula de interés es una enzima que convierte el lípido en un ácido graso, un monosacárido, o ambos. En una realización de la invención, el monosacárido u oligosacárido es oligoalginato, manuronato, guluronato, manitol, a-ceto-ácido, 4-desoxi-L-eritro-hexoselulosa uronato (DEHU), 2-ceto-3-desoxi D-gluconato (KDG), glucosa, glucuronato, galacturonato, galactosa, xilosa, arabinosa o manosa. En una realización de la invención, el ácido graso es 14:0, trans-14, 16:0, 16:ln-7, trans-16, 16:2n-6, 18:0, 18:ln-9, 18:2n-6, 18:3n-6, 18:3n-3, 18:4n-3, 20:0, 20:2n-6, 20:3n-6, 20:4n-3,20:4n-6, o 20:5n-3.
En una realización de la invención, la biomolécula de interés es una enzima que convierte la biomolécula extracelular en un producto químico básico. En una realización de la invención, el producto químico básico es etanol, butanol o biodiesel. En una realización de la invención, el biodiesel es un ácido graso, un éster de ácido graso o un terpenoide.
Como se utiliza en el presente documento, el término "inactivado" se refiere a la interrupción o la supresión de la expresión de un gen a niveles transcripcionales o de traducción. Preferiblemente, el término "inactivado" se refiere a un gen cuya transcripción se suprime.
De acuerdo con la invención, la inactivación de un gen puede deberse a la mutación del gen o a la inserción del sistema de expresión dentro de la secuencia de codificación del gen. En el significado de la presente invención, el término "mutación" se refiere a un cambio estable en la secuencia genética. Ejemplos de mutación que podrían conducir a la inactivación de un gen en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, mutaciones puntuales, inserciones, supresiones y amplificación o duplicación de genes.
Preferiblemente, la mutación es una supresión. El término "supresión" como se utiliza en este documento significa la pérdida o ausencia de un gen, preferiblemente la pérdida o ausencia total de un gen. Más preferiblemente, la supresión comienza en o antes del codón de inicio del gen suprimido, y termina en o después del codón de parada del gen suprimido.
En una realización de la invención, e se inactiva l gen S. El gen S codifica una proteína holina (S105) y una proteína anti-holina (S107). La proteína holina desencadena la formación de agujeros en la membrana. Se requiere la holina para liberación de la endolisina codificada por el gen R. En el lado opuesto, la proteína antiholina inhibe la formación de huecos S105. De acuerdo con una realización, el gen S tiene la secuencia SEQ ID NO: 1. En otra realización, la secuencia del gen S presenta una identidad de secuencia de por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, 5 por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, e incluso más preferiblemente de por lo menos 99% con la SEQ ID NO: 1.
El gen S puede contener modificaciones de secuencia conservadoras que se refieren a modificaciones de aminoácidos que no afectan ni alteran significativamente la función de la proteína S. Dichas modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y supresiones de aminoácidos. Se pueden introducir modificaciones en la secuencia del gen S mediante técnicas estándar conocidas en el arte, tales como la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos son normalmente aquellas en las que un residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con propiedades fisicoquímicas similares. La secuencia modificada de la proteína S puede comprender una, dos, tres, cuatro o más inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos. Cuando se hacen las sustituciones, las sustituciones preferidas serán modificaciones conservadoras. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de la proteína S se pueden reemplazar con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales y la proteína S modificada se puede probar para la función retenida (es decir, las propiedades establecidas aquí) mediante comparación con la proteína S codificada por la secuencia SEQ ID NO: 1.
El término "identidad" o "idéntico", cuando se utiliza en una relación entre las secuencias de dos o más polipéptidos, se refiere al grado de relación de secuencia entre los polipéptidos, según lo determinado por el número de coincidencias entre cadenas de dos o más residuos de aminoácidos. La "identidad" mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la menor de dos o más secuencias con alineaciones de espacios (si las hay) abordadas por un modelo matemático o programa de computadora en particular (es decir, "algoritmos"). La identidad de los polipéptidos relacionados se puede calcular fácilmente mediante métodos conocidos. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics 5 and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Análisis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48,1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en programas de ordenador disponibles públicamente. Los métodos de programas de ordenador preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. \2, 387 (1984); Genetics Computer Group, University de Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). El programa BLASTX está disponible públicamente en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y otras fuentes (Manual BLAST, Altschul y otros. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). El conocido algoritmo Smith Waterman también se puede utilizar para determinar la identidad.
En otra realización, se inactiva el gen R. La proteína R es una endolisina: esta transglicosilasa degrada la mureina de la pared celular de la célula anfitriona. De acuerdo con una realización, el gen R tiene la secuencia SEQ ID NO: 2. En otra realización, la secuencia del gen R presenta una identidad de secuencia de por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, 5 por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, e incluso más preferiblemente de por lo menos 99% con la SEQ ID NO: 2.
El gen R puede contener modificaciones de secuencia conservadoras como se describió aquí anteriormente que se refieren a modificaciones de aminoácidos que no afectan ni alteran significativamente la función de la proteína R. La secuencia modificada de la proteína R puede comprender una, dos, tres, cuatro o más inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos. Por lo tanto, uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de la proteína R se pueden reemplazar con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales y la proteína R modificada se puede probar para la función retenida (es decir, las propiedades establecidas aquí) mediante comparación con la proteína R codificada por la secuencia SEQ ID NO: 2.
En otra realización, se inactiva el gen Rz. La proteína Rz pertenece a la familia de espanina. Esta proteína puede estar involucrada en la ruptura de la membrana externa de la célula anfitriona durante la fase lítica. De acuerdo con una realización, el gen Rz tiene la secuencia SEQ ID NO: 3. En otra realización, la secuencia del gen Rz presenta una identidad de secuencia de por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, 5 por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, e incluso más preferiblemente de por lo menos 99% con la SEQ ID NO: 3.
El gen Rz puede contener modificaciones de secuencias conservadoras como se describió en este documento anteriormente que se refieren a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente la función de la proteína Rz. La secuencia modificada de la proteína Rz puede comprender una, dos, tres, cuatro o más inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos. De esta manera, uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de la proteína Rz se puede reemplazar con otros residuos de aminoácidos desde la misma familia cadena lateral y la proteína Rz modificada se puede probar para función retenida (es decir, las propiedades establecidas en este documento) mediante comparación con la proteína Rz codificada mediante la secuencia SEQ ID NO: 3.
En otra realización, el gen Q se inactiva. La proteína Q es un regulador de gen tardío: la proteína Q es un antiterminador de Síntesis de ARN desde el promotor utilizado para transcripción de la región “tardía” completa de ADN de lambda. De acuerdo con una realización, el gen Q tiene la secuencia SEQ ID NO: 35. En otra realización, la secuencia del gen Q presenta una identidad de secuencia de por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, 5 por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, e incluso más preferiblemente de por lo menos 99% con la SEQ ID NO: 35.
El gen Q puede contener modificaciones de secuencias conservadoras como se describió en este documento anteriormente que se refieren a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente la función de la proteína Q. La secuencia modificada de la proteína Q puede comprender una, dos, tres, cuatro o más inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos. De esta manera, uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de la proteína Q se puede reemplazar con otros residuos de aminoácidos desde la misma familia cadena lateral y la proteína Q modificada se puede probar para función retenida (es decir, las propiedades establecidas en este documento) mediante comparación con la proteína Q codificada por la secuencia SEQ ID NO: 35.
En otra realización, se suprime un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia de codificación del gen S. De acuerdo con la invención, dicho fragmento de ácido nucleico no comprende las secuencias de codificación del gen ral (SEQ ID NO: 4) y/o del gen N (SEQ ID NO: 5). Por lo tanto, de acuerdo con una realización, cuando no se suprime el fago es lambda, la región entre residuos 33930 y 35582.
De acuerdo con otra realización, cuando no se suprime el fago es lambda(DE3), la región entre residuos 10813 y 11391.
Preferiblemente, dicho fragmento de ácido nucleico no comprende la secuencia de codificación de N y C2 (SEQ ID NO: 6), así como también las secuencias reguladoras del promotor de C2. Para asegurarse de que las secuencias reguladoras de C2 no se suprimen, el fragmento que se va a suprimir puede estar en el codón de inicio ATG del siguiente gen: el gen Cro.
Más preferiblemente, dicho fragmento de ácido nucleico no comprende la secuencia de codificación de ral, N y C2 (SEQ ID NO: 6), así como también las secuencias reguladoras del promotor de C2.
El gen C2 codifica una proteína represora, lo cual es importante para mantener el estado lisogénico. Este gen también se llama cI en la secuencia de varios otros fagos lambdoides. En el fago lambda, la secuencia de codificación de los genes ral, N y cI es desde los residuos 33930 a 38040 o desde los residuos 33930 a 38022. En el fago Lambda DE3, la secuencia de codificación de los genes ral, N, C2 es desde los residuos 10813 a 12436.
En una realización, la longitud de dicho fragmento de ácido nucleico suprimido es desde 30 kb hasta 300 b, preferiblemente desde 5 kb hasta 500 b. En otra realización, la longitud de dicho fragmento de ácido nucleico suprimido es 30 kb, 25 kb, 20 kb, 15 kb, 10 kb, 9 kb, 8 kb, 7 kb, 6 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2kb, 1 kb, 750 b, 500b.
De acuerdo con una realización en la que el fago es lambda, el fragmento de ácido nucleico suprimido inicia en una posición que varía desde la posición 35582 hasta la posición 45186, preferiblemente desde 38041 hasta 45186 o desde 38023 hasta 45186 y finaliza en una posición que varía desde la posición 45510 hasta la posición 48502
De acuerdo con otra realización en la que el fago es lambda DE3, el fragmento de ácido nucleico suprimido inicia en una posición que varía desde la posición 11392 hasta la posición 16764, preferiblemente desde 12437 hasta la posición 16764 y finaliza en una posición que varía desde 17088 y 42925.
En otra realización, el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir comprende por lo menos la secuencia de codificación del gen S y Rs. De acuerdo con una realización, cuando el fago es lambda, el fragmento de ácido nucleico inicia en una posición que varía desde la posición 35582 hasta la posición 45186, preferiblemente desde 38041 hasta 45186 o desde 38023 hasta 45186, y finaliza en una posición que varía desde la posición 45970 hasta la posición 48502. En otra realización, cuando el fago es lambda DE3, el fragmento de ácido nucleico inicia en una posición que varía desde la posición 11392 hasta la posición 16764, preferiblemente desde 12437 hasta la posición 16764, y finaliza en una posición que varía desde 17548 y 42925.
En otra realización, el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir comprende por lo menos la secuencia de codificación de los genes S, R y Rz. De acuerdo con una realización, cuando el fago es lambda, el fragmento de ácido nucleico inicia en una posición que varía desde la posición 35582 hasta la posición 45186, preferiblemente desde 38041 hasta 45186 o desde 38023 hasta 45186. De acuerdo con esta realización, el fragmento puede finalizar en una posición que varía desde la posición 46428 hasta la posición 46458. Incluso de acuerdo con esta realización, el fragmento de ácido nucleico puede finalizar en una posición que varía desde 46428 hasta 48502.
De acuerdo con otra realización, cuando el fago es lambda DE3, el fragmento de ácido nucleico inicia en una posición que varía desde la posición 11392 hasta la posición 16764, preferiblemente desde 12437 hasta la posición 16764. De acuerdo con esta realización, el fragmento puede finalizar en una posición que varía desde la posición 18006 y 18036. Incluso de acuerdo con esta realización, el fragmento de ácido nucleico puede finalizar en una posición que varía desde la posición 18006 hasta 24496. Incluso de acuerdo con esta realización, el fragmento de ácido nucleico puede finalizar en una posición que varía desde la posición 18006 hasta 42925.
De acuerdo con otra realización, el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir comprende por lo menos la secuencia de codificación del gen R.
De acuerdo con una realización, cuando el fago es lambda, el fragmento de ácido nucleico inicia en una posición que varía desde la posición 35582 hasta la posición 45493, preferiblemente que varía desde la posición 38041 o 38022 hasta la posición 45493. De acuerdo con esta realización, el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir puede finalizar en una posición que varía desde 45970 hasta la posición 48502.
De acuerdo con otra realización, cuando el fago es lambda DE3, el fragmento de ácido nucleico inicia en una posición que varía desde la posición 11392 hasta la posición 17071, preferiblemente que varía desde la posición 12437 hasta la posición 17071. De acuerdo con esta realización, el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir puede finalizar en una posición que varía desde 17548 hasta la posición 24496. Incluso de acuerdo con esta realización, el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir puede finalizar en una posición que varía desde 17548 hasta la posición 42925.
De acuerdo con otra realización, el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir comprende por lo menos la secuencia de codificación de los genes R y Rz.
De acuerdo con una realización, cuando el fago es lambda, el fragmento de ácido nucleico inicia en una posición que varía desde la posición 35582 hasta la posición 45493, preferiblemente que varía desde la posición 38041 o 38022 hasta la posición 45493. De acuerdo con esta realización, el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir puede finalizar en una posición que varía desde 46428 hasta la posición 46458. Incluso de acuerdo con esta realización, el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir puede finalizar en una posición que varía desde 46428 hasta la posición 48502.
De acuerdo con otra realización, cuando el fago es lambda DE3, el fragmento de ácido nucleico inicia en una posición que varía desde la posición 11392 hasta la posición 17071, preferiblemente que varía desde la posición 12437 hasta la posición 17071. De acuerdo con esta realización, el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir puede finalizar en una posición que varía desde 18006 hasta la posición 18330. Incluso de acuerdo con esta realización, el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir puede finalizar en una posición que varía desde 18006 hasta la posición 24496. Incluso de acuerdo con esta realización, el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir puede finalizar en una posición que varía desde 18006 hasta la posición 42925.
De acuerdo con otra realización, el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir comprende por lo menos la secuencia de codificación del gen Q.
De acuerdo con una realización en la que el fago es lambda, el fragmento de ácido nucleico suprimido inicia en una posición que varía desde la posición 35582 hasta la posición 43886, preferiblemente desde 38041 hasta 43886 o desde 38023 hasta 43886 y finaliza en una posición que varía desde la posición 44510 hasta la posición 48502.
De acuerdo con otra realización en la que el fago es lambda DE3, el fragmento de ácido nucleico suprimido inicia en una posición que varía desde la posición 11392 hasta la posición 15464, preferiblemente desde 12437 hasta la posición 15464 y finaliza en una posición que varía desde 16088 y 42925.
De acuerdo con otra realización, el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir comprende por lo menos la secuencia de codificación de los genes Q y S.
De acuerdo con una realización en la que el fago es lambda, el fragmento de ácido nucleico suprimido inicia en una posición que varía desde la posición 35582 hasta la posición 43886, preferiblemente desde 38041 hasta 43886 o desde 38023 hasta 43886 y finaliza en una posición que varía desde la posición 45510 hasta la posición 48502.
De acuerdo con otra realización en la que el fago es lambda DE3, el fragmento de ácido nucleico suprimido inicia en una posición que varía desde la posición 11392 hasta la posición 15464, preferiblemente desde 12437 hasta la posición 15464 y finaliza en una posición que varía desde 17088 y 42925.
De acuerdo con otra realización, el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir comprende por lo menos la secuencia de codificación del gen Q, S y Rs.
De acuerdo con una realización en la que el fago es lambda, el fragmento de ácido nucleico suprimido inicia en una posición que varía desde la posición 35582 hasta la posición 43886, preferiblemente desde 38041 hasta 43886 o desde 38023 hasta 43886 y finaliza en una posición que varía desde la posición 45970 hasta la posición 48502.
De acuerdo con otra realización en la que el fago es lambda DE3, el fragmento de ácido nucleico suprimido inicia en una posición que varía desde la posición 11392 hasta la posición 15464, preferiblemente desde 12437 hasta la posición 15464 y finaliza en una posición que varía desde 17548 y 42925.
De acuerdo con otra realización, el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir comprende por lo menos la secuencia de codificación de los genes Q, S, R y Rz.
De acuerdo con una realización en la que el fago es lambda, el fragmento de ácido nucleico suprimido inicia en una posición que varía desde la posición 35582 hasta la posición 43886, preferiblemente desde 38041 hasta 43886 o desde 38023 hasta 43886 y finaliza en una posición que varía desde la posición 46428 hasta la posición 48502.
De acuerdo con otra realización en la que el fago es lambda DE3, el fragmento de ácido nucleico suprimido inicia en una posición que varía desde la posición 11392 hasta la posición 15464, preferiblemente desde 12437 hasta la posición 15464 y finaliza en una posición que varía desde 18006 y 42925.
En una realización, se inactiva el gen Int. La proteína Int maneja la inserción y la división del genoma de fago en el genoma del anfitrión. De acuerdo con una realización, el gen Int tiene la secuencia SEQ ID NO: 7. En otra realización, la secuencia del gen Int presenta una identidad de secuencia de por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, 5 por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, e incluso más preferiblemente de por lo menos 99% con la SEQ ID NO: 7.
El gen Int puede contener modificaciones de secuencias conservadoras como se describió en este documento anteriormente que se refieren a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente la función de la proteína Int. La secuencia modificada de la proteína Int puede comprender una, dos, tres, cuatro o más inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos. De esta manera, uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de la proteína Int se puede reemplazar con otros residuos de aminoácidos de la misma familia cadena lateral y la proteína Int modificada se puede probar para función retenida (es decir, las propiedades establecidas en este documento) mediante comparación con la proteína Int codificada por la secuencia SEQ ID NO: 7.
En una realización, se inactiva el gen Xis. La proteína Xis es una excisionasa, que está involucrada en el proceso de división del fago lambda ADN fuera del cromosoma anfitrión bacteriano. De acuerdo con una realización, el gen Xis tiene la secuencia SEQ ID NO: 8. En otra realización, la secuencia del gen Xis presenta una identidad de secuencia de por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, 5 por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, e incluso más preferiblemente de por lo menos 99% con la SEQ ID NO: 8.
El gen Xis puede contener modificaciones de secuencias conservadoras como se describió en este documento anteriormente que se refieren a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente la función de la proteína Xis. La secuencia modificada de la proteína Xis puede comprender una, dos, tres, cuatro o más inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos. De esta manera, uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de la proteína Xis se puede reemplazar con otros residuos de aminoácidos de la misma familia cadena lateral y la proteína Xis modificada se puede probar para función retenida (es decir, las propiedades establecidas en este documento) mediante comparación con la proteína Xis codificada por la secuencia SEQ ID NO: 8.
En una realización, se suprime un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia de codificación del gen Int. De acuerdo con una realización, el fago es lambda y el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir comprende los residuos desde la posición 27812 hasta 28882. De acuerdo con otra realización, el fago es lambda y el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir inicia en una posición que varía desde la posición 1 hasta la posición 27812; y finaliza en una posición que varía desde 28882 hasta 33929.
En una realización, se suprime un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia de codificación del gen Xis.
De acuerdo con una realización, el fago es lambda y el fragmento de ácido nucleico suprimido que se va a suprimir comprende los residuos desde la posición 28860 hasta 29078. De acuerdo con otra realización, el fago es lambda y el fragmento inicia en una posición que varía desde la posición 1 hasta la posición 28860, y finaliza en una posición que varía desde la posición 29078 hasta la posición 33929.
De acuerdo con otra realización, el fago es DE3 y el ácido nucleico suprimido comprende los residuos desde la posición 5586 hasta 5804. De acuerdo con otra realización, el fragmento que se va a suprimir inicia en una posición que varía desde la posición 1 hasta la posición 5586, y finaliza en una posición que varía desde la posición 5804 hasta la posición 10812.
En una realización, se suprime un fragmento de ácido nucleico que comprende las secuencias de codificación de los genes Xis e Int. De acuerdo con una realización, el fago es lambda y el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir comprende los residuos desde la posición 27812 hasta 29078. De acuerdo con otra realización, el fago es lambda y el fragmento de ácido nucleico que se va a suprimir inicia en una posición que varía desde la posición 1 hasta la posición 27812; y finaliza en una posición que varía desde 29078 hasta 33929.
En una realización de la invención, el fago genéticamente modificado de la invención se inactiva adicionalmente para el gen kil. De acuerdo con una realización, el gen kil tiene la secuencia SEQ ID NO: 36. En otra realización, el gen kil presenta una identidad de secuencia de por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, más preferiblemente de por lo menos 99% con la SEQ ID NO: 36. Preferiblemente, se suprime la secuencia de codificación del gen kil. De acuerdo con una realización, el fago es lambda y el fragmento de ácido nucleico suprimido comprende los residuos desde la posición 33187 hasta 33331.
De acuerdo con otra realización, el fago es DE3 y el ácido nucleico suprimido comprende los residuos desde la posición 9913 hasta 10057.
De acuerdo con una realización, la secuencia attP no se suprime de la secuencia del fago de la invención. La secuencia attP es la SEQ ID NO: 9. La secuencia attP se ubica desde la posición 27586 y 27817 en la secuencia del fago lambda, y desde la posición 42788 hasta 42925 y desde 1 hasta 94 en el genoma del fago Lambda DE3 (el genoma del fago es circular, de esta manera la secuencia attP es continua).
En una realización de la invención, el fago genéticamente modificado comprende la secuencia attP y la secuencia del gen C2. En otra realización, el fago genéticamente modificado consiste de la secuencia attP y la secuencia del gen C2.
De acuerdo con una realización preferida, un fago genéticamente modificado de la invención P11 tiene la secuencia SEQ ID NO: 10 y es (DE3) AS-C, Axis-ea10 (DE3 se refiere al fago lambda DE3 en el que el gen de polimerasa de ARN T7 se ha integrado dentro de la secuencia de gen Int). Dicho fago P11 modificado corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, R, Rz, Xis y Int.
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P12 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes Int y S (un ejemplo de P12 es la secuencia DE3 AS, Axis-ea10).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P13 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, R, Rz, Q, Xis y Int (un ejemplo de P13 es la secuencia DE3 AS-C, Axis-ea10, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P14 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes R y Int (un ejemplo de P14 es la secuencia DE3 AR).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P15 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes Q y Int (un ejemplo de P15 es la secuencia DE3 AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P16 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S y Xis (un ejemplo de P16 es la secuencia NC_001416 AS, Axis-ea10).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P17 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes R y Xis (un ejemplo de P17 es la secuencia NC_001416 AR, Axis-ea10 ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P18 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes Q y Xis (un ejemplo de P18 es la secuencia NC_001416 Axis-ea10, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención p19 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes R, Rz y Int (un ejemplo de P19 es la secuencia DE3 AR, ARz).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P20 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, Rz y Int (un ejemplo de P20 es la secuencia DE3 AS, ARz).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P21 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes Rz, Q y Int (un ejemplo de P21 es la secuencia DE3 ARz, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P22 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, Q y Int (un ejemplo de P22 es la secuencia DE3 AS, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P23 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes R, Q, y Int (un ejemplo de P23 es la secuencia DE3 AR, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P24 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, R y Int (un ejemplo de P24 es la secuencia DE3 AS, AR).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P25 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes R, Rz y Xis (un ejemplo de P25 es la secuencia NC_001416 AR, Axis-ea10, ARz).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P26 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, Rz y Xis (un ejemplo de P26 es la secuencia NC_001416 AS, Axis-ea10, ARz).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P27 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes Q, Rz y Xis (un ejemplo de P27 es la secuencia NC_0014l6 ARz, Axis-ea10, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P28 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, Q y Xis (un ejemplo de P28 es la secuencia NC_00l4l6 AS, Axis-ea10, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P29 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes R, Q y Xis (un ejemplo de P29 es la secuencia NC_00l4l6 AR, Axis-ea10, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P30 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes R, S y Xis (un ejemplo de P30 es la secuencia NC_00l4l6 AS, Axis-ea10, AR).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P31 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes R, Xis y Int (un ejemplo de P31 es la secuencia DE3 AR, Axis-ea10).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P32 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, Xis y Int (un ejemplo de P32 es la secuencia DE3 AS, Axis-ea10).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P33 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes Q, Xis y Int (un ejemplo de P33 es la secuencia DE3 Axis-ea10, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P34 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, R, Xis y Int (un ejemplo de P34 es la secuencia DE3 As , Axis-ea10, AR).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P35 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes R, Q, Xis y Int (un ejemplo de P35 es la secuencia DE3 AR, Axis-ea10, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P36 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, Q, Xis y Int (un ejemplo de P36 es la secuencia DE3 As , Axis-ea10 , AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P37 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes R, Rz, Xis y Int (un ejemplo de P37 es la secuencia d E3 AR, Axis-ea10, ARz).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P38 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, Rz, Xis y Int (un ejemplo de P38 es la secuencia DE3 AS, Axis-ea10, ARz).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P39 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes Rz, Q, Xis y Int (un ejemplo de P39 es la secuencia DE3 ARz, Axis-ea10, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P40 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, R, Q y Int (un ejemplo de P40 es la secuencia DE3 AS, AR, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P41 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, R, Rz y Int (un ejemplo de P41 es la secuencia DE3 AS-C).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P42 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes R, Rz, Q y Int (un ejemplo de P42 es la secuencia DE3 AR, ARz, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P43 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, Rz, Q y Int (un ejemplo de P43 es la secuencia DE3 AS, ARz, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P44 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, R, Q y Xis (un ejemplo de P44 es la secuencia NC_001416 AS, AR, Axis-ea10, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P45 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, R, Rz y Xis (un ejemplo de P45 es la secuencia NC_001416 AS-C, Axis-ea10).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P46 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes R, Rz, Q y Xis (un ejemplo de P46 es la secuencia NC_0oi4l6 a R, ARz, Axis-ea10, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P47 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, Rz, Q y Xis (un ejemplo de P47 es la secuencia NC_0014l6 AS, ARz, Axis-ea10, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P48 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, R, Q, Xis y Int (un ejemplo de P48 es la secuencia DE3 AS, AR, Axis-ea10, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P49 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, Rz, Q, Xis y Int (un ejemplo de P49 es la secuencia d E3 AS, ARz, Axis-ea10, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P50 corresponde a la secuencia NC_0014l6 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes R, Rz, Q, Xis y Int (un ejemplo de P50 es la secuencia DE3 AR, ARz, Axis-ea10, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P51 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, R, Q, Rz y Int (un ejemplo de P51 es la secuencia DE3 AS-C, Aq ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P52 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, R, Rz, Q y Xis (un ejemplo de P52 es la secuencia NC_001416 AS-C, Axis-ea10, AQ).
De acuerdo con otra realización, un fago genéticamente modificado de la invención P53 corresponde a la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes Q, Xis y Int (un ejemplo de P53 es la secuencia DE3 Axis-ea10, AQ).
La presente invención también se refiere a un proceso para producir el fago modificado de la invención, en la que dicho proceso comprende por lo menos dos etapas de supresión de genes.
En una realización, el proceso de la invención se lleva a cabo con un fago integrado en el genoma de una célula anfitriona.
En una realización, la célula anfitriona es un microorganismo, preferiblemente un procariota, más preferiblemente una bacteria, más preferiblemente una bacteria gram negativa. Ventajosamente, la célula anfitriona es una bacteria de la familia Enterobacteriacea de acuerdo con la taxonomía aplicable actual. Si la taxonomía cambiara, el experto en la técnica sabría cómo adaptar los cambios en la taxonomía para deducir las cepas que se podrían utilizar en la presente invención. Ejemplos de bacterias de la familia Enterobacteriacea incluyen, pero no se limitan a, bacterias pertenecientes a los géneros Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella y Yersinia. De acuerdo con una realización preferida, la célula anfitriona pertenece al género Escherichia, y más preferiblemente la célula anfitriona es Escherichia coli (E. coli).
Los métodos para eliminar genes de un fago integrado son bien conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, la recombinación homóloga (también llamada recombinación) utilizando los genes codificados Red lambda: exo, bet y gam. También es posible utilizar los genes recE y recT correspondientes del profago Rac. Los genes exo y recE codifican una exonucleasa 5'-3' que produce salientes de 3'. Los genes bet y recT codifican una proteína de emparejamiento o también llamada proteína de hibridación que se une a las salientes 3' y media su hibridación y recombinación homóloga entre dos secuencias de ADN complementarias. El gen gam codifica un inhibidor de la exonucleasa RecBCD de E. coli y, por lo tanto, protege los fragmentos de ADN lineales de interés. El método de recombinación fue bien descrito por varios investigadores, incluidos Datsenko and Wanner (PNAS 97-12, 6640-6645, 2000) y Stewart et al (Wo0l04288). El principio del método es generar (mediante amplificación por PCR, por ejemplo) un fragmento de ADN que contenga el fragmento a integrar y dos brazos de recombinación. Estos brazos son homólogos a las regiones adyacentes al gen que se va a inactivar. Se utilizarán para apuntar a la inserción del fragmento de interés. Es posible crear este tipo de fragmento de ADN mediante PCR utilizando cebadores que contienen brazos homólogos de 20 a 60 nucleótidos.
La presente invención también se refiere a una célula anfitriona que comprende el fago genéticamente modificado de la invención. En una realización preferida, la célula anfitriona de la invención comprende el fago genéticamente modificado integrado en su genoma.
En una realización, la célula anfitriona es un microorganismo, preferiblemente un procariota, más preferiblemente una bacteria, más preferiblemente una bacteria gram negativa. Ventajosamente, la célula anfitriona es una bacteria de la familia Enterobacteriacea de acuerdo con la taxonomía aplicable actual. Si la taxonomía cambiara, el experto en la materia sabría cómo adaptar los cambios en la taxonomía para deducir las cepas que se podrían utilizar en la presente invención. Ejemplos de bacterias de la familia Enterobacteriacea incluyen, pero no se limitan a, bacterias pertenecientes a los géneros Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella y Yersinia. De acuerdo con una realización preferida, la célula anfitriona pertenece al género Escherichia, y más preferiblemente la célula anfitriona es Escherichia coli (E. coli). Ejemplos de cepas de E. coli que se podrían utilizar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cepas derivadas de E. coli K-12, E. coli B o E. coli W, tales como, por ejemplo, MG1655, W3110, DG1, DG2, Top10, DH10B, DH5alpha, HMS174, BL21, BL21(DE3), HMS174(DE3), BL21(DE3) pLysS, BL21(DE3) pLysE.
En una realización, se pueden inactivar los genes de las células anfitrionas.
En una realización, se inactiva el gen tonA (también conocido como fhuA, SEQ ID NO: 11). La proteína TonA/FhuA es un receptor para los fagos T1, T5 y Phi80.
En una realización, se inactiva el gen galK (SEQ ID NO: 12). La supresión de teste gen permite el uso de la selección positiva/negativa de galK para la supresión de los genes mediante un método con base en la recombinación homóloga.
En una realización, se inactiva el gen araB (SEQ ID NO: 13). En otra realización, se inactiva el gen araA (SEQ ID NO: 14). La inactivación de araB y/o araA se recomienda para el uso del promotor PBAD (inducible por arabinosa) dentro de la célula anfitriona.
En una realización, se inactivan el gen lon (SEQ ID NO: 15) y/o el gen ompT (SEQ ID NO: 16). La proteína Lon es una proteasa dependiente de ATP. La proteína OmpT es una proteasa de membrana externa. Preferiblemente, se inactivan los genes lon y ompT.
En una realización, se inactiva el gen rcsA (SEQ ID NO: 17). La proteína RcsA es un regulador positivo de la síntesis de la cápsula, que se degrada por la proteasa Lon. En una realización, se inactivan el gen hsdR (SEQ ID NO: 18) y/o el gen mrr (SEQ ID NO: 19). Las proteínas HsdR y Mrr son enzimas de restricción con diferente especificidad. Preferiblemente, los genes hsdR y mrr ambos son inactivados.
En una realización, se inactivan el gen endA (SEQ ID NO: 20) y/o el gen recA (SEQ ID NO: 21). EndA es una endonucleasa específica a ADN. RecA es una proteína de recombinación con actividad de proteasa y nucleasa. Preferiblemente, se inactivan ambos genes endA y recA.
En una realización de la invención, por lo menos se inactivan uno de los genes tonA, galK, araB, araA, lon, ompT, rcsA, hsdR, mrr, endA y recA. Preferiblemente, se suprimen inactivados.
En una realización preferida, se inactivan los genes tonA, galK, araB, lon, ompT, rcsA, hsdR, mrr, endA y recA. Preferiblemente, se suprimen los genes tonA, galK, araB, lon, ompT, rcsA, hsdR, mrr, endA y recA.
En una realización de la invención, se transforma la célula anfitriona de la invención con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula tóxica, como se describe en US2004/0115811. La presencia de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la molécula tóxica permitirá la selección de clones recombinantes que tienen integrados un gen de interés y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de antídoto funcional a una molécula tóxica, en la que dichos clones recombinantes son los que sobreviven luego de su integración en una célula anfitriona que comprende en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica dicha molécula tóxica. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la proteína antídoto y la molécula tóxica son, respectivamente, una proteína antiveneno y una proteína venenosa. Dichas proteínas antivenenosas o venenosas podrían ser proteínas de tipo silvestre o proteínas modificadas que son natural o artificialmente venenosas y afectan una o más funciones vitales de una célula (preferiblemente, una célula procariota) y pueden conducir a la destrucción de la célula.
La proteína antídoto y la molécula tóxica se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en proteínas CcdA/CcdB, proteínas Kis/Kid, proteínas Phd/Doc, proteínas RelB/relE, proteínas PasB (o PasC)/PasA, proteínas mazF/mazE como se describe en el documento US2004/0115811, o cualquier otro par de moléculas antivenenosas/venenosas que sean o no de origen plásmido. La molécula tóxica también puede ser una proteína de toxina que es natural o artificialmente tóxica y afecta a una o más funciones vitales de una célula (procariota). La proteína codificada por el gen sacB (de Bacillus amylolique-faciens), la proteína GpE, la proteína GATA-1 y la proteína Crp son otros ejemplos de dichas moléculas tóxicas. El gen sacB codifica la sacarasa de levano que cataliza la hidrólisis de la sacarosa en productos que son tóxicos para E. coli (Pierce et al. Proc. Natl Acad. Sci., Vol.
89, N[deg.]6 (1992) p. 2056-2060). La proteína GpE codifica los genes E del bacteriófago [phi] X174 que incluye seis sitios de restricción únicos y codifica gpE y que causa lisis de las células de E. Coli (Heinrich et al., Gene, Vol. 42 (3) (1986) p. 345- 349). Se ha descrito la proteína GATA-1 por Trudel et al. (Biotechniques 1996, vol. 20 (4), p. 684­ 693). La proteína Crp ha sido descrita por Schlieper et al. (Anal. Biochem. 1998, Vol. 257 (2), pág. 203-209).
Las proteínas antídotos contra dicha molécula tóxica son cualquier proteína capaz de reducir o suprimir el efecto de la molécula tóxica correspondiente sobre una célula (preferiblemente una célula procariota), cuando dicha célula tóxica es producida por dicha célula.
De acuerdo con una realización preferida, la célula anfitriona de la invención comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína CcdB. El gen ccdB tiene la secuencia SEQ ID NO: 22.
La presente invención también se refiere a un kit que comprende una célula anfitriona como se describió anteriormente, en la que se inserta el gen que codifica una proteína venenosa, y un plásmido que lleva la secuencia de ácidos nucleicos del gen que codifica la proteína antivenenosa. La expresión de la proteína antivenenosa en la célula anfitriona se requiere para mantener la viabilidad de la célula anfitriona. En una realización preferida, la proteína venenosa se codifica por el gen ccdB, y la proteína antivenenosa se codifica por el gen ccdA (SEQ ID NO: 23).
De acuerdo con una realización de la invención, el plásmido del kit adicionalmente puede contener, o se puede modificar para contener adicionalmente, la secuencia de ácidos nucleicos de la biomolécula de interés.
La presente invención también se refiere a un proceso para preparar una célula anfitriona como se describió anteriormente.
En una realización, el proceso de la invención comprende una etapa de infección de la célula anfitriona por un fago genéticamente modificado de acuerdo con la invención. En una realización de la invención, dicha etapa de infección incluye el uso de un fago ayudante. En el significado de la presente invención, el término "fago auxiliar" se refiere a un fago utilizado para complementar una eliminación o una inactivación de otro fago. El fago auxiliar proporcionará las funciones faltantes a otro fago para poder infectar bacterias o para preparar la reserva de fago. Usualmente, el fago auxiliar no puede formar un lisógeno por si mismo porque es cl menos (no tiene represor y, por lo tanto, es virulento).
El proceso para infectar una célula anfitriona con un fago que utiliza un fago auxiliar es bien conocido en la técnica. La primera etapa es la preparación de los lisados y la segunda es la lisogenización. Brevemente, los lisados bacterianos del fago auxiliar se preparan utilizando métodos estándar como se describe en "Molecular cloning: a laboratory manual", Sambrook et al (2001, ISBN 978-087969577-4) o en "Large- and Small-Scale Preparation of Bacteriophage lambda lysate and DNA", Su et al, BioTechniques 25:44-46 (Julio 1998). La preparación del fago de interés se realiza utilizando el mismo principio, después de la inducción del fago (la mayoría de las veces se utiliza radiación UV o cualquier situación en la que un lisógeno sufra daños en el ADN o la respuesta SOS del anfitrión o la producción de Cro) con el fin iniciar el ciclo lítico y utilizar un fago auxiliar para proporcionar las funciones que faltan. Una alternativa al fago auxiliar es el uso de un plásmido que codifica las funciones faltantes.
A continuación, los lisados de fagos se mezclan con las bacterias seleccionadas y se colocan sobre placas LB con el fin de obtener lisógenos (como se describe en el kit de lisogenización DE3 de lambda de Novagen, User Protocol TB031 o se describe un método alternativo en Studier and Moffat, Journal of Molecular Biology, 1986, 189: 113-130). Se puede utilizar un fago de selección para seleccionar específicamente bacterias que contienen el fago de interés. Este fago de selección es un fago virulento que tiene la misma inmunidad que el fago de interés. En consecuencia, el fago de selección no puede formar placas o matar bacterias lisógenas para el fago de interés porque este fago produce el represor cl (también llamado C2 en el fago lambda DE3).
La presente invención también se refiere, por lo tanto, a un kit que comprende el fago modificado de la invención, como se describió anteriormente, y un fago auxiliar. Ejemplos de fagos auxiliares incluyen, pero no se limitan a, el fago auxiliar B10 o cualquier otro fago lambdoide con una inmunidad diferente a la del fago de interés (ejemplo: fago con inmunidad 434, 80,...). Algunos fagos auxiliares y sus manipulaciones fueron bien descritos en la literatura, incluyendo en Haldimann and Wanner (Journal of Bacteriology, 183, 6384-6393, 2001).
En una realización, el proceso para preparar una célula anfitriona de la invención comprende adicionalmente una etapa de supresión, en la que se suprimen las secuencias de ácido nucleico de la célula anfitriona. Los métodos para suprimir la secuencia de un gen son bien conocidos por los expertos en la técnica. El método más eficiente es el método de recombinación homóloga mediado por los genes codificados en Red lambda o los genes recE y recT del profago Rac. Como se describió anteriormente, este método fue bien descrito por varios investigadores, incluidos Datsenko and Wanner (PNAS 97-12, 6640-6645, 2000) y Stewart et al (WO0104288). Los productos de PCR se generan utilizando cebadores con extensiones de 20 a 60 nt que son homólogas a las regiones adyacentes al gen que se va a inactivar. Dado que solo una pequeña cantidad de bacterias recombinará efectivamente el fragmento de interés, es necesario tener un marcador de selección fuerte para seleccionarlo. Se pueden utilizar marcadores de antibióticos para seleccionar los recombinantes: los cebadores modificados se utilizan para amplificar un gen de resistencia a antibióticos. Después de la transformación y activación de los genes de recombinación, las bacterias recombinantes se seleccionan en un medio que contiene el antibiótico apropiado. En este caso, el gen objetivo se reemplaza por un gen de resistencia a antibióticos. Con el fin utilizar la misma estrategia para la próxima supresión, es necesario eliminar este gen de resistencia a los antibióticos durante una segunda etapa. Como se describe en Datsenko and Wanner, es posible utilizar un gen de resistencia a antibióticos que se flanquea por sitios FRT (objetivo de reconocimiento de FLP). Los genes de resistencia se eliminan al utilizar un plásmido auxiliar que codifica la recombinasa FLP. El gen de resistencia a los antibióticos se elimina con esta recombinasa específica del sitio, pero este método deja rastros: un sitio de recombinación específico del sitio aún está presente después de la eliminación del gen de resistencia a los antibióticos.
Para evitar la presencia de este sitio, más preferiblemente, el método de la invención utiliza galK como un gen marcador. El principio de la selección de galK se describe en Warming et al. (Nucleic acid research, 2005, 33(4)). Este método utiliza galK como marcador de selección positiva (crecimiento sobre medio mínimo que contiene galactosa) durante la primera recombinación (inserción). La eliminación de este marcador se realiza durante una segunda etapa de recombinación homóloga. Durante esta etapa, galK se utiliza como marcador de selección negativa en medio mínimo que contiene 2-desoxi-galactosa (DOG). El producto del gen galK, la galactoquinasa, cataliza la primera etapa en la ruta de degradación de la galactosa. La galactoquinasa también cataliza eficientemente la fosforilación del análogo de galactosa DOG. El producto de esta reacción no se puede metabolizar adicionalmente, lo que lleva a la acumulación de una molécula tóxica (2-desoxi-galactosa-1-fosfato). La ventaja de este método es evitar la presencia de un sitio de recombinación específico después de la supresión del gen objetivo y la eliminación del marcador selectivo.
La presente invención también se refiere a un proceso para producir una biomolécula de interés, que comprende - cultivar una célula anfitriona que comprende el fago genéticamente modificado de acuerdo con la invención y la secuencia de ácidos nucleicos de la biomolécula de interés,
- recuperar la biomolécula de interés.
En una realización de la invención, la secuencia de ácidos nucleicos de la biomolécula de interés está comprendida dentro del sistema de expresión del fago genéticamente modificado. De acuerdo con esta realización, la producción de la biomolécula de interés es directa, es decir, resulta de la expresión del gen del sistema de expresión, por ejemplo mediante cultivo en un medio en el que se induce el promotor comprendido en el sistema de expresión. En otra realización de la invención, el sistema de expresión del fago genéticamente modificado comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la polimerasa de ARN T7 bajo el control de un promotor lac, preferiblemente el promotor lacUV5. De acuerdo con esta realización, el proceso para producir la biomolécula de interés comprende la transformación de la célula anfitriona con un plásmido que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la biomolécula de interés bajo el control de un promotor t 7. La expresión del promotor T7 está bajo el control de polimerasa de ARN T7, que es rigurosamente específica para el promotor T7, es decir, el promotor T7 solo puede ser utilizado por la polimerasa de ARN del bacteriófago T7. Cuando se agrega IPTG al medio de cultivo, la polimerasa de ARN de T7 se expresa por transcripción del promotor lac y permite la expresión de la biomolécula de interés.
En el significado de la presente invención, el término "promotor T7" incluye promotores que están presentes en el genoma del bacteriófago T7, así como secuencias de consenso y variantes de dichos promotores con la capacidad de mediar la transcripción por la polimerasa de ARN T7. El bacteriófago T7 contiene diecisiete secuencias promotoras diferentes, todas las cuales comprenden una secuencia de nucleótidos altamente conservada.
De acuerdo con una realización preferida, el plásmido que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la biomolécula de interés también comprende la secuencia de ácidos nucleicos de ccdA, y la célula anfitriona comprende la secuencia de ccdB integrada en su genoma. Por lo tanto, solo se propagan clones recombinantes que contienen el plásmido.
De acuerdo con una realización, se secreta la biomolécula de interés por la célula anfitriona en el caldo de fermentación. De acuerdo con esta realización, la biomolécula de interés se puede recuperar fácilmente del caldo de fermentación.
De acuerdo con otra realización, la biomolécula de interés no es secretada por la célula anfitriona en el caldo de fermentación. Los métodos para recuperar una biomolécula intracelular de interés son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de dicho método incluyen, pero no se limitan a, el uso de ácido tricloroacético (TCA) o tampón de craqueo que contiene dodecilsulfato de sodio (SDS) con el fin de recuperar proteínas citoplásmicas totales en condiciones de desnaturalización o el uso de sonicación, prensa francesa o equivalente para interrumpir bacterias bajo presión para recuperar proteínas citoplásmicas totales en condiciones nativas (no desnaturalizantes). A continuación, la proteína de interés se puede purificar utilizando métodos específicos que incluyen, pero no se limitan a, el uso de columnas de afinidad o de intercambio iónico.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Imagen de un gel SDS-Page coloreado con tinción con azul de Coomassie, que muestra la producción de la proteína de interés. 1 y 6: tamaño; 2: sedimento [pScherryl] M11DE3 antes de inducción; 3: sedimento [pScherryl] M11DE3 después de inducción; 4: sedimento [pScherryl] HMS174DE3 antes de inducción; 5: sedimento [pScherryl] HMS174DE3 después de inducción. La matriz es para identificar la proteína de interés.
Ejemplos
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1: Depresión de los genes xis, exo, bet, gam, kit, cIII, N y ral
a) Supresión de la región del ADN de xis y reemplazo por galK
Primero, el gen galK se amplificó mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) sobre el plásmido pGalK utilizando los cebadores de inicio (5' GGGGGTAAATCCCGGCGCTCATGACTTCGCCTTCTTCCCAGAATTCCTGTTGAC AATTA 3', SEQ ID NO: 24) y de parada XisgalK (5' GTTCTGATTATTGGAAATCTTCTTTGCCCTCCAGTGTGAGCAGCACTGTCCTGCTCCTTG 3', SEQ ID NO: 25). Estos cebadores contienen en el extremo 5' una secuencia de 40 bases idéntica al objetivo de ADN (en cursiva). Estas secuencias de 40 bases son los brazos de recombinación. Los extremos 3' se diseñaron para amplificar el gen galK y su promotor constitutivo. El fragmento de ADN amplificado por PCR (1315 pb) se dirigió a los genes xis, exo, bet, gam, kil y cIII (fragmento de ADN de 5133 pb): estos genes se reemplazaron durante la recombinación homóloga por el gen galK y su promotor. Las bacterias electrocompetentes que llevan el profago T7 (DE3) y el plásmido pKD46 se prepararon de acuerdo con Datsenko y Wanner (PNAS 97-12, 6640-6645, 2000). A continuación, el fragmento galK amplificado se electroporó en estas bacterias de acuerdo con los procedimientos estándar (se utilizaron 200 ng de fragmento de ADN para cada electroporación). Se agregó medio SOC y se incubaron bacterias durante 1 hora a 37°C. A continuación, las bacterias se lavaron (se centrifugaron, se retiraron los medios, se agregaron medios frescos y se volvieron a suspender) dos veces con medio mínimo M9 (Sambrook et al (2001, ISBN 978-087969577-4)) y se colocaron en placas bacterianas que contenían medio M9 mínimo y galactosa al 1%. Las placas se incubaron a 37°C durante 1 o 2 días.
La siguiente etapa fue el cribado bacteriano: el cribado por PCR se realizó directamente sobre colonias utilizando los cebadores Xis1 (5'GTCTTCAAGTGGAGCATCAG3', SEQ ID NO: 26) y Xis4 (5'ACCAGGACTATCCGTATGAC3', SEQ ID NO: 27). Una amplificación de un fragmento de ADN de 5774 pb corresponde a un cromosoma no modificado (colonia no recombinante) y, por el contrario, una amplificación de un fragmento de ADN de 1955 pb corresponde a un cromosoma recombinante. Las bacterias que permitían la amplificación del fragmento de ADN de 1955 pb se seleccionaron y se sembraron dos veces en placas selectivas (medio M9 mínimo suplementado con 1% de galactosa) para purificarlo y eliminar posibles copias no modificadas del cromosoma. El cribado por PCR se realizó una vez más al final de la etapa de purificación y se seleccionaron 3 bacterias que permiten la amplificación del fragmento de ADN de 1955 pb. Los fragmentos de ADN amplificados correspondientes a estas bacterias se secuenciaron utilizando los mismos cebadores con el fin de confirmar la recombinación del ADN y la supresión de la región del ADN Xis (genes xis, exo, bet, gam, kil y cIII).
b) Eliminación de GalK
Un fragmento de ADN que contiene grandes brazos de recombinación (de 350 pb y 343 pb) se construyó mediante PCR para eliminar los genes galK y N y ral. El primer brazo se amplificó por PCR sobre colonias bacterianas que contenían el profago T7 (DE3) utilizando los cebadores Xis1 y Xis2 (5'CCAAACGGAACAGATGAAGAAGGCGAAGTCATGAG3', SEQ ID NO: 28). Se amplificó un fragmento de ADN de 365 bases. El segundo brazo también se realizó por PCR sobre la misma bacteria utilizando los cebadores Xis3 (5' GACTTCGCCTTCTTCATCTGTTCCGTTTGGCTTCC3', SEQ ID NO: 29) y Xis6 (5'GTAATGGAAAGCTGGTAGTCG3', SEQ ID NO: 30). Se amplificó un ADN de fragmento de 358 bases. Ambos brazos de recombinación se purificaron después de la electroforesis en gel de agarosa. Los cebadores Xis2 y Xis3 fueron diseñados para generar fragmentos de ADN que contienen una secuencia idéntica de 30 pares de bases. Esta secuencia se utilizó para unir ambos brazos de recombinación en una tercera PCR utilizando los cebadores Xisl y Xis6. Se generó un fragmento de ADN de 693 pb. Este fragmento de ADN se electroporó en bacterias seleccionadas anteriormente y que llevan el plásmido pKD46 (preparado como se describe en Datsenko and Wanner). Se agregó medio s Oc y se incubaron bacterias a 37°C durante 1 hora. A continuación, las bacterias se lavaron dos veces con medio M9 y se colocaron en placas selectivas que contenían medio M9 suplementado con glicerol al 0.2% y DOG al 1%. Las placas se incubaron durante 2 días a 37°C. Se cribaron varias colonias por PCR utilizando los cebadores Xis5 (5 CAGCCGTAAGTCTTGATCTC3', SEQ ID NO: 31) y Xis7 (5'CAGCAGGCATGATCCAAGAG3', SEQ ID NO: 32). Siempre se obtuvo una amplificación de 3246 pb correspondiente al cromosoma de ADN no modificado en lugar de una amplificación de 1122 pb correspondiente al cromosoma modificado. El experimento se reprodujo completamente e independientemente tres veces sin éxito: no se obtuvo ninguna bacteria que comprenda la supresión deseada.
En consecuencia, decidimos eliminar solo el fragmento GalK y dejar los genes N y ral. El fragmento de ADN que contiene los brazos de recombinación se generó como se describió anteriormente utilizando Xis, 1 Xis2b (5' TTTGCCCTCCAGTGTGAAGAAGGCGAAGTCATGAG3', SEQ ID NO: 33) para el primer brazo de recombinación (365bp) y Xis8 (5' CTCATGACTTCGCCTTCTTCACACTGGAGGGCAAAGAAG, SEQ ID NO: 34) y Xis4 para el segundo brazo de recombinación. La PCR de unión se realizó utilizando cebadores Xisl y Xis4 y generó un fragmento de ADN de 714 pb. Este fragmento se electroporó como se describió anteriormente en las bacterias seleccionadas y que llevan el plásmido pKD46. Las bacterias se colocaron en placas en las mismas placas selectivas que contenían DOG y se incubaron durante dos días a 37°C. El cribado por PCR se realizó utilizando cebadores Xis5 y Xis6. Las bacterias que muestran una amplificación de 1770 pb (en lugar de una amplificación de 3010 pb correspondiente al cromosoma no modificado) se seleccionaron y purificaron. El fragmento de ADN se secuenció utilizando los cebadores Xis5 y Xis6 y mostró la eliminación correcta del gen galK. Esta recombinación se realizó una sola vez, ya que las bacterias se obtuvieron inmediatamente.
Estos resultados muestran que no fue posible eliminar galK asociado a los genes N y ral mediante recombinación homóloga. Sin embargo, utilizando exactamente el mismo procedimiento, pudimos solo eliminar galK.
En conclusión, demostramos que la eliminación de los genes N y ral conduce a la muerte de bacterias, lo cual fue inesperado.
Ejemplo 2: Expresión de proteínas utilizando MG1655
Con el fin de probar la eficiencia de producción de proteínas de la cepa construida de acuerdo con la invención, se realizaron pruebas de expresión a pequeña escala utilizando bacterias llamadas M11 (DE3). El genotipo de esta cepa es MG1655 AgalK, Arcs A, Alon, AhsdR-mmr, AfhuA, AendA, ArecA, AaraB, AompT, A-DES (T7pol, Axis-ea10, AS-C). Dado que MG1655 es una Escherichia coli K-12, se comparó con otra cepa K-12 utilizada como estándar en el campo de la producción de proteínas y llamada HSM174 (DE3) (genotipo: recAI, hsdR, A-DE3, (Rif R)). Ambas cepas se transformaron con ADN de plásmido pSCherryl (Delphi Genetics, Bélgica). Este plásmido codifica una proteína llamada "cherry" fácilmente detectable (por los ojos, color rojo) bajo el control del promotor T7.
Protocolo para una expresión a pequeña escala utilizando IPTG:
1) Se inocularon dos matraces Erlenmeyer que contenían 10 ml de medio LB, cada uno con una colonia única de HMS174 (DE3) y M11 (DE3) que llevaban el plásmido pSCherryl como se incubaron a 30°C durante la noche.
2) Dos nuevos matraces que contenían medio fresco se inocularon con 1 ml de los cultivos durante la noche y se incubaron con agitación a 37°C hasta que la OD600 alcanzó 0.6.
3) Se tomó una muestra (1 ml) de cada matraz y se centrifugó. El medio se descartó y el sedimento se mantuvo en hielo. Las muestras fueron los controles no inducidos. Para inducir la expresión de proteínas en el cultivo restante, se agregó IPTG (isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido, 90 pl de una solución madre de 100 mM fresca) para alcanzar una concentración final de 1 mM en ambos matraces. La incubación de ambos matraces se continuó durante 4 horas.
4) Al final del período de inducción, se midió la densidad óptica a 600 nm para cada cultivo (1.09 para M11 (DE3) y 1.13 para HMS174 (DE3)). Una muestra de 1 ml de cada matraz se centrifuga a la velocidad máxima (13000 g) durante 10 minutos a 4°C. Se observó que el sedimento era rojo de acuerdo con la expresión de la proteína Cherry. El sobrenadante se desechó y se agregaron 100 pl de agua para resuspender las bacterias. También se agregaron 100 |jl de tampón de "craqueo" (DTT 100 mM, s Ds al 2%, Tris-HCl 80 mM, pH 6.8, azul de bromofenol al 0.006%, glicerol al 15%) para lisar las bacterias. Las muestras no inducidas se trataron con el mismo protocolo, excepto que solo se utilizaron 60 pl de agua y 60 pl de tampón de craqueo (de acuerdo con la densidad óptica de las muestras).
5) Las muestras se calentaron a 70°C-100°C (10 min.) Para resuspender todas las proteínas y desnaturalizar las proteínas.
6) Se cargaron 10 j l de cada muestra en gel de SDS-PAGE al 12% y se migró durante 2 horas a 100 voltios.
7) Después de la migración, las proteínas se colorearon con tinción con azul de Coomassie.
Como se muestra en la figura 1, ambas cepas fueron capaces de producir la proteína de interés (proteína Cherry, indicada por la matriz), pero la producción es de aproximadamente 5 a 10 veces mayor al utilizar M11 (DE3) que al utilizar HMS174 (DE3). El experimento se realizó dos veces con exactamente los mismos resultados.
Ejemplo 3: Expresión de proteínas utilizando BL21 (DE3)
Las cepas BL21 (DE3) suprimidas de Axis-ea10 y/o AS-C se construyeron de acuerdo con el ejemplo 1. La supresión AS-C se insertó en el cromosoma de la bacteria (en lambda DE3 suprimida del gen int y codificaba la polimerasa de ARN de T7) sola o en combinación con la supresión Axis-ea10. Se construyeron de esta manera dos derivados BL21 (DE3): BL21 (DE3) AS-C y BL21 (DE3) Axis-ea10, AS-C. Las supresiones se confirmaron mediante amplificación por PCR de la región modificada y esta región se secuenció. Esta etapa de secuenciación confirmó la presencia de las supresiones correspondientes de acuerdo con las secuencias teóricas. A continuación, las bacterias construidas se probaron para determinar la expresión de proteínas utilizando dos plásmidos diferentes que codifican la proteína cherry (pSCherryl y pSSC-Cherryl, Delphi Genetics) de acuerdo con el ejemplo 2. Los resultados mostraron claramente una sobreexpresión del gen cherry que codifica la proteína cherry. Esta proteína fue detectada fácilmente por los ojos y en el análisis SDS-PAGE.
Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que estas bacterias son capaces de sobreproducir proteínas sin riesgo de lisis bacteriana no deseada debido al fago lambda DE3 porque este fago está por lo menos suprimido de los genes int, S, R y Rz que codifican las funciones requeridas para la división de fagos y lisis bacteriana.
Dado que la lisis bacteriana durante la proteína depende de varios parámetros, que incluyen las condiciones de crecimiento, la proteína sobreexpresada,... diseñamos una cepa modelo para mostrar que las cepas construidas son resistentes a la lisis debido a las supresiones de genes específicos. En el fago lambda, se requiere tener una expresión constitutiva del represor CI con el fin de reprimir el desarrollo lítico y mantener el estado lisogénico del profago. Un mutante (CI857) de este represor es bien conocido debido a su capacidad para ser termosensible: a 30°C, el represor mutado es completamente activo y mantiene el estado lisogénico. Sin embargo, a una temperatura más alta (37°C a 42°C), el CI857 no es eficiente e induce el estado lítico del fago lambda. Las cepas que llevan esta mutación CI857 y las supresiones de acuerdo con la invención se construyeron: BL21 (DE3) AS-C correspondiente a una cepa BL21 que comprende P41; BL21 (DE3) Axis-ea10 y AS-C correspondientes a una cepa BL21 que comprende P11; BL21 (DE3) Axis-ea10, AS-C y AQ correspondientes a una cepa BL21 que comprende P13; BL21 (DE3) AQ correspondiente a una cepa BL21 que comprende P15 y BL21 (DE3) Axis-ea10 y AQ correspondiente a una cepa BL21 que comprende P53.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una célula anfitriona bacteriana que comprende un fago genéticamente modificado en la que
    - se inserta un sistema de expresión, dicho sistema de expresión comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína, dicha proteína que induce adicionalmente la expresión de una biomolécula de interés, y - se suprimen los genes int, S, R, Rz, Xis, y
    en la que dicho fago genéticamente modificado se integra en el genoma de dicha célula anfitriona bacteriana, y en la que el fago es el fago lambda, el fago 434, el fago phi80, el fago phi81, el fago HK97, o el fago P21.
    2. La célula anfitriona bacteriana de acuerdo con la reivindicación 1, en la que se inactiva adicionalmente el gen Q.
    3. La célula anfitriona bacteriana de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que el promotor comprendido en el sistema de expresión es inducible.
    4. La célula anfitriona bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el sistema de expresión es el sistema de expresión T7.
    5. La célula anfitriona bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho fago es uno de los fagos P11 o P13, en la que
    - P11 comprende la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, R, Rz, Xis y Int, y
    - P13 comprende la secuencia NC_001416 en la que se suprimen las secuencias de codificación de los genes S, R, Rz, Q, Xis y Int.
    6. La célula anfitriona bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la célula anfitriona bacteriana es una enterobacteria, preferiblemente E. coli, más preferiblemente BL21.
    7. La célula anfitriona bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprende adicionalmente la inactivación de por lo menos uno de los genes tonA, galK, araB, araA, lon, ompT, rcsA, hsdR, mrr, endA y recA.
    8. La célula anfitriona bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende la inserción del gen ccdB.
    9. Un kit que comprende la célula anfitriona bacteriana de acuerdo con la reivindicación 8 y un plásmido que comprende el gen ccdA.
    10. Un proceso para preparar la célula anfitriona bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende infectar una célula anfitriona bacteriana con un fago genéticamente modificado en el que - se inserta un sistema de expresión, dicho sistema de expresión comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína, dicha proteína que induce adicionalmente la expresión de una biomolécula de interés, - se suprimen los genes int, S, R, Rz, Xis, y
    - el fago es el fago lambda, el fago 434, el fago phi80, el fago phi81, el fago HK97, o el fago P21, y
    utilizar un fago ayudante para complementación.
    11. Un proceso para producir una biomolécula de interés, que comprende
    - cultivar una célula anfitriona bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha célula anfitriona comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la biomolécula de interés,
    - expresar dicha biomolécula de interés.
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