JP7194711B2

JP7194711B2 - タンパク質を産生させるために改善した宿主細胞

Info

Publication number: JP7194711B2
Application number: JP2020105496A
Authority: JP
Inventors: スピアラー，セドリック; カブレンヌ，ジョナサン; ミシェル，ベンジャミン
Original assignee: アール．ピー．シェーラーテクノロジーズ，エルエルシー
Priority date: 2014-07-25
Filing date: 2020-06-18
Publication date: 2022-12-22
Anticipated expiration: 2035-07-24
Also published as: AU2015293825A1; EP3172334A1; EP3172334B1; AU2015293825B2; JP2022162124A; JP7126824B2; BR112017001463A2; CL2017000200A1; JP2020202828A; CA2956107A1; WO2016012607A1; CN106715681A; ES2903413T3; US10718001B2; JP2017523780A; US20170211118A1; CN106715681B

Description

本発明は、組み換えタンパク質の産生のための異種系に関する。特に本発明は、改善した毒性－解毒性の系に基づきタンパク質を産生させるための方法に使用する宿主細胞に関する。

現在微生物は、タンパク質またはＤＮＡの産生に広く使用されている。通常、これらの工程は、発現させる遺伝子を有するベクターとしての細菌性プラスミドの使用を必要とする。しかしながら微生物内でのプラスミドの維持は限定されており、よってプラスミドの不安定さが、組み換えタンパク質の産生またはＤＮＡの産生において重要な懸念を提示している。

プラスミド担持細胞の増殖速度は、プラスミドを含まない細胞の増殖速度と比較して有意に減少していることが証明されている。１つの理論として、プラスミドの複製、転写、およびタンパク質の産生が、細胞の代謝にとって有意な負担を表すとの理論がある。よって培養工程では、プラスミドを失った細胞は、プラスミドをまだ有する細胞よりも高い適応度を呈しており、細菌集合において前者は後者を急激に上回る。

細胞集合でのプラスミドの減少を制限するため、およびプラスミドを含まない細胞の生存を避けるため、および培養物を支配するために、選択可能なマーカーがプラスミドに挿入された。

培養工程で使用される最も一般的な選択可能なマーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。しかしながら、抗生物質（または抗生物質耐性をコードする遺伝子）による産物またはバイオマスの混入は、医学または制御の観点から許容できるものではない。さらに抗生物質耐性遺伝子は、この環境で増殖する場合があり、または病原性株となる場合がある。さらに、近年の研究では、組み換えタンパク質を産生させるために抗生物質耐性遺伝子を使用することは、タンパク質の産生の収率を著しく下げることが例証されている（Ｐｅｕｂｅｚｅｔａｌ．，ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｅｌｌｆａｃｔｏｒｉｅｓ，２０１０，９：６５）。

よって、プラスミドの維持を可能にし、抗生物質耐性遺伝子の欠点のない他の系が必要とされている。

抗生物質遺伝子の使用の代替例として、プラスミドに挿入した野生型のアレイによる変異した重要な染色体遺伝子の補完がある。たとえば、変異宿主がこの機能を提供する遺伝子を担持するプラスミドなしでは必須アミノ酸を合成することができない系が開発された。しかしながらこの手法は、増殖培地において可能な選択肢を著しく限定する。

開発された別の戦略は、プラスミド媒介型リプレッサーの量を調節することによって、ｌａｃオペレーターの制御下に置かれた重要な染色体遺伝子の抑制に打ち勝つ系である。しかしながらこの手法は、以下：（ｉ）Ｌａｃプロモーターをタンパク質の発現などの他の目的に利用できなくさせる、（ｉｉ）系が、Ｌａｃプロモーターが機能的である大腸菌または他の細菌に限定される、および（ｉｉｉ）ラクトースを含む培地を回避しなければならない、といった限定を有する。

抗生物質耐性遺伝子の使用の別の代替的な系は、解毒剤と組み合わせた毒性タンパク質（すなわち宿主細胞にとって毒性である分子）の対に基づくものである。たとえば毒性遺伝子は、染色体の複製物から宿主細胞により発現し得、解毒剤はプラスミドにより保有されている。よって、プラスミドの存在が宿主細胞の生存にとって必要となる。対の毒素／解毒剤の例として、ｃｃｄＡ（解毒剤）／ｃｃｄＢ（毒素）系がある。ＣｃｄＡおよびＣｃｄＢは、Ｅ．ｃｏｌｉＦプラスミドによりコードされた解毒性タンパク質および毒性タンパク質である。共にこれらは、Ｆの複製物を受領しない娘細胞の死を確実にする。ｃｃｄＢタンパク質の発現は、ＤＮＡギラーゼの再結合ステップに干渉し、宿主細胞の染色体が断片に切断される。解毒剤／毒素の対の他の例として、限定するものではないが、Ｋｉｓ／Ｋｉｄタンパク質、Ｐｈｄ／Ｄｏｃタンパク質、ＲｅｌＢ／ｒｅｌＥタンパク質、ＰａｓＢ（またはＰａｓＣ）／ＰａｓＡタンパク質、ｍａｚＦ／ｍａｚｅタンパク質が挙げられる。

解毒性／毒性の系は、たとえば米国特許第８，４７０，５８０号に記載されるクローニング方法（毒素をコードする遺伝子を含む宿主細胞を、対応する解毒剤をコードする遺伝子を含むプラスミドと組み合わせて使用する）で広く使用されている。よってこの系は、解毒遺伝子を発現する細胞のみが生存するため、対象の統合された遺伝子を有する細胞の直接的な選択を可能にする。

またこの系は、本発明者らによって従来より記載されているように、タンパク質の産生に使用されている（ＳｚｐｉｒｅｒａｎｄＭｉｌｉｎｋｏｖｉｔｃｈ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００５，３８（５）：７７５－７８１）。予想外なことに、３～５倍の組み換えタンパク質の産生レベルの増加が観察され、このことから、組み換えタンパク質の産生に関するこの系の顕著な将来性が証明された。

しかしながら本発明者らは、この系が毒性タンパク質の産生に使用される場合、たとえば対象の遺伝子内の変異、解毒性／毒性の系の変異などといったいくつかの欠点が現れる場合があることを観察した。改善したプラスミド安定化の系を開発するために、本発明者らは、毒性遺伝子の１つの複製物と組み合わせた解毒遺伝子の１つの複製物を含む従来の系を改変した。驚くことに、かつ予想外に、本発明者らは、宿主細胞のゲノムの毒性遺伝子の追加的な複製物の挿入がプラスミドの安定性を上げ、さらにはタンパク質の産生収率をも（相関しない方法で）上げることをも示した。

よって本発明は、対象の組み換えペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を産生する宿主細胞であって、毒性タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも２つの複製物を含む、宿主細胞に関する。一実施形態では、上記少なくとも２つの複製物は、毒性タンパク質に対する解毒性タンパク質をコードする核酸配列と異なるレプリコンにある。一実施形態では、毒性タンパク質は、配列番号１または配列番号１と少なくとも７５％の同一性を有するいずれかの核酸配列によりコードされているＣｃｄＢである。

一実施形態では、宿主細胞は、毒性タンパク質に対する解毒性タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも１つの複製物をさらに含む。一実施形態では、上記解毒性タンパク質は、配列番号１３または配列番号１３と少なくとも７５％の同一性を有するいずれかの核酸配列によりコードされているＣｃｄＡである。

一実施形態では、解毒性タンパク質をコードする核酸配列は、対象の組み換えペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列が挿入されている、または挿入され得る発現系をさらに含むプラスミドにより、保有されている。一実施形態では、上記発現系は、Ｔ７プロモーター、Ｐｔｒｃ、Ｐａｒａ、およびＰｌａｃを含む群から選択されるプロモーターを含む。別の実施形態では、上記発現系はＴ７プロモーターを含み、宿主細胞は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、好ましくはゲノムに挿入されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、より好ましくはＴ７発現系におけるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をさらに含む。別の実施形態では、発現系は、Ｔ７プロモーターを含み、宿主細胞は、ゲノムの中に挿入された遺伝子改変したファージをさらに含み、好ましくは、上記ファージは、
Ｔ７発現系が挿入されており、
Ｓ、Ｒ、および／またはＱ遺伝子が不活性化されており、
Ｉｎｔおよび／またはＸｉｓ遺伝子が不活性化されている
ファージとして定義されている。

一実施形態では、宿主細胞は細菌、好ましくはグラム陰性細菌、より好ましくは腸内細菌科、さらにより好ましくは大腸菌である。一実施形態では、本発明の宿主細胞は、遺伝子ｔｏｎＡ、ｇａｌＫ、ａｒａＢ、ａｒａＡ、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ、ｒｃｓＡ、ｈｓｄＲ、ｍｒｒ、ｅｎｄＡ、およびｒｅｃＡのうちの少なくとも１つの不活性化をさらに含む。一実施形態では、本発明の宿主細胞は、ｇｙｒＡ遺伝子の少なくとも１つの追加的な複製物をさらに含む。

また本発明は、上述の宿主細胞と、解毒性タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも１つの複製物および対象の組み換えペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列が挿入されている、または挿入され得る発現系の少なくとも１つの複製物を含むベクターとを含むキットに関する。一実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列は、Ｔ７プロモーター、Ｐｔｒｃ、Ｐａｒａ、およびＰｌａｃを含む群から選択されるプロモーターの制御下にある。

本発明の別の目的は、対象の組み換えペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を産生させる方法であって、上述の宿主細胞を培養することと、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を回収することとを含む、方法である。一実施形態では、組み換えタンパク質は、分泌タンパク質、膜貫通タンパク質、または細菌株にとって毒性であるタンパク質である。

定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
本明細書中で使用される場合、「ペプチド」は、ペプチド結合により共に結合されている５０個未満のアミノ酸の直鎖状ポリマーを表し、「ポリペプチド」は、ペプチド結合により共に結合されている少なくとも５０個の直鎖状のポリマーを表し、タンパク質は、具体的には、１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドおよび任意に非ポリペプチド補因子により形成されている、機能的な実体を表す。

「組み換えペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質」は、組み換えＤＮＡから、すなわち産生宿主細胞に人工的に挿入されたＤＮＡから作製されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を表す。

「毒性タンパク質」は、当該毒性タンパク質を産生する宿主細胞にとって毒性であるタンパク質を表す。よって、本明細書中で使用される場合、毒性タンパク質は、本発明の宿主細胞にとって毒性である。

詳細な説明
本発明は、組み換えペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を産生する宿主細胞であって、毒性タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも２つの複製物を含む宿主細胞に関する。一実施形態では、宿主細胞は、毒性タンパク質をコードする核酸配列の２つの複製物、またはこの核酸配列の３、４、５、もしくは６個の複製物（もしくはそれ以上）を含む。

毒性タンパク質の例として、限定するものではないが、ＣｃｄＢ、Ｋｉｄ、Ｄｏｃ、ＲｅｌＥ、ＰａｓＡ、ＭａｚＥ、または、たとえばプラスミド由来もしくはプラスミド由来ではないバクテリオシンなどの他のいずれかの毒性分子が挙げられる。また、毒性タンパク質は、天然または人工的に毒性の毒性であり、細胞（原核細胞）の１つまたは複数の重要な機能に影響を与える毒性タンパク質とすることができる。遺伝子ｓａｃＢ（バシラス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ－ｆａｃｉｅｎｓ）由来）によりコードされるタンパク質、タンパク質ＧｐＥ、タンパク質ＧＡＴＡ－１、およびタンパク質Ｃｒｐは、このような毒性分子の他の例である。遺伝子ｓａｃＢは、大腸菌に毒性である産物へのスクロースの加水分解を触媒するレバンスクラーゼをコードする（Ｐｉｅｒｃｅｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．８９，Ｎ［ｄｅｇ．］６（１９９２）ｐ．２０５６－２０６０）。タンパク質ＧｐＥは、６個の固有の制限部位を含むバクテリオファージφＸ１７４由来のＥ遺伝子によりコードされている。ＧｐＥによって、大腸菌細胞の溶解がおきる（Ｈｅｉｎｒｉｃｈｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．４２（３）（１９８６）ｐ．３４５－３４９）。タンパク質ＧＡＴＡ－１は、Ｔｒｕｄｅｌらにより説明されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９９６，Ｖｏｌ．２０（４），ｐ．６８４－６９３）。タンパク質Ｃｒｐは、Ｓｃｈｌｉｅｐｅｒらにより説明されている（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，Ｖｏｌ．２５７（２），ｐ．２０３－２０９）。

好ましくは、本発明の宿主細胞は、少なくとも２つ、好ましくは２つの、タンパク質ＣｃｄＢをコードする核酸配列の複製物を含む。一実施形態では、タンパク質ＣｃｄＢをコードする核酸配列は、ｃｃｄＢ遺伝子（配列番号１）、または配列番号１と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の同一性を有する機能的なＣｃｄＢタンパク質をコードするいずれかの配列である。

一実施形態では、毒性タンパク質（好ましくはＣｃｄＢ）をコードする核酸配列の少なくとも２つの複製物は、２つの複製物間の組み換え事象を回避するために、１００％の同一性を有さない（たとえば約３０％、好ましくは約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の同一性を有する）。

一実施形態では、毒性タンパク質（好ましくはＣｃｄＢ）をコードする核酸配列の少なくとも２つの複製物は、異なる起源由来（たとえば少なくとも２つの細菌種由来）であり、または第１の複製物はプラスミド由来であり、第２の複製物は染色体由来である。たとえば、ＣｃｄＢの第１の複製物は、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７由来であってもよく、ＣｃｄＢの第２の複製物は、Ｆプラスミド由来であってもよい。

一実施形態では、少なくとも２つの毒性タンパク質は１００％同一ではあるが、１００％の同一性を有さない核酸配列によりコードされている（すなわちこれら核酸配列は、所定のアミノ酸をコードするコドンが、同一のアミノ酸をコードする別のコドンにより置換されるなどの、非コード的な差異により異なる）。

一実施形態では、少なくとも２つの毒性タンパク質は、１００％同一性ではない（たとえば約３０％、好ましくは約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、またはそれ以上の同一性を有する）が、これら毒性タンパク質の作用は同一の解毒剤により相殺され得る。

一実施形態では、毒性タンパク質（好ましくはＣｃｄＢ）をコードする核酸配列の少なくとも２つの複製物は、１００％の同一性を有さないが、たとえばＧｕｇｌｉｅｌｍｉｎｉら（ＢＭＣＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２００８，８：１０４）に記載されるプログラムＴＡＱＶ１．０を使用したｉｎｓｉｌｉｃｏでの解析にしたがって、保存された推定ドメインがこの両方に含まれる。一実施形態では、毒性タンパク質をコードする核酸配列の第２の複製物は、第１の複製物に関連しており、プログラムＴＡＱＶ１．０を使用して同定された推定上の毒性タンパク質である。一実施形態では、毒性タンパク質をコードする核酸配列の第１の複製物はＣｃｄＢであり、第２の複製物は、Ｇｕｇｌｉｅｌｍｉｎｉｅｔａｌ．，２００８によるプログラムＴＡＱＶ１．０を使用して同定された２２個のｉｎｓｉｌｉｃｏで推測されたＣｃｄＢの毒素から選択される。

本発明の一実施形態では、毒性タンパク質（好ましくはＣｃｄＢ）をコードする核酸配列の少なくとも２つの複製物は、対応する解毒性タンパク質をコードする核酸配列と異なるレプリコンの上、すなわち対応する解毒性タンパク質をコードする核酸配列を含まないレプリコンの上にある。特に、この実施形態では、プラスミドＦの少なくとも２つの複製物を含む宿主細胞（プラスミドＦは、毒性タンパク質をコードする核酸配列と解毒性タンパク質をコードする核酸配列との両方を含むレプリコンを含む）は、本発明の一部ではない。

一実施形態では、毒性タンパク質（好ましくはＣｃｄＢ）をコードする核酸配列の少なくとも２つの複製物は、同一のレプリコンの上にある。別の実施形態では、毒性タンパク質（好ましくはＣｃｄＢ）をコードする核酸配列の少なくとも２つの複製物は、少なくとも２つの別々のレプリコンの上にある。

一実施形態では、毒性タンパク質（好ましくはＣｃｄＢ）をコードする核酸配列の少なくとも２つの複製物のうちの少なくとも１つは、プラスミドの上にある。別の実施形態では、毒性タンパク質（好ましくはＣｃｄＢ）をコードする核酸配列の少なくとも２つの複製物は、プラスミド上にある。

本発明の一実施形態では、毒性タンパク質（好ましくはＣｃｄＢ）をコードする核酸配列の少なくとも２つの複製物は染色体であり、すなわち宿主細胞のゲノムに挿入されている。

本発明の一実施形態では、毒性タンパク質をコードする核酸配列の２つの複製物は、宿主細胞のゲノムの中に挿入されており、それぞれが、宿主細胞の染色体の反対側に位置している。好ましくは、各複製物は、宿主細胞の染色体の非コード領域または不活性化される遺伝子に挿入されている。

たとえば、毒性タンパク質をコードする核酸配列の第１の複製物は、ｄｃｍ遺伝子に導入されており、毒性タンパク質をコードする核酸配列の第２の複製物は、ｙｊｊＫおよびｓｌｔ遺伝子の間、すなわち、遺伝子間の非コード空間において大腸菌の染色体の反対側に挿入されている。

２つ以上の核酸配列またはポリペプチドの配列間の関係で使用される場合の用語「同一性」または「同一な」は、２つ以上の核酸残基またはアミノ酸残基（それぞれ）の鎖の間の一致数により決定される、核酸配列またはポリペプチド（それぞれ）の間の配列関連性の度合いを表す。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）により提示されるギャップアライメント（任意）を有する２つ以上の配列間のうちより小さな配列の間での同一性の一致のパーセントを測定する。関連するポリペプチドの同一性は、既知の方法により容易に計算できる。このような方法として、限定するものではないが、ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ５ａｎｄＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９３；ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａ，Ｐａｒｔ１，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ，１９９４；ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎＨｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９８７；ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏｅｔａｌ．，ＳＩＡＭＪ．ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載される方法が挙げられる。同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列間で最大の一致を得るように設計されている。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定する好ましいコンピュータプログラム法として、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．＼２，３８７（１９８４）；ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０（１９９０））を含むＧＣＣプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他のソース（ＢＬＡＳＴＭａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨＢｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ）から公開されている。また既知のＳｍｉｔｈＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを、同一性を決定するために使用してもよい。

好ましくは、毒性タンパク質をコードする核酸配列は、天然のプロモーターの制御下にある。たとえばタンパク質ＣｃｄＢをコードする核酸配列は、ｃｃｄプロモーターに下流で融合し得る。よって解毒剤の存在下では、ｃｃｄプロモーターは強力に抑制されている。

一実施形態では、宿主細胞は、微生物、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌、さらにより好ましくはグラム陰性細菌である。好ましくは、宿主細胞は、現在利用可能な分類学による腸内細菌科由来の細菌である。分類学が変化する場合、当業者は、本発明に使用できる細菌株を推測するように分類学の変化に適合する方法を承知している。腸内細菌科由来の細菌の例として、限定するものではないが、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、フォトラブダス属（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、モーガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、およびエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）に属する細菌が挙げられる。好ましい実施形態では、宿主細胞はエシェリキア属に属しており、より好ましくは、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）である。本発明に使用できる大腸菌株の例として、限定するものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉＫ－１２、Ｅ．ｃｏｌｉＢ、またはＥ．ｃｏｌｉＷ、たとえばＭＧ１６５５、Ｗ３１１０、ＤＧ１、ＤＧ２、Ｔｏｐ１０、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５ａｌｐｈａ、ＨＭＳ１７４、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥなどに由来する細菌株が挙げられる。

一実施形態では、宿主細胞の遺伝子は不活性化されていてもよい。

本明細書中使用される用語「不活性化された」は、転写または翻訳の段階での遺伝子の発現の中断または抑制を表す。好ましくは、用語「不活性化された」は、転写が抑制されている遺伝子を表す。本発明では、遺伝子の不活性化は、遺伝子の変異または遺伝子のコード配列内の発現系の挿入によるものであってもよい。本発明の意味では、用語「変異」は、遺伝子配列の安定した変化を表す。本発明において遺伝子の不活性化をもたらし得る変異の例として、限定するものではないが、点変異、挿入、欠失、および増幅、または遺伝子の重複が挙げられる。好ましくは、この変異は欠失である。本明細書中使用される用語「欠失」は、遺伝子の喪失または不存在、好ましくは全体的な遺伝子の喪失または不存在を意味する。より好ましくは、欠失は、欠失した遺伝子の開始コドンまたは開始コドンの前で開始し、欠失した遺伝子のストップコドンまたはストップコドンの後で終結する。

一実施形態では、遺伝子ｔｏｎＡ（ｆｈｕＡとしても知られている、配列番号２）が不活性化されている。ＴｏｎＡ／ＦｈｕＡタンパク質は、ファージＴ１、Ｔ５、およびＰｈｉ８０の受容体である。

一実施形態では、遺伝子ｇａｌＫ（配列番号３）が不活性化されている。この遺伝子の欠失は、相同組み換えに基づく方法により、遺伝子の欠失に関してｇａｌＫの陽性／陰性の選択の使用を可能にする。

一実施形態では、遺伝子ａｒａＢ（配列番号４）が不活性化されている。別の実施形態では、遺伝子ａｒａＡ（配列番号５）が不活性化されている。ａｒａＢおよび／またはａｒａＡの不活性化は、宿主細胞内のＰａｒａプロモーター（アラビノースにより誘導可能）の使用で推奨されている。

一実施形態では、遺伝子ｌｏｎ（配列番号６）および／または遺伝子ｏｍｐＴ（配列番号７）が不活性化されている。Ｌｏｎタンパク質はＡＴＰ依存性プロテアーゼである。Ｏｍｔタンパク質は、外膜プロテアーゼである。好ましくは、遺伝子ｌｏｎおよびｏｍｐＴが不活性化されている。

一実施形態では、遺伝子ｒｃｓＡ（配列番号８）が不活性化されている。タンパク質ＲｃｓＡは、嚢の合成の正のレギュレーターであり、Ｌｏｎプロテアーゼにより分解される。

一実施形態では、遺伝子ｈｓｄＲ（配列番号９）および／または遺伝子ｍｒｒ（配列番号１０）が不活性化されている。ＨｓｄＲおよびＭｒｒタンパク質は、異なる特異性を有する制限酵素である。好ましくは遺伝子ｈｓｄＲおよびｍｒｒは、両方とも不活性化されている。

一実施形態では、遺伝子ｅｎｄＡ（配列番号１１）および／または遺伝子ｒｅｃＡ（配列番号１２）が不活性化されている。ＥｎｄＡは、ＤＮＡに特異的なエンドヌクレアーゼである。ＲｅｃＡは、プロテアーゼおよびヌクレアーゼの活性を伴う組み換えタンパク質である。好ましくは、遺伝子ｅｎｄＡおよびｒｅｃＡは、両方とも不活性化されている。

本発明の一実施形態では、遺伝子ｔｏｎＡ、ｇａｌＫ、ａｒａＢ、ａｒａＡ、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ、ｒｃｓＡ、ｈｓｄＲ、ｍｒｒ、ｅｎｄＡ、およびｒｅｃＡのうちの少なくとも１つが不活性化されている。好ましくは不活性化された遺伝子は欠失している。

好ましい実施形態では、遺伝子ｔｏｎＡ、ｇａｌＫ、ａｒａＢ、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ、ｒｃｓＡ、ｈｓｄＲ、ｍｒｒ、ｅｎｄＡ、およびｒｅｃＡが不活性化されている。好ましくは、遺伝子ｔｏｎＡ、ｇａｌＫ、ａｒａＢ、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ、ｒｃｓＡ、ｈｓｄＲ、ｍｒｒ、ｅｎｄＡ、およびｒｅｃＡは欠失している。

一実施形態では、本発明の宿主細胞は、少なくとも１つの追加的な、毒性タンパク質の標的をコードする核酸配列の複製物を含む。一実施形態では、宿主細胞は、２つの、毒性タンパク質の標的をコードする核酸配列の複製物、または３、４、５、もしくは６個の（もしくはそれ以上の）、この核酸配列の複製物を含む。好ましくは、上記少なくとも１つの追加的な複製物は染色体であり、すなわち宿主細胞のゲノム内に挿入されている。

毒性タンパク質がＣｃｄＢである一実施形態では、本発明の宿主細胞は、少なくとも１つの追加的な、タンパク質ＧｙｒＡをコードする核酸配列の複製物を含んでもよい。

一実施形態では、タンパク質ＧｙｒＡをコードする核酸配列は、ｇｙｒＡ遺伝子（配列番号１５の配列）、または配列番号１５と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、もしくはそれ以上の同一性を有する機能的なＧｙｒＡタンパク質をコードするいずれかの配列である。

一実施形態では、毒性タンパク質の標的タンパク質をコードする核酸配列の第２の複製物は、毒性タンパク質をコードする核酸配列の複製物と同一の位置で、宿主細胞の染色体に挿入されている。一実施形態では、毒性タンパク質の標的タンパク質をコードする核酸配列の第２の複製物は、毒性タンパク質をコードする核酸配列の複製物に付随して挿入されている。

一実施形態では、本発明の宿主細胞は、本発明の宿主細胞により発現される毒性タンパク質の作用を相殺する解毒性タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも１つの複製物を含む。

解毒性タンパク質の例として、限定するものではないが、ＣｃｄＡ（ＣｃｄＢの解毒剤）、Ｋｉｓ（Ｋｉｄの解毒剤）、Ｐｈｄ（Ｄｏｃの解毒剤）、ＲｅｌＢ（ＲｅｌＥの解毒剤）、ＰａｓＢ（またはＰａｓＣ）（ＰａｓＡの解毒剤）、ＭａｚＦ（ＭａｚＥの解毒剤）または免疫分子（バクテリオシンの解毒剤）が挙げられる。毒性分子に対する解毒性タンパク質は、対応する毒性分子が細胞（好ましくは原核細胞）によって産生される場合に、上記細胞に及ぼす上記毒性分子の作用を低減または抑制することができるいずれかのタンパク質である。

好ましい実施形態では、毒性タンパク質はＣｃｄＢであり、宿主細胞は、ＣｃｄＡをコードする核酸配列の少なくとも１つの複製物を含む。一実施形態では、タンパク質ＣｃｄＡをコードする核酸配列は、ｃｃｄＡ遺伝子（配列番号１３の配列）または配列番号１３と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、またはそれ以上の同一性を有する機能的なＣｃｄＡタンパク質をコードするいずれかの配列である。本明細書中で使用される場合、「機能的な」ＣｃｄＡタンパク質は、配列番号１３と少なくとも７５％の同一性を有し、細胞に及ぼすＣｃｄＢの作用を低減または抑制するＣｃｄＡの能力を保持しているタンパク質に関する。

一実施形態では、解毒性タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、たとえばプラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、陽イオン性小胞、または他のいずれかの種類のベクターなどのベクターにより、好ましくはプラスミドにより、保有される。よって、当業者は、解毒性タンパク質をコードする核酸配列の複製物の数が、使用するプラスミドの種類に依存することを容易に推測し得る。たとえば、ｐＢＲ３２２ファミリーのプラスミドは、通常、約１～約１００個、好ましくは約２０～約５０個の範囲の複製物の数で、細胞に存在する：ｐＵＣファミリーのプラスミドは、通常、約１００個～約５００個、好ましくは約１５０～約２００個の範囲の複製物の数で細胞に存在する。しかしながら、当業者は、宿主細胞内のプラスミドの複製物の数が、複製速度および／または宿主細胞の増殖にも依存し得ることをも容易に推測し得る。

よって、好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、（１）毒性タンパク質に対する解毒剤をコードする核酸配列および（２）産生される対象の組み換えペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質をコードする核酸配列、または産生される対象の組み換えペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質をコードする核酸配列を挿入するための挿入部位を担持する、少なくとも１つのベクター、好ましくはプラスミドの複製物をさらに含む。

一実施形態では、対象の組み換えペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質をコードする核酸配列は発現系の中に含まれており、または挿入部位は、挿入されると、対象の組み換えペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列が発現系の中に含まれるように構成されている。特に、対象の組み換えペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列は、プロモーターの制御下で配置されている、または挿入の後に配置される。

本明細書中で使用される場合、「発現系」は、系の転写に関する追加的なフラグメントに操作可能に結合した対象の組み換えペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列をコードするフラグメントから構成された直鎖状または環状のＤＮＡ分子を表す。

追加的なフラグメントは、プロモーターおよびストップコドンの配列を含む。発現系は、１つまたは複数の複製開始点、１つまたは複数の選択マーカー、およびリボソーム結合部位をコードする配列をさらに含んでもよい。

「操作可能に結合した」は、フラグメントが、たとえばいったん転写がプロモーターで開始すると、ストップコドンへとコードしたフラグメントを通過するように機能付けするよう構成されていることを意味する。

本発明の意味での「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を許容する発現を制御する配列である。

本発明の一実施形態では、核酸配列は、「強力な」プロモーターの制御下にある。強力なプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ、他方で通常は天然に存在する対応するＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列の高い結合親和性、ならびに他方でのＲＮＡポリメラーゼによるｍＲＮＡの形成の高い比率を特徴とする。

好ましい実施形態では、核酸配列は、「誘導可能なプロモーター」の制御下にある。「誘導可能なプロモーター」は、外部要因、たとえば誘導原（「誘導因子」とも呼ばれる）分子の存在またはリプレッサー分子の不存在、または温度の増減、モル浸透圧濃度、もしくはｐＨ値のような物理的な要因といった外部要因により調節され得るプロモーターである。異なるプロモーターおよびそれぞれの誘導の原則は、Ｍａｋｒｉｄｅｓらにより概説されている（ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，１９９６，（６０）３：５１２－５３８）。本発明に使用し得る誘導可能なプロモーターの例として、限定するものではないが、ｔａｃまたはｔｒｃプロモーター、ｌａｃまたはｌａｃＵＶ５プロモーター（すべてがラクトースまたはその類似体のＩＰＴＧ（イソプロピルチオール－β－Ｄ－ガラクトシド）により誘導可能である）、厳密に調節可能なａｒａＢＡＤプロモーター（Ｐａｒａ；Ｇｕｚｍａｎｅｔａｌ．，１９９５，アラビノースにより誘導可能）、ｔｒｐプロモーター（βインドールアクリル酸の付加、またはトリプトファンの飢餓により誘導可能、トリプトファン付加により抑制可能）、ラムダプロモーターＰＬ（λ）（温度の上昇による誘導）、ｐｈｏＡプロモーター（リン酸塩の飢餓により誘導可能）、ＰｐｒｐＢ（プロピオン酸塩で誘導）、または組み換えペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質発現に適した他のプロモーターが挙げられ、すべてが、大腸菌のＲＮＡポリメラーゼを使用する。

とりわけ誘導可能なプロモーターは、「漏出」発現事象を示すプロモーターである。このようなプロモーター（いわゆる「漏出性プロモーター」）は、原則として誘導可能であるが、外部から誘導することなく基底の発現を示す。非誘導性の条件下で漏出発現を示す誘導可能なプロモーターは、構成的プロモーターと同様に作用し得る（すなわち、安定して連続的に活性であり、または特定の培養条件の結果として活性化または亢進されてもよい）。漏出性プロモーターは、連続して操作する培養工程に特に有益であってもよい。漏出性プロモーターの例として、Ｔ７プロモーターおよびｔｒｐプロモーターがある。本発明の意味では、用語「Ｔ７プロモーター」は、バクテリオファージＴ７のゲノム、ならびにＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写を媒介する特性を有する当該プロモーターのコンセンサス配列および変異体に存在するプロモーターを含む。バクテリオファージＴ７は、１７個の異なるプロモーター配列を含み、このうちのすべてが、高度に保存されたヌクレオチド配列を含む。

本発明の一実施形態では、プロモーターは構成的であってもよく、すなわち他方で誘導の必要性または他方で抑制の可能性がなく、発現を制御するプロモーターであってもよい。よって、特定のレベルで連続し、安定した発現が存在する。例として、強力な構成的ＨＣＤプロモーター（Ｐｏｏｅｔａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，２００２，２４：１１８５－１１８９；Ｊｅｏｎｇｅｔａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２００４，３６：１５０－１５６）が、構成的な発現に使用されてもよい。

好ましくは、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現は、たとえば選択下などの特定の条件で誘導される。

好ましい実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列は、Ｔ７プロモーター、ＩＰＴＧにより誘導可能なプロモーター、たとえばＰｔｒｃプロモーターもしくはＰｔａｃプロモーター、またはアラビノースにより誘導可能なプロモーター、たとえばＰａｒａなどの制御下に置かれている。

好ましい実施形態では、解毒性タンパク質をコードする核酸配列は、直接機能的であり、すなわち、機能的な解毒性タンパク質を直接コードする。さらに一実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列、または挿入部位は、解毒性タンパク質をコードする核酸配列の中に置かれていない。

一実施形態では、本発明のベクターは、ｃｅｒ遺伝子座を含む。ｃｅｒ遺伝子座は、「ダイマーのカタストロフ」として知られているマルチマーの集積の増加を防止することにより、ＣｏｌＥ１および関連するプラスミドの安定した遺伝を可能にする。マルチマーの分解は、ｃｅｒ部位でのＸｅｒＣｄ部位特異的リコンビナーゼの作用を介して達成される。好ましくは、ｃｅｒ遺伝子座が本発明のベクター内に挿入される場合、宿主細胞は大腸菌である。

一実施形態では、本発明のベクターは、抗生物質耐性遺伝子を全く含まない。別の実施形態では、本発明の宿主細胞は、抗生物質耐性遺伝子を全く含まない。一実施形態では、本発明のベクターも宿主細胞も、抗生物質耐性遺伝子を全く含まない。よってこの実施形態では、本発明の宿主細胞およびベクターを使用して対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を産生する際に、抗生物質が必要とされない。

また本発明は、本発明の宿主細胞を含むキットであって、毒性タンパク質をコードする核酸の少なくとも２つの複製物と、上述の少なくとも１つのベクター（好ましくはプラスミド）とを含む、キットに関する。好ましくは、上記ベクターは、毒性タンパク質に対する解毒性タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列と、発現系における対象の組み換えペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質をコードする核酸配列、または発現系における対象の組み換えペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質をコードする核酸配列を挿入するための挿入部位とを担持する。

好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、宿主細胞のゲノムに挿入されているタンパク質ＣｃｄＢをコードする少なくとも２つの核酸配列を含み、本発明のベクターは、ＣｃｄＡをコードする少なくとも１つの核酸配列を担持する。

一実施形態では、ベクターは、発現系の中に対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列を挿入することにより、対象のペプチド、ポリペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を産生する機能的なベクターを得るための発現系および挿入部位を含む。よって、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を産生する本発明のベクターで宿主細胞を形質転換する前に、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列は、ベクターの中の挿入部位に挿入されなければならない。挿入部位の中に核酸配列を挿入する方法は当業者によく知られており、これは通常制限酵素の使用に基づくものである。

対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に関して、たとえば工業用のペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、または治療用のペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質といった、製造スケールで生産されるべきいずれかのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を表してもよい。

本発明の方法により産生させることができるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の例は、限定するものではないが、酵素、調節タンパク質、受容体、ペプチド（たとえばペプチドホルモン）、サイトカイン、抗体、ナノボディ、膜または輸送タンパク質である。

また、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、ワクチン接種、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、完全長の抗体もしくは抗体のフラグメントまたは誘導体に使用される抗原であってもよい。抗体の誘導体は、単鎖抗体、（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、単一ドメイン抗体（ＶＨまたはＶＬフラグメント）、ラクダ単一可変ドメイン（ＶＨＨ）、またはたとえばＡｎｄｅｒｓｅｎおよびＲｅｉｌｌｙ（ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１５：４５６－４６２）またはＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５（２３）９：１１２６－１１３６）に記載される他の抗体型から選択されてもよい。

また、本発明の対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、たとえばＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｉ－ＨＶ、インフルエンザなどの病原性ウイルスのゲノムにコードされているタンパク質（ウイルス性抗原）、たとえばコートタンパク質、コアタンパク質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）などの増殖因子；腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキンなどのサイトカイン；エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、トロンボポエチンなどの造血性因子；黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＢ－ＲＨ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、インスリン、ソマトスタチン、成長ホルモン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＵ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、バソプレシン、オキシトキシン（ｏｘｙｔｏｘｉｎ）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン、ガストリン、セクレチン、パンクレオザイミン、コレシストキニン、アンジオテンシン、ヒト胎盤性ラクトゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、セルレイン、モチリンなどのペプチドホルモン；エンケファリン、エンドルフィン、ダイノルフィン、キョートルフィンなどの沈痛性ペプチド；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、アスパラギナーゼ、カリクレインなどの酵素；ペプチド神経伝達物質、たとえばボンベシン、ニューロテンシン（ｎｅｕｔｒｏｔｅｎｓｉｎ）、ブラジキニン、Ｐ物質、アルツハイマー病のアミロイドペプチド（ＡＤ）、ＳＯＤｌ、プレセニリン（ｐｒｅｓｅｎｉｌｌｉｎ）１および２、レニン、Ｄシヌクレイン、アミロイドＡ、アミロイドＰ、アクチビン、抗－ＨＥＲ－２、ボンベシン、エンケファリナーゼ、プロテアーゼ阻害剤、治療用酵素、Ｄ１－アンチトリプシン、哺乳類のトリプシン阻害剤、哺乳類の膵性トリプシン阻害剤、カルシトニン、心肥大因子、カルジオトロフィン（カルジオトロフィン－１など）、ＣＤタンパク質（ＣＤ－３、ＣＤ－４、ＣＤ－８およびＣＤ－１９など）、ＣＦＴＲ、ＣＴＮＦ、ＤＮａｓｅ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、サイトカイン、トランスサイレチン、アミリン、リポタンパク質、リンホカイン、リゾチーム、成長ホルモン（ヒト成長ホルモンを含む）、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、増殖因子、脳由来神経栄養性増殖因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＤＦＧＦおよびＤＦＧＦなど）、インスリン様増殖因子－Ｉおよび－ＩＩ、ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳のＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質、神経成長因子（ＮＧＦ－Ｄなど）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、成長ホルモンもしくは増殖因子の受容体、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）（ＴＧＦ－Ｄ、ＴＧＦ－Ｄ１、ＴＧＦ－Ｄ２、ＴＧＦ－Ｄ３、ＴＧＦ－Ｄ４またはＴＧＦ－Ｄ５など）、神経栄養因子（ニューロトロフィン－３、－４、－５、または－６など）、ゲルゾリン、グルカゴン、カリクレイン、ミュラー管阻害物質、神経栄養因子、ｐ５３、タンパク質ＡまたはＤ、プロリラキシン、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、リウマトイド因子、ロドプシン、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、インヒビン、インスリン、インスリン鎖、インスリンＡ鎖、インスリンＤ鎖、インスリン受容体、プロインスリン、黄体化ホルモン、インテグリン、インターロイキン（ＩＬ）（ＩＬ－１～ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３など）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、フィブリリン、卵胞刺激ホルモン、凝固因子（ＶＩＩＩＣ因子、ＩＸ因子、組織因子、およびフォンウィレブランド因子など）、抗凝固因子（タンパク質Ｃ、心房性ナトリウム利尿因子（ａｔｒｉａｌｎａｔｕｒｉｅｔｉｃｆａｃｔｏｒ）、肺サーファクタントなど）、プラスミノーゲン活性化因子（ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターまたはウロキナーゼなど）、トロンビン、腫瘍壊死因子－ＤまたはＤ、Ｄ－ケト酸デヒドロゲナーゼ、アドレシン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦおよびＧ－ＣＳＦなど）、崩壊促進因子、ホーミング受容体、インターフェロン（インターフェロン－α、γ、およびβなど）、ケラチン、骨誘導因子、ＰＲＮＰ、調節タンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ、膜表面タンパク質、輸送タンパク質、Ｔ細胞受容体、ｇｐ１２０（ＨＩｂ）イムノトキシンなどの抗原、心房性ナトリウム利尿ペプチド、精嚢外分泌タンパク質、Ｄ２－ミクログロブリン、ＰｒＰ、プレカルシトニン（ｐｒｅｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、アタキシン１、アタキシン２、アタキシン３、アタキシン６、アタキシン７、ハンチンチン、アンドロゲン受容体、ＣＲＥＢ結合タンパク質、ｇｐｌ２０、ｐ３００、ＣＲＥＢ、ＡＰＩ、ｒａｓ、ＮＦＡＴ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｏｒｕｂｒａｌｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎａｔｒｏｐｈｙ）関連タンパク質、微生物タンパク質（たとえばマルトース結合タンパク質、ＡＢＣトランスポーター、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、チオレドキシン、Ｄ－ラクタマーゼ）、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、リボヌクレアーゼ、カタラーゼ、ウリカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、トリプシン、パパイン、アルカリホスファターゼ、β－グルコロニダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはバトロキソビンなどの酵素、オピオイド、たとえばエンドルフィン、エンケファリン、または非天然のオピオイド、ホルモンまたはニューロペプチド、たとえばカルシトニン、グルカゴン、ガストリン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、コレシストキニン、黄体形成ホルモン、ゴナドトロピン－放出ホルモン（ｒｅｌｅａｓｓｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ）、絨毛性ゴナドトロピン、コルチコトロピン放出因子、バソプレシン、オキシトシン、抗利尿性ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、リラキシン、プロラクチン、ペプチドＹＹ、ニューロペプチドＹ、膵性ポリペプチド、レプチン、ＣＡＲＴ（コカインおよびアンフェタミン制御転写物）、ＣＡＲＴ関連ペプチド、ペリリピン、ＭＣ－４などのメラノコルチン（メラニン細胞刺激ホルモン）、メラニン濃縮ホルモン、ナトリウム利尿ペプチド、アドレノメデュリン、エンドセリン、セクレチン、アミリン、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、ボンベシン、ボンベシン様ペプチド、チモシン、ヘパリン結合タンパク質、可溶性ＣＤ４、視床下部性放出因子およびメラトニン（ｍｅｌａｎｏｔｏｎｉｎ）、またはそれらの機能的な類似体により例示することができる。本発明の別の実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、プロテアーゼ（たとえばエンテロキナーゼ、カスパーゼ、トリプシン様セリンプロテアーゼ）、リパーゼ、ホスファターゼ、グリコシルヒドロラーゼ（たとえばマンノシダーゼ、キシロシダーゼ、フコシダーゼ）、キナーゼ、モノまたはジオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミダーゼ、エステラーゼ、ホスファターゼなどのプロセッシング酵素であってもよい。

このような哺乳類のポリペプチドの好ましい供給源として、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、オオカミ、およびげっ歯類の供給源が挙げられ、ここではヒトのタンパク質が特に好ましい。

また本発明の対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、上述の対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の変異体を含む。これらの変異体は、たとえば上述の対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質と同一の活性を有し、上述の対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のアミノ酸配列において、１つまたは複数の欠失、置換、挿入、および／または付加したアミノ酸を伴うアミノ酸配列を含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含む。このようなペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、上述の対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質と同一の活性を有し、かつ上述の対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のアミノ酸配列において、１つまたは複数の欠失、置換、挿入、および／または付加したアミノ酸を伴うアミノ酸配列を含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質により例示することができる。欠失、置換、挿入、および付加から選択される２つ以上の異なる種類の改変は、同時に行われてもよい。

また本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、上述の対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の「部分的なペプチドまたはポリペプチド」をも含む。対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の部分的なペプチドまたはポリペプチドは、上述の対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のアミノ酸配列の一部が中断されず作用しているアミノ酸配列を含む部分的なペプチドまたはポリペプチドによって例証することができ、ここで部分的なペプチドまたはポリペプチドは、好ましくは上記対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質と同一の活性を有する。このような部分的なペプチドまたはポリペプチドは、上述の対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のアミノ酸配列において少なくとも２０個、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列により、例証することができる。このペプチドまたはポリペプチドは、好ましくは上述の対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の活性に関与する領域に対応するアミノ酸配列を含む。さらに本発明で使用される部分的なペプチドまたはポリペプチドはまた、このペプチドの改変により得た部分的なペプチドまたはポリペプチドとすることができ、ここでは１つまたは複数のアミノ酸残基（たとえば約１～２０個、より好ましくは約１～１０、およびさらにより好ましくは約１～５個）が、このアミノ酸配列から欠失、このアミノ酸配列で置換、このアミノ酸配列に挿入、および／またはこのアミノ酸配列に付加されている。本発明で使用される部分的なペプチドまたはポリペプチドはまた、抗体産生用の抗原として使用することもできる。

本発明の一実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、ヒト成長ホルモン、ヒトインスリン、卵胞刺激ホルモン、ＶＩＩＩ因子、エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｉｅｔｉｎ）、顆粒球コロニー刺激因子、α－グラクトシダーゼ（Ａｌｐｈａ－ｇｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）Ａ、α－Ｌ－イズロニダーゼ、Ｎ－アセチル（ａｃｔｅｔｙｌ）ガラクトサミン－４－スルファターゼ、ドルナーゼアルファ、組織プラスミノーゲン活性化因子、グルコセレブロシダーゼ、インターフェロン、インスリン様増殖因子１、ウシソマトトロピン、ブタソマトトロピン、ウシキモシン、およびＢ型肝炎ウイルスのエンベロープタンパク質を含む群から選択される。

また対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、環化、グリコシル化、リン酸化、メチル化、酸化、脱水、タンパク質分解切断などの、周辺質における翻訳後および輸送後の修飾を経た、修飾されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をも含む。

一実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、細胞外媒体中の生体分子（本明細書中「細胞外生体分子」と呼ばれる）を代謝する酵素である。一実施形態では、細胞外生体分子は、多糖または脂質を含む。本発明の一実施形態では、多糖は、アルギン酸塩、ペクチン、セルロース、セロビオース、ラミナリン、またはそれらの混合物を含む。本発明の一実施形態では、脂質は、脂肪酸、糖脂質、ベタイン脂質、グリセロ脂質、リン脂質、グリセロリン脂質（ｇｌｙｃｅｒｏｌｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、サッカロ脂質、ポリケチド、またはそれらの混合物を含む。本発明の一実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、多糖を単糖、オリゴ糖、またはその両方に変換する酵素である。本発明の一実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、脂質を脂肪酸、単糖、またはその両方に変換する酵素である。本発明の一実施形態では、単糖またはオリゴ糖は、オリゴアルギン酸塩、マンヌロン酸塩、グルロン酸塩、マンニトール、ａ－ケト酸、４－デオキシ－Ｌ－エリスロ－ヘキソースウロースウロナート（４－ｄｅｏｘｙ－Ｌ－ｅｒｙｔｈｒｏ－ｈｅｘｏｓｅｌｕｌｏｓｅｕｒｏｎａｔｅ）（ＤＥＨＵ）、２－ケト－３－デオキシＤ－グルコナート（ＫＤＧ）、グルコース、グルクロン酸塩、ガラクツロン酸塩、ガラクトース、キシロース、アラビノース、またはマンノースである。本発明の一実施形態では、脂肪酸は、１４：０、トランス－１４、１６：０、１６：ｌｎ－７、トランス－１６、１６：２ｎ－６、１８：０、１８：ｌｎ－９、１８：２ｎ－６、１８：３ｎ－６、１８：３ｎ－３、１８：４ｎ－３、２０：０、２０：２ｎ－６、２０：３ｎ－６、２０：４ｎ－３、２０：４ｎ－６、または２０：５ｎ－３である。

本発明の一実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、細胞外生体分子を汎用化学製品に変換する酵素である。本発明の一実施形態では、汎用化学製品は、エタノール、ブタノール、またはバイオディーゼルである。本発明の一実施形態では、バイオディーゼルは、脂肪酸、脂肪酸エステル、またはテルペノイドである。

一実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は分泌タンパク質である。一実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は天然に分泌されており、すなわち同ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列は、天然に、その分泌をもたらすシグナルペプチドを含む。別の実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は人工的に分泌されており、すなわち同ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列はシグナルペプチドに融合することにより、その分泌を可能にする。本発明の文脈で使用され得るシグナルペプチドの例として、限定するものではないが、ＯｍｐＡシグナルペプチド（配列番号１７）、ＤｓｂＡシグナルペプチド（配列番号１８）、またはＰｈｏＡシグナルペプチド（配列番号１９）が挙げられる。

別の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は膜貫通タンパク質である。

別の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、宿主細胞に毒性であるタンパク質である。

一実施形態では、本発明の宿主細胞は、好ましくは発現系に位置する、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現を誘導するタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。

このような核酸配列の例として、限定するものではないが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、Ｔ７遺伝子１が挙げられる。この場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現は、Ｔ７プロモーターの制御下におかれた対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現を誘導する。

好ましくは、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現を誘導するタンパク質をコードする核酸配列は、Ｔ７発現系である。Ｔ７発現系は、米国特許第４，９５２，４９６号に記載されており、この文献は本明細書中参照として援用されている。Ｔ７発現系は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの全体のコード配列（すなわちＴ７遺伝子１）を含む、Ｔ７ファージ由来のＤＮＡフラグメントを含む。Ｔ７遺伝子１の天然の活性プロモーターは除去され、誘導可能なｌａｃＵＶ５プロモーターは、コード配列の前に挿入された。ｌａｃＵＶ５プロモーターは、培養培地にＩＰＴＧを添加することにより、誘導される。

一実施形態では、本発明の宿主細胞は、そのゲノムの中に挿入されたファージを含む。対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質がＴ７プロモーターの制御下に置かれている一実施形態では、上記遺伝的に改変したファージは、国際特許出願第２０１３／００４８１７号（参照として本明細書中に援用）に記載されている。一実施形態では、上記遺伝的に改変したファージは、
発現系（好ましくはＴ７発現系）が挿入されており、
Ｓおよび／またはＲ遺伝子が不活性化されている
ファージとしてさらに定義されている。

本発明の一実施形態では、ファージのＩｎｔおよび／またはＸｉｓ遺伝子（複数可）が不活性化されている。

一実施形態では、遺伝的に改変したファージは、
発現系（好ましくはＴ７発現系）が挿入されており、
Ｓ、Ｒ、および／またはＱ遺伝子が不活性化されており、
Ｉｎｔおよび／またはＸｉｓ遺伝子が不活性化されている
ファージとしてさらに定義されている。

本発明に使用できるファージの例として、限定するものではないが、ラムダ（λ）ファージ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｐｈａｇｅｌａｍｂｄａ、アクセッション番号ＮＣ＿００１４１６）、ラムダ様ファージおよびラムドイドファージが挙げられる。ラムダファージは、大腸菌ファージλとしても知られており、大腸菌に感染させるウイルスである。ラムダは、テンペレートバクテリオファージである。ラムダ様ファージは、長い非収縮性の尾を特徴とするバクテリオファージおよび古細菌ウイルスのファミリーを形成する。ラムドイドファージは、ラムダファージの天然の近縁種である。これらの大部分は大腸菌で増殖するが、数種は、たとえばサルモネラ・チフィリウムなどの他の宿主細胞からもたらされる。本発明に使用できるラムダ様ファージおよびラムドイドファージの例として、限定するものではないが、大腸菌ファージ４３４、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、ＨＫ９７、Ｐ２１およびＰ２２が挙げられる。

一実施形態では、ファージはラムダＤＥ３（アクセッション番号ＥＵ０７８５９２）である。ラムダＤＥ３ファージは、改変したラムダファージＤ６９であり、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下で、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含む。

好ましい実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列番号１４を有し、（ＤＥ３）ΔＳ－Ｃ、Δｘｉｓ－ｅａ１０であるファージＰ１１である（ＤＥ３は、ラムダファージＤＥ３を表し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、ｉｎｔ遺伝子の配列の中に統合されている）。上記改変したファージＰ１１は、配列ＮＣ＿００１４１６に対応しており、遺伝子Ｓ、Ｒ、Ｒｚ、ＸｉｓおよびＩｎｔのコード配列が欠失している。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ１２であり、遺伝子ＩｎｔおよびＳのコード配列が欠失している（Ｐ１２の一例は、配列ＤＥ３ ΔＳ、Δｘｉｓ－ｅａ１０である）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ１３であり、遺伝子Ｓ、Ｒ、Ｒｚ、Ｑ、ＸｉｓおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ１３の一例は、配列ＤＥ３ ΔＳ－Ｃ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ１４であり、遺伝子ＲおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ１４の一例は、配列ＤＥ３ ΔＲである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ１５であり、遺伝子ＱおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ１５の一例は、配列ＤＥ３ ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ１６であり、遺伝子ＳおよびＸｉｓのコード配列が欠失している（Ｐ１６の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６ ΔＳ、Δｘｉｓ－ｅａ１０である）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ１７であり、遺伝子ＲおよびＸｉｓのコード配列が欠失している（Ｐ１７の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６ ΔＲ、Δｘｉｓ－ｅａ１０である）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ１８であり、遺伝子ＱおよびＸｉｓのコード配列が欠失している（Ｐ１８の一例は、ＮＣ＿００１４１６ Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ１９であり、遺伝子Ｒ、ＲｚおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ１９の一例は、配列ＤＥ３ ΔＲ、ΔＲｚである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ２０であり、遺伝子Ｓ、ＲｚおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ２０の一例は、配列ＤＥ３ ΔＳ、ΔＲｚである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ２１であり、遺伝子Ｒｚ、Ｑ、およびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ２１の一例は、配列ＤＥ３ ΔＲｚ、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ２２であり、遺伝子Ｓ、ＱおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ２２の一例は、配列ＤＥ３ ΔＳ、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ２３であり、遺伝子Ｒ、Ｑ、およびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ２３の一例は、配列ＤＥ３ ΔＲ、 ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ２４であり、遺伝子Ｓ、ＲおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ２４の一例は、配列ＤＥ３ ΔＳ、 ΔＲである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ２５であり、遺伝子Ｒ、ＲｚおよびＸｉｓのコード配列が欠失している（Ｐ２５の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６ ΔＲ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＲｚである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ２６であり、遺伝子Ｓ、ＲｚおよびＸｉｓのコード配列が欠失している（Ｐ２６の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６ ΔＳ、 Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＲｚである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ２７であり、遺伝子Ｑ、ＲｚおよびＸｉｓのコード配列が欠失している（Ｐ２７の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６ ΔＲｚ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ２８であり、遺伝子Ｓ、ＱおよびＸｉｓのコード配列が欠失している（Ｐ２８の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６ ΔＳ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ２９であり、遺伝子Ｒ、ＱおよびＸｉｓのコード配列が欠失している（Ｐ２９の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６ ΔＲ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ３０であり、遺伝子Ｒ、ＳおよびＸｉｓのコード配列が欠失している（Ｐ３０の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６ ΔＳ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＲである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ３１であり、遺伝子Ｒ、ＸｉｓおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ３１の一例は、配列ＤＥ３ ΔＲ、Δｘｉｓ－ｅａ１０である）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ３２であり、遺伝子Ｓ、ＸｉｓおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ３２の一例は、配列ＤＥ３ ΔＳ、Δｘｉｓ－ｅａ１０である）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ３３であり、遺伝子Ｑ、ＸｉｓおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ３３の一例は、配列ＤＥ３ Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ３４であり、遺伝子Ｓ、Ｒ、ＸｉｓおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ３４の一例は、配列ＤＥ３ ΔＳ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＲである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ３５であり、遺伝子Ｒ、Ｑ、ＸｉｓおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ３５の一例は、配列ＤＥ３ ΔＲ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ３６であり、遺伝子Ｓ、Ｑ、ＸｉｓおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ３６の一例は、配列ＤＥ３ ΔＳ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ３７であり、遺伝子Ｒ、Ｒｚ、ＸｉｓおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ３７の一例は、配列ＤＥ３ ΔＲ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＲｚである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ３８であり、遺伝子Ｓ、Ｒｚ、ＸｉｓおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ３８の一例は、配列ＤＥ３ ΔＳ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＲｚである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ３９であり、遺伝子Ｒｚ、Ｑ、ＸｉｓおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ３９の一例は、配列ＤＥ３ ΔＲｚ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ４０であり、遺伝子Ｓ、Ｒ、ＱおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ４０の一例は、配列ＤＥ３ ΔＳ、ΔＲ、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ４１であり、遺伝子Ｓ、Ｒ、ＲｚおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ４１の一例は、配列ＤＥ３ ΔＳ－Ｃである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ４２であり、遺伝子Ｒ、Ｒｚ、ＱおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ４２の一例は、配列ＤＥ３ ΔＲ、ΔＲｚ、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ４３であり、遺伝子Ｓ、Ｒｚ、ＱおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ４３の一例は、配列ＤＥ３ ΔＳ、ΔＲｚ、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ４４であり、遺伝子Ｓ、Ｒ、ＱおよびＸｉｓのコード配列が欠失している（Ｐ４４の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６ ΔＳ、ΔＲ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ４５であり、遺伝子Ｓ、Ｒ、ＲｚおよびＸｉｓのコード配列が欠失している（Ｐ４５の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６ ΔＳ－Ｃ、Δｘｉｓ－ｅａ１０である）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ４６であり、遺伝子Ｒ、Ｒｚ、ＱおよびＸｉｓのコード配列が欠失している（Ｐ４６の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６ ΔＲ、ΔＲｚ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ４７であり、遺伝子Ｓ、Ｒｚ、ＱおよびＸｉｓのコード配列が欠失している（Ｐ４７の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６ ΔＳ、ΔＲｚ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ４８であり、遺伝子Ｓ、Ｒ、Ｑ、ＸｉｓおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ４８の一例は、配列ＤＥ３ ΔＳ、ΔＲ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ４９であり、遺伝子Ｓ、Ｒｚ、Ｑ、ＸｉｓおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ４９の一例は、配列ＤＥ３ ΔＳ、ΔＲｚ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ５０であり、遺伝子Ｒ、Ｒｚ、Ｑ、ＸｉｓおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ５０の一例は、配列ＤＥ３ ΔＲ、ΔＲｚ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ５１であり、遺伝子Ｓ、Ｒ、Ｑ、ＲｚおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ５１の一例は、配列ＤＥ３ ΔＳ－Ｃ、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１６に対応するＰ５２であり、遺伝子Ｓ、Ｒ、Ｒｚ、ＱおよびＸｉｓのコード配列が欠失している（Ｐ５２の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６ ΔＳ－Ｃ、Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

別の実施形態では、遺伝的に改変したファージは、配列ＮＣ＿００１４１５に対応するＰ５３であり、遺伝子Ｑ、ＸｉｓおよびＩｎｔのコード配列が欠失している（Ｐ５３の一例は、配列ＤＥ３ Δｘｉｓ－ｅａ１０、ΔＱである）。

また本発明は、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を産生させる方法であって、
毒性タンパク質、好ましくはＣｃｄＢをコードする核酸配列の少なくとも２つの複製物と、
毒性タンパク質に対する解毒性タンパク質、好ましくはＣｃｄＡをコードする核酸配列の少なくとも１つの複製物と、
対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも１つの複製物と
を含む、本発明の宿主細胞を培養することと、
対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を回収することと
を含む、方法に関する。

一実施形態では、毒性タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも２つの複製物は、宿主細胞のゲノムの中に挿入されている。

一実施形態では、毒性タンパク質に対する解毒性タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも１つの複製物、および対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも１つの複製物が、同一のベクターにより担持されている。よって、ベクターを含む宿主細胞のみが増殖され、ベクターを含まない宿主細胞は毒性タンパク質の毒性作用により死滅する。

本発明の一実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列は、発現系の中に含まれている。この実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の産生は、直接的であり、すなわち、たとえば発現系に含まれるプロモーターが誘導される培地での培養により、発現系の遺伝子発現からもたらされる。たとえば一実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列は、ｐＬａｃまたはｐＴＲＣプロモーターの制御下に置かれており、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現は、ＩＰＴＧが培養培地に添加される際に誘導される。さらに別の実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列は、Ｐａｒａプロモーターの制御下に置かれており、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現は、アラビノースを培養培地に添加する際に誘導される。

別の実施形態では、本発明の宿主細胞は、宿主細胞のゲノムに挿入されているｌａｃプロモーター、好ましくはｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼの核酸配列を含む別の発現系をさらに含む。この実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を産生させる工程は、Ｔ７プロモーターの制御下で対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の核酸配列と、解毒性タンパク質をコードする核酸配列と含むベクター、好ましくはプラスミドを用いた宿主細胞の形質転換を含む。Ｔ７プロモーター由来の発現は、Ｔ７プロモーターに厳密に特異的であるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの制御下にあり、すなわちＴ７プロモーターは、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼによってのみ利用することができる。ＩＰＴＧが培養培地に添加される際、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現を可能にするｌａｃプロモーターからの転写により発現される。

一実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、培養ブロス中の宿主細胞により分泌される。この実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、当業者に既知の方法を使用して培養ブロスから容易に回収され得る。

別の実施形態では、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、培養ブロス中の宿主細胞によって分泌されない。対象の細胞内または周辺質のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を回収する方法もまた、当該分野でよく知られている。

このような方法の例として、限定するものではないが、変性条件において全タンパク質を回収するための、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むクラッキングバッファー（ｃｒａｃｋｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）の使用、または超音波処理、フレンチプレス、もしくは天然の条件（変性条件ではない）において全細胞質内タンパク質を回収するための圧力下で細菌を破壊するための均等物の使用が挙げられる。次に、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、限定するものではないが、アフィニティカラムまたはイオン交換カラムの使用を含む特定の方法を使用して、精製することができる。

また本発明は、上述の宿主細胞を調製する方法をも表す。

本発明の宿主細胞を調製する方法は、宿主細胞のゲノムの中に毒性タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも２つの複製物、好ましくは２つの複製物を挿入することを含む。好ましく、上記毒性タンパク質はＣｃｄＢであり、より好ましくは上記毒性タンパク質をコードする核酸配列は配列番号１である。

一実施形態では、本発明の宿主細胞を調製する方法は、宿主細胞の核酸配列を欠失する欠失のステップを含む。

遺伝子の配列を挿入または欠失する方法は、当業者によく知られている。より効率的な方法は、プロファージＲａｃ由来のラムダＲｅｄコード遺伝子またはｒｅｃＥおよびｒｅｃＴ遺伝子により媒介される相同組み換え方法である。この方法は、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（ＰＮＡＳ９７－１２，６６４０－６６４５，２０００）ならびにＳｔｅｗａｒｔら（ＷＯ０１０４２８８）を含む数人の研究者により良好に説明された。ＰＣＲ産物は、欠失する遺伝子の近くの領域または核酸配列が挿入される領域に相同である２０～６０ｎｔの伸張を伴うプライマーを使用して作製される。少量の細菌のみが対象のフラグメントを効率的に組み換えるため、それを選択するための強力な選択マーカーを有する必要がある。抗生物質のマーカーは、組み換え体を選択するために使用することができる：改変したプライマーは、抗生物質耐性遺伝子を増幅させるために使用する。組み換え遺伝子の形質転換および活性化の後、組み換え細菌を、適切な抗生物質を含む培地上で選択する。この場合、標的化した遺伝子または領域は、抗生物質耐性遺伝子により置換されている。次の欠失のため同一の戦略を使用するために、第２のステップの間にこの抗生物質耐性遺伝子を除去する必要がある。ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒらの文献に記載されるように、ＦＲＴ（ＦＬＰ認識標的）部位の横に配置されている抗生物質耐性遺伝子を使用することが可能である。次に耐性遺伝子を、ＦＬＰリコンビナーゼをコードするヘルパープラスミドを使用することにより除去する。抗生物質耐性遺伝子は、この部位特異的なリコンビナーゼにより除去されるが、この方法は痕跡が残る：１つの部位特異的な組み換え部位は、抗生物質耐性遺伝子を除去した後でも存在する。

この部位の存在を回避するため、より好ましくは本発明の方法は、マーカー遺伝子としてｇａｌＫを使用する。ｇａｌＫの選択の原則は、Ｗａｒｍｉｎｇら（Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，３３（４））に記載されている。この方法は、第１の組み換え（挿入）の間、陽性選択マーカー（ガラクトースを含む最少培地で増殖）としてｇａｌＫを使用する。このマーカーの除去を、第２の相同組み換えステップの間に行う。このステップの間、ｇａｌＫを、２－デオキシ－ガラクトース（ＤＯＧ）を含む最少培地での陰性選択マーカーとして使用する。ｇａｌＫ遺伝子産物、ガラクトキナーゼは、ガラクトース分解経路の第１のステップを触媒する。また、ガラクトキナーゼは、ＤＯＧガラクトース類似体のリン酸化を効率的に触媒する。この反応の産物は、さらに代謝することができず、毒性分子（２－デオキシ－ガラクトース－１－リン酸塩）の蓄積をもたらす。この方法の利点は、標的化遺伝子の欠失および選択マーカーの除去の後に、特定の組み換え部位の存在を回避することにある。

一実施形態では、本発明の方法は、本明細書中上記で定義した遺伝的に改変したファージによる宿主細胞の感染ステップをさらに含む。本発明の一実施形態では、上記感染ステップは、ヘルパーファージの使用を含む。本発明の意味では、用語「ヘルパーファージ」は、別のファージの欠失または不活性化を補完するために使用されるファージを表す。ヘルパーファージは、細菌を感染させることができ、またはファージの原液を調製することができるよう上記別のファージに失われた機能を提供する。通常、ヘルパーファージは、ｃＩマイナス（リプレッサーを有さず、よって病原性である）であるため、それ自体が溶原菌を形成することができない。

ヘルパーファージを使用してファージで宿主細胞を感染させる工程は、当該分野でよく知られている。一実施形態では、第１のステップは溶菌液の調製であり、第２のステップは溶原化である。簡潔に述べると、ヘルパーファージの細菌溶菌液は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ”，Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（２００１，ＩＳＢＮ９７８－０８７９６９５７７－４）または“Ｌａｒｇｅ－ａｎｄＳｍａｌｌ－ＳｃａｌｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｌａｍｂｄａｌｙｓａｔｅａｎｄＤＮＡ”，Ｓｕｅｔａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２５：４４－４６（Ｊｕｌｙ１９９８）に記載される標準的な方法を使用して調製され得る。対象のファージの調製は、溶菌サイクルを開始させるためにファージの誘導の後に同一の原則を使用して（ほとんどの場合、ＵＶ照射、または溶原菌がＤＮＡ損傷もしくは宿主のＳＯＳ応答、もしくはＣｒｏの産生を経るいずれかの状況を使用して）、かつ失われた機能を提供するヘルパーファージを使用して、行われてもよい。ヘルパーファージの代わりとして、失われた機能をコードするプラスミドの使用がある。

次に、ファージの溶菌液を標的化した細菌と混合し、ＬＢプレートにプレーティングすることにより、溶原菌を得ることができる（Ｎｏｖａｇｅｎ製のラムダＤＥ３溶原化キットに記載、ユーザープロトコルＴＢ０３１、または代替的な方法が、ＳｔｕｄｉｅｒａｎｄＭｏｆｆａｔ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９８６，１８９：１１３－１３０に記載されている）。選択ファージは、対象のファージを含む細菌を特異的に選択するために使用することができる。この選択ファージは、対象のファージと同一の免疫を有する病原性ファージである。結果として、選択ファージは、ｃＩリプレッサー（ＤＥ３ラムダファージにおけるＣ２とも呼ばれる）を産生するため、対象のファージのためにプラークを形成できず、または細菌性溶原菌を殺すことができない。

一実施形態では、本発明の方法は、（１）毒性タンパク質に対する解毒性タンパク質をコードする核酸配列および（２）対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列を担持するベクター、好ましくは本明細書中上述されるプラスミドで本発明の宿主細胞を形質転換することをさらに含む。ベクターで細胞を形質転換する方法は、当該分野でよく知られており、限定するものではないが、化学的な形質転換およびエレクトロポレーションが挙げられる。

よって、本発明の宿主細胞を使用して対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を産生させる方法は、以下の利点を提示する：
いずれかのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、さらには宿主細胞に毒性であるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に使用することができる。
宿主細胞のゲノムの中のｃｃｄＢ遺伝子を挿入することが当業者にとって容易であるため、任意の宿主細胞に使用することができる。
以下の実施例で示されるように、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の産生収率が上がる。
以下の実施例で示されるように、特に対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が宿主細胞にとって毒性である場合、対象のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターの安定性を上げることが可能である。
一部の実施形態では、抗生物質を使用することを含まず、宿主細胞およびベクターは、両方とも抗生物質耐性遺伝子を含まない。

ｐＶＨＨ６ベクターのマップである。ｐＶＨＨ６ΔＫａｎの２４時間の誘導後の、Ｗ３１１０ｃｃｄＢ株におけるＰＣＲスクリーニングを示す写真である。誘導後の培養は、抗生物質を用いることなくプレート上で画線培養し、２０個のコロニーでＰＣＲを行った。ＶＨＨ６（Ａ）、ｃｃｄＢ（Ｂ）、および細胞株に特異的な（Ｃ）遺伝子にわたるＰＣＲの結果が示されている。左の矢印は、予測されるＰＣＲ産物の大きさを示す。上の矢印は、ｃｃｄＢの変質を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける、Ｗ３１１０ｐＶＨＨ６、Ｗ３１１０ｃｃｄＢｐＶＨＨ６ΔＫａｎおよびＷ３１１０２ｃｃｄＢｐＶＨＨ６ΔＫａｎ株の産生の比較を示す写真である。非誘導型（ＮＩ）および誘導型の試料の間で差異が観察されたが、特に、誘導した試料間で差異が観察された（四角形）。ｐＴｒａＧベクターのマップである。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける、Ｗ３１１０ｃｃｄＢｐＴｒａＧおよびＷ３１１０２ｃｃｄＢｐＴｒａＧ株の産生の比較を示す写真である。非誘導型（ＮＩ）および誘導型の試料の間で差異が観察されたが、誘導した試料間では観察されなかった。クマシーブルー染色（左）またはウェスタンブロット（右）による、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける、Ｗ３１１０ｐＤ１．３、Ｗ３１１０ｃｃｄＢｐＤ１．３ｃｃｄＡΔＡｍｐ、およびＷ３１１０２ｃｃｄＢｐＤ１．３ｃｃｄＡΔＡｍｐ株の産生の比較を示す２つの写真の組み合わせである。ウェスタンブロットにより、非誘導型（ＮＩ）および誘導型（Ｉ）の試料の間で差異が良好に観察される。ｐＳｔａｂｙ１．２ＴｒａＧの２４時間の誘導後のＳＥ３（ＢＬ２１（ＤＥ３）２ｃｃｄＢ）株におけるＰＣＲのスクリーニングを示す写真である。誘導後の培養は、ペトリ皿上での画線培養し、２２個のコロニーでＰＣＲを行った。ＴｒａＧ（Ａ）、ｃｃｄＡ（Ｂ）、最初のｃｃｄＢ（Ｃ）、および第２のｃｃｄＢ（Ｄ）遺伝子にわたるＰＣＲの結果が示されている。左の矢印は、予測されるＰＣＲ産物の大きさを示す。ＳＥ１ｐＳｔａｂｙＴｒａＧおよびＳＥ４（ＢＬ２１（ＤＥ３）２ｃｃｄＢ２ｇｙｒＡ）ｐＳｔａｂｙＴｒａＧ株の産生の比較を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの写真である。非誘導型（ＮＩ）および誘導型（Ｉ）の試料の間で差異が観察される。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける、Ｗ３１１０ｃｃｄＢｐＶＨＨ６ΔＫａｎ、Ｗ３１１０２ｃｃｄＢｐＶＨＨ６ΔＫａｎ、およびＷ３１１０２ｃｃｄＢ２ｇｙｒＡｐＶＨＨ６ΔＫａｎ株の産生の比較を示す写真である。非誘導型（ＮＩ）および誘導型（Ｉ）の試料の間で差異が観察されるが、特に、誘導した試料の間で差異が観察された。

実施例
本発明を、さらに以下の実施例により例証する。
実施例１：ｃｃｄＢ遺伝子の複製は、産生の収率を上げる
Ｓｔａｂｙ（登録商標）技術（宿主染色体内のｃｃｄＢ遺伝子の１つの複製物の挿入に基づく技術、ＤｅｌｐｈｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＳｔａｂｙＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）製品、国際特許第９９５８６５２号）によりもたらされる安定性を試験するために、本出願人は、大腸菌においても毒性の特性を有するように見える分泌タンパク質（ＶＨＨ６と名付けられた可変重鎖抗体フラグメント）を生成した。Ｗ３１１０Ｅ．ｃｏｌｉ株（遺伝的背景：Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２、遺伝子型：Ｆ^－λ^－ＩＮＶ（ｒｒｎＤ－ｒｒｎＥ）ｒｐｈ－１）を、産生株の宿主として使用し、かつｐＢＲ３２２ベクター（ｐＶＨＨ６；図１）上のｐＴｒｃプロモーターを用いて発現を実現した。従来の抗生物質安定化システム（ここではカナマイシン耐性）を使用したＷ３１１０株の産生を、Ｓｔａｂｙ（登録商標）技術（ｃｃｄＢ遺伝子が株の染色体の中に導入されている）を使用するよう改変されたＷ３１１０ｃｃｄＢ株の産生と比較した。この比較で使用したベクターは両方ともｃｃｄＡ遺伝子を含むものであり、Ｗ３１１０ｃｃｄＢに使用したベクターを、カナマイシン耐性遺伝子（ｐＶＨＨ６ΔＫａｎ）に関して欠失させた。

抗生物質を含むまたは含まないＬＢ培地（１０ｍｌ）で、株を３０℃で増殖させ、ＯＤ_６００が０．５に達した際に４時間誘導した（０．５ｍＭ、ＩＰＴＧ）。これらのゆっくりとした誘導条件下での両選択系におけるプラスミドの安定性が１００％であるにも関わらず、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析される際の産生は明らかではなかった。より強力な誘導条件を、以下のように使用した（ここでは、灌流に基づく連続した培養の後）。株を、５００ｍｌの培養槽で増殖させ、灌流：新鮮な培地の添加（最大５ｌ）および培養槽のＯＤ_６００を常に０．３に維持するためにオーバーフローを除去することにより、ＯＤ_６００を０．３に一定して維持した。５ｌの灌流の後、ＯＤ_６００を増加させ、最終的に、培養物が０．５のＯＤ_６００に達した際に誘導を２４時間実現させた。抗生物質選択システムを使用して、発現ベクターを安定化させる場合、最終的なプラスミドの安定性を、適切な抗生物質（プラスミドによりコードされた耐性遺伝子による）を含むまたは含まないプレート上に細菌をプレーティングすることにより、決定した。抗生物質を含まないプレートは、細菌の総数を決定するために使用し、抗生物質を含むプレートは、未だにプラスミドを含む細菌の数を決定するために使用する。

プラスミドの安定性を、抗生物質（抗生物質を含むプレート上にコロニーがない）を使用した細菌に関して、約０％に評価した。

ｃｃｄＡおよびｃｃｄＢに基づきＳｔａｂｙ（登録商標）システムを使用する場合、抗生物質耐性遺伝子は存在しない。結果として、プラスミドの存在の有無を、ＰＣＲにより試験する。本出願人がＳｔａｂｙ（登録商標）システムを使用するため、染色体の細菌における選択ｃｃｄＢ遺伝子およびプラスミドにおけるｃｃｄＡ解毒遺伝子の存在により、プレート上で増殖したすべての細菌はプラスミドを含むべきであると本出願人は仮説を立てた。予想外なことに、本出願人は、コロニーでのＰＣＲの実験により約６５％の安定性を観察した（図２Ｂ）。実際に、たとえ安定性が顕著に増大したとしても、Ｓｔａｂｙ（登録商標）技術が１００％の安定性を提供しないということは初めてである。

さらに、保持された６５％のうち、対象の遺伝子（ＶＨＨ６遺伝子）は、試験したすべてのプラスミドにおいて部分的または完全な欠失により変異していた（図２Ａ）。予測されるものよりも大きなｃｃｄＢのＰＣＲのバンドを抽出し、シークエンシングした。シークエンシングの結果は、ｃｃｄＢ遺伝子が、小さな挿入配列（ｉｎｓＡＢ）の挿入（配列番号１６）により不活性化されていることを示す。株に特異的なＰＣＲの結果（図２Ｃ）により、ｃｃｄＢ遺伝子にわたり増幅していないバンドは、ｃｃｄＢ領域における大きな欠失または挿入によるものであり得る。この実験を繰り返し、同等の結果を観察した。

よって、Ｓｔａｂｙ（登録商標）技術は、この種の安定化システムの不活性化を回避するように改善されなければならない。毒性遺伝子の第２の複製物は、ｙｊｊＫおよびｓｌｔ遺伝子の間に挿入されている（Ｗ３１１０２ｃｃｄＢ株をもたらす）。これらの遺伝子は、第１のｃｃｄＢ遺伝子の位置に関して大腸菌染色体の反対側に位置しており、遺伝子間の空間はノンコーディングであるように見えるため、選択された。

Ｗ３１１０、Ｗ３１１０ｃｃｄＢおよびＷ３１１０２ｃｃｄＢ株における産生を比較するために、以下のプロトコルを使用した。１０ｍｌのＬＢ培地で、単一のコロニーを３７℃で一晩増殖させた。後日、１０ｍｌの新鮮なＬＢ培地の接種のために、各培養物から１μｌを使用した。培養物を３７℃で一晩増殖させた。さらなる作製を行うために、このステップを再度反復した（培養槽で実現される）。後日、１０ｍｌの新鮮なＬＢ培地の接種のために、各培養物から１０μｌを使用した。培養物を３０℃で増殖させ、２４時間ＯＤ_６０００．５で誘導した。これらのステップの間、Ｗ３１１０株にのみカナマイシンを使用した。発現プラスミドを維持するためにこの抗生物質を使用したにも関わらず、この安定性は誘導後で約０％であった。他方で、このより穏やかなプロトコル（：ｃｃｄＢ遺伝子およびプラスミドｃｃｄＡ遺伝子に対して行われたすべてのＰＣＲは予測された大きさのものであった）下での両Ｓｔａｂｙ（登録商標）システム（すなわち１または２個のｃｃｄＢ遺伝子）では、プラスミドの安定性は約１００％であった。Ｗ３１１０２ｃｃｄＢ培養物のいくつかのＶＨＨ６遺伝子のみが変異していた（２７％）。

また、産生を、クマシーブルーＳＤＳ－ＰＡＧＥにより比較した（図３）。予想外なことに、Ｗ３１１０２ｃｃｄＢ株の産生の収率は、他の株よりもずっと多かった（ＶＨＨ６＝２７ｋＤａ）。この種の収率の増加は、すでにＳｔａｂｙ（登録商標）技術により報告されているが、ｃｃｄＢ遺伝子の１つの複製物を用いたものであった（Ｐｅｕｂｅｚｅｔａｌ．，ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｉｅｓ２０１０，９：６５；Ｓｏｄｏｙｅｒｅｔａｌ．，Ｉｎ：ＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃＲｅｓｉｓｔａｎｔＢａｃｔｅｒｉａ－ＡＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓＣｈａｌｌｅｎｇｅｉｎｔｈｅＮｅｗＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ２０１２）。ここで、この収率の増加は、驚くべきことに、プラスミドが安定であり、ｃｃｄＢ遺伝子の１つの複製物を含む細菌に存在しているという事実にも関わらず２つのｃｃｄＢの複製物が存在する場合にのみ起こる。

実施例２：他のタンパク質を産生させるＳｔａｂｙ（登録商標）２ｃｃｄＢ技術の使用
ｃｃｄＢ遺伝子の２つの複製物を含む株の使用がすべてのタンパク質（ｃｃｄＢの１つの複製物のみですでに良好に発現したタンパク質を含む）にとって可能であるかどうかを試験するために、本出願人は、７０ｋＤａのＴｒａＧタンパク質の産生を試験した（Ｓｚｐｉｒｅｒｅｔａｌ．，２０００，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７（６）１２８３－１２９２）。解毒剤ＣｃｄＡおよびＴｒａＧ（ｐＴｒａＧ）をコードしたプラスミドを含むＷ３１１０（ＤＥ３）ｃｃｄＢおよびＷ３１１０（ＤＥ３）２ｃｃｄＢ株を構築した（図４）。ｔｒａＧ遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御下にあった。これらの株およびプラスミドは、プラスミドを安定化させるためにＳｔａｂｙ（登録商標）技術を使用する。第１の観察は、ｃｃｄＡをコードするプラスミドの存在下でｃｃｄＢ遺伝子の２つの複製物の存在がＷ３１１０株の生存率および増殖に影響しない：プラスミドのｃｃｄＡ遺伝子の１つの複製物、完全な生存率を得るために十分である、ということであった。

従来のＳｔａｂｙ（登録商標）システム（１つのｃｃｄＢ遺伝子）の下でのＴｒａＧの産生は、新規のＳｔａｂｙ（登録商標）システム（２つのｃｃｄＢ遺伝子）を用いた産生と同等である（図５）。しかしながら、１つのｃｃｄＢを用いた産生は、すでに非常に良好な収率をもたらしており、よってこの収率の増加は、新規のＳｔａｂｙ（登録商標）システムを使用しても可能ではない場合がある。

本出願人の以前の結果を確認するために、別の産生を実現させた。抗体フラグメントは、モデル（Ｄ１．３＝重鎖および軽鎖では２４ｋＤａ、または関連する鎖では５０ｋＤａ）として選択され、Ｐａｒａプロモーター（アラビノース誘導）を使用して発現された。ベクター（ｐＢＡＤ２４）は、ｃｃｄＢ遺伝子（複数可）を含む株に適合されている（ｃｃｄＡの挿入およびアンピシリン耐性遺伝子の欠失）。

図６に示されるように、産生収率は、ｃｃｄＢ遺伝子の１つまたは２つの複製物を使用することにより強力に増加しているが、本出願人は、２つの株の間の差異（増殖および速度を含む）を観察しなかった。

結果として、ｃｃｄＢの２つの複製物を含む株の使用は、いずれかのタンパク質の産生に使用され得る。しかしながら、この収率の利点は各タンパク質に依存しており、収率がｃｃｄＢの１つの複製物のみを使用する際にすでに非常に高い場合、２つの複製物をコードする株は同一の結果を提供する。工業生産者および研究者は、彼らの実験を開始する際にタンパク質の産生が困難かそうでないかどうかを知らないため、従来の産生が困難なタンパク質に関して同一の株を利用でき、かつ最も困難なタンパク質に関して設計された株を用いてすぐに開始できるといった利点がある。

実施例３：他の宿主株でタンパク質を産生する２ｃｃｄＢ技術の使用
大腸菌株は、Ｋ１２型およびＢ型に分けられている。Ｗ３１１０株はＫ１２株であるため、Ｂ株に対する２ｃｃｄＢ技術の適用性を試験した。よって、ｃｃｄＢの２つの複製物を、Ｅ．ｃｏｌｉＢ（ＢＬ２１（ＤＥ３）型－遺伝子背景：Ｅ．ｃｏｌｉＢ－遺伝子型Ｆ－ｏｍｐＴｇａｌｄｃｍｌｏｎｈｓｄＳ_Ｂ（ｒ_Ｂ－ｍ_Ｂ－）λ（ＤＥ３［ｌａｃＩｌａｃＵＶ５－Ｔ７ｇｅｎｅ１］））のゲノムに導入して、ＳＥ３株を得た。次に、灌流した培養を、いくつかの作製を終えた後にＴｒａＧタンパク質を生成するため実現させた。２４時間の誘導の後のプラスミドの安定性は１００％である（図７）。すべてのｃｃｄＢ遺伝子は、これらの発現条件下で無変化である。

同様の結果が、以下の遺伝子型：Ｆ－ｅｎｄＡ１ｇｌｎＶ４４ｔｈｉ－１ｒｅｃＡ１ｒｅｌＡ１ｇｙｒＡ９６ｄｅｏＲｎｕｐＧ Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ）Ｕ１６９、ｈｓｄＲ１７（ｒＫ－ｍＫ＋）、λ‐、ｄｃｍ：：ＦＲＴｃｃｄＢｙｊｊＫ：：ＦＲＴｃｃｄＢを有する別のＫ１２由来の株で得られた。この株は、ｃｃｄＢ遺伝子の２つの複製物が上述のように挿入されたＤＨ５αに由来するものであった。

これらの結果は、ｃｃｄＢ遺伝子の２つの複製物の挿入を含む異なる大腸菌株を構築することが可能であることを示す。これら２つの複製物の存在は有害ではない。

実施例４：ｇｙｒＡ遺伝子の複製
上述のように、Ｓｔａｂｙ（登録商標）技術は、大腸菌に関するＣｃｄＢタンパク質の毒性に基づくものである。ＣｃｄＡ解毒剤はｃｃｄＢ遺伝子の発現を阻害するため、選択圧は、この毒性遺伝子に対して適用される。よって、ＣｃｄＢに対する一部の大腸菌耐性株を見出す可能性は低い。しかしながら、この種の耐性は、変異剤の存在下で数回の増殖を使用することにより、人工的に単離されている（Ｂｅｒｎａｒｄｅｔａｌ．，ＪＭｏｌＢｉｏｌ．１９９２，２２６：７３５）。この耐性株は、アルギニン４６２をシステインに変えるｇｙｒＡ遺伝子の変異（ＣｃｄＢの標的）を提示する。

本出願人の毒性タンパク質モデルＶＨＨ６（実施例１参照）の発現の間、野生型ｃｃｄＢ遺伝子を用いるが、プラスミド（よってｃｃｄＡ遺伝子）を用いることなく株を単離した。よってこれらの株はＣｃｄＢに耐性があった。これらの株のｇｙｒＡ遺伝子を、別のまだ記載されていないアミノ酸（セリン）へのアルギニン４６２の改変を確認するために、シークエンシングした。

この特許で述べられるようにｃｃｄＢ遺伝子を複製することにより、本出願人は、ｇｙｒＡ遺伝子に関する選択圧が増加し、より容易にＣｃｄＢ耐性株を作製すると推測する。これらの変異株を回避するために、ｇｙｒＡ遺伝子の複製もまた実現させた。この新規のｇｙｒＡの複製物を、組み換えアームとして使用される相同領域により囲まれたｇｙｒＡ、カナマイシン、およびｃｃｄＢ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの形質導入により、ＳＥ２株のｙｊｊＫ遺伝子およびｓｌｔ遺伝子の間のｃｃｄＢの第２の複製物と同時に統合させた。この組み換え事象を、カナマイシン耐性遺伝子を使用して選択した。この遺伝子は、ＦＬＰリコンビナーゼを使用して除去される２つのＦＲＴ部位により囲まれていた。この構築は成功しており、株の生存率は変化しなかった。ＴｒａＧの発現特性を、実施例２のように試験し、ＳＥ４（ＢＬ２１（ＤＥ３）２ｃｃｄＢ２ｇｙｒＡ）と呼ばれるＳＥ２株の誘導体を用いて行った。

図８に示されるように、従来のＳｔａｂｙ（登録商標）システム（１つのｃｃｄＢ遺伝子）の下でのＴｒａｇの産生は、新規のＳｔａｂｙ（登録商標）システム（２つのｃｃｄＢ遺伝子＋１つの追加的なｇｙｒＡの複製物）を用いた産生と同等である。しかしながら、１つのｃｃｄＢを用いた産生はすでに非常に良好な収率を提供しており、よってこの収率の増加は、新規のＳｔａｂｙ（登録商標）システムを使用することによるものであっても可能ではない場合がある。本出願人は、２つのｃｃｄＢおよび１つの追加的なｇｙｒＡの複製物（１つの複製物はすでに存在）の付加が、ＣｃｄＢ毒性タンパク質の高い毒性によってタンパク質の量を低下させないことを観察することができる。

同様の遺伝的な改変を、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０誘導体（ＫＷ４：Ｗ３１１０２ｃｃｄＢ２ｇｙｒと呼ばれる株）に使用した。この株を、毒性タンパク質モデルＶＨＨ６の産生に関して他のＷ３１１０株と比較した。産生の後、各株を、プラスミドの存在に関して試験し、１００％の保持がすべての株で観察された。図９に示されるように、ＶＨＨ６の産生は、ｃｃｄＢ遺伝子の２つの複製物が存在する場合により良好である（図９）。さらに、Ｓ４株について述べられているように、２つのｃｃｄＢおよび１つの追加的なｇｙｒＡの複製物（１つの複製物はすでに存在）の付加は、産生されるタンパク質の量を低下するものではなく、増殖特性に影響しない。

実施例５：Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７由来のｃｃｄＢの使用
Ｆプラスミド以外の別の起源由来のｃｃｄＢ遺伝子の複製物が、２ｃｃｄＢシステムで使用され得るかを検証するために、本出願人は、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７由来のｃｃｄＢの複製物を含む株を構築した。Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７由来のｃｃｄＢ遺伝子は、（１）（アミノ酸レベルで）Ｆプラスミド由来のｃｃｄＢ遺伝子と３６％のみの相同性を有するため、および（２）Ｆプラスミド由来の同一のＣｃｄＡタンパク質により阻害されるため、選択された。

最初に、ＤＮＡフラグメントを細菌ゲノムに挿入した後に耐性遺伝子を切除できる２つのＦＲＴ部位により囲まれたｃｃｄＢ_Ｏ１５７遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを構築した。この構築物をプラスミドに結合し、Ｂ４６２（ｇｙｒＡ４６２変異の存在によりＣｃｄＢに耐性がある株）に形質転換した。第２に、耐性遺伝子の除去の後に新規のＫＷ５株（Ｗ３１１０ｙｊｊＫ：：ＦＲＴｃｃｄＢ_Ｏ１５７）を作製するため、Ｐｂａｄプロモーターの制御下でｃｃｄＡをコードするプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０のｙｊｊＫおよびｓｌｔ遺伝子の間に、このフラグメントを挿入した。この株をＷＴ株として増殖させ、Ｐｂａｄプロモーターが抑制される（アラビノースの不存在下）場合に予測されるように、ｃｃｄＢ_Ｏ１５７遺伝子は細菌を殺傷する。これらの結果は、ｃｃｄＢ_Ｏ１５７遺伝子を使用して株を構築することが可能であることを示す。ＣｃｄＢ_Ｏ１５７タンパク質の産物は、ＦプラスミドＣｃｄＡにより相殺され、本発明に使用することができる。

実施例６：本発明の宿主細胞のさらなる改変
次に本出願人は、Ｑ、Ｓ、Ｒ、およびＲｚ遺伝子が欠失している発現系を含む遺伝的に改変したファージを含む細菌株に対する２ｃｃｄＢシステムの適用性を試験した。これら遺伝子の欠失は、ファージの偶発的な再活性化が起こる場合の宿主細胞の溶解を防止する。

相同組み換えによる欠失を可能にするために、２つのＦＲＴ部位を備え、Ｑ、Ｓ、Ｒ、およびＲｚ遺伝子に隣接する領域に囲まれたカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡフラグメント（国際特許公開公報第２０１３００４８１７号にすでに記載）を、ＳＥ２株［ＢＬ２１（ＤＥ３）ｄｃｍ：：ＦＲＴｃｃｄＢ］に形質導入して、カナマイシン耐性遺伝子を除去した後にＢＬ２１（ＤＥ３）ｄｃｍ：：ＦＲＴｃｃｄＢＱＳＲＲｚ：：ＦＲＴ株を作製した。第２に、ｙｊｊＫ：：ＦＲＴｋａｎＦＲＴｃｃｄＢをコードする別のフラグメントを、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｄｃｍ：：ＦＲＴｃｃｄＢＱＳＲＲｚ：：ＦＲＴに形質導入して、カナマイシン耐性遺伝子を除去した後にＳＥ５［ＢＬ２１（ＤＥ３）ｄｃｍ：：ＦＲＴｃｃｄＢｙｊｊＫ：：ＦＲＴｃｃｄＢＱＳＲＲｚ：：ＦＲＴ］を作製した。最終的な株は、上述の２つのｃｃｄＢ遺伝子、および細菌の溶解を回避するＱ、Ｓ、Ｒ、Ｒｚ遺伝子の欠失を含む。

また、ＳＥ５株を、改変していないＱＳＳＲｚ相同株（ＳＥ３）と比較する。両株ともＳＥ１株と同一の速度で増殖しており、対照タンパク質（ＴｒａＧ）の産生もまた同一の結果を提供する。

Claims

ＣｃｄＢをコードする核酸配列の少なくとも２つの複製物を染色体上に含み、且つＣｃｄＡをコードする核酸配列の少なくとも１つの複製物を含む、細菌宿主細胞であって、
前記細菌宿主細胞は、大腸菌であり、
前記ＣｃｄＡをコードする核酸配列は、目的の組み換えペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸配列が挿入されているか挿入され得る発現系をさらに含むプラスミドによって担持されており、
前記目的の組み換えペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質は、抗体または抗体フラグメントである、
細菌宿主細胞。
前記ＣｃｄＢが、配列番号１、または配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する任意の核酸配列、によりコードされるＣｃｄＢである、請求項１に記載の細菌宿主細胞。
前記ＣｃｄＡが、配列番号１３、または配列番号１３と少なくとも９０％の同一性を有する任意の核酸配列、によりコードされるＣｃｄＡである、請求項１または２に記載の細菌宿主細胞。
前記発現系が、Ｔ７プロモーター、Ｐｔｒｃ、Ｐａｒａ、およびＰｌａｃを含む群から選択されるプロモーターを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の細菌宿主細胞。
前記発現系がＴ７プロモーターを含み、前記宿主細胞がＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の細菌宿主細胞。
前記発現系がＴ７プロモーターを含み、前記宿主細胞が、そのゲノム内に挿入された遺伝的に改変したファージをさらに含む、
請求項１～５のいずれか１項に記載の細菌宿主細胞。
遺伝子ｔｏｎＡ、ｇａｌＫ、ａｒａＢ、ａｒａＡ、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ、ｒｃｓＡ、ｈｓｄＲ、ｍｒｒ、ｅｎｄＡ、およびｒｅｃＡのうち少なくとも１つの不活性化をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の細菌宿主細胞。
ｇｙｒＡ遺伝子の少なくとも１つの追加的な複製物をさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の細菌宿主細胞。
ＣｃｄＢをコードする核酸配列の少なくとも２つの複製物を染色体上に含む細菌宿主細胞、および
ＣｃｄＡをコードする核酸配列の少なくとも１つの複製物と、目的の組み換えペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸配列が挿入されているか挿入され得る発現系の少なくとも１つの複製物と、を含むベクター、
を含む、キットであって、
前記細菌宿主細胞は大腸菌であり、
前記目的の組み換えペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質は、抗体または抗体フラグメントである、
キット。
前記目的の組み換えペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸配列が、Ｔ７プロモーター、Ｐｔｒｃ、Ｐａｒａ、およびＰｌａｃを含む群から選択されるプロモーターの制御下にある、請求項９に記載のキット。
目的の抗体または抗体フラグメントを産生させる方法であって、請求項１～８のいずれか１項に記載の細菌宿主細胞を培養することと、前記目的の抗体または抗体フラグメントを回収することと、を含む方法。