BR112014000248B1 - célula hospedeira bacteriana compreendendo um fago geneticamente modificado, kit, processo para preparar a célula hospedeira bacteriana e processo para produzir uma biomolécula de interesse - Google Patents

Abstract

FAGO GENETICAMENTE MODIFICADO E USO DESTE A presente invenção diz respeito a um fago geneticamente modificado e uso deste em um método para produzir uma biomolécula de interesse.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção diz respeito ao campo da produção de biomoléculas de interesse em sistemas biológicos. Especificamente, a presente invenção diz respeito a um fago geneticamente modificado e ao uso deste a fim de evitar a contaminação de fago do caldo de cultura e/ou lise bacteriana.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] As células bacterianas são sistemas de escolha para a produção de biomoléculas, especialmente de proteínas alvo. Entre outras vantagens, os sistemas bacterianos são fáceis de usar e permitir a produção rápida de quantidades grandes de proteína em um volume limitado de cultura.

[0003] Um dos sistemas bacterianos usados de maneira ampla e rotineira é o sistema de expressão de bacteriofago T7. Este sistema bacteriano foi descrito no US 4,952,496. Neste sistema, o gene que codifica a proteína alvo é colocado sob o controle de um promotor T7 e é transformado em um hospedeiro bacteriano, usualmente E. coli, que compreende um fago de lisogênio lambda DE3 integrado. O fago de lisogênio lambda DE3 carrega o gene que codifica a T7 RNA polimerase sob o controle de um promotor lacUV5. Quando cultivado em um meio contendo IPTG, a expressão da T7 RNA polimerase é induzida e permite a expressão da proteína alvo.

[0004] Devido à integração do gene da T7 RNA polimerase (T7 gene 1) dentro da sequência do gene Int, o fago Lambda DE3 deve ser defeituoso em sua capacidade de entrar na fase lítica. Entretanto, a lise bacteriana é observada durante algumas produções de proteína e na ausência de qualquer outro fago, sugerindo que o fago DE3 pode recuperar suas propriedades líticas. A lise bacteriana e ainda mais a presença de fagos infecciosos no caldo de cultura é altamente problemático porque (i) isto compromete o uso de proteínas alvo produzidas para algumas aplicações, tais como, por exemplo, aplicações farmacêuticas, (ii) o processo de descontaminação a fim de remover qualquer traço de fagos requer o desligamento das linhas de produção e a renovação completa das bateladas de cultura e (iii) reduz dramaticamente o campo da proteína recombinante.

[0005] Os métodos alternativos ao uso de um fago foram descritos:

[0006] O WO03/050240 descreve um sistema de expressão para a produção de uma proteína alvo em uma célula hospedeira que compreende um gene que codifica T7 RNA polimerase integrada usando-se a recombinação homóloga. Entretanto, o sistema do WO03/050240 é difícil de implementar, devido ao tamanho do gene de T7 RNA polimerase e devido ao fato que a recombinação homóloga não é fácil de se realizar em todas as cepas de E. coli (como mencionado por Phue et al., Biotechnology and Bioengineering, 101, 831-836, 2008). Consequentemente, o número de células transformadas que carregam a integração de T7 RNA polimerase permanece muito baixo ou estas células não são obtidas. Além disso, usando-se a recombinação homóloga, é necessário usar um marcador de seleção para selecionar as bactérias contendo a integração do gene T7 RNA polimerase gene. Este marcador não será utilizável para outra etapa de seleção e pode ser indesejado para o uso final da cepa. Por exemplo, os marcadores seletivos frequentemente usados são genes de resistência a antibióticos, mas é recomendado evitar estes genes em produções biofarmacêuticas. Uma etapa adicional é, desta maneira, requerido para remover o gene de resistência a antibiótico da cepa e nem sempre é possível realizá-la.

[0007] O WO2008/139153 descreve outro sistema de expressão, em que a célula hospedeira é transformada com um plasmídeo que compreende um cassete de expressão para T7 RNA polimerase. Entretanto, devido ao uso de um plasmídeo, as células hospedeiras devem ser mantidas em condições seletivas para certificar-se que estes compreenderão o plasmídeo. Além disso, os plasmídeos são frequentemente submetidos à recombinação, que prejudicou o sistema de expressão.

[0008] Portanto, existe uma necessidade quanto a um novo método para produzir uma biomolécula de interesse, em que, quando um fago é usado, a cultura não é contaminada pelos fagos infecciosos ou não intencionalmente lisada durante o desenvolvimento ou produção de proteína.

[0009] A presente invenção, desse modo, fornece um fago geneticamente modificado que não recupera suas propriedades líticas durante a cultura, desse modo, permitindo a produção de uma biomolécula de interesse sem a contaminação de fago. SUMÁRIO

[0010] Um objeto da invenção é um fago geneticamente modificado em que - um sistema de expressão é inserido, - os genes S e/ou R são inativados.

[0011] Em uma forma de realização da invenção, o gene Int e/ou Xis é inativado.

[0012] Outro objeto da invenção é um fago geneticamente modificado em que - um sistema de expressão é inserido, - os genes S, R e/ou Q são inativados e - o gene Int e/ou Xis gene é inativado.

[0013] Em outra forma de realização da invenção, o gene Rz é inativado.

[0014] Em outra forma de realização da invenção, um sistema de expressão é inserido e o gene Int, o gene Xis e os genes R, S e Rz são inativados.

[0015] Em outra forma de realização da invenção, um sistema de expressão é inserido e o gene Int, o gene Xis e o gene Q, R, S e Rz são inativados.

[0016] Em outra forma de realização da invenção, o sistema de expressão é o sistema de expressão T7.

[0017] Em outra forma de realização da invenção, o fago é o fago lambda, o fago 434, o fago phi80, o fago phi81, o fago HK97, o fago P21.

[0018] Em outra forma de realização da invenção, o fago geneticamente modificado como descrito anteriormente tem a sequência SEQ ID NO: 10. Em outra forma de realização da invenção, o fago geneticamente modificado como descrito anteriormente é um dos fagos P11 a P53.

[0019] Outro objetivo da invenção é um kit que compreende o fago geneticamente modificado como descrito anteriormente e um fago auxiliar.

[0020] Outro objetivo se a invenção é uma célula hospedeira que compreende o fago geneticamente modificado como descrito anteriormente.

[0021] Em uma forma de realização da invenção, a célula hospedeira é uma enterobactéria, preferivelmente E. Coli, mais preferivelmente BL21.

[0022] Em outra forma de realização da invenção, a célula hospedeira como descrito anteriormente ainda compreende a inativação de pelo menos um dos genes tonA, galK, araB, araA, lon, ompT, rcsA, hsdR, mrr, endA e recA.

[0023] Em outra forma de realização da invenção, a célula hospedeira como descrito anteriormente compreende a inserção do gene ccdb.

[0024] Outro objetivo da invenção é um kit que compreende a célula hospedeira como descrito anteriormente e um plasmídeo que compreende o gene ccdA.

[0025] Outro objetivo da invenção é um processo para preparar uma célula hospedeira como descrito anteriormente, que compreende infectar uma célula hospedeira com um fago geneticamente modificado como descrito anteriormente.

[0026] Outro objetivo da invenção é um processo para produzir uma biomolécula de interesse, que compreende - cultivar uma célula hospedeira que compreende o fago geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7 e a sequência de ácido nucléico da biomolécula de interesse, - recuperar a biomolécula de interesse.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0027] A presente invenção diz respeito a um fago geneticamente modificado, em que a capacidade do fago recuperar suas propriedades líticas é limitada.

[0028] Os inventores focaram na modificação genética de um fago. De maneira surpreendente, os inventores observaram que não foi possível deletar todas as sequências virais do fago integrado, por causa da viabilidade das bactérias infectadas foi gravemente comprometida naquele caso. Em particular, os inventores mostraram que a deleção de um fragmento de DNA que compreende as sequências codificadoras do gene ral e o gene N leva à morte da célula hospedeira (ver EXEMPLOS). Este resultado foi surpreendente por causa dos genes ral e N não são conhecidos estarem envolvidos no estado lisogênico; o gene N gene é apenas descrito como essencial para o desenvolvimento lítico. Ao contrário, no estado lisogênico, um repressor do fago, isto é CI ou C2, bloqueia a expressão de N e ral.

[0029] A presente invenção, desta maneira, diz respeito a um fago geneticamente modificado em que - um sistema de expressão é inserido e - pelo menos um dos genes Int, Xis, R, S, Q e Rz é inativado.

[0030] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e o gene S é inativado.

[0031] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e o gene R é inativado.

[0032] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e o gene Q é inativado.

[0033] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e o gene Int é inativado.

[0034] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e o gene Xis é inativado.

[0035] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S e Int são inativados.

[0036] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S e Xis são inativados.

[0037] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S e R são inativados.

[0038] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S e Rz são inativados.

[0039] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S e Q são inativados.

[0040] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes R e Rz são inativados.

[0041] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes R e Int são inativados.

[0042] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes R e Xis são inativados.

[0043] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes R e Q são inativados.

[0044] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes Q e Rz são inativados.

[0045] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes Q e Int são inativados.

[0046] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes Q e Xis são inativados.

[0047] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, Int e Xis são inativados.

[0048] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, Int e Rz são inativados.

[0049] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, Int e R são inativados.

[0050] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, Xis e Rz são inativados.

[0051] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, Xis e R são inativados.

[0052] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, R e Rz são inativados.

[0053] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, R e Q são inativados.

[0054] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, Q e Rz são inativados.

[0055] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, Q e Int são inativados.

[0056] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, Q e Xis são inativados.

[0057] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes R, Int e Xis são inativados.

[0058] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes R, Int e Rz são inativados.

[0059] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes R, Xis e Rz são inativados.

[0060] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes R, Q e Rz são inativados.

[0061] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes R, Xis e Q são inativados.

[0062] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes R, Int e Q são inativados.

[0063] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes Q, Int e Rz são inativados.

[0064] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes Q, Int e Xis são inativados.

[0065] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes Q, Xis e Rz são inativados.

[0066] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, Int, Xis e Rz são inativados.

[0067] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, Int, Xis e R são inativados.

[0068] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, Int, R e Rz são inativados.

[0069] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, R, Xis e Rz são inativados.

[0070] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes R, Rz, Xis e Int são inativados.

[0071] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes Q, R, Rz e S são inativados.

[0072] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes Q, R, Rz e Int são inativados.

[0073] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes Q, R, S e Int são inativados.

[0074] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes Q, Rz, S e Int são inativados.

[0075] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes Q, R, Rz e Xis são inativados.

[0076] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes Q, R, S e Xis são inativados.

[0077] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes Q, Rz, S e Xis são inativados.

[0078] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes Q, R, Int e Xis são inativados.

[0079] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes Q, Rz, Int e Xis são inativados.

[0080] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes Q, S, Int e Xis são inativados.

[0081] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, R, Rz, Xis e Int são inativados.

[0082] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, R, Q, Rz e Xis são inativados.

[0083] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, R, Q, Rz e Int são inativados.

[0084] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, R, Q, Xis e Int são inativados.

[0085] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, Q, Rz, Xis e Int são inativados.

[0086] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes R, Q, Rz, Xis e Int são inativados.

[0087] Em uma forma de realização, o fago geneticamente modificado compreende um sistema de expressão e os genes S, R, Q, Rz, Xis e Int são inativados.

[0088] Os exemplos dos fagos que podem ser usados na invenção incluem, mas não são limitados ao fago lambda (X), fagos semelhantes a lambda e fagos lambdóides. O fago lambda, também conhecido como colifago lambda, é um vírus que infecta Escherichia coli. O Lambda é um bacteriofago temperado. Os fagos semelhantes ao Lambda formam uma família de bacteriofagos e vírus archaeal que são caracterizados por caudas longas não contráteis. Os fagos Lambdóides são parentes naturais do fago lambda. A maioria destes desenvolvem-se em E. coli, mas alguns vem de outras células hospedeiras, tais como, por exemplo, Salmonella typhimurium. Estes fagos podem ter a mesma ordem genética que o lambda.

[0089] Os exemplos de fagos semelhantes a lambda e fagos lambdóides que podem ser usados na presente invenção incluem, mas não são limitados a, colifago 434, phi80, phi81, HK97, P21 e P22.

[0090] Em uma forma de realização, o fago é lambda (Enterobacteria fago lambda, número de acessão NC_001416). A organização do genoma do fago lambda é mostrada na Tabela 1 abaixo. Tabela 1

[0091] Na presente invenção, a posição dos resíduos dentro da sequência do fago lambda diz respeito a NC_001416.

[0092] Em outra forma de realização, o fago é lambda DE3 (número de acessão EU078592). O fago Lambda DE3 é um fago lambda modificado D69, que compreende o gene que codifica o T7 RNA polimerase sob o controle de um promotor lacUV5. A lista dos genes carregados pela sequência de Lambda DE3 e sua posição é mostrada na Tabela 2 abaixo. Tabela 2

[0093] Na presente invenção, a posição dos resíduos dentro da sequência do fago lambda DE3 diz respeito ao EU078592.

[0094] Como usado aqui, um “sistema de expressão” refere-se a uma molécula de DNA linear ou uma circular composta de um fragmento que codifica uma sequência de ácido nucléico operacionalmente ligada a um fragmento adicional para a transcrição do sistema.

[0095] O fragmento adicional inclui um promotor e uma sequência de códon de interrupção. O sistema de expressão ainda pode conter uma ou mais origens de replicações, um ou mais marcadores de seleção e uma sequência que codifica um local de ligação de ribossomo.

[0096] "Operacionalmente ligado" significa que os fragmentos estão dispostos para funcionar quando estes são supostos serem, por exemplo, uma vez que a transcrição inicia no promotor, isto acontece através do fragmento codificado ao códon de interrupção.

[0097] "Promotor" no significado da presente invenção é um elemento de controle de expressão que permite a ligação de RNA polimerase e o início de transcrição.

[0098] Em uma forma de realização da invenção, a sequência de ácido nucléico está sob o controle de um promotor "forte". Um promotor forte é caracterizado por uma afinidade de ligação alta da sequência de promotor a uma RNA polimerase, usualmente, a RNA polimerase de ocorrência natural correspondente, por um lado e a taxa de formação de mRNA pela qual a RNA polimerase por outro lado.

[0099] Em uma forma de realização preferida, a sequência de ácido nucléico está sob o controle de um “promotor indutível”. Um “promotor indutível” é um promotor que pode ser regulado pelos fatores externos, por exemplo, a presença de uma molécula indutora (também denominada "indutor") ou a ausência de uma molécula repressora ou fatores físicos como temperatura aumentada ou diminuída, osmolaridade ou valor de pH. Os promotores diferentes e os princípios de indução respectivos foram revistos por Makrides et al. (Microbiological Reviews, 1996, (60)3: 512-538). Os exemplos de promotores indutíveis que podem ser usados na presente invenção incluem, mas não são limitados ao promotor tac ou trc, o lac ou o promotor lacUV5 (todos indutíveis por lactose ou seu IPTG análogo (isopropiltiol-β-D-galactosideo)), o promotor araBAD firmemente regulável (PBAD; Guzman et al., 1995, indutível por arabinose), o promotor de trp (indutível pela adição do ácido β-indol acrílico ou privação de triptofano, repressível pela adição de triptofano), o promotor lambda pL (X) (indução por um aumento de temperatura), o promotor phoA (indutível por privação de fosfato), o PprpB (indução com propionato) ou outros promotores adequados para a expressão de proteína recombinante, todos usando RNA polimerase de E. coli.

[0100] Entre os promotores indutíveis estão aqueles que mostram um comportamento de expressão "avariado". Tais promotores (denominados "promotores avariados") são, em princípio, indutíveis, mas também mostram, todavia, expressão basal sendo externamente induzido. Os promotores indutíveis que mostram a expressão avariada sob condições não induzidas podem comportar-se de maneira similar ais promotores constitutivos (isto é, estes são ativos de maneira fixa e contínua e estes podem ser ativados ou intensificados como um resultado de certas condições de cultivo). Os promotores avariados podem ser particularmente úteis para processos de cultivo operados de maneira contínua. Os exemplos de promotores avariados são o promotor T7 e o promotor trp.

[0101] Em uma forma de realização da invenção, o promotor pode também ser constitutivo, ou seja, um promotor que controla a expressão, sem a necessidade de indução, por um lado, ou a possibilidade de repressão por outro lado. Assim, não há expressão contínua e constante em um determinado nível. Como um exemplo, o promotor HCD constitutivo forte (Poo et al., Biotechnology Letters, 2002, 24:11851189; Jeong et al., Protein expression and purification, 2004, 36:150-156) pode ser aplicado para a expressão constitutiva.

[0102] Em uma forma de realização, o sistema de expressão compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica uma proteína que induz a expressão da biomolécula de interesse. Vantajosamente, a expressão da biomolécula de interesse é induzida em condições particulares, tais como, por exemplo, sob seleção.

[0103] Os exemplos de tais sequências de ácido nucléico incluem, mas não são limitados ao gene que codifica a T7 RNA polimerase, T7 gene 1. Naquele case, a expressão da T7 RNA polimerase induz a expressão da biomolécula de interesse colocada sob o controle de um promotor T7.

[0104] Preferivelmente, o sistema de expressão é o sistema de expressão T7. O sistema de expressão T7 foi descrito no US4,952,496, que é incorporado aqui por referência. O sistema de expressão T7 compreende um fragmento de DNA do fago T7, contendo a sequência codificadora interia para a T7 RNA polimerase (isto é, o T7 gene 1). Qualquer promotor ativo natural do T7 gene 1 foi removido e um promotor indutível lacUV5 foi inserido à frente da sequência codificadora. O promotor lacUV5 é induzido pela indução de IPTG ao meio de cultura.

[0105] De acordo com outra forma de realização, o sistema de expressão compreende a sequência de ácido nucléico da biomolécula de interesse.

[0106] Com respeito à biomolécula de interesse, não existem limitações. Este pode, principalmente ser quaisquer sequências de aminoácido, sequências de ácido nucléico, tal como, por exemplo, DNA ou RNA.

[0107] Os exemplos de sequências de aminoácido incluem polipeptídeo, proteína ou peptídeo que deve ser produzido em uma escala de fabricação, por exemplo, escala de fabricação, por exemplo, uma biomolécula industrial ou uma biomolécula terapêutica.

[0108] Os exemplos de biomoléculas que podem ser produzidas pelo método da invenção são, sem limitação, enzimas, proteínas reguladoras, receptores, peptídeos, por exemplo, hormônios peptídicos, citocinas, membrana ou proteínas de transporte.

[0109] As biomoléculas de interesse podem também ser antígenos como utilizados para a vacinação, vacinas, proteínas de ligação ao antígeno, proteínas estimuladoras imunes, alérgenos, anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpos ou seus derivados. Derivados de anticorpo podem ser selecionados a partir do grupo de anticorpos de cadeia simples, (scFv), fragmentos Fab, fragmentos Fv, anticorpos de domínio único (fragmentos VH ou VL) anticorpos de domínio, como anticorpos de domínio único de camelídeos (VHH, nanocorpos) ou outros formatos de anticorpos como descrito, por exemplo, em Andersen and Reilly (Current Opinion in Biotechnology, 2004, 15:456-462) ou Holliger and Hudson (Nature Biotechnology, 2005 (23)9: 1126-1136).

[0110] As biomoléculas de interesse na presente invenção também podem ser exemplificadas por proteína (antígeno viral), por exemplo, proteína capsidial, a proteína do núcleo, a protease, a transcriptase reversa, a integrase, e assim por diante, codificada no genoma de um vírus patogênico, por exemplo, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, I-HV, influenza, e assim por diante; fatores de crescimento tais como o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento de células estaminais (SCF), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento transformador (TGF ), fator de crescimento do nervo (NGF), o fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), e assim por diante; citocinas tais como o fator de necrose do tumor, interferon, interleucina, e assim por diante , fatores hematopoiéticos como a eritropoietina, fator estimulante de colônias de granulócitos, fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófago, fator estimulante de colônias de macrófago, trombopoietina, e assim por diante; hormônios peptídicos como o hormônio de liberação do hormônio luteinizante (LB-RH), hormônio liberador de tireotrofina (TRH), insulina, somatostatina, hormônio do crescimento, prolactina, hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), hormônio estimador de melanócito- estimulante (MSH), hormônio estimulador da tireóide (TSH), hormônio luteinizante (LU), hormônio estimulador de folículo (FSH) , vasopressina, oxitoxina, calcitonina hormônio da paratireóide (PTH), glucagon, gastrina, secretina, pancreozimina, colecistocinina, angiotensina,lactogênio da placenta humana , gonadotrofina coriônica humana (HCG), ceruleína, motilina, e assim por diante; peptídeos analgésico como encefalina, endorfina, dinorfina, quiotorfina, e assim por diante; enzimas tais como superóxido dismutase (SOD), uroquinase, ativador de plasminogênio de tecido (TPA), asparaginase, calicreína, e assim por diante; neurotransmissores peptídicos, tais como a bombesina, neutrotensina, bradiquinina, substância P, amilóide da doença de Alzheimer (AD), SODl, presenilina 1 e 2, renina, Disnucleina, amilóide A, amilóide P, activina, antiHER-2, bombesina, encefalinase, inibidores de protease, enzimas terapêuticas, Dl-antitripsina, inibidor da tripsina de mamífero, inibidor de tripsina de pâncreas de mamíferos, calcitonina, fator de hipertrofia cardíaca cardiotrofinas (tal como cardiotrofina1), proteínas (CD, tais como CD3, CD4, CD8 e CD19), CFTR, CTNF, ADNase, gonadotrofina coriónica humana, peptídeo associado à gonadotropina de camundongo, citocinas, transtirretina, amilina, lipoproteínas, linfocinas lisozima, um hormônio de crescimento (incluindo o hormônio do crescimento humano), hormônio de crescimento bovino, fator de liberação de hormônio de crescimento hormônio da paratireóide, hormônio estimulador da tireóide, fatores de crescimento, fator de crescimento neurotrófico derivado do cérebro, fator do crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblastos (tais como FGF D e D FGF), fator de crescimento semelhante à insulina I e II, des (1-3)-IGFI (IGF-I cerebral), proteínas de ligação do fator de crescimento semelhante a insulina, fator de desenvolvimento de nervo (tal como NGF-D), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), receptores para hormônios de crescimento ou fatores de crescimento, fator de crescimento transformador (TGF) (tal como TGF-D, TGF-D 1, TGF-D2, TGF-D3, TGF-D4 ou TGF- D5), fatores neurotróficos (tais como neurotrofina-3, -4 ,-5, ou -6), gelsolina, glucagon, calicreínas, substância inibidora muleriana, fatores neutróficos, p53, proteína A ou D, prorelaxina, cadeia de relaxina A, cadeia de relaxina B, fatores reumatóides, rodopsina, uma albumina de soro (tais como albumina de soro humana), inibina, insulina, cadeias de insulina, cadeia de insulina A, cadeia de insulina D, receptor de insulina, proinsulina, hormônio luteinizante, integrina, interleucinas (ILs) (tais como IL- 1 a IL-10, IL-12, IL-13), eritropoietina, trombopoietina, fibrilina, hormônio estimulador de folículo, fatores de coagulação (tais como fator VIIIC, fator IX, fator de tecido e fator de von Willebrands), fatores anti-coagulação (tal como Proteína C, fator naturiético atrial, tensoativo pulmonar), um ativador de plasminogênio (tal como ativador de plaminogênio de tecido humano ou urocinase), trombina, fator de necrose de tumor-D ou D, D-cetoácido desidrogenase, adressinas, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), colágeno, fatores estimuladores de colônia (CSFs) (tais como M-CSF, GM- CSF and G-CSF), fator de aceleração de declínio, receptores auto-direcionais, interferons (tais como interferon-alfa, -gama e -beta), queratina, fatores osteoindutores, PRNP, proteína reguladoras, superóxido dismutase, proteínas de membrana de superfície, proteínas transportadoras, receptores de célula T, antígenos, tais como gpl 20(HIb) imuno toxinas, peptídeo natriurético atrial, proteína exócrina da vesícula seminal, D2-microglobulina, PrP, precalcitonina, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 6, ataxina 7, huntingtina, receptor de androgênio, proteína de ligação CREB, gpl 20, p300, CREB, API, ras, NFAT, jun, fos, proteina associada com atrofia dentaorubral pallidoluisiana, uma proteína miocrobiana (por exemplo, proteína de ligação de maltose, transportador ABC, glutationa S transferase, tioredoxina, D-lactamase), proteína fluorescente verde, proteína fluorescente vermelha, uma enzima, tal como superóxido dismutase, asparaginase, arginase, arginina deaminase, adenosina desaminase, ribonuclease, catalase, uricase, bilirubina oxidase, tripsina, papaína, fosfatase alcalina, beta-glucoronidase, purina nucleosídeo fosforilase ou batroxobina, um opióide, por exemplo endorfinas, encepalinas ou opióides não naturais, um hormônio ou neuropeptídeo, por exemplo, calcitonina, glucagon, gastrinas, hormônio adreno-corticotrópico (ACTH), colecistocininas, hormônio lutenizante, hormônio liberador de gonadotropina, gonadotropina coriônica, fator de liberação de corticotrofina, vasopressina, oxitocina, hormônios antidiuréticos, hormônio estimulador de tireóide, hormônio liberador de tyrotropina, relaxina, prolactina, peptídeo YY, neuropeptídeo Y, polipeptídeo pancreático, leptina, CART (transcrição regulada por cocaína e anfetamina), um peptídeo relacionado com CART, perilipina, melano- cortinas (hormônios estimuladores de melanócito), tais como MC-4, hormônios de concentração de melanina, peptídeos natriuréticos, adrenomedulina, endotelina, secretina, amilina, peptídeo intestinal vasoativo (VIP), polipeptídeo ativador da adenilato ciclase pituitária (PACAP), bombesina, peptídeos semlhantes a bombesina, timosina, proteína de ligação de heparina, CD4 solúvel, fator de liberação hipotalâmico e melanotoninas ou seus análogos funcionais. Em outra forma de realização da invenção, a proteína alvo também pode ser uma enzima de processamento, tal como proteases (por exemplo, enterocinase, caspases tripsina como serina proteases), lipase, fosfatase, glicosil hidrolases (por exemplo, manosidases, xilosidases, fucosidases), cinase, mono ou dioxidase, peroxidase, transglutaminase, carboxipeptidase, amidase, esterase e fosfatase...

[0111] As fontes preferidas para tais polipeptídeos de mamífero incluem fontes humanas, bovinas, equinas, suínas, lupinas e de roedores, com proteínas humanas sendo particularmente preferidas.

[0112] A biomolécula de interesse da presente invenção também abrange variantes da proteína mencionada acima. Estas variantes compreendem, por exemplo, a proteína que tem a mesma atividade que a proteína mencionada acima e que compreende uma sequência de aminoácidos com, na sequência de aminoácidos da proteína mencionada acima, um ou mais aminoácidos suprimidos, substituídos, inseridos e/ou aminoácidos adicionados. Tal proteína pode ser exemplificada por proteína que tem a mesma atividade que a proteína mencionada acima e que compreende uma sequência de aminoácidos com, na sequência de aminoácidos da proteína mencionada acima, um ou mais aminoácidos suprimidos, substituídos, inseridos e/ou adicionados. Dois ou mais tipos diferentes de modificações selecionadas a partir de supressão, substituição, inserção, adição e podem ser realizadas simultaneamente.

[0113] A biomolécula de interesse da presente invenção também abrange peptídeos "parciais" da proteína mencionada acima. Um peptídeo parcial da proteína pode ser exemplificado por um peptídeo parcial que compreende uma sequência de aminoácidos em que a porção da sequência de aminoácidos da proteína mencionada acima funciona sem interrupção, em que o peptídeo parcial, preferivelmente, tem a mesma atividade que as ditas proteínas. Tal peptídeo parcial pode ser exemplificado pelo polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que compreende pelo Menos de 20 e preferivelmente pelo Menos de 50 dos resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos da proteína mencionada acima. Preferivelmente, este polipeptídeo contém a sequência de aminoácidos que corresponde à região que está envolvida com a atividade da proteína mencionada acima. Além disso, o peptídeo parcial usado na presente invenção também pode ser um peptídeo parcial como produzido pela modificação deste polipeptídeo em que 1 ou uma pluralidade de resíduos de aminoácido (por exemplo, aproximadamente 1 a 20, mais preferivelmente aproximadamente 1 a 10, e ainda mais preferivelmente aproximadamente 1 a 5) e deletado de, substituído em, inserido em e/ou adicionado a esta sequência de aminoácido. O peptídeo parcial usado na presente invenção também pode ser usado como um antígeno para a produção de anticorpo.

[0114] Em uma forma de realização da invenção, a biomolécula de interesse é selecionada do grupo que compreende hormônio de desenvolvimento humano, insulina humana, hormônio estimulador de folículo, Fator VIII, eritropoietina, fator estimulador da colônia de granulócito, Alfa-glactosidase A, Alfa-L-iduronidase, N- actetilgalactosamine-4-sulfatase, Dornase alfa, ativador de plasminogênio de tecido, Glucocerebrosidase, Interferon, fator de desenvolvimento semelhante a insulina 1, somatotropina bovina, somatotropina porcina, quimosina bovina e proteína de envelope de vírus da hepatite B.

[0115] A biomolécula de interesse trambém abrange polipeptídeos ou proteínas modificadas que passaram por modificações pós-tradução e pós-exportação no periplasma, tais como ciclização, glicosilação, fosforilação, metilação, oxidação, desidratação, clivagem proteolítica.

[0116] Em uma forma de realização, a biomolécula de interesse é uma enzima para a metabolização de uma biomolécula no meio extracelular (aqui referido como "biomolécula extracelular"). Em uma forma de realização, a biomolécula extracelular compreende um polissacarídeo ou um lipídeo. Em uma forma de realização da invenção, o polissacarídeo compreende alquinato, pectina, celulose, celobiose, laminarina ou uma mistura dos mesmos. Em uma forma de realização da invenção, o lipídeo que compreende um ácido graxo, um glicolipídeo, um lipídeo de betaína, um glicerolipídeo, um fosfolipídeo, um glicerolfosfolipídeo, um esfingolipídeo, um lipídeo esterol, um lipídeo prenol, um sacarolipídeo, um policetídeo, ou uma mistura dos mesmos. Em uma forma de realização da invenção, uma biomolécula de interesse é uma enzima conversora do polissacarídeo a um monossacarídeo, um oligossacarídeo, ou ambos.

[0117] Em uma forma de realização da invenção, a biomolécula de interesse é uma enzima que converte o lipídeo a um ácido graxo, um monossacarídeo ou ambos. Em uma forma de realização da invenção, o monossacarídeo ou oligossacarídeo é oligoalginato, manuronato, glucuronato, manitol, a-ceto ácido, 4-desóxi-L-eritro- hexocelulose uronato (DEHU), 2-ceto-3-desóxi D-gluconato (KDG), glicose, glucuronato, galacturonato, galactose, xilose, arabinose ou manose. Em uma forma de realização da invenção, o ácido graxo é 14:0, trans-14, 16:0, 16:ln-7, trans-16, 16:2n-6, 18:0, 18:ln-9, 18:2n-6, 18:3n-6, 18:3n-3, 18:4n-3, 20:0, 20:2n-6, 20:3n-6, 20:4n-3,20:4n-6, ou 20:5n-3.

[0118] Em uma forma de realização da invenção, a biomolécula de interesse é uma enzima que converte a biomolécula extracelular a um produto químico consumível. Em uma forma de realização da invenção, o produto químico consumível é etanol, butanol ou biodiesel. Em uma forma de realização da invenção, o biodiesel é um ácido graxo, um éster de ácido graxo ou um terpenóide.

[0119] Como usado Aqui o termo "inativado" refere-se à interrupção ou à supressão da expressão de um gene a níveis transcripcionais ou translacionais. Preferivelmente o termo "inativado" refere-se a um gene cuja transcrição é reprimida.

[0120] De acordo com a invenção, a inativação de um gene que pode ocorrer devido à mutação do gene ou a uma inserção do sistema de expressão dentro da sequência codificadora do gene.

[0121] No significado da presente invenção, o termo “mutação” refere-se a uma mudança estável na sequência genética. Os exemplos de mutação que podem levar à inativação de um gene na presente invenção incluem, mas não são limitados a, mutações de ponto, inserções, deleções e amplificação ou duplicação do gene.

[0122] Preferivelmente, a mutação é uma deleção. O termo “deleção” como usado aqui significa a perda ou a ausência de um gene, preferivelmente, a perda total ou a ausência de um gene. Mais preferivelmente, a deleção começa em ou antes do códon de partida do gene deletado e termina em ou após o códon de interrupção do códon de partida do gene deletado.

[0123] Em uma forma de realização da invenção, o gene S é inativado. O gene S codifica tanto uma proteína holin (S105) quanto uma proteína anti-holin (S107). A proteína holin dispara a formação de furos na membrana. A holin é requerida para a liberação de endolisina codificada pelo gene R gene. Ao contrário, a proteína antiholin inibe a formação de furo S105. De acordo com uma forma de realização, o gene S tem a sequência SEQ ID N°: 1. Em outra forma de realização, a sequência do gene S apresenta uma identidade de sequência de pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, 5 pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % e ainda mais preferivelmente de pelo menos 99 % com a SEQ ID N°: 1.

[0124] O gene S pode conter modificações de sequência conservativas que referem-se a modificações de aminoácido que não afetam significantemente ou alteram a função a proteína S. Tais modificações conservativas incluem substituições, adições ou deleções de aminoácido. As modificações podem ser introduzidas na sequência do gene S por técnicas padrão conhecidas na técnica, tal como mutagênese direcionada ao local e mutagênese mediada por PCR. As substituições de aminoácido conservativas são tipicamente aquelas em que um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia secundária com propriedades fisicoquímicas similares. A sequência modificada da proteína S pode compreender um, dois, rês, quatro ou mais inserções, deleções ou substituições de aminoácido. Quando as substituições são feitas, as substituições preferidas serão modificações conservativas. As famílias de resíduos de aminoácido que têm cadeias secundárias similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias secundárias básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias secundárias ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias secundárias polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias secundárias não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias secundárias beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias secundárias aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Desta maneira, um ou mais resíduos de aminoácido dentro da sequência da proteína S podem ser substituídos com outros resíduos de aminoácido da mesma família de cadeia secundária e a proteína S modificada pode ser testada quanto à função retida (isto é, as propriedades apresentadas aqui) pela comparação com a prtoeína S codificada pela sequência SEQ ID N°: 1.

[0125] O termo "identidade" ou "idêntico", quando usado em uma conexão entre as sequências de dois ou mais polipeptídeos, refere-se ao grau da relação de sequência entre os polipeptídeos, como determinado pelo número de pontos entre as faixas de dois ou mais resíduos de aminoácidos. A "identidade" mede a porcentagem dos pontos idênticos entre o menor de duas ou mais sequências com alinhamento de fenda (se houver) indicado pelo modelo matemático particular ou programa de computador (isto é, "algorítmos"). A identidade dos polipeptídeos relacionados pode ser prontamente calculada pelos métodos conhecidos. Tais métodos incluem, mas não limitado a, aqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics 5 and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M. e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988). Os métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para dar o ponto maior entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade são descritos nos programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos do programa de computador preferido para determinar a identidade entre as duas sequências incluem a embalagem do programa GCG, incluindo GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. \2, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul et al., J. MoI. Biol. 215, 403-410 (1990)). O programa BLASTX é publicamente disponível de National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). O algorítmo Smith Waterman bem conhecido também pode ser usados para determinar a identidade.

[0126] Em outra forma de realização, o gene R é inativado. A proteína R é uma endolisina: esta transglicosilase degrada a mureina da parede celular da célula hospedeira. De acordo com uma forma de realização, o gene R tem a sequência SEQ ID N°: 2. Em outra forma de realização, a sequência do gene R apresenta uma identidade de sequência de pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, 5 pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % e ainda mais preferivelmente de pelo menos 99 % com a SEQ ID N°: 2.

[0127] O gene R pode conter modificações da sequência conservativa como descrito anteriormente que refere-se às modificações do aminoácido que não significantemente afetam ou alteram a função da proteína R. A sequência modificada da proteína R pode compreender uma, duas, três, quatro ou mais inserções, deleções ou substituições de aminoácidos. Deste modo, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro da sequência do proteína R podem ser substituídos com outros resíduos de aminoácidos a partir da mesma família da cadeia secundária e a proteína R modificada pode ser testada para função retida (isto é, as propriedades apresentadas neste) em comparação com a proteína R codificada pela sequência SEQ ID N°: 2.

[0128] Em outra forma de realização, o gene Rz é inativado. A proteína Rz pertence a família da espanina. Esta proteína pode ser envolvida no rompimento da membrana externa da célula hospedeira durante a fase lítica. De acordo com uma forma de realização, o gene Rz tem a sequência SEQ ID N°: 3. Em outra forma de realização, a sequência do gene Rz apresenta uma identidade de sequência de pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, 5 pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % e ainda mais preferivelmente de pelo menos 99 % com a SEQ ID N°: 3.

[0129] O gene Rz pode conter modificações da sequência conservativa como descrito anteriormente que refere-se às modificações do aminoácido que não significantemente afetam ou alteram a função da proteína Rz. A sequência modificada da proteína Rz pode compreender uma, duas, três, quatro ou mais inserções, deleções ou substituições de aminoácidos. Deste modo, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro da sequência da proteína Rz podem ser substituídos com outros resíduos de aminoácidos a partir da mesma família da cadeia secundária e a proteína Rz modificada pode ser testada para função retida (isto é, as propriedades apresentadas neste) em comparação com a proteína Rz codificada pela sequência SEQ ID N°: 3.

[0130] Em outra forma de realização, o gene Q é inativado. A proteína Q é um regulador de gene posterior: a proteína Q é um anti-terminador da síntese de RNA a partir do promotor usado para transcrição da região “tardia” total de lambda DNA. De acordo com uma forma de realização, o gene Q tem a sequência SEQ ID N°: 35. Em outra forma de realização, a sequência do gene Q apresenta uma identidade de sequência de pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, 5 pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % e ainda mais preferivelmente de pelo menos 99 % com a SEQ ID N°: 35.

[0131] O gene Q pode conter modificações da sequência conservativa como descrito anteriormente que refere-se às modificações do aminoácido que não significantemente afetam ou alteram a função da proteína Q. A sequência modificada da proteína Q pode compreender uma, duas, três, quatro ou mais inserções, deleções ou substituições de aminoácidos. Deste modo, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro da sequência do proteína Q podem ser substituídos com outros resíduos de aminoácidos a partir da mesma família da cadeia secundária e a proteína Q modificada pode ser testada para função retida (isto é, as propriedades apresentadas neste) em comparação com a proteína Q codificada pela sequência SEQ ID N°: 35.

[0132] Em outra forma de realização, um fragmento de ácido nucléico que compreende a sequência codificadora do gene S é deletada. De acordo com a invenção, o dito fragmento de ácido nucléico não compreende as sequências codificadoras do gene ral (SEQ ID N°: 4) e/ou do gene N (SEQ ID N°: 5). Portanto, de acordo com uma forma de realização, quando o fago é lambda, a região entre os resíduos 33930 e 35582 não é deletada.

[0133] De acordo com outra forma de realização, quando o fago é lambda (DE3), a região entre os resíduos 10813 e 11391 não é deletada.

[0134] Preferivelmente, o dito fragmento de ácido nucléico não compreende a sequência codificadora de N e C2 (SEQ ID N°: 6), bem como as sequências reguladoras do promotor de C2. Para ter certeza que as sequências reguladoras de C2 não são deletadas, o fragmento a ser deletado por iniciar no códon de partida ATG do seguinte gene: o gene Cro.

[0135] Mais preferivelmente, o dito fragmento de ácido nucléico não compreende a sequência codificadora de ral, N e C2 (SEQ ID N°: 6), bem como as sequências reguladoras do promotor de C2.

[0136] O gene C2 codifica uma proteína repressora, que é importante para manutenção do estado lisogênico. Este gene também é denominado cI na sequência de diversos outros fagos lambdóides. No fago lambda, a sequência codificadora dos genes ral, N e cI é a partir dos resíduos 33930 a 38040 ou a partir dos resíduos 33930 a 38022. No fago lambda DE3, a sequência codificadora dos genes ral, N, C2 é a partir dos resíduos 10813 a 12436.

[0137] Em uma forma de realização, o comprimento do dito fragmento de ácido nucléico deletado é de 30 kb a 300 b, preferivelmente de 5 kb a 500 b. Em outra forma de realização, o comprimento do dito fragmento de ácido nucléico deletado é 30 kb, 25 kb, 20 kb, 15 kb, 10 kb, 9 kb, 8 kb, 7 kb, 6 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2kb, 1 kb, 750 b, 500b.

[0138] De acordo com uma forma de realização onde o fago é lambda, o fragmento de ácido nucléico deletado inicia em uma posição que varia da posição 35582 a posição 45186, preferivelmente de 38041 a 45186 ou de 38023 a 45186 e termina em uma posição que varia da posição 45510 a posição 48502.

[0139] De acordo com outra forma de realização onde o fago é lambda DE3, o fragmento de ácido nucléico deletado inicia em uma posição que varia da posição 11392 a posição 16764, preferivelmente de 12437 a posição 16764 e termina em uma posição que varia de 17088 e 42925.

[0140] Em outra forma de realização, o fragmento de ácido nucléico a ser deletado compreende pelo menos a sequência codificadora dos genes S e R. De acordo com uma forma de realização, quando o fago é lambda, o fragmento de ácido nucléico inicia em uma posição que varia da posição 35582 a posição 45186, preferivelmente de 38041 a 45186 ou de 38023 a 45186 e termina em uma posição que varia da posição 45970 a posição 48502. Em outra forma de realização, quando o fago é lambda DE3, o fragmento de ácido nucléico inicia em uma posição que varia da posição 11392 a posição 16764, preferivelmente de 12437 a posição 16764 e termina em uma posição que varia de 17548 e 42925.

[0141] Em outra forma de realização, o fragmento de ácido nucléico a ser deletado compreende pelo menos a sequência codificadora dos genes S, R e Rz. De acordo com uma forma de realização, quando o fago é lambda, o fragmento de ácido nucléico inicia em uma posição que varia da posição 35582 a posição 45186, preferivelmente de 38041 a 45186 ou de 38023 a 45186. De acordo com esta forma de realização, o fragmento pode terminar em uma posição que varia da posição 46428 a posição 46458. Ainda de acordo com esta forma de realização, o fragmento de ácido nucléico pode terminar em uma posição que varia de 46428 a 48502.

[0142] De acordo com outra forma de realização, quando o fago é lambda DE3, o fragmento de ácido nucléico inicia em uma posição que varia da posição 11392 a posição 16764, preferivelmente de 12437 a posição 16764. De acordo com esta forma de realização, o fragmento pode terminar em uma posição que varia da posição 18006 e 18036. Ainda de acordo com esta forma de realização, o fragmento de ácido nucléico pode terminar em uma posição que varia da posição 18006 a 24496. Ainda de acordo com esta forma de realização, o fragmento de ácido nucléico pode terminar em uma posição que varia da posição 18006 a 42925.

[0143] De acordo com outra forma de realização, o fragmento de ácido nucléico a ser deletado compreende pelo menos a sequência codificadora do gene R.

[0144] De acordo com uma forma de realização, quando o fago é lambda, o fragmento de ácido nucléico inicia em uma posição que varia da posição 35582 a posição 45493, preferivelmente que varia da posição 38041 ou 38022 a posição 45493. De acordo com esta forma de realização, o fragmento de ácido nucléico a ser deletado pode terminar em uma posição que varia de 45970 a posição 48502.

[0145] De acordo com outra forma de realização, quando o fago é lambda DE3, o fragmento de ácido nucléico inicia em uma posição que varia da posição 11392 a posição 17071, preferivelmente que varia da posição 12437 a posição 17071. De acordo com esta forma de realização, o fragmento de ácido nucléico a ser deletado pode terminar em uma posição que varia de 17548 a posição 24496. Ainda de acordo com esta forma de realização, o fragmento de ácido nucléico a ser deletado pode terminar em uma posição que varia de 17548 a posição 42925.

[0146] De acordo com outra forma de realização, o fragmento do ácido nucléico a ser deletado compreende pelo menos a sequência codificadora dos genes R e Rz.

[0147] De acordo com uma forma de realização, quando o fago é lambda, o fragmento do ácido nucléico inicia em uma posição que varia a partir da posição 35582 a posição 45493, preferivelmente que varia a partir da posição 38041 ou 38022 a posição 45493. De acordo com esta forma de realização, o fragmento do ácido nucléico a ser deletado pode terminar em uma posição que varia de 46428 a posição 46458. Ainda de acordo com esta forma de realização, o fragmento do ácido nucléico a ser deletado pode terminar em uma posição que varia de 46428 a posição 48502.

[0148] De acordo com outra forma de realização, quando o fago é lambda DE3, o fragmento do ácido nucléico inicia em uma posição que varia a partir da posição 11392 a posição 17071, preferivelmente que varia a partir da posição 12437 a posição 17071. De acordo com esta forma de realização, o fragmento do ácido nucléico a ser deletado pode terminar em uma posição que varia de 18006 a posição 18330. Ainda de acordo com esta forma de realização, o fragmento do ácido nucléico a ser deletado pode terminar em uma posição que varia de 18006 a posição 24496. Ainda de acordo com esta forma de realização, o fragmento do ácido nucléico a ser deletado pode terminar em uma posição que varia de 18006 a posição 42925.

[0149] De acordo com outra forma de realização, o fragmento do ácido nucléico a ser deletado compreende pelo menos a sequência codificadora do gene Q.

[0150] De acordo com uma forma de realização onde o fago é lambda, o fragmento do ácido nucléico deletado inicia em uma posição que varia a partir da posição 35582 a posição 43886, preferivelmente de 38041 a 43886 ou de 38023 a 43886 e termina em uma posição que varia a partir da posição 44510 a posição 48502.

[0151] De acordo com outra forma de realização onde o fago é lambda DE3, o fragmento do ácido nucléico deletado inicia em uma posição que varia a partir da posição 11392 a posição 15464, preferivelmente de 12437 a posição 15464 e termina em uma posição que varia de 16088 e 42925.

[0152] De acordo com outra forma de realização, o fragmento do ácido nucléico a ser deletado compreende pelo menos a sequência codificadora dos genes Q e S.

[0153] De acordo com uma forma de realização onde o fago é lambda, o fragmento do ácido nucléico deletado inicia em uma posição que varia a partir da posição 35582 a posição 43886, preferivelmente de 38041 a 43886 ou de 38023 to 43886 e termina em uma posição que varia a partir da posição 45510 a posição 48502.

[0154] De acordo com outra forma de realização onde o fago é lambda DE3, o fragmento do ácido nucléico deletado inicia em uma posição que varia a partir da posição 11392 a posição 15464, preferivelmente de 12437 a posição 15464 e termina em uma posição que varia de 17088 e 42925.

[0155] De acordo com outra forma de realização, o fragmento do ácido nucléico a ser deletado compreende pelo menos a sequência codificadora dos genes Q, S e R.

[0156] De acordo com uma forma de realização onde o fago é lambda, o fragmento do ácido nucléico deletado inicia em uma posição que varia a partir da posição 35582 a posição 43886, preferivelmente de 38041 a 43886 ou de 38023 a 43886 e termina em uma posição que varia a partir da posição 45970 a posição 48502.

[0157] De acordo com outra forma de realização onde o fago é lambda DE3, o fragmento do ácido nucléico deletado inicia em uma posição que varia a partir da posição 11392 a posição 15464, preferivelmente de 12437 a posição 15464 e termina em uma posição que varia de 17548 e 42925.

[0158] De acordo com outra forma de realização, o fragmento do ácido nucléico a ser deletado compreende pelo menos a sequência codificadora dos genes Q, S, R e Rz.

[0159] De acordo com uma forma de realização onde o fago é lambda, o fragmento do ácido nucléico deletado inicia em uma posição que varia a partir da posição 35582 a posição 43886, preferivelmente de 38041 a 43886 ou de 38023 a 43886 e termina em uma posição que varia a partir da posição 46428 a posição 48502.

[0160] De acordo com outra forma de realização onde o fago é lambda DE3, o fragmento do ácido nucléico deletado inicia em uma posição que varia a partir da posição 11392 a posição 15464, preferivelmente de 12437 a posição 15464 e termina em uma posição que varia de 18006 e 42925.

[0161] Em uma forma de realização, o gene Int é inativado. A proteína Int administra a inserção e a excisão do genoma de fago nos genomas hospedeiros. De acordo com uma forma de realização, o gene Int tem a sequência SEQ ID N°: 7. Em outra forma de realização, a sequência do gene Int apresenta uma identidade da sequência de pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, 5 pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % e ainda mais preferivelmente de pelo menos 99 % com a SEQ ID N°: 7.

[0162] O gene Int pode conter modificações da sequência conservativa como descrito anteriormente que refere-se as modificações de aminoácido que não significantemente afetam ou alteram a função da proteína Int. A sequência modificada da proteína Int pode compreender um, dois, três, quatro ou mais inserções, deleções ou substituições de aminoácidos. Deste modo, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro da sequência da proteína Int pode ser substituída com outros resíduos de aminoácidos a partir da mesma família da cadeia secundária e a proteína Int modificada pode ser testada pela função retida (isto é, as propriedades apresentadas neste) em comparação com a proteína Int codificada pela sequência SEQ ID N°: 7.

[0163] Em uma forma de realização, o gene Xis é inativado. A proteína Xis é um excisionase, que é envolvido no processo da excisão do DNA de fago lambda fora do cromossomo hospedeiro bacteriano. De acordo com uma forma de realização, o gene Xis tem a sequência SEQ ID N°: 8. Em outra forma de realização, a sequência do gene Xis apresenta uma identidade da sequência de pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, 5 pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % e ainda mais preferivelmente de pelo menos 99 % com a SEQ ID N°: 8.

[0164] O gene Xis pode conter modificações da sequência conservativa como descrito anteriormente que refere-se as modificações de aminoácido que não significantemente afetam ou alteram a função da proteína Xis. A sequência modificada da proteína Xis pode compreender um, dois, três, quatro ou mais inserções, deleções ou substituições de aminoácidos. Deste modo, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro da sequência da proteína Xis pode ser substituída com outros resíduos de aminoácidos a partir da mesma família da cadeia secundária e a proteína Xis modificada pode ser testada pela função retida (isto é, as propriedades apresentadas neste) em comparação com a proteína Xis codificada pela sequência SEQ ID N°: 8.

[0165] Em uma forma de realização, um fragmento de ácido nucléico que compreende a sequência codificadora do gene Int é deletada. De acordo com uma forma de realização, o fago é lambda e o fragmento do ácido nucléico a ser deletado compreende os resíduos a partir da posição 27812 a 28882. De acordo com outra forma de realização, o fago é lambda e o fragmento do ácido nucléico a ser deletado inicia em uma posição que varia a partir da posição 1 a posição 27812; e termina em uma posição que varia de 28882 a 33929.

[0166] Em uma forma de realização, um fragmento de ácido nucléico que compreende a sequência codificadora do gene Xis é deletada.

[0167] De acordo com uma forma de realização, o fago é lambda e o fragmento do ácido nucléico deletado a ser deletado compreende os resíduos a partir da posição 28860 a 29078. De acordo com outra forma de realização, o fago é lambda e o fragmento inicia em uma posição que varia a partir da posição 1 a posição 28860, e termina em uma posição que varia da posição 29078 a posição 33929.

[0168] De acordo com outra forma de realização, o fago é DE3 e o ácido nucléico deletado compreende os resíduos a partir da posição 5586 a 5804. De acordo com outra forma de realização, o fragmento a ser deletado inicia em uma posição que varia a partir da posição 1 a posição 5586, e termina em uma posição que varia da posição 5804 a posição 10812.

[0169] Em uma forma de realização, um fragmento de ácido nucléico que compreende a sequência codificadoras dos genes Xis e Int é deletada. De acordo com uma forma de realização, o fago é lambda e o fragmento do ácido nucléico a ser deletado compreende os resíduos a partir da posição 27812 a 29078. De acordo com outra forma de realização, o fago é lambda e o fragmento do ácido nucléico a ser deletado inicia em uma posição que varia a partir da posição 1 a posição 27812; e termina em uma posição que varia de 29078 a 33929.

[0170] Em uma forma de realização da invenção, o fago geneticamente modificado da invenção ainda é inativado pelo gene kil. De acordo com uma forma de realização, o gene kil tem a sequência SEQ ID N°: 36). Em outra forma de realização, o gene kil apresenta uma identidade da sequência de pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, mais preferivelmente de pelo menos 99 % com a SEQ ID N°: 36. Preferivelmente, a sequência codificadora do gene kil é deletada.

[0171] De acordo com uma forma de realização, o fago é lambda e o fragmento do ácido nucléico deletado compreende os resíduos a partir da posição 33187 a 33331.

[0172] De acordo com outra forma de realização, o fago é DE3 e o ácido nucléico deletado compreende os resíduos a partir da posição 9913 a 10057.

[0173] De acordo com uma forma de realização, a sequência attP não é deletada a partir da sequência do fago da invenção. A sequência attP é SEQ ID N°: 9. A sequência attP é localizada a partir da posição 27586 e 27817 na sequência de fago lambda e a partir da posição 42788 a 42925 e de 1 a 94 no genoma do fago lambda DE3 (o genoma do fago é circular, a sequência attP é deste modo continua).

[0174] Em uma forma de realização da invenção, o fago geneticamente modificado compreende a sequência attP e a sequência do gene C2. Em outra forma de realização, o fago geneticamente modificado consiste da sequência attP e a sequência do C2 gene.

[0175] De acordo com a forma de realização preferida, um fago geneticamente modificado da invenção P11 tem a sequência SEQ ID N°: 10 e é (DE3) ΔS-C, Δxis- ea10 (DE3 refere-se ao fago lambda DE3 em que o gene de polimerase T7 RNA foi integrado dentro da sequência do gene int). O dito fago modificado P11 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, R, Rz, Xis e Int são deletadas.

[0176] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P12 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes Int e S são deletadas (um exemplo de P12 é a sequência DE3 ΔS, Δxis-ea10).

[0177] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P13 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, R, Rz, Q, Xis e Int são deletadas (um exemplo de P13 é a sequência DE3 ΔS-C, Δxis-ea10, ΔQ).

[0178] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P14 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes R e Int são deletadas (um exemplo de P14 é a sequência DE3 ΔR).

[0179] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P15 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes Q e Int são deletadas (um exemplo de P15 é a sequência DE3 ΔQ).

[0180] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P16 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S e Xis são deletadas (um exemplo de P16 é a sequência NC_001416 ΔS, Δxis-ea10).

[0181] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P17 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes R e Xis são deletadas (um exemplo de P17 é a sequência NC_001416 ΔR, Δxis-ea10).

[0182] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P18 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes Q e Xis são deletadas (um exemplo de P18 é a sequência NC_001416 Δxis-ea10, ΔQ).

[0183] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção p19 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes R, Rz e Int são deletadas (um exemplo de P19 é a sequência DE3 ΔR, ΔRz).

[0184] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P20 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, Rz e Int são deletadas (um exemplo de P20 é a sequência DE3 ΔS, ΔRz).

[0185] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P21 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes Rz, Q e Int são deletadas (um exemplo de P21 é a sequência DE3 ΔRz, ΔQ).

[0186] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P22 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, Q e Int são deletadas (um exemplo de P22 é a sequência DE3 ΔS, ΔQ).

[0187] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P23 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes R, Q e Int são deletadas (um exemplo de P23 é a sequência DE3 ΔR, ΔQ).

[0188] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P24 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, R e Int são deletadas (um exemplo de P24 é a sequência DE3 ΔS, ΔR).

[0189] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P25 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes R, Rz e Xis são deletadas (um exemplo de P25 é a sequência NC_001416 ΔR, Δxis-ea10, ΔRz).

[0190] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P26 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, Rz e Xis são deletadas (um exemplo de P26 é a sequência NC_001416 ΔS, Δxis-ea10, ΔRz).

[0191] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P27 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes Q, Rz e Xis são deletadas (um exemplo de P27 é a sequência NC_001416 ΔRz, Δxis-ea10, ΔQ).

[0192] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P28 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, Q e Xis são deletadas (um exemplo de P28 é a sequência NC_001416 ΔS, Δxis-ea10, ΔQ).

[0193] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P29 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes R, Q e Xis são deletadas (um exemplo de P29 é a sequência NC_001416 ΔR, Δxis-ea10, ΔQ).

[0194] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P30 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes R, S e Xis são deletadas (um exemplo de P30 é a sequência NC_001416 ΔS, Δxis-ea10, ΔR).

[0195] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P31 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes R, Xis e Int são deletadas (um exemplo de P31 é a sequência DE3 ΔR, Δxis-ea10).

[0196] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P32 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, Xis e Int são deletadas (um exemplo de P32 é a sequência DE3 ΔS, Δxis-ea10).

[0197] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P33 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes Q, Xis e Int são deletadas (um exemplo de P33 é a sequência DE3 Δxis-ea10, ΔQ).

[0198] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P34 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, R, Xis e Int são deletadas (um exemplo de P34 é a sequência DE3 ΔS, Δxis-ea10, ΔR).

[0199] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P35 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes R, Q, Xis e Int são deletadas (um exemplo de P35 é a sequência DE3 ΔR, Δxis-ea10, ΔQ).

[0200] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P36 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, Q, Xis e Int são deletadas (um exemplo de P36 é a sequência DE3 ΔS, Δxis-ea10, ΔQ).

[0201] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P37 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes R, Rz, Xis e Int são deletadas (um exemplo de P37 é a sequência DE3 ΔR, Δxis-ea10, ΔRz).

[0202] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P38 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, Rz, Xis e Int são deletadas (um exemplo de P38 é a sequência DE3 ΔS, Δxis-ea10, ΔRz).

[0203] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P39 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes Rz, Q, Xis e Int são deletadas (um exemplo de P39 é a sequência DE3 ΔRz, Δxis-ea10, ΔQ).

[0204] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P40 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, R, Q e Int são deletadas (um exemplo de P40 é a sequência DE3 ΔS, ΔR, ΔQ).

[0205] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P41 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, R, Rz e Int são deletadas (um exemplo de P41 é a sequência DE3 ΔS-C).

[0206] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P42 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes R, Rz, Q e Int são deletadas (um exemplo de P42 é a sequência DE3 ΔR, ΔRz, ΔQ).

[0207] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P43 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, Rz, Q e Int são deletadas (um exemplo de P43 é a sequência DE3 ΔS, ΔRz, ΔQ).

[0208] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P44 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, R, Q e Xis são deletadas (um exemplo de P44 é a sequência NC_001416 ΔS, ΔR, Δxis-ea10, ΔQ).

[0209] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P45 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, R, Rz e Xis são deletadas (um exemplo de P45 é a sequência NC_001416 ΔS-C, Δxis-ea10).

[0210] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P46 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes R, Rz, Q e Xis são deletadas (um exemplo de P46 é a sequência NC_001416 ΔR, ΔRz, Δxis-ea10, ΔQ).

[0211] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P47 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, Rz, Q e Xis são deletadas (um exemplo de P47 é a sequência NC_001416 ΔS, ΔRz, Δxis-ea10, ΔQ).

[0212] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P48 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, R, Q, Xis e Int são deletadas (um exemplo de P48 é a sequência DE3 ΔS, ΔR, Δxis-ea10, ΔQ).

[0213] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P49 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, Rz, Q, Xis e Int são deletadas (um exemplo de P49 é a sequência DE3 ΔS, ΔRz, Δxis-ea10, ΔQ).

[0214] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P50 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes R, Rz, Q, Xis e Int são deletadas (um exemplo de P50 é a sequência DE3 ΔR, ΔRz, Δxis-ea10, ΔQ).

[0215] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P51 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, R, Q, Rz e Int são deletadas (um exemplo de P51 é a sequência DE3 ΔS-C, ΔQ).

[0216] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P52 corresponde à sequência NC_001416 em que as sequências codificadoras dos genes S, R, Rz, Q e Xis são deletadas (um exemplo de P52 é a sequência NC_001416 ΔS-C, Δxis-ea10, ΔQ).

[0217] De acordo com outra forma de realização, um fago geneticamente modificado da invenção P53 corresponde à sequência NC_001415 em que as sequências codificadoras dos genes Q, Xis e Int são deletadas (um exemplo de P53 é a sequência DE3 Δxis-ea10, ΔQ).

[0218] A presente invenção também diz respeito a um processo para a produção do fago modificado da invenção, em que o dito processo compreende pelo menos duas etapas de deleção dos genes.

[0219] Em uma forma de realização, o processo da invenção é realizado com um fago integrado no genoma de uma célula hospedeira.

[0220] Em uma forma de realização, a célula hospedeira é um microorganismo, preferivelmente um procariota, mais preferivelmente uma bactéria, mais preferivelmente uma bactéria de gram negativo. Vantajosamente, a célula hospedeira é uma bactéria a partir da família Enterobacteriacea de acordo com a taxonomia aplicável corrente. Se a taxonomia deve mudar, a pessoa habilitada deve conhecer como adaptar as mudanças na taxonomia para deduzir as cepas que devem ser usadas na presente invenção. Os exemplos de bactéria da família de Enterobacteriacea incluem, mas não estão limitados a, bactéria que pertence ao gênero Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella e Yersinia. De acordo com a forma de realização preferida, a célula hospedeira pertence ao gênero Escherichia e mais preferivelmente a célula hospedeira é Escherichia coli (E. coli).

[0221] Os métodos para a deleção dos genes a partir de um fago integrado são bem conhecidos da pessoa habilitada. Exemplos de tais métodos incluem, mas não limitado a recombinação homóloga (também denominado engenharia genética mediada por recombinação) usando os genes codificados por lambda Red: exo, bet e gam. Também é possível usar os genes recE e recT correspondentes a partir do profago Rac. Os genes exo e recE codificam um 5’-3’ exonuclease que produz projeção 3’. Os genes bet e recT codificam um par ou também denominado proteína de recozimento que liga-se a projeção 3’ e media seu recozimento e recombinação homóloga entre duas sequências de DNA complementar. O gene gam codifica um inibidor de E. coli RecBCD exonuclease e deste modo protege os fragmentos de DNA lineares de interesse. O método de engenharia genética mediada por recombinação foi bem descrito por diversas buscas incluindo Datsenko and Wanner (PNAS 97-12, 6640-6645, 2000) and Stewart et al (WO0104288). A princípio do método é gerar (pela Amplificação PCR por exemplo) um fragmento de DNA contendo o fragmento para integrar e dois membros de recombinação. Estes membros são homólogos às regiões adjacentes ao gene a ser inativados. Estes serão usados para alvejar a inserção do fragmento de interesse. É possível criar estes grupo do fragmento de DNA por PCR usando iniciadores contendo membros homólogas de 20 a 60 nucleotídeos.

[0222] A presente invenção também diz respeito a uma célula hospedeira que compreende o fago geneticamente modificado da invenção. Em uma forma de realização preferida, a célula hospedeira da invenção compreende o fago geneticamente modificado integrado neste genoma.

[0223] Em uma forma de realização, a célula hospedeira é um microorganismo, preferivelmente um procarioto, mais preferivelmente uma bactéria, mais preferivelmente uma bactéria de gram negativo. Vantajosamente, a célula hospedeira é uma bactéria a partir da família Enterobacteriacea de acordo com a taxonomia aplicável corrente. Se a taxonomia deve mudar, a pessoa habilitada deve reconhecer como adaptar as mudanças na taxonomia para deduzir as cepas que devem ser usadas na presente invenção. Exemplos da bactéria a partir da família Enterobacteriacea incluem, mas não limitado a, bactéria que pertence ao gênero Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella e Yersinia. De acordo com a forma de realização preferida, a célula hospedeira pertence ao gênero Escherichia e mais preferivelmente a célula hospedeira é Escherichia coli (E. coli). Exemplos das cepas de E. coli que deve ser usada na presente invenção inclui, mas não limitado a, cepas derivadas de E. Coli K-12, E. coli B ou E. coliW, tal como, por exemplo, MG1655, W3110, DG1, DG2, Top10, DH10B, DH5alpha, HMS174, BL21, BL21(DE3), HMS174(DE3), BL21(DE3) pLysS, BL21(DE3) pLysE.

[0224] Em uma forma de realização, genes das células hospedeiras podem ser inativados.

[0225] Em uma forma de realização, o gene tonA (também conhecido como fhuA, SEQ ID N°: 11) é inativado. A proteína TonA/FhuA é um receptor para os fagos T1, T5 e Phi80.

[0226] Em uma forma de realização, o gene galK (SEQ ID N°: 12) é inativado. A deleção deste gene permite o uso da seleção positiva/negativa galK para deleção dos genes pelo método com base na recombinação homóloga.

[0227] Em uma forma de realização, o gene araB (SEQ ID N°: 13) é inativado. Em outra forma de realização, o gene araA (SEQ ID N°: 14) é inativado. A inativação de araB e/ou araA é recomendada pelo uso do promotor PBAD (indutível por arabinose) dentro da célula hospedeira.

[0228] Em uma forma de realização, o gene lon (SEQ ID N°: 15) e/ou o gene ompT (SEQ ID N°: 16) são inativados. A proteína Lon é uma protease dependente de ATP. A proteína OmpT é uma protease de membrana externa. Preferivelmente, os genes lon e ompT são inativados.

[0229] Em uma forma de realização, o gene rcsA (SEQ ID N°: 17) é inativado. A proteína RcsA é um regulador positivo da síntese da cápsula, que é degradada pela protease Lon.

[0230] Em uma forma de realização, o gene hsdR (SEQ ID N°: 18) e/ou o gene mrr (SEQ ID N°: 19) são inativados. As proteínas HsdR e Mrr são enzimas de restrição com especificidade diferente. Preferivelmente, o genes hsdR e mrr são ambos inativados.

[0231] Em uma forma de realização, o gene endA (SEQ ID N°: 20) e/ou o gene recA (SEQ ID N°: 21) são inativados. EndA é um endonuclease específico por DNA. RecA é uma proteína recombinante com protease e atividade de nuclease. Preferivelmente, o genes endA e recA são ambos inativados.

[0232] Em uma forma de realização da invenção, pelo menos um dos genes tonA, galK, araB, araA, lon, ompT, rcsA, hsdR, mrr, endA e recA são inativados. Preferivelmente, os genes inativados são deletados.

[0233] Em uma forma de realização preferida, os genes tonA, galK, araB, lon, ompT, rcsA, hsdR, mrr, endA e recA são inativados. Preferivelmente, os genes tonA, galK, araB, lon, ompT, rcsA, hsdR, mrr, endA e recA são deletados.

[0234] Em uma forma de realização da invenção, a célula hospedeira da invenção é transformada com uma sequência de ácido nucléico codificando uma molécula tóxica, como descrito em US2004/0115811. A presença da sequência de ácido nucléico que codifica a molécula tóxica permitirá a seleção dos clones recombinantes tendo integrado um gene de interesse e uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína de antídoto funcional a uma molécula tóxica, em que os ditos clones recombinantes são que sobrevivem seguindo sua integração em uma célula hospedeira que compreende em seu genoma a sequência de nucleotídeo que codifica a dita molécula tóxica.

[0235] De acordo com a forma de realização preferida da presente invenção, a proteína de antídoto e a molécula tóxica são respectivamente, uma proteína anti- tóxica e uma proteína tóxica. A dita proteínas tóxicas ou anti-tóxicas devem ser proteínas de tipo selvagem ou proteínas modificadas que são naturalmente ou artificialmente tóxicas e afetam uma ou mais funções vitais de uma célula (preferivelmente, uma célula procariota) e pode levar a morte da célula.

[0236] A proteína de antídoto e a molécula tóxica são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste das proteínas CcdA/CcdB, proteínas Kis/Kid, proteínas Phd/Doc, proteínas RelB/relE, proteínas PasB (ou PasC)/PasA, proteínas mazF/mazE como descrito em US2004/0115811, ou qualquer outra ligação das moléculas tóxicas/não tóxicas que são ou não são origem de plasmídeo. A molécula tóxica também pode ser uma proteína de toxina sendo naturalmente ou artificialmente tóxica e afeta uma ou mais funções vitais de uma célula (procariota). A proteína codificada pelo gene sacB (de Bacillus amylolique-faciens), a proteína GpE, a proteína GATA-1 e a proteína Crp são outros exemplos de tais moléculas tóxicas. O gene sacB codifica a levan sucrase que catalisa a hidrólise da sucrose nos produtos são tóxicos por E. Coli (Pierce et al. Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 89, N[deg.]6 (1992) p. 2056-2060). A proteína GpE codifica os genes E a partir do bacteriofago [phi]X174 que inclui seis locais de restrição únicos e codificam gpE e que causam líse da célula E. Coli (Heinrich et al., Gene, Vol. 42(3) (1986) p. 345-349). A proteína GATA-1 foi descrita por Trudel et al. (Biotechniques 1996, Vol. 20(4), p. 684-693). A proteína Crp foi descrita por Schlieper et al. (Anal. Biochem. 1998, Vol. 257(2), p. 203-209).

[0237] As proteínas de antídoto para a dita molécula tóxica são qualquer proteína capaz de reduzir ou suprimir o efeito da molécula tóxica correspondente em uma célula (preferivelmente uma célula procariótica), quando a dita molécula tóxica é produzida pela dita célula.

[0238] De acordo com a forma de realização preferida, a célula hospedeira da invenção compreende uma sequência de ácido nucléico codificando uma proteína CcdB. O gene ccdB tem a sequência SEQ ID N°: 22.

[0239] A presente invenção também diz respeito a um kit que compreende uma célula hospedeira como em seguida descrita, em que o gene codificando uma proteína tóxica é inserido, e um plasmídeo realizando a sequência de ácido nucléico do gene que codifica a proteína anti-tóxica. A expressão da proteína anti-tóxica em uma célula hospedeira é requerida pela manutenção da viabilidade da célula hospedeira. Em uma forma de realização preferida, a proteína tóxica é codificada pelo gene ccdB e a proteína anti-tóxica é codificada pelo gene ccdA (SEQ ID N°: 23).

[0240] De acordo com uma forma de realização da invenção, o plasmídeo do kit ainda pode conter, ou pode ser modificado ainda para conter, a sequência de ácido nucléico da biomolécula de interesse.

[0241] A presente invenção também refere-se a um processo para preparar uma célula hospedeira como em seguida descrita.

[0242] Em uma forma de realização, o processo da invenção compreende uma etapa da infecção da célula hospedeira por um fago geneticamente modificado de acordo com a invenção. Em uma forma de realização da invenção, a dita etapa de infecção inclui o uso de um fago auxiliar. No significado da presente invenção, o termo “fago auxiliar” refere-se a um fago usado para complementar a deleção ou uma inativação de outro fago. O fago auxiliar fornecerá funções perdidas de outro fago a ser capaz de infectar bactéria ou para preparar o estoque do fago. Usualmente, o fago auxiliar não pode formar um lisogênio por si só porque este é cI menos (não tem repressor e é deste modo virulento).

[0243] O processo para infectar uma célula hospedeira com um fago usando um fago auxiliar é bem conhecido na técnica. A primeira etapa é a preparação dos lisados e a segunda é a lisogenização. Brevemente, os lisados bacterianos do fago auxiliar são preparados usando os métodos padrão como descrito em “Molecular cloning: a laboratory manual”, Sambrook et al (2001, ISBN 978-087969577-4) ou em “Large- and Small-Scale Preparation do bacteriofago lambda lysate and DNA”, Su et al, BioTechniques 25:44-46 (July 1998). A preparação do fago de interesse é feita usando o mesmo princípio, após a indução do fago (mais frequentemente usando a irradiação UV ou qualquer situação onde um lisogênio sofre dano de DNA ou a resposta SOS do hospedeiro ou produção Cro) a fim de começar o ciclo lítico e usar um fago auxiliar para fornecer as funções perdidas. Uma alternativa ao fago auxiliar é o uso de um plasmídeo que codifica as funções perdidas.

[0244] Em seguida, os lisados do fago são misturados com a bactéria alvejada e colocados nas placas LB a fim de criar lisogênios (como descrito em kit de lisogenização lambda DE3 de Novagen, User Protocol TB031 ou um método alternativo é descrito em Studier and Moffat, Journal of Molecular Biology, 1986, 189:113-130). Um fago de seleção pode ser usado para selecionar especificamente a bactéria contendo o fago de interesse. Este fago de seleção é um fago virulento tendo a mesma imunidade como o fago de interesse. Consequentemente, o fago de seleção é incapaz para formar as placas ou para matar os lisogênios de interesse por causa de seu fago produz o repressor cI (também denominado C2 em DE3 fago lambda).

[0245] A presente invenção deste modo também diz respeito a um kit que compreende o fago modificado da invenção, como em seguida descrito, e um fago auxiliar. Exemplos dos fagos auxiliares incluem, mas não limitado a, fago auxiliar B10 ou qualquer outro fago lambdóide com uma imunidade diferente do que o fago de interesse (exemplo: fago com imunidade 434, 80, ...). Alguns fagos auxiliares e suas manipulações foram bem descritas na literatura incluindo em Haldimann and Wanner (Journal of Bacteriology, 183, 6384-6393, 2001).

[0246] Em uma forma de realização, o processo para preparação de uma célula hospedeira da invenção ainda compreende uma etapa de deleção, em que a sequência de ácidos nucléicos da célula hospedeira são deletadas. Os métodos para a deleção da sequência de um gene são bem conhecidos por uma pessoa habilitada. O método mais eficiente é o método de recombinação homóloga mediado pelos genes codificados por lambda Red ou os genes recE e recT a partir do profago Rac.. Como descrito acima, este método foi bem descrito por diversas buscas incluindo Datsenko and Wanner (PNAS 97-12, 6640-6645, 2000) e Stewart et al (WO0104288). Os produtos de PCR são gerados usando iniciadores com extensões de 20- a 60-nt que são homólogos as regiões adjacentes ao gene a ser inativado. Visto que apenas uma quantidade menor da bactéria efetivamente recombinará o fragmento de interesse, é necessário ter um marcador de seleção forte para selecioná-lo. Os marcadores antibióticos podem ser usados para selecionar os recombinantes: os iniciadores modificados são usados para amplificar um gene de resistência antibiótico. Após transformação e ativação dos genes de recombinação, bactéria recombinante são selecionados no meio contendo o antibiótico apropriado. Neste caso, o gene alvejado é substituído por um gene de resistência ao antibiótico. A fim de usar a mesma estratégia para a próxima deleção, é necessário remover este gene de resistência ao antibiótico durante a segunda etapa. Como descrito em Datsenko and Wanner, é possível usar o gene de resistência ao antibiótico que é flanqueado pelos locais FRT (alvo de reconhecimento FLP). Os genes de resistência são então eliminados pelo uso de um plasmídeo auxiliar que codifica uma recombinase FLP. O gene de resistência ao antibiótico é removido pela recombinase específica por local mas este método deixa traços: um local de recombinação específica por local ainda é presente após a remoção do gene de resistência ao antibiótico.

[0247] Para evitar a presença deste local, mais preferivelmente, o método da invenção usa galK como um gene marcador. A princípio da seleção galK é descrita em Warming et al. (Nucleic acid research, 2005, 33(4)). Este método usa galK como um marcador de seleção positivo (desenvolvimento no meio mínimo contendo galactose) durante a primeira recombinação (inserção). A remoção deste marcador é realizado durante a segunda etapa da recombinação homóloga. Durante esta etapa, galK é usado como um marcador de seleção negativo no meio mínimo contendo 2- desóxi-galactose (DOG). O produto do gene galK, galactocinase, catalisa a primeira etapa no caminho de degradação de galactose. A Galactocinase também eficientemente catalisa a fosforilação do análogo de galactose DOG. O produto desta reação ainda não pode ser metabolizado, levando ao acúmulo da molécula tóxica (2- desóxi-galactose-1-fosfato). A vantagem deste método é evitar a presença do local de recombinação específica após deleção do gene alvejado e remoção do marcador de seleção.

[0248] A presente invenção também diz respeito a um processo para produzir uma biomolécula de interesse, que compreende - cultivar uma célula hospedeira que compreende o fago geneticamente modificado de acordo com a invenção e a sequência de ácido nucléico da biomolécula de interesse, - recuperar a biomolécula de interesse.

[0249] Em uma forma de realização da invenção, a sequência de ácido nucléico da biomolécula de interesse é compreendida dentro do sistema de expressão do fago geneticamente modificado. De acordo com esta forma de realização, a produção da biomolécula de interesse é direta, isto é resultados a partir da expressão do gene de um sistema de expressão, por exemplo, pela cultura em um meio em que o promotor compreendido em um sistema de expressão é induzido.

[0250] Em outra forma de realização da invenção, um sistema de expressão do fago geneticamente modificado compreende a sequência de ácido nucléico da polimerase T7 RNA sob o controle de um promotor lac, preferivelmente o promotor lacUV5. De acordo com esta forma de realização, o processo para a produção da biomolécula de interesse compreende a transformação da célula hospedeira com um plasmídeo que compreende a sequência de ácido nucléico da biomolécula de interesse sob o controle do promotor T7. A expressão a partir do promotor T7 está sob o controle de polimerase T7 RNA, que é estritamente específico pelo promotor T7, isto é o promotor T7 apenas pode ser utilizado pela polimerase RNA do bacteriofago T7. Quando IPTG é adicionado ao meio de cultura, polimerase T7 RNA é expressa pela transcrição a partir do promotor lac e permite a expressão da biomolécula de interesse.

[0251] No significado da presente invenção, o termo "promotor T7" inclui os promotores que estão presentes no genoma do bacteriofago T7, bem como sequências consenso e variantes de tais promotores com a capacidade de mediar a transcrição pela polimerase T7 RNA. O bacteriofago T7 contém dezessete sequências promotores diferentes, todos de que compreendem uma sequência de nucleotídeo altamente conservada.

[0252] De acordo com a forma de realização preferida, o plasmídeo que compreende a sequência de ácido nucléico da biomolécula de interesse também compreende a sequência de ácido nucléico de ccdA e a célula hospedeira compreende a sequência de ccdB integrado neste genoma. Portanto, apenas os clones recombinantes contendo o plasmídeo são propagados.

[0253] De acordo com uma forma de realização, a biomolécula de interesse é secretada pela célula hospedeira no caldo de fermentação. De acordo com esta forma de realização, a biomolécula de interesse pode ser facilmente recuperado a partir do caldo de fermentação.

[0254] De acordo com outra forma de realização, a biomolécula de interesse não é secretada pela célula hospedeira no caldo de fermentação. Os métodos para recuperação de uma biomolécula de interesse intracelular são bem conhecidos na técnica. Exemplos de tal método incluem, mas não limitado a, o uso do ácido tricloroacético (TCA) ou tampão de craqueamento contendo sulfato de dodecil sódico (SDS) para recuperar as proteínas citoplásmicos totais nas condições de desnaturação ou o uso da sonificação, pressão French ou equivalente para romper a bactéria sob pressão a fim de recuperar as proteínas citoplásmicas totais nas condições naturais (não desnaturação). Em seguida, a proteína de interesse pode ser purificada usando os métodos específicos incluindo mas não limitado ao uso da afinidade ou colunas trocadoras de íon.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0255] A Figura 1: imagem de um gel SDS-Page corado Coomassie blue, mostrando a produção de uma proteína de interesse. 1 e 6: tamanho; 2: precipitado [pScherry1] M11DE3 antes da indução; 3: precipitado [pScherry1] M11DE3 após indução; 4: precipitado [pScherry1] HMS174DE3 antes da indução; 5: precipitado [pScherry1] HMS174DE3 após indução. O ensaio é para indentificar a proteína de interesse.

EXEMPLOS

[0256] A presente invenção ainda é ilustrada pelos seguintes exemplos. Exemplo 1: Deleção dos genes xis, exo, bet, gam, kil, cIII, N e ral a) Deleção da região de DNA xis DNA e substituição por galK

[0257] Primeiro o gene galK foi amplificado pela reação de cadeia de polimerase (PCR) no plasmídeo pGalK usando os iniciadores XisgalKstart (5’ GGGGGTAAATCCCGGCGCTCATGACTTCGCCTTCTTCCCAGAATTCCTGTTGAC AATTA 3’, SEQ ID N°: 24) e interrupção XisgalK (5’ GTTCTGATTATTGGAAATCTTCTTTGCCCTCCAGTGTGAGCAGCACTGTCCTGCT CCTTG 3’, SEQ ID N°: 25). Estes iniciadores contém na extremidade 5’ uma sequência de 40 bases idênticas ao alvo de DNA (grifados). Estas sequências de 40 bases são os membros de recombinação. As extremidades 3’ foram projetadas para amplificar o gene galK e seu promotor constitutivo. O fragmento de DNA amplificado por PCR (1315 bp) alvejam os genes xis, exo, bet, gam, kil e cIII (fragmento de DNA de 5133 bp): estes genes foram substituídos durante a recombinação homóloga pelo gene galK e seu promotor. A bactéria eletrocompetente realizando um profago T7(DE3) e o plasmídeo pKD46 foi preparada de acordo com Datsenko and Wanner (PNAS 97-12, 6640-6645, 2000). Em seguida, o fragmento galK amplificado foi submetido a eletroporação nesta bactéria de acordo com os procedimentos padrão (200 ng do fragmento de DNA foi usado para cada eletroporação). O meio SOC foi adicionado e a bactéria foi incubada durante 1 hora a 37° C. Em seguida, as bactérias foram lavadas (centrifugadas, remoção do meio, adição do meio fresco e recolocadas em suspensão) duas vezes com meio mínimo M9 (Sambrook et al (2001, ISBN 978087969577-4)) e colocados nas placas bacterianas contendo meio mínimo M9 e 1 % de galactose. As placas foram incubadas a 37° C durante 1 ou 2 dias.

[0258] A próxima etapa foi avaliação bacteriana: avaliação PCR foi realizada diretamente nas colônias usando os iniciadores Xis1 (5’GTCTTCAAGTGGAGCATCAG3’, SEQ ID N°: 26) e Xis4 (5’ACCAGGACTATCCGTATGAC3’, SEQ ID N°: 27). Uma amplificação de um fragmento 5774 bp de DNA corresponde a um cromossomo não modificado (colônia não recombinante) e, pelo contrário, uma amplificação de um fragmento de DNA 1955 bp que correspondente a um cromossomo recombinante. As bactérias permitem a amplificação do fragmento de DNA 1955 bp foram selecionadas e riscadas duas vezes nas placas seletivas (meio mínimo M9 suplementado com 1 % de galactose) a fim de purificar e para remover as cópias não modificadas possíveis do cromossomo. A avaliação PCR foi feita mais vezes no final da etapa de purificação e 3 bactérias permitem a amplificação do fragmento de DNA 1955 bp que foram selecionados. Os fragmentos de DNA amplificados correspondem a estas bactérias que foram sequenciadas usando os mesmos iniciadores a fim de confirmar a recombinação de DNA e a deleção da região de DNA Xis DNA (genes xis, exo, bet, gam, kil e cIII). b) Remoção GalK

[0259] Um fragmento de DNA contendo membros de recombinação amplo (of 350bp and 343 bp) foi construído por PCR para remover os genes galK e o N e ral. O primeiro membro foi amplificado por PCR em colônias bacterianas contendo o profago T7(DE3) usando-se os iniciadores Xis1 e Xis2 (5’CCAAACGGAACAGATGAAGAAGGCGAAGTCATGAG3’, SEQ ID N°: 28). Um fragmento de DNA de 365 bases foi amplificado. O segundo membro também foi realizado por PCR na mesma bactéria usando-se os iniciadores Xis3 (5’ GACTTCGCCTTCTTCATCTGTTCCGTTTGGCTTCC3’, SEQ ID N°: 29) e Xis6 (5’ GTAATGGAAAGCTGGTAGTCG3’, SEQ ID N°: 30). Um fragmento de DNA de 358 bases foi amplificado. Ambos os membros de recombinação foram purificados após a eletroforese em gel de agarose. Os iniciadores Xis2 e Xis3 foram projetados para gerar fragmentos de DNA contendo uma sequência idêntica de 30 pares de base. Esta sequência foi usada para unir os dois braços de recombinação em um terceiro PCR usando-se iniciadores Xis1 e Xis6 . Um fragmento de DNA de 693 pb foi gerado. Este fragment de DNA foi eletroporado em bactérias seleccionadas acima e realizando um plasmídeo pKD46 (preparado como descrito in Datsenko and Wanner). Meio SOC foi adicionado e as bactérias foram incubadas a 37° C durante 1 hora. Em seguida, as bactérias foram lavadas duas cezes com meio M9 e colocadas em placas NAS seletivas contendo meio M9 suplementado com 0,2% de glicerol e 1% DOG. As placas foram incubadas durante 2 dias a 37° C. Diversa colônias foram avaliadas por PCR usando-se os iniciadores Xis5 (5’ CAGCCGTAAGTCTTGATCTC3’, SEQ ID N°: 31) and Xis7 (5’CAGCAGGCATGATCCAAGAG3’, SEQ ID N°: 32). Uma amplificação de 3246bp correspondente ao cromossomo de DNA não modificado foi sempre obtido em vez de uma aplificação de 1122bp correspondente ao cromossomo modificado. O experimento foi reproduzido de maneira completa e independente três vezes sem sucesso: nenhuma bactéria compreendendo a deletaão desejada foi obtida.

[0260] Consequentemente, decidimos remover apenas o fragmento GalK e deixar os genes N e ral. O fragmento de DNA contendo os memvros de recombinação foi gerado como descrito acima usando-se Xis,1 Xis2b (5’ TTTGCCCTCCAGTGTGAAGAAGGCGAAGTCATGAG3’, SEQ ID N°: 33) para o primeiro membro de recombinação (365bp) e Xis8 (5’ CTCATGACTTCGCCTTCTTCACACTGGAGGGCAAAGAAG, SEQ ID N°: 34) e Xis4 para o segundo membro de recombinação (384bp). O PCR de união foi realizado usando-se os iniciadores Xis1 e Xis4 iniciadores e gerou um fragmento de DNA de 714bp. Este fragmento foi submetido à eletroporação como descrito acima nas bactérias selecionadas e realizando-se um plasmídeo de pKD46. As bactérias foram colocadas nas mesmas placas seletivas contendo DOG e incubadas durante dois dias a 37° C. A avaliação por PCR foi realizada usando-se os iniciadores Xis5 e Xis6. As bactérias que mostram uma amplificação de 1770bp (em vez de uma amplificação de 3010bp correspondente ao cromossomo não modificado) foram selecionadas e purificadas. O fragmento de DNA foi sequenciado usando-se os iniciadores Xis5 e Xis6 iniciadores e mostraram a remoção correta do gene galK. Esta combinação foi realizada apenas uma vez visto que as bactérias foram obtidas imediatamente.

[0261] Estes resultados mostram que não foi possível remover o galK associado aos genes N e ral usando-se recombinação homóloga. Entretanto, usando-se exatamente o mesmo procedimento, fomos capazes de remover o galK sozinho.

[0262] Em conclusão, demonstramos que a remoção dos genes N e ral levam à morte da bactéria, o que foi inesperado. Exemplo 2: Expressão de proteína usando-se MG1655

[0263] A fim de testar uma eficiência de produção de proteína da cepa construída de acordo com a invenção, o teste de expressão em escala pequena foi realizado usando-se bactérias denominadas M11(DE3). O genotipo desta cepa é MG1655 ΔgalK, ΔrcsA, Δlon, ΔhsdR-mrr, ΔfhuA, ΔendA, ΔrecA, ΔaraB, ΔompT, À-DE3 (T7pol, Δxis-ea10, ΔS-C). Visto que MG1655 é um Escherichia coli K-12, foi comparado com outra cepa de K-12 usada como um padrão no campo da produção de proteína e denominada HSM174(DE3) (genotipo: recA1, hsdR, À-DE3, (Rif R)). Ambas as cepas foram transformadas com o DNA de plasmídeo pSCherry1 (Delphi Genetics, Bélgica). Este plasmídeo codifica uma proteína denominada “cherry” facilmente detectável (por olhos, cor vermelha) sob o controle do promotor T7.

[0264] Protocolo para uma expressão em escala pequena usando-se IPTG: i .Dois frascos Erlenmeyer contendo 10 ml de meio LB foram inoculados, cada um com uma colônia simples de HMS174 (DE3) e o M11(DE3) que carrega o plasmídeo pSCherry1 e incubado a 30° C durante a noite. ii .Dois novos frascos contendo meio fresco foram inoculados com 1 ml das culturas durante a noite e incubados com agitação a 37° C até OD600 atingir 0,6. iii .Uma amostra (1 ml) de cada frasco foi retirada e centrifugada. O meio foi descartado e o granulo foi mantido em gelo. As amostras foram os controles não induzidos. Para induzir a expressão da proteína na cultura remanescente, IPTG (isopropil e-D-1-tiogalactopiranosídeo, 90 μl de uma solução de estoque de 100 mM fresca) foram adicionados para atingir uma concentração final de 1 mM, em dois frascos. A incubação de ambos os frascos foi continuada durante 4 horas. iv .No final do período de indução, a densidade óptica a 600 nm foi medida para cada uma das culturas (1,09 para M11 (DE3) e 1,13 para HMS174 (DE3)). Uma amostra de 1 ml de cada frasco foi centrifugada em velocidade máxima (13000 g) durante 10 min a 4° C. Observou-se que o precipitado foi vermelho de acordo com uma expressão da proteína Cherry. O sobrenadante foi descartado e 100 μl de água foi adicionado para recolocar as bactérias em suspensão. 100 ul de tampão de "craqueamento" (100 mM de DTT, 2 % de SDS, 80 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 0,006 % de azul de bromofenol, 15 % de glicerol) também foi adicionado para lisar as bactérias. As amostras não induzidas foram tratadas com o mesmo protocolo exceto que apenas 60 μL de água e 60 μL de tampão de craqueamento foram usados (de acordo com a densidade óptica das amostras). v .as amostras foram aquecidas de 70° C a 100° C (10 minutos) para recolocar em suspensão todas as proteínas e para desnaturar as proteínas. vi .10 μl de cada amostra foi carregada em 12 % de gel de SDS-PAGE gel e migrado durante migradas durante 2 horas a 100 Volt. vii .Após a migração, as proteínas foram coloridas com tingimento com Coomassie-blue.

[0265] Como mostrado na Figura 1, ambas as cepas foram capazes de produzir a proteína de interesse (proteína Cherry, indicada pela disposição) mas a produção é de cerca de 5 a 10 vezes maior usando-se M11(DE3) do que usando-se HMS174(DE3). O experimento foi realizado duas vezes com exatamente os mesmos resultados. Exemplo 3: expressão de proteína usando-se BL21(DE3)

[0266] As cepas BL21 (DE3) deletadas de Δxis-ea10 e/ou ΔS-C foram construídas de acordo com o exemplo 1. A deleção ΔS-C foi inserida no cromossomo das bactérias (em lambda DE3 deletado do gene Int e que codifica uma T7 RNA polimerase) sozinho ou em combinação com a deleção Δxis-ea10. Dois derivados BL21 (DE3) foram, deste modo, construídos: BL21(DE3) ΔS-C e BL21(DE3) Δxis-ea10, ΔS-C. As deleções foram confirmadas pela amplificação de PCR da região modificada e esta região foi sequenciada. Esta etapa de sequenciamento confirmou a presença das deleções correspondentes de acordo com as sequências teóricas. Em seguida, as bactérias construídas foram testadas quanto à expressão de proteína usando-se dois plasmídeos diferentes que codificam a proteína cherry (pSCherry1 e pSSC-Cherry1, Delphi Genetics) de acordo com exemplo 2. Os resultados mostraram claramente a super-expressão do gene que codifica a proteína. Esta proteína foi facilmente detectada pelos olhos e na análise de SDS-PAGE.

[0267] Deste modo, concluímos que estas bactérias são capazes de super- produzir proteínas sem o risco de lise bacteriana indesejada devido ao fago lambda DE3 por causa deste fago ser pelo menos deletado dos genes int, S, R e Rz que codificam funções requeridas para a excisão de fago e lise bacteriana.

[0268] Visto que a lise bacteriana durante a proteína depende de diversos parâmetros incluindo parameters incluindo condições de desenvolvimento, proteína super-expressa,... projetamos uma cepa modelo para mostrar que as cepas construídas são resistentes à lise devido às deleções genéticas específicas. Em fago lambda, é requerido ter uma expressão constitutiva do repressor CI a fim de reprimir o desenvolvimentio lítico e para manter o estado lisogênico do profago. Um mutante (CI857) deste repressor é bem conhecido devido à sua capacidade de ser termossensível: a 30°C, o repressor mutado é totalmente ativo e este mantém o estado lisogênico. Entretanto, em temperatura mais alta (37° C a 42° C), o CI857 não é eficiente e induz o estado lítico do fago lambda. As cepas que carregam esta mutação de CI857 e as deleções de acordo com a invenção foram construídas: BL21(DE3) ΔS-C que corresponde a uma cepa BL21 que compreende P41; BL21(DE3) Δxis-ea10 e ΔS-C que corresponde a uma cepa BL21 que compreende P11; BL21(DE3) Δxis-ea10, ΔS-C e ΔQ que corresponde a uma cepa BL21 que compreende P13; BL21 (DE3) ΔQ que corresponde a uma cepa BL21 que compreende P15 e BL21(DE3) Δxis-ea10 e ΔQ que corresponde a uma cepa BL21 que compreende P53.

[0269] Mudando-se a temperatura a 42° C, o estado lítico é induzido. Nenhuma lise foi observada para as cepas da invenção. Além disso, observamos que o rendimento da produção da proteína de interesse (proteína cherry) foi melhorado para as cepas da invenção em comparação com o controle.

Claims (12)

1. Célula hospedeira bacteriana compreendendo um fago geneticamente modificado, caracterizadopelo fato de que - o fago é o fago lambda, o fago 434, o fago phi80, o fago phi81, o fago HK97, ou o fago P21, - um sistema de expressão é inserido, dito sistema de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína, dita proteína induzindo ainda a expressão de uma biomolécula de interesse, - os genes Int, S, R, Rz, Xis são inativados, - a célula hospedeira bacteriana é E. coli, e em que dito fago geneticamente modificado é integrado no genoma da dita célula hospedeira bacteriana.

2. Célula hospedeira bacteriana de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o gene Q do fago geneticamente modificado é inativado.

3. Célula hospedeira bacteriana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que o sistema de expressão é indutível.

4. Célula hospedeira bacteriana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de que o sistema de expressão é o sistema de expressão T7.

5. Célula hospedeira bacteriana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadopelo fato de que o dito fago é um dos fagos P11 ou P53.

6. Kit, compreendendo o fago geneticamente modificado caracterizadopelo fato de que - o fago é o fago lambda, o fago 434, o fago phi80, o fago phi81, o fago HK97, ou o fago P21, - um sistema de expressão é inserido, dito sistema de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína, dita proteína induzindo ainda a expressão de uma biomolécula de interesse, e os genes Int, S, R, Rz, Xissão inativados.

7. Célula hospedeira bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira E. coli é BL21.

8. Célula hospedeira bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7, caracterizada pelo fato de que ainda compreende a inativação de pelo menos um dos genes tonA, galK, araB, araA, lon, ompT, rcsA, hsdR, mrr, endA e recA.

9. Célula hospedeira bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7 a 8, caracterizada pelo fato de que dita célula hospedeira compreende a inserção do gene ccdb.

10. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a célula hospedeira bacteriana, tal como definida na reivindicação 9 e um plasmídeo que compreende o gene ccdA.

11. Processo para preparar a célula hospedeira bacteriana, tal como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7 a 9, compreendendo infectar uma célula hospedeira bacteriana com um fago geneticamente modificado caracterizado pelo fato de que - o fago é o fago lambda, o fago 434, o fago phi80, o fago phi81, o fago HK97, ou o fago P21, - um sistema de expressão é inserido, dito sistema de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína, dita proteína induzindo ainda a expressão de uma biomolécula de interesse, e os genes Int, S, R, Rz, Xis são inativados.

12. Processo para produzir uma biomolécula de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas cultivar uma célula hospedeira bacteriana tal como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7 a 9, em que dita célula hospedeira compreende a sequência de ácido nucléico da biomolécula de interesse, recuperar a biomolécula de interesse.

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