ES2903413T3

ES2903413T3 - Célula huésped mejorada para la producción de proteínas

Info

Publication number: ES2903413T3
Application number: ES15741223T
Authority: ES
Inventors: Cédric Szpirer; Jonathan Cavrenne; Benjamin Michel
Original assignee: RP Scherer Technologies LLC
Current assignee: RP Scherer Technologies LLC
Priority date: 2014-07-25
Filing date: 2015-07-24
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2035-07-24
Also published as: EP3172334A1; JP7194711B2; JP2020202828A; CL2017000200A1; AU2015293825B2; CA2956107A1; AU2015293825A1; CN106715681A; US10718001B2; BR112017001463A2; JP2022162124A; JP7126824B2; US20170211118A1; JP2017523780A; WO2016012607A1; CN106715681B; EP3172334B1

Abstract

Célula huésped bacteriana que comprende al menos 2 copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa y al menos una copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína antídoto para la proteína venenosa, siempre que dichas al menos 2 copias de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína venenosa se inserten dentro del cromosoma de la célula huésped bacteriana, en la que la célula huésped bacteriana es E. coli, en la que dicha proteína venenosa es CcdB y dicha proteína antídoto es CcdA, y en la que dicha secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto es transportada por un plásmido que comprende además un sistema de expresión en el que una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés es o puede insertarse, en el que la inserción de una segunda copia de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína venenosa en el genoma de la célula huésped aumenta el rendimiento de la producción de proteína.

Description

DESCRIPCIÓN

Célula huésped mejorada para la producción de proteínas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a sistemas heterólogos para la producción de proteínas recombinantes. En particular, la presente invención se refiere a células huésped para su uso en métodos para producir proteínas con base en un sistema mejorado de antídoto de veneno.

Antecedentes de la invención

En la actualidad, los microorganismos se utilizan ampliamente para la producción de proteínas o ADN. Por lo general, estos procesos requieren el uso de plásmidos bacterianos como vectores portadores del gen que se va a expresar. Sin embargo, el mantenimiento del plásmido dentro de los microorganismos es limitado y, por lo tanto, la inestabilidad del plásmido representa una preocupación importante en la producción de proteínas recombinantes o en la producción de ADN.

Se ha demostrado que la tasa de crecimiento de las células portadoras de plásmidos se reduce significativamente con respecto a la de una célula sin plásmidos. Una teoría es que la replicación y transcripción de plásmidos, así como la producción de proteínas, representan una carga significativa sobre el metabolismo celular. Por lo tanto, en un proceso de fermentación, las células que pierden el plásmido exhiben una mayor aptitud que las células que todavía portan el plásmido, y las primeras superan rápidamente a las últimas en la población bacteriana.

Para limitar la pérdida de plásmido en una población celular y evitar que las células sin plásmido sobrevivieran y dominaran el cultivo, se insertaron marcadores seleccionables en los plásmidos.

Los marcadores seleccionables más comunes que se utilizan en los procedimientos de fermentación son los genes de resistencia a los antibióticos. Sin embargo, la contaminación del producto o la biomasa por antibióticos (o genes que codifican una resistencia a los antibióticos) es inaceptable desde una perspectiva médica o reglamentaria. Además, los genes de resistencia a los antibióticos pueden propagarse en el medio ambiente o transferirse a cepas patógenas. Además, estudios recientes demostraron que el uso de genes de resistencia a los antibióticos para producir una proteína recombinante reduce considerablemente el rendimiento de la producción de proteínas (Peubez et al., Microbial Cell Factories, 2010, 9: 65).

Por lo tanto, existe la necesidad de otros sistemas que permitan el mantenimiento del plásmido y que estén libres de los inconvenientes de los genes de resistencia a los antibióticos.

Una alternativa al uso de genes de resistencia a antibióticos es la complementación de un gen cromosómico mutado esencial con un alelo de tipo silvestre insertado en el plásmido. Por ejemplo, se desarrollaron sistemas en los que el huésped mutante es incapaz de sintetizar un aminoácido esencial sin un plásmido que lleve a cabo el gen que proporciona esta función. Sin embargo, este enfoque restringe seriamente las posibles opciones en el medio de crecimiento.

Otra estrategia desarrollada es un sistema en el que una titulación represora mediada por plásmidos supera la represión de un gen cromosómico esencial colocado bajo el control del operador lac. Sin embargo, este procedimiento tiene las siguientes limitaciones: (i) hace que el promotor Lac no esté disponible para otros fines, como la expresión de proteínas, (ii) el sistema se limita a E. coli u otras bacterias en las que el promotor Lac es funcional, y (iii) debe evitarse el medio que contiene lactosa.

Otro sistema alternativo al uso de genes de resistencia a antibióticos se basa en parejas de proteínas venenosas (es decir, moléculas que son tóxicas para la célula huésped) combinadas con sus antídotos. Por ejemplo, el gen del veneno puede ser expresado por la célula huésped a partir de una copia cromosómica, mientras que el antídoto lo porta el plásmido. Por lo tanto, se requiere la presencia del plásmido para la supervivencia de la célula huésped. Un ejemplo de pareja veneno/antídoto es el sistema ccdA (antídoto)/ccdB (veneno). CcdA y CcdB son las proteínas del antídoto y de la toxina codificadas por el plásmido F de E. coli. Juntos, aseguran la muerte de las células hijas que no reciben una copia de F. La expresión de la proteína ccdB interfiere con la etapa de reincorporación de la ADN girasa, lo que hace que el cromosoma de la célula huésped se corte en pedazos. Otros ejemplos de parejas de antídoto/veneno incluyen, entre otros, proteínas Kis/Kid, proteínas Phd/Doc, proteínas RelB/relE, proteínas PasB (o PasC)/PasA, proteínas mazF/maze.

El documento WO 2010/007246 describe un vector autorreplicante que carece de un gen resistente a antibióticos pero que comprende una secuencia que codifica una proteína CcdA y una secuencia heteróloga, así como células procariotas, concretamente CYS21 y SE1, que contienen dicho vector. Estas células contienen una sola copia de un gen ccdB en el cromosoma bacteriano.

Este sistema de antídoto/veneno se ha utilizado ampliamente en métodos de clonación, como se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 8,470,580: se usa una célula huésped que comprende el gen que codifica un veneno en combinación con un plásmido que comprende el gen que codifica el antídoto correspondiente. Este sistema permite así la selección directa de células que han integrado un gen de interés, ya que solo sobreviven las células que expresan el gen del antídoto.

Este sistema también se utiliza para la producción de proteínas, como describieron previamente los inventores (Szpirer y Milinkovitch, BioTechniques, 2005, 38 (5): 775-781). Inesperadamente, se observó un aumento de tres a cinco veces el nivel de producción de proteínas recombinantes, lo que demuestra el gran potencial de este sistema para producir proteínas recombinantes. Sin embargo, los inventores observaron que, cuando se usa este sistema para producir proteínas tóxicas, pueden aparecer algunos inconvenientes, como, por ejemplo, mutaciones dentro del gen de interés, mutaciones en el sistema antídoto/veneno y similares. Dispuestos a desarrollar un sistema mejorado de estabilización de plásmidos, modificaron el sistema clásico que comprende una copia del gen del antídoto combinada con una copia del gen del veneno. De manera sorprendente e inesperada, demostraron que la inserción de una copia adicional del gen del veneno en el genoma de la célula huésped aumenta la estabilidad del plásmido, pero también aumenta el rendimiento de producción de proteínas (de manera no correlacionada).

Resumen

La presente invención es como se define en las reivindicaciones.

La presente divulgación se refiere además a una célula huésped para producir un péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés, en la que dicha célula huésped comprende al menos 2 copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa. En una realización, dichas al menos 2 copias están en un replicón diferente al de una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto de la proteína venenosa. En una realización, dicha proteína venenosa es CcdB, codificada por la s Eq ID NO: 1 o cualquier secuencia de ácido nucleico que tenga al menos un 75% de identidad con la SEQ ID NO: 1.

En una realización, la célula huésped comprende además al menos una copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto para la proteína venenosa. En una realización, dicha proteína antídoto es CcdA, codificada por la SEQ ID NO: 13 o cualquier secuencia de ácido nucleico que tenga al menos un 75% de identidad con la SEQ ID NO: 13.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto es transportada por un plásmido que comprende además un sistema de expresión en el que se inserta o puede insertarse la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés. En una realización, dicho sistema de expresión comprende un promotor seleccionado del grupo que comprende un promotor de T7, Ptrc, Para y Plac. En otra realización, dicho sistema de expresión comprende un promotor de T7 y la célula huésped comprende además un gen de ARN polimerasa de T7, preferiblemente insertado en su genoma, más preferiblemente en un sistema de expresión de T7. En otra realización, el sistema de expresión comprende un promotor de T7 y la célula huésped comprende además un fago modificado genéticamente insertado dentro de su genoma, preferiblemente dicho fago se define como un fago en el que:

- se inserta un sistema de expresión de T7,

- los genes S, R, y/o el Q están inactivos, y

- el gen Int y/o Xis están inactivados.

En una realización, la célula huésped es una bacteria, preferiblemente una bacteria Gram negativa, más preferiblemente una Enterobacteriacea, e incluso más preferiblemente E. coli. En una realización, la célula huésped de la invención comprende además la inactivación de al menos uno de los genes tonA, galK, araB, araA, lon, ompT, rcsA, hsdR, mrr, endA y recA. En una realización, la célula huésped de la invención comprende además al menos una copia adicional del gen gyrA.

La presente divulgación también se refiere a un kit que comprende una célula huésped como se describió anteriormente y un vector que comprende al menos una copia de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto y al menos una copia de un sistema de expresión en el que se inserta o se puede insertar la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido recombinante, un polipéptido o proteína de interés. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína de interés está bajo el control de un promotor seleccionado del grupo que comprende un promotor de T7, Ptrc, Para y Plac.

También se describe en el presente documento un método para producir un péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés, en el que dicho método comprende cultivar la célula huésped como se describe anteriormente y recuperar el péptido, polipéptido o proteína de interés. En una realización, la proteína recombinante es una proteína secretada, una proteína transmembrana o una proteína que es tóxica para la cepa bacteriana.

Definiciones

En la presente invención, los siguientes términos tienen los siguientes significados:

- Como se usa en este documento, un "péptido" se refiere a un polímero lineal de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos; un" polipéptido "se refiere a un polímero lineal de al menos 50 aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos; y una proteína se refiere específicamente a un entidad formada por uno o más péptidos o polipéptidos, y opcionalmente por cofactores no polipéptidos.

- "Péptido recombinante, polipéptido o proteína" se refiere a un péptido, polipéptido o proteína generado a partir de ADN recombinante, es decir, de ADN insertado artificialmente en una célula huésped productora.

- "Proteína venenosa" se refiere a una proteína que es tóxica para la célula huésped que la produce. Como se usa en este documento, una proteína venenosa es, por tanto, tóxica para la célula huésped de la invención.

Descripción detallada

La presente divulgación se refiere a una célula huésped para producir péptidos, polipéptidos o proteínas recombinantes, en la que dicha célula huésped comprende al menos dos copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa. En una realización, la célula huésped comprende 2 copias de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína venenosa, o 3, 4, 5 o 6 copias (o más) de esta secuencia de ácido nucleico.

Los ejemplos de proteínas venenosas incluyen, pero no se limitan a, CcdB, Kid, Doc, RelE, PasA, MazE o cualquier otra molécula venenosa como, por ejemplo, bacteriocinas que son o no de origen plasmídico. La proteína venenosa también puede ser una proteína toxina que es natural o artificialmente tóxica y afecta una o más funciones vitales de una célula (procariota). La proteína codificada por el gen sacB (de Bacillus amyloliquefaciens), la proteína GpE, la proteína GATA-1 y la proteína Crp son otros ejemplos de estas moléculas tóxicas. El gen sacB codifica una levan sacarasa que cataliza la hidrólisis de sacarosa en productos que son tóxicos para E. Coli (Pierce et al. Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 89, N° 6 (1992) pág. 2056-2060). La proteína GpE está codificada por los genes E del bacteriófago [phi]X174, que incluye seis sitios de restricción únicos. GpE causa lisis de células de E. Coli(Heinrich et al., Gene, vol.

42 (3) (1986) pág. 345-349). La proteína GATA-1 ha sido descrita por Trudel et al. (Biotechniques 1996, Vol. 20 (4), p.

684-693). La proteína Crp ha sido descrita por Schlieper et al. (Anal. Biochem. 1998, Vol. 257(2), p. 203-209).

Preferiblemente, la célula huésped comprende al menos dos, preferiblemente 2, copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CcdB. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CcdB es el gen ccdB (secuencia SEQ ID NO: 1) o cualquier secuencia que codifique una proteína CcdB funcional que tenga al menos 75%, preferiblemente al menos 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o más de identidad con la SEQ ID NO: 1.

En una realización, al menos 2 copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa (preferiblemente CcdB) no tienen 100% de identidad (por ejemplo, tienen aproximadamente 30%, preferiblemente aproximadamente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o más de identidad), para evitar eventos de recombinación entre 2 copias.

En una realización, al menos 2 copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa (preferiblemente CcdB) son de diferentes orígenes (por ejemplo, son de al menos 2 especies bacterianas) o la primera es de origen plásmido y la segunda es de origen cromosómico. Por ejemplo, la primera copia de CcdB puede ser de E. coli O157:H7 y la segunda copia de CcdB pueden ser del plásmido F.

En una realización, al menos dos proteínas venenosas son 100% idénticas, pero están codificadas por secuencias de ácido nucleico que no tienen 100% de identidad (es decir, las secuencias de ácido nucleico difieren por diferencias no codificantes, como, por ejemplo, un codón que codifica un aminoácido dado se reemplaza por otro codón que codifica el mismo aminoácido).

En una realización, al menos dos proteínas venenosas no son 100% idénticas (por ejemplo, tienen aproximadamente 30%, preferiblemente aproximadamente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o más de identidad), pero su efecto puede ser contrarrestado por el mismo antídoto.

En una realización, al menos 2 copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa (preferiblemente CcdB) no tienen 100% de identidad, pero ambas contienen dominios putativos conservados de acuerdo con el análisis in silico, utilizando, por ejemplo, el programa TAQ V1.0 descrito en Guglielmini et al. (BMC Microbiology 2008, 8: 104). En una realización, la segunda copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa es una proteína supuestamente venenosa relacionada con la primera e identificada usando el programa TAQ V1.0. En una realización, la primera copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa es CcdB, y la segunda copia se selecciona entre las 22 toxinas CcdB inferidas in silico identificadas mediante el programa TAQ VI.0 de Guglielmini et al., 2008.

En una realización, al menos dos copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa (preferiblemente CcdB) están en un replicón diferente al de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto correspondiente, es decir, en un replicón que no comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto correspondiente. En particular, de acuerdo con esta realización, las células huésped que comprenden al menos dos copias del plásmido F (el plásmido F comprende un replicón que comprende tanto una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína venenosa como una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto) no forman parte del presente invención.

En una realización, al menos dos copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa (preferiblemente CcdB) están en el mismo replicón. En otra realización, al menos dos copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa (preferiblemente CcdB) están en al menos dos replicones distintos.

En una realización, al menos una de al menos dos copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa (preferiblemente CcdB) está en un plásmido. En otra realización, al menos dos copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa (preferiblemente CcdB) están en un plásmido.

En una realización, al menos dos copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa (preferiblemente CcdB) son cromosómicas, es decir, se insertan dentro del genoma de la célula huésped.

En una realización, cuando se insertan dos copias de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa dentro del genoma de la célula huésped, cada una se encuentra en un lado opuesto del cromosoma de la célula huésped. Preferiblemente, cada copia se inserta en una región no codificante del cromosoma de la célula huésped o en un gen a inactivar.

Por ejemplo, una primera copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa se inserta en el gen dcm, y una segunda copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa se inserta entre los genes yjjK y slt, es decir, en el lado opuesto del cromosoma de E. coli, en un espacio intergénico no codificante.

El término "identidad" o "idéntico", cuando se usa en una relación entre las secuencias de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipéptidos, se refiere al grado de relación de secuencias entre secuencias de ácido nucleico o polipéptidos (respectivamente), según lo determinado por el número de coincidencias entre cadenas de dos o más residuos de ácido nucleico o residuos de aminoácidos (respectivamente). La "identidad" mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la menor de dos o más secuencias con alineaciones de espacios (si los hay) abordadas por un modelo matemático o programa informático particular (es decir, "algoritmos"). La identidad de polipéptidos relacionados se puede calcular fácilmente mediante métodos conocidos. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics 5 and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; y Carillo et al., SIa M J. Applied Math. 48, 1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en programas informáticos disponibles públicamente. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. \2, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol.

215, 403-410 (1990)). El programa BLASTX está disponible públicamente en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Maryland. 20894; Altschul et al., citado anteriormente). El conocido algoritmo de Smith Waterman también se puede utilizar para determinar la identidad.

Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína venenosa está bajo el control del promotor nativo. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CcdB puede fusionarse secuencia abajo con el promotor ccd. Por tanto, en presencia del antídoto, el promotor ccd está fuertemente reprimido.

En una realización, la célula huésped es un microorganismo, preferiblemente un procariota, más preferiblemente una bacteria, e incluso más preferiblemente una bacteria Gram negativa. Ventajosamente, la célula huésped es una bacteria de la familia Enterobacteriacea de acuerdo con la taxonomía vigente aplicable. Si cambia la taxonomía, el experto en la materia sabe cómo adaptar los cambios en la taxonomía para deducir las cepas que podrían usarse en la presente invención. Ejemplos de bacterias de la familia Enterobacteriacea incluyen, pero no se limita a, bacterias pertenecientes al género Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella y Yersinia. De acuerdo con una realización preferida, la célula huésped pertenece a al género Escherichia, y más preferiblemente la célula huésped es Escherichia coli (E. coli). Ejemplos de cepas de E. coli que podrían usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cepas derivadas de E. coli K-12, E. coli B o E. coli W, como por ejemplo MG1655, W3110, DG1, DG2, Top10, DH10B, DH5alpha, HMS174, BL21, BL21 (DE3), HMS174 (DE3), BL21 (DE3) pLysS y BL21 (DE3) pLysE.

En una realización, los genes de las células huésped pueden inactivarse.

Como se usa en este documento, el término "inactivado" se refiere a la interrupción o supresión de la expresión de un gen a niveles transcripcionales o traduccionales. Preferiblemente, el término "inactivado" se refiere a un gen cuya transcripción está suprimida. De acuerdo con la invención, la inactivación de un gen puede deberse a la mutación del gen o a la inserción de un sistema de expresión dentro de la secuencia codificante del gen. En el sentido de la presente invención, el término "mutación" se refiere a un cambio estable en la secuencia genética. Los ejemplos de mutación que podrían conducir a la inactivación de un gen en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, mutaciones puntuales, inserciones, eliminaciones y amplificación o duplicación de genes. Preferiblemente, la mutación es una eliminación. El término "eliminación", como se usa en este documento, significa la pérdida o ausencia de un gen, preferiblemente la pérdida o ausencia total de un gen. Más preferiblemente, la eliminación comienza en o antes del codón de inicio del gen eliminado y termina en o después del codón de terminación del gen eliminado.

En una forma de realización, el gen tonA (también conocido como fhuA, SEQ ID NO: 2) está inactivo. La proteína TonA/FhuA es un receptor de los fagos T1, T5 y Phi80.

En una forma de realización, el gen galK (SEQ ID NO: 3) está inactivo. La eliminación de este gen permite el uso de la selección positiva/negativa de galK para la eliminación de genes mediante un método basado en la recombinación homóloga.

En una forma de realización, el gen araB (SEQ ID NO: 4) está inactivo. En otra forma de realización, el gen araA (SEQ ID NO: 5) está inactivo. La inactivación de araB y/o araA se recomienda para el uso del promotor Para (inducible por arabinosa) dentro de la célula huésped.

En una forma de realización, el gen lon (SEQ ID NO: 6) y/o el gen om pT (SEQ ID NO: 7) están inactivos. La proteína Lon es una proteasa dependiente de ATP. La proteína OmpT es una proteasa de la membrana externa. Preferiblemente, los genes lon y ompT están inactivos.

En una forma de realización, el gen rcsA (SEQ ID NO: 8) está inactivo. La proteína RcsA es un regulador positivo de la síntesis de la cápsula, que es degradada por la proteasa Lon.

En una forma de realización, el gen hsdR (SEQ ID NO: 9) y/o el gen mrr (SEQ ID NO: 10) están inactivos. Las proteínas HsdR y Mrr son enzimas de restricción con diferente especificidad. Preferiblemente, los genes hsdR y mrr ambos están inactivos.

En una forma de realización, el gen endA (SEQ ID NO: 11) y/o el gen recA (SEQ ID NO: 12) están inactivos. EndA es una endonucleasa específica de ADN. RecA es una proteína de recombinación con actividad proteasa y nucleasa. Preferiblemente, los genes endA y recA están ambos inactivos.

En una realización de la invención, al menos uno de los genes tonA, galK, araB, araA, lon, ompT, rcsA, hsdR, mrr, endA y recA están inactivos. Preferiblemente, los genes inactivados se eliminan.

En una realización preferida, los genes tonA, galK, araB, lon, ompT, rcsA, hsdR, mrr, endA y recA están inactivos. Preferiblemente, los genes tonA, galK, araB, lon, ompT, rcsA, hsdR, mrr, endA y recA se eliminan.

En una realización, la célula huésped comprende al menos una copia adicional de la secuencia de ácido nucleico que codifica la diana de la proteína venenosa. En una realización, la célula huésped comprende 2 copias de la secuencia de ácido nucleico que codifica la diana de la proteína venenosa, o 3, 4, 5 o 6 copias (o más) de esta secuencia de ácido nucleico. Preferiblemente, dicha al menos una copia adicional es cromosómica, es decir, se inserta dentro del genoma de la célula huésped.

En una realización en la que la proteína venenosa es CcdB, la célula huésped de la invención puede comprender al menos una copia adicional de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína GyrA.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína GyrA es el gen gyrA (secuencia SEQ ID NO: 15) o cualquier secuencia que codifique una proteína GyrA funcional que tenga al menos 75%, preferiblemente al menos 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o más de identidad con la SEQ ID NO: 15.

En una realización, la segunda copia de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína diana de la proteína venenosa se inserta en el cromosoma de la célula huésped en el mismo lugar que una copia de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína venenosa. En una realización, la segunda copia de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína diana de la proteína venenosa se inserta de forma concomitante con una copia de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína venenosa.

En una realización, la célula huésped comprende al menos una copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto que contrarresta los efectos de la proteína venenosa expresada por la célula huésped de la invención.

Los ejemplos de proteínas antídoto incluyen, entre otros, CcdA (antídoto de CcdB), Kis (antídoto de Kid), Phd (antídoto de Doc), RelB (antídoto de RelE), PasB (o PasC) (antídoto de PasA), MazF (antídoto de MazE) o moléculas de inmunidad (antídotos de bacteriocinas). La proteína antídoto contra una molécula tóxica es cualquier proteína capaz de reducir o suprimir el efecto de la molécula tóxica correspondiente en una célula (preferiblemente una célula procariota), cuando dicha molécula tóxica es producida por dicha célula.

De acuerdo con una realización preferida, la proteína venenosa es CcdB y la célula huésped comprende al menos una copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica CcdA. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CcdA es el gen ccdA (secuencia SEQ ID NO: 13) o cualquier secuencia que codifique una proteína CcdA funcional que tenga al menos 75%, preferiblemente al menos 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o más de identidad con la SEQ ID NO: 13. Como se usa en el presente documento, una proteína CcdA "funcional" se refiere a una proteína que tiene al menos un 75% de identidad con la SEQ ID NO: 13 y que conserva la capacidad de CcdA para reducir o suprimir el efecto de CcdB en una célula.

En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína antídoto es transportada por un vector, tal como, por ejemplo, un plásmido, un bacteriófago, un virus, una vesícula catiónica o cualquier otro tipo de vector, preferiblemente por un plásmido. Por tanto, el experto en la materia puede deducir fácilmente que el número de copias de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto depende del tipo de plásmido utilizado. Por ejemplo, un plásmido de la familia pBR322 está normalmente presente en una célula en un número de copias que varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 100, preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 50; mientras que un plásmido de la familia pUC está normalmente presente en una célula en un número de copias que varía de aproximadamente 100 a aproximadamente 500, preferiblemente de aproximadamente 150 a aproximadamente 200. Sin embargo, el experto en la materia también puede deducir fácilmente que el número de copias de un plásmido dentro de una célula huésped también puede depender de la tasa de replicación y/o del crecimiento de la célula huésped.

En una realización preferida, la célula huésped comprende además al menos una copia de un vector, preferiblemente un plásmido, que porta (1) una secuencia de ácido nucleico que codifica el antídoto para la proteína venenosa, y (2) una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido recombinante, polipéptido o proteína de interés a producir o un sitio de inserción para insertar la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés a producir.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés está comprendida dentro de un sistema de expresión; o el sitio de inserción es tal que, cuando se inserta, la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés está comprendida dentro de un sistema de expresión. En particular, la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés se coloca, o se colocará después de la inserción, bajo el control de un promotor.

Como se usa en este documento, un "sistema de expresión" se refiere a una molécula de ADN lineal o circular compuesta por un fragmento que codifica la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés unido operativamente a un fragmento adicional para la transcripción del sistema.

El fragmento adicional incluye un promotor y una secuencia de codón de parada. El sistema de expresión puede contener además uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores de selección y una secuencia que codifica un sitio de unión a ribosoma.

"Unido operativamente" significa que los fragmentos están dispuestos para que funcionen como se supone que deben hacerlo, por ejemplo, una vez que comienza la transcripción en el promotor, atraviesa el fragmento codificado hasta el codón de parada.

"Promotor" en el significado de la presente invención es un elemento de control de la expresión que permite la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la transcripción.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico está bajo el control de un promotor "fuerte". Un promotor fuerte se caracteriza por una alta afinidad de unión de la secuencia promotora a una ARN polimerasa, normalmente la ARN polimerasa correspondiente de origen natural, por un lado, y por una alta tasa de formación de ARNm por esa ARN polimerasa por otro lado.

En una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico está bajo el control de un "promotor inducible". Un "promotor inducible" es un promotor que puede estar regulado por factores externos, por ejemplo la presencia de una molécula inductora (también denominada "inductora") o la ausencia de una molécula represora, o factores físicos como temperatura aumentada o disminuida, osmolaridad o valor de pH. Diferentes promotores y los respectivos principios de inducción fueron revisados por Makrides et al., (Microbiological Reviews, 1996, (60) 3: 512-538). Los ejemplos de promotores inducibles que pueden usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, el promotor tac o trc, el promotor lac o lacUV5 (todos inducibles por lactosa o su análogo ipTG (isopropiltiol-p-D-galactósido)), el promotor araBAD estrictamente regulable (Para; Guzman et al., 1995, inducible por arabinosa), el promotor trp (inducible por la adición de ácido p-indol acrílico o inanición de triptófano, reprimible por adición de triptófano), el promotor lambda pL (A) (inducción por aumento de temperatura), el promotor phoA (inducible por inanición de fosfato), el PprpB (inducción con propionato) u otros promotores adecuados para la expresión de péptidos, polipéptidos o proteínas recombinantes, que todos utilizan a Rn polimerasa de E. coli.

Entre los promotores inducibles se encuentran aquellos que muestran un comportamiento de expresión "con fugas". Dichos promotores (los denominados "promotores de fugas") son, en principio, inducibles, pero, no obstante, también muestran expresión basal sin ser inducidos externamente. Los promotores inducibles que muestran expresión con fugas en condiciones no inducidas pueden comportarse de manera similar a los promotores constitutivos (es decir, están activos de manera constante y continua o pueden activarse o potenciarse como resultado de ciertas condiciones de cultivo). Los promotores de fugas pueden ser particularmente útiles para procesos de cultivo operados de forma continua. Ejemplos de promotores de fugas son el promotor de T7 y el promotor trp. En el sentido de la presente invención, el término "promotor de T7" incluye promotores que están presentes en el genoma del bacteriófago T7, así como secuencias consenso y variantes de dichos promotores con la capacidad de mediar la transcripción por la ARN polimerasa de T7. El bacteriófago T7 contiene diecisiete secuencias promotoras diferentes, todas las cuales comprenden una secuencia de nucleótidos altamente conservada.

En una realización, el promotor también puede ser constitutivo, es decir, un promotor que controla la expresión sin la necesidad de inducción por un lado, o la posibilidad de represión por otro lado. Por lo tanto, existe una expresión continua y estable en un cierto nivel. Como ejemplo, el fuerte promotor constitutivo HCD (Poo et al., Biotechnology Letters, 2002, 24: 1185-1189; Jeong et al., Protein expression and purification, 2004, 36: 150-156) se puede aplicar para la expresión constitutiva.

Ventajosamente, la expresión del péptido, polipéptido o proteína de interés se induce en condiciones particulares, tales como, por ejemplo, bajo selección.

De acuerdo con una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína de interés se coloca bajo el control de un promotor de T7, de un promotor inducible por IPTG, tal como, por ejemplo, un promotor Ptrc o un promotor Ptac, o de un promotor inducible por arabinosa, tal como, por ejemplo, Para.

En una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto es directamente funcional, es decir, codifica directamente una proteína antídoto funcional. Además, en una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína de interés o el sitio de inserción no se coloca dentro de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto.

En una realización, el vector comprende un locus cer. El locus cer permite la herencia estable de ColE1 y plásmidos relacionados al prevenir la acumulación descontrolada de multímeros conocida como "catástrofe de dímeros". La resolución de multímeros se logra mediante la acción de la recombinasa específica del sitio XerCd en el sitio cer. Preferiblemente, cuando un locus cer se inserta dentro del vector de la invención, la célula huésped es Escherichia coli.

En una realización, el vector no comprende ningún gen de resistencia a antibióticos. En otra realización, la célula huésped de la invención no comprende genes de resistencia a antibióticos. En una realización, ni el vector ni la célula huésped de la invención comprenden ningún gen de resistencia a antibióticos. Por lo tanto, de acuerdo con esta realización, no se requiere antibiótico cuando se produce un péptido, polipéptido o proteína de interés utilizando la célula huésped y el vector de la invención.

La presente divulgación también se refiere a un kit que comprende una célula huésped, que comprende al menos dos copias de un ácido nucleico que codifica una proteína venenosa y al menos un vector (preferiblemente un plásmido) como se describió anteriormente. Preferiblemente, dicho vector porta al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto de la proteína venenosa y una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés en un sistema de expresión, o un sitio de inserción para insertar la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés en un sistema de expresión.

De acuerdo con una realización preferida, la célula huésped de la invención comprende al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína CcdB insertada en su genoma, y el vector porta al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica CcdA.

En una realización, el vector comprende un sistema de expresión y un sitio de inserción para insertar la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína de interés dentro de dicho sistema de expresión, obteniendo así un vector funcional para producir el péptido, polipéptido o proteína de interés. Por lo tanto, antes de transformar las células huésped con el vector de la invención para producir el péptido, polipéptido o proteína de interés, la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína de interés debe insertarse dentro del vector en el sitio de inserción. Los métodos para insertar una secuencia de ácido nucleico dentro de un sitio de inserción son bien conocidos por los expertos en la técnica y normalmente se basan en el uso de enzimas de restricción.

Con respecto al péptido, polipéptido o proteína de interés, puede referirse a cualquier péptido, polipéptido o proteína que se va a producir a escala de fabricación, por ejemplo, un péptido, polipéptido o proteína industrial o un péptido, polipéptido o proteína terapéutica.

Ejemplos de péptidos, polipéptidos o proteínas que pueden producirse mediante el método de la invención son, sin limitación, enzimas, proteínas reguladoras, receptores, péptidos (por ejemplo, hormonas peptídicas), citocinas, anticuerpos, nanocuerpos, proteínas de membrana o de transporte.

El péptido, polipéptido o proteína de interés también pueden ser antígenos usados para vacunación, vacunas, proteínas de unión a antígenos, proteínas inmunoestimuladoras, alérgenos, anticuerpos de longitud completa o fragmentos o derivados de anticuerpos. Los derivados de anticuerpos pueden seleccionarse del grupo de anticuerpos monocatenarios, (scFv), fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, anticuerpos de dominio único (fragmento VH o VL), dominios variables individuales de camélidos (VHH) u otros formatos de anticuerpos como se describe, por ejemplo, en Andersen y Reilly (Current Opinion in Biotechnology, 2004, 15: 456-462) o Holliger y Hudson (Nature Biotechnology, 2005 (23) 9: 1126-1136).

El péptido, polipéptido o proteína de interés en la presente invención también puede ejemplificarse mediante proteína (antígeno viral), por ejemplo, proteína de cubierta, proteína central, proteasa, transcriptasa inversa, integrasa, etc., codificadas en el genoma de un virus patógeno, por ejemplo, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, I-HV, influenza, etc., factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento de células madre (SCF), el factor de crecimiento de hepatocitos (h Gf ), el factor de crecimiento transformante (TGF), el factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), etc., citocinas tales como factor de necrosis tumoral, interferón, interleucina, etc., factores hematopoyéticos tales como eritropoyetina, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, factor estimulante de colonias de macrófagos, trombopoyetina, etc., hormonas peptídicas tales como hormona liberadora de hormona luteinizante (LB-RH), hormona liberadora de tirotropina (TRH), insulina, somatostatina, hormona del crecimiento, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), hormona estimulante de melanocitos (MSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH), hormona luteinizante (LU), hormona estimulante de folículos (FSH), vasopresina, oxitoxina, calcitonina, hormona paratiroidea (PTH), glucagón, gastrina, secretina, pancreozimina, colecistoquinina, angiotensina, lactógeno de placenta humana, gonadotropina coriónica humana (HCG), ceruleína, motilina, etc., péptidos analgésicos tales como encefalina, endorfina, dinorfina, quiotorfina, etc., enzimas tales como superóxido dismutasa (SOD), uroquinasa, activador de plasminógeno tisular (TPA), asparaginasa, calicreína, etc., neurotransmisores peptídicos tales como bombesina, neutrotensina, bradiquinina, sustancia P, péptido amiloide de Alzheimer (AD), SOD1, presenilina 1 y 2, renina, sinucleína D, amiloide A, amiloide P, activina, anti-HER-2, bombesina, encefalinasa, inhibidores de proteasa, enzimas terapéuticas, D1-antitripsina, inhibidor de tripsina de mamíferos, inhibidor de tripsina pancreática de mamíferos, calcitonina, factor de hipertrofia cardíaca, cardiotrofinas (tales como cardiotrofina-1), proteínas CD (tales como CD-3, CD-4, CD-8 y CD-19), CFTR, CTNF, DNasa, gonadotropina coriónica humana, péptido asociado a gonadotropina de ratón, citocinas, transtiretina, amilina, lipoproteínas, linfocinas, lisozima, una hormona del crecimiento (incluida la hormona de crecimiento humano), hormona de crecimiento bovino, factor de liberación de la hormona de crecimiento, hormona paratiroidea, hormona estimulante de la tiroides, factores de crecimiento, factor de crecimiento neurotrófico derivado del cerebro, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (tal como D FGF y D FGF), factor de crecimiento similar a la insulina I y II, des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento nervioso (tal como NGF-D), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptores de hormonas de crecimiento o factores de crecimiento, factor de crecimiento transformante (TGF) (tal como TGF-D, TGF-D1, TGF-D2, TGF-D3, TGF-D4 o TGF-D5), factores neurotróficos (tales como neurotrofina-3, 4, 5, o 6), gelsolina, glucagón, calicreínas, sustancia inhibidora mulleriana, factores neurotróficos, p53, proteína A o D, prorrelaxina, cadena A de relaxina, cadena B de relaxina, factores reumatoides, rodopsina, una albúmina de suero (tal como albúmina de suero humano), inhibina, insulina, cadenas de insulina, cadena A de insulina, cadena D de insulina, receptor de insulina, proinsulina, hormona luteinizante, integrina, interleucinas (IL) (tales como IL-1 a IL-10, IL-12, IL-13), eritropoyetina, trombopoyetina, fibrilina, hormona estimulante del folículo, factores de coagulación (tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular y factor de von Willebrands), factores anticoagulantes (tales como proteína C, factor natriurético auricular, tensioactivo pulmonar), un activador del plasminógeno (tal como el activador del plasminógeno tisular humano o uroquinasa), trombina, factor-D o D de necrosis tumoral, D-cetoácido deshidrogenasa, direccioninas, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), colágeno, factores estimulantes de colonias (CSF) (tales como M-CSF, GM-CSF y G-CSF), factor de aceleración de la desintegración, receptores buscadores de blancos, interferones (tales como interferón-alfa, gamma y beta), queratina, factores osteoinductores, PRNP, proteínas reguladoras, superóxido dismutasa, proteínas de la membrana de superficie, proteínas de transporte, receptores de células T, antígenos tales como las inmunotoxinas gpl 20 (HIb), péptido natriurético auricular, proteína exocrina de la vesícula seminal, D2-microglobulina, PrP, precalcitonina, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 6, ataxina 7, huntingtina, receptor de andrógenos, proteína de unión a CREB, gpl 20, p300, CREB, API, ras, NFAT, jun, fos, proteína asociada a atrofia palidoluisiana dentaorubral, una proteína microbiana (por ejemplo, proteína de unión a maltosa, transportador ABC, glutatión S transferasa, tiorredoxina, D-lactamasa), proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja, una enzima tal como superóxido dismutasa, asparaginasa, arginasa, arginina desaminasa, adenosina desaminasa, ribonucleasa, catalasa, uricasa, bilirrubina oxidasa, tripsina, papaína, fosfatasa alcalina, beta-glucoronidasa, purina nucleósido fosforilasa o batroxobina, un opioide, por ejemplo, endorfinas, encefalinas u opioides no naturales, una hormona o neuropéptido, por ejemplo, calcitonina, glucagón, gastrinas, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), colecistoquininas, hormona luteinizante, hormona liberadora de gonadotropina, gonadotropina coriónica, factor liberador de corticotropina, vasopresina, oxitocina, hormonas antidiuréticas, hormona estimulante de la tiroides, hormona liberadora de tirotropina, relaxina, prolactina, péptido YY, neuropéptido Y, polipéptido pancreático, leptina, CART (cocaína y transcrito regulado por anfetamina), un péptido relacionado con CART, perilipina, melanocortinas (hormonas estimulantes de los melanocitos) tales como MC-4, hormonas concentradoras de melanina, péptidos natriuréticos, adrenomedulina, endotelina, secretina, amilina, péptido intestinal vasoactivo (VIP), polipéptido activador de adenilato ciclasa pituitaria (PACAP), bombesina, péptidos similares a bombesina, timosina, proteína de unión a heparina, CD4 soluble, factor de liberación hipotalámico y melanotoninas o análogos funcionales de los mismos. En otra realización de la invención, el péptido, polipéptido o proteína de interés puede ser una enzima de procesamiento tal como proteasas (por ejemplo, enteroquinasa, caspasas, serina proteasas similares a tripsina), lipasa, fosfatasa, glicosil hidrolasas (por ejemplo manosidasas, xilosidasas, fucosidasas), quinasa, mono o dioxidasa, peroxidasa, transglutaminasa, carboxipeptidasa, amidasa, esterasa, fosfatasa y similares.

Las fuentes preferidas para tales polipéptidos de mamíferos incluyen fuentes humana, bovina, equina, porcina, lupina y de roedor, siendo las proteínas humanas particularmente preferidas.

El péptido, polipéptido o proteína de interés de la presente invención también incluye variantes del péptido, polipéptido o proteína de interés mencionado anteriormente. Estas variantes abarcan, por ejemplo, péptido, polipéptido o proteína que tiene la misma actividad que el péptido, polipéptido o proteína de interés antes mencionado y que comprende una secuencia de aminoácidos con, en la secuencia de aminoácidos del péptido, polipéptido o proteína mencionado anteriormente de interés, uno o más aminoácidos eliminados, sustituidos, insertados y/o añadidos. Dicho péptido, polipéptido o proteína se puede ejemplificar por péptido, polipéptido o proteína que tiene la misma actividad que el péptido, polipéptido o proteína de interés antes mencionado y que comprende una secuencia de aminoácidos con, en la secuencia de aminoácidos del péptido mencionado, polipéptido o proteína de interés, uno o más aminoácidos eliminados, sustituidos, insertados y/o añadidos. Se pueden llevar a cabo simultáneamente dos o más tipos diferentes de modificaciones seleccionadas de eliminación, sustitución, inserción y adición.

El péptido, polipéptido o proteína de interés de la presente invención también incluye "péptidos o polipéptidos parciales" del péptido, polipéptido o proteína de interés mencionado anteriormente. Un péptido o polipéptido parcial del péptido, polipéptido o proteína de interés puede ejemplificarse mediante un péptido o polipéptido parcial que comprende una secuencia de aminoácidos en la que una parte de la secuencia de aminoácidos del péptido, polipéptido o proteína de interés mencionado anteriormente corre ininterrumpidamente, en el que el péptido o polipéptido parcial tiene preferiblemente la misma actividad que dicho péptido, polipéptido o proteína de interés. Dicho péptido o polipéptido parcial puede ejemplificarse mediante una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 20 y preferiblemente al menos 50 de los residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del péptido, polipéptido o proteína de interés antes mencionado. Este péptido o polipéptido contiene preferiblemente la secuencia de aminoácidos que corresponde a la región que está implicada en la actividad del péptido, polipéptido o proteína de interés antes mencionado. Además, el péptido o polipéptido parcial usado en la presente invención también puede ser un péptido o polipéptido parcial producido por una modificación de este péptido en el que 1 o una pluralidad de residuos de aminoácidos (por ejemplo, aproximadamente 1 a 20, más preferiblemente aproximadamente 1 a 10, e incluso más preferiblemente aproximadamente 1 a 5) se elimina, se sustituye, se inserta y/o se añade a su secuencia de aminoácidos. El péptido o polipéptido parcial usado en la presente invención también puede usarse como un antígeno para la producción de anticuerpos.

En una realización, el péptido, polipéptido o proteína de interés se selecciona del grupo que comprende hormona del crecimiento humana, insulina humana, hormona estimulante del folículo, factor VIII, eritropoyetina, factor estimulante de colonias de granulocitos, alfa-galactosidasa A, alfa-L-iduronidasa, N-actetilgalactosamina-4-sulfatasa, Dornasa alfa, activador del plasminógeno tisular, glucocerebrosidasa, interferón, factor 1 de crecimiento similar a la insulina, somatotropina bovina, somatotropina porcina, quimosina bovina y proteína envolvente del virus de la hepatitis B.

El péptido, polipéptido o proteína de interés también incluye péptidos, polipéptidos o proteínas modificados que han sufrido modificaciones postraduccionales y posteriores a la exportación en el periplasma tales como ciclación, glicosilación, fosforilación, metilación, oxidación, deshidratación, escisión proteolítica.

En una realización, el péptido, polipéptido o proteína de interés es una enzima para metabolizar una biomolécula en el medio extracelular (denominada en el presente documento "biomolécula extracelular"). En una realización, la biomolécula extracelular comprende un polisacárido o un lípido. En una realización de la invención, el polisacárido comprende alginato, pectina, celulosa, celobiosa, laminarina o una mezcla de los mismos. En una realización de la invención, el lípido comprende un ácido graso, un glicolípido, un lípido de betaína, un glicerolípido, un fosfolípido, un glicerolfosfolípido, un esfingolípido, un lípido de esterol, un lípido de prenol, un sacarolípido, un policétido o una mezcla de los mismos. En una realización de la invención, el péptido, polipéptido o proteína de interés es una enzima que convierte un polisacárido en un monosacárido, un oligosacárido o ambos. En una realización de la invención, el péptido, polipéptido o proteína de interés es una enzima que convierte un lípido en un ácido graso, un monosacárido o ambos. En una realización de la invención, el monosacárido u oligosacárido es oligoalginato, manuronato, guluronato, manitol, a-cetoácido, uronato de 4-desoxi-L-eritro-hexocelulosa (DEHU), 2-ceto-3-desoxi D-gluconato (KDG), glucosa, glucuronato, galacturonato, galactosa, xilosa, arabinosa o manosa. En una realización de la invención, el ácido graso es 14:0, trans-14, 16:0, 16:ln-7, trans-16, 16:2n-6, 18:0, 18:ln-9, 18:2n-6, 18:3n-6, 18:3n-3, 18:4n-3, 20:0, 20:2n-6, 20:3n-6, 20:4n-3, 20:4n-6, o 20:5n-3.

En una realización, el péptido, polipéptido o proteína de interés es una enzima que convierte una biomolécula extracelular en un producto químico básico. En una realización de la invención, el producto químico básico es etanol, butanol o biodiésel. En una realización de la invención, el biodiésel es un ácido graso, un éster de ácido graso o un terpenoide.

En una realización, el péptido, polipéptido o proteína de interés es una proteína secretada. En una realización, el péptido, polipéptido o proteína de interés se secreta de forma natural, es decir, la secuencia de ácido nucleico que lo codifica comprende de forma natural un péptido señal que conduce a su secreción. En otra realización, el péptido, polipéptido o proteína de interés se secreta artificialmente, es decir, la secuencia de ácido nucleico que lo codifica se fusiona con un péptido señal, lo que permite su secreción. Los ejemplos de péptidos señal que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, péptido señal OmpA (SEQ ID NO: 17), péptido señal DsbA (SEQ ID NO: 18) o péptido señal PhoA (SEQ ID NO: 19).

En otra realización, el péptido, polipéptido o proteína es una proteína transmembrana. En otra realización, el péptido, polipéptido o proteína es una proteína que es tóxica para la célula huésped.

En una realización, la célula huésped comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que induce la expresión del péptido, polipéptido o proteína de interés, preferiblemente colocada en un sistema de expresión.

Ejemplos de tales secuencias de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, el gen que codifica la ARN polimerasa de T7, gen 1 T7. En ese caso, la expresión de la ARN polimerasa de T7 induce la expresión del péptido, polipéptido o proteína de interés colocado bajo el control de un promotor de T7.

Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que induce la expresión del péptido, polipéptido o proteína de interés es el sistema de expresión de T7. El sistema de expresión de T7 se describió en la patente de los Estados Unidos No. 4,952,496.

El sistema de expresión de T7 comprende un fragmento de ADN del fago T7, que contiene la secuencia codificante completa de la ARN polimerasa de T7 (es decir, el gen 1 T7). Cualquier promotor activo natural del gen 1 de T7 se eliminó y se insertó un promotor inducible lacUV5 antes de la secuencia codificante. El promotor lacUV5 se induce mediante la adición de IPTG al medio de cultivo.

En una realización, la célula huésped comprende un fago insertado dentro de su genoma. En una realización en la que el péptido, polipéptido o proteína de interés se coloca bajo el control de un promotor de T7, dicho fago modificado genéticamente es como se describe en la solicitud de patente PCT WO2013/004817.

En una realización, dicho fago modificado genéticamente se define además como un fago en el que:

- se inserta un sistema de expresión (preferiblemente un sistema de expresión de T7), y

- los genes S y/o R están inactivados.

En una forma de realización, el gen o genes Int y/o Xis del fago se inactivan.

En una realización, el fago modificado genéticamente se define además como un fago en el que:

- se inserta un sistema de expresión (preferiblemente un sistema de expresión de T7),

- el gen o genes S, R y/o el Q está/están inactivados, y

- el gen o genes Int y/o Xis está/están inactivados.

Los ejemplos de fagos que pueden usarse en la invención incluyen, pero no se limitan a, el fago lambda (A) (fago de Enterobacteria lambda, número de acceso NC_001416), fagos de tipo lambda y lambdoides. El fago lambda, también conocido como colifago lambda, es un virus que infecta Escherichia coli. Lambda es un bacteriófago moderado. Los fagos de tipo lambda forman una familia de bacteriófagos y virus arqueales que se caracterizan por tener colas largas no contráctiles. Los fagos lambdoides son parientes naturales del fago lambda. La mayoría de ellos crecen en E. coli, pero algunos provienen de otras células huésped, tales como, por ejemplo, Salmonella typhimurium. Los ejemplos de fagos de tipo lambda y lambdoides que podrían usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, colifago 434, phi80, phi81, HK97, P21 y P22.

En una realización, el fago es lambda DE3 (número de acceso EU078592). El fago Lambda DE3 es un fago lambda modificado D69, que comprende el gen que codifica la ARN polimerasa de T7 bajo el control de un promotor lacUV5.

De acuerdo con una realización preferida, el fago modificado genéticamente es el fago P11 que tiene la secuencia SEQ ID NO: 14 y que es (DE3) AS-C, Axis-ea10 (DE3 se refiere al fago lambda DE3 en el que el gen de la ARN polimerasa de t 7 se ha integrado dentro de la secuencia del gen int). Dicho fago modificado P11 corresponde a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, R, Rz, Xis e Int se eliminan.

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P12 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes Int y S se eliminan (un ejemplo de P12 es la secuencia DE3 AS, Axisea10).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P13 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, R, Rz, Q, Xis e Int se eliminan (un ejemplo de P13 es la secuencia DE3 AS-C, Axis-ea10, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P14 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes R e Int se eliminan (un ejemplo de P14 es la secuencia DE3 AR). De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P15 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes Q e Int se eliminan (un ejemplo de P15 es la secuencia DE3 AQ). De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P16 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S y Xis se eliminan (un ejemplo de P16 es la secuencia NC_001416 AS, Axis-ea10).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P17 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes R y Xis se eliminan (un ejemplo de P17 es la secuencia NC_001416 AR, Axis-ea10).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P18 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes Q y Xis se eliminan (un ejemplo de P18 es la secuencia NC_001416 Axis-ea10, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P19 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes R, Rz e Int se eliminan (un ejemplo de P19 es la secuencia DE3 AR, ARz).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P20 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, Rz e Int se eliminan (un ejemplo de P20 es la secuencia DE3 AS, ARz).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P21 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes Rz, Q e Int se eliminan (un ejemplo de P21 es la secuencia DE3 ARz, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P22 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, Q e Int se eliminan (un ejemplo de P22 es la secuencia DE3 AS, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P23 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes R, Q, e Int se eliminan (un ejemplo de P23 es la secuencia DE3 AR, AQ) .

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P24 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, R e Int se eliminan (un ejemplo de P24 es la secuencia DE3 AS, AR) .

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P25 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes R, Rz y Xis se eliminan (un ejemplo de P25 es la secuencia NC_001416 AR, Axis-ea10, ARz).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P26 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, Rz y Xis se eliminan (un ejemplo de P26 es la secuencia NC_001416 AS, Axis-ea10, ARz).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P27 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes Q, Rz y Xis se eliminan (un ejemplo de P27 es la secuencia NC_001416 ARz, Axis-ea10, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P28 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, Q y Xis se eliminan (un ejemplo de P28 es la secuencia NC_001416 AS, Axis-ea10, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P29 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes R, Q y Xis se eliminan (un ejemplo de P29 es la secuencia NC_001416 AR, Axis-ea10, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P30 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes R, S y Xis se eliminan (un ejemplo de P30 es la secuencia NC_001416 AS, Axis-ea10, AR).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P31 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes R, Xis e Int se eliminan (un ejemplo de P31 es la secuencia DE3 AR, Axis-ea10).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P32 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, Xis e Int se eliminan (un ejemplo de P32 es la secuencia DE3 AS, Axis-ea10).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P33 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes Q, Xis e Int se eliminan (un ejemplo de P33 es la secuencia DE3 Axisea10, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P34 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, R, Xis Int se eliminan (un ejemplo de P34 es la secuencia DE3 AS, Axis-ea10, AR).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P35 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes R, Q, Xis e Int se eliminan (un ejemplo de P35 es la secuencia DE3 AR, Axis-ea10, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P36 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, Q, Xis e Int se eliminan (un ejemplo de P36 es la secuencia DE3 AS, Axis-ea10, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P37 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes R, Rz, Xis e Int se eliminan (un ejemplo de P37 es la secuencia DE3 AR, Axis-ea10, ARz).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P38 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, Rz, Xis e Int se eliminan (un ejemplo de P38 es la secuencia DE3 AS, Axis-ea10, ARz).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P39 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes Rz, Q, Xis e Int se eliminan (un ejemplo de P39 es la secuencia DE3 ARz, Axis-ea10, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P40 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, R, Q e Int se eliminan (un ejemplo de P40 es la secuencia DE3 AS, AR, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P41 corresponde a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, R, Rz e Int se eliminan (un ejemplo de P41 es la secuencia DE3 AS-C).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P42 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes R, Rz, Q e Int se eliminan (un ejemplo de P42 es la secuencia DE3 AR, ARz, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P43 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, Rz, Q e Int se eliminan (un ejemplo de P43 es la secuencia DE3 AS, ARz, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P44 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, R, Q y Xis se eliminan (un ejemplo de P44 es la secuencia NC_001416 AS, AR, Axis-ea10, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P45 corresponde a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, R, Rz y Xis se eliminan (un ejemplo de P45 es la secuencia NC_001416 AS-C, Axis-ea10).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P46 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes R, Rz, Q y Xis se eliminan (un ejemplo de P46 es la secuencia NC_001416 AR, ARz, Axis-ea10, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P47 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, Rz, Q y Xis se eliminan (un ejemplo de P47 es la secuencia NC_001416 AS, ARz, Axis-ea10, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P48 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, R, Q, Xis e Int se eliminan (un ejemplo de P48 es la secuencia DE3 AS, a R, Axis-ea10, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P49 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, Rz, Q, Xis e Int se eliminan (un ejemplo de P49 es la secuencia DE3 AS, ARz, Axis-ea10, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P50 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes R, Rz, Q, Xis e Int se eliminan (un ejemplo de P50 es la secuencia DE3 AR, ARz, Axis-ea10, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P51 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, R, Q, Rz e Int se eliminan (un ejemplo de P51 es la secuencia DE3 AS-C, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P52 correspondiente a la secuencia NC_001416 en el que las secuencias codificantes de genes S, R, Rz, Q y Xis se eliminan (un ejemplo de P52 es la secuencia NC_001416 AS-C, Axis-ea10, AQ).

De acuerdo con otra realización, el fago modificado genéticamente es P53 correspondiente a la secuencia NC_001415 en el que las secuencias codificantes de genes Q, Xis e Int se eliminan (un ejemplo de P53 es la secuencia DE3 Axisea10, AQ).

La presente divulgación también se refiere a un proceso para producir un péptido, polipéptido o proteína de interés, en el que dicho método comprende:

- cultivar una célula huésped, que comprende:

- al menos dos copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa, preferiblemente CcdB, - al menos una copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto contra la proteína venenosa, preferiblemente CcdA, y

- al menos una copia de la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína de interés, y - recuperar el péptido, polipéptido o proteína de interés.

En una realización, al menos dos copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa se insertan dentro del genoma de la célula huésped.

En una realización, al menos una copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto de la proteína venenosa y al menos una copia de la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína de interés son transportadas por el mismo vector. Por lo tanto, solo se propagan las células huésped que contienen el vector, mientras que las células huésped sin el vector mueren debido al efecto tóxico de la proteína venenosa.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína de interés está comprendida dentro del sistema de expresión. De acuerdo con esta realización, la producción del péptido, polipéptido o proteína de interés es directa, es decir, resulta de la expresión del gen del sistema de expresión, por ejemplo mediante cultivo en un medio en el que se induce el promotor comprendido en el sistema de expresión. Por ejemplo, en una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína de interés se coloca bajo el control de un promotor pLac o pTRC, y la expresión del péptido, polipéptido o proteína de interés se induce cuando se añade IPTG al medio de cultivo. Además, en otra realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína de interés se coloca bajo el control de un promotor Para, y la expresión del péptido, polipéptido o proteína de interés se induce cuando se añade arabinosa al medio de cultivo.

En otra realización, la célula huésped comprende además otro sistema de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de la ARN polimerasa de T7 bajo el control de un promotor lac, preferiblemente el promotor lacUV5, insertado en su genoma. De acuerdo con esta realización, el proceso para producir el péptido, polipéptido o proteína de interés comprende la transformación de la célula huésped con un vector, preferiblemente un plásmido, que comprende la secuencia de ácido nucleico del péptido, polipéptido o proteína de interés bajo el control del promotor de T7 y la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto. La expresión del promotor de T7 está bajo el control de la ARN polimerasa de T7, que es estrictamente específica para el promotor de T7, es decir, el promotor de T7 solo puede ser utilizado por la ARN polimerasa del bacteriófago t 7. Cuando se añade IPTG al medio de cultivo, la ARN polimerasa de T7 se expresa por transcripción del promotor lac que permitirá la expresión del péptido, polipéptido o proteína de interés. De acuerdo con una realización, el péptido, polipéptido o proteína de interés es secretado por la célula huésped en el caldo de fermentación. De acuerdo con esta realización, el péptido, polipéptido o proteína de interés puede recuperarse fácilmente del caldo de fermentación usando métodos bien conocidos en la técnica.

De acuerdo con otra realización, el péptido, polipéptido o proteína de interés no es secretado por la célula huésped en el caldo de fermentación. Los métodos para recuperar un péptido, polipéptido o proteína intracelular o periplasmática de interés también son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de tales métodos incluyen, pero no se limitan a, el uso de ácido tricloroacético (TCA) o tampón de craqueo que contiene dodecil sulfato de sodio (SDS) para recuperar proteínas totales en condiciones de desnaturalización o el uso de sonicación, prensa francesa o equivalente para romper bacterias bajo presión para recuperar proteínas citoplasmáticas totales en condiciones nativas (no desnaturalizantes). A continuación, el péptido, polipéptido o proteína de interés se puede purificar usando métodos específicos que incluyen, pero no se limitan al uso de columnas de afinidad o de intercambio iónico.

La presente divulgación también se refiere a un método para preparar una célula huésped como se describió anteriormente.

El método para preparar una célula huésped comprende insertar al menos dos copias, preferiblemente dos copias, de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína venenosa dentro del genoma de la célula huésped. Preferiblemente, dicha proteína venenosa es CcdB, más preferiblemente dicha secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína venenosa es la SEQ ID NO: 1.

En una realización, el método para preparar una célula huésped comprende una etapa de eliminación, en la que se eliminan las secuencias de ácido nucleico de la célula huésped.

Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para insertar o eliminar la secuencia de un gen. El método más eficiente es el método de recombinación homóloga mediado por los genes codificados por lambda Red o los genes recE y recT del profago Rac. Este método fue bien descrito por varios investigadores, incluidos Datsenko y Wanner (PNAS 97-12, 6640-6645, 2000) y Stewart et al., (WO0104288). Los productos de PCR se generan usando cebadores con extensiones de 20 a 60 nt que son homólogas a las regiones adyacentes al gen que se va a eliminar o a la región en la que se insertará una secuencia de ácido nucleico. Dado que solo una pequeña cantidad de bacterias recombinará eficazmente el fragmento de interés, es necesario tener un marcador de selección fuerte para seleccionarlo. Se pueden usar marcadores antibióticos para seleccionar los recombinantes: los cebadores modificados se usan para amplificar un gen de resistencia a antibióticos. Después de la transformación y activación de los genes de recombinación, las bacterias recombinantes se seleccionan en un medio que contiene el antibiótico apropiado. En este caso, el gen o la región diana se reemplaza por un gen de resistencia a los antibióticos. Para utilizar la misma estrategia para la siguiente eliminación, es necesario eliminar este gen de resistencia a los antibióticos durante una segunda etapa. Como se describe en Datsenko y Wanner, es posible usar genes de resistencia a antibióticos que están flanqueados por sitios FRT (objetivo de reconocimiento de FLP). A continuación, los genes de resistencia se eliminan mediante el uso de un plásmido auxiliar que codifica la recombinasa FLP. El gen de resistencia a los antibióticos se elimina mediante esta recombinasa específica de sitio, pero este método deja rastros: un sitio de recombinación específico del sitio todavía está presente después de la eliminación del gen de resistencia a los antibióticos.

Para evitar la presencia de este sitio, más preferiblemente, el método de la invención usa galK como gen marcador. El principio de selección de galK se describe en Warming et al., (Nucleic acid research, 2005, 33 (4)). Este método usa galK como marcador de selección positiva (crecimiento en medio mínimo que contiene galactosa) durante la primera recombinación (inserción). La eliminación de este marcador se realiza durante una segunda etapa de recombinación homóloga. Durante esta etapa, galK se utiliza como marcador de selección negativa en un medio mínimo que contiene 2-desoxi-galactosa (DOG). El producto del gen galK, la galactoquinasa, cataliza la primera etapa en la ruta de degradación de la galactosa. La galactoquinasa también cataliza eficazmente la fosforilación del análogo de galactosa DOG. El producto de esta reacción no se puede metabolizar más, lo que lleva a la acumulación de una molécula tóxica (2-desoxi-galactosa-1-fosfato). La ventaja de este método es evitar la presencia de un sitio de recombinación específico después de la eliminación del gen diana y la eliminación del marcador selectivo.

En una realización, el método comprende además una etapa de infección de la célula huésped por un fago modificado genéticamente como se definió en este documento anteriormente. En una realización, dicha etapa de infección incluye el uso de un fago auxiliar. En el sentido de la presente invención, el término "fago auxiliar" se refiere a un fago utilizado para complementar una eliminación o inactivación de otro fago. El fago auxiliar proporcionará las funciones faltantes a dicho otro fago para poder infectar bacterias o preparar una existencia de fagos. Por lo general, el fago auxiliar no puede formar un lisógeno por sí mismo porque es cI menos (no tiene represor y, por lo tanto, es virulento).

Los procesos para infectar una célula huésped con un fago usando un fago auxiliar son bien conocidos en la técnica. En una realización, una primera etapa es la preparación de los lisados y una segunda es la lisogenización. Brevemente, los lisados bacterianos del fago auxiliar se pueden preparar usando métodos estándar como se describe en "Molecular cloning: a laboratory manual", Sambrook et al., (2001, ISBN 978-087969577-4) o en "Large- and Small-Scale Preparation of Bacteriophage lambda lysate and DNA", Su et al., BioTechniques 25: 44-46 (julio de 1998). La preparación del fago de interés se puede realizar utilizando el mismo principio, después de la inducción del fago (la mayoría de las veces usando irradiación UV o cualquier situación en la que un lisógeno sufra daño en el ADN o la respuesta SOS del huésped o la producción de Cro) para iniciar el ciclo lítico y el uso de un fago auxiliar para proporcionar las funciones que faltan. Una alternativa al fago auxiliar es el uso de un plásmido que codifica las funciones faltantes. A continuación, los lisados de fagos se pueden mezclar con las bacterias diana y se pueden colocar en placas de LB para obtener lisógenos (como se describe en el kit de lisogenización lambda DE3 de Novagen, Protocolo de usuario TB031 o se describe un método alternativo en Studier y Moffat, Journal of Molecular Biology, 1986, 189: 113-130). Puede usarse un fago de selección para seleccionar específicamente bacterias que contienen el fago de interés. Este fago de selección es un fago virulento que tiene la misma inmunidad que el fago de interés. En consecuencia, el fago de selección es incapaz de formar placas o de matar lisógenos de bacterias para el fago de interés porque este fago produce el represor cI (también llamado C2 en el fago lambda DE3).

En una realización, el método comprende además transformar la célula huésped de la invención con un vector, preferiblemente un plásmido como se describió anteriormente, que porta (1) una secuencia de ácido nucleico que codifica el antídoto para la proteína venenosa y (2) una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína de interés. Los métodos para transformar una célula con un vector son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, transformación química y electroporación.

El método para producir un péptido, polipéptido o proteína de interés utilizando la célula huésped de la invención presenta, por lo tanto, las siguientes ventajas:

- se puede aplicar a cualquier péptido, polipéptido o proteína, incluso a péptidos, polipéptidos o proteínas que sean tóxicos para la célula huésped;

- puede aplicarse a cualquier célula huésped, ya que la inserción del gen ccdB dentro del genoma de una célula huésped es fácil para el experto en la materia;

- como se muestra en los ejemplos siguientes, da como resultado un mayor rendimiento de producción del péptido, polipéptido o proteína de interés;

- como se muestra en los ejemplos siguientes, permite incrementar la estabilidad del vector que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína de interés, especialmente cuando el péptido, polipéptido o proteína de interés es tóxico para la célula huésped; y

- en algunas realizaciones, no comprende el uso de antibióticos, y tanto la célula huésped como el vector están libres de genes de resistencia a antibióticos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un mapa del vector pVHH6.

La Figura 2 es una fotografía que muestra el cribado por PCR en la cepa W3110ccdB después de 24 h de inducción de pVHH6AKan. El cultivo después de la inducción se ha sembrado en placas sin antibióticos y se ha realizado la PCR en 20 colonias. Se muestran los resultados de PCR sobre VHH6 (A), ccdB (B) y genes específicos de la cepa (C). Las flechas de la izquierda muestran el tamaño esperado de los productos de PCR. Las flechas de cabeza muestran alteraciones de ccdB.

La Figura 3 es una fotografía que muestra la comparación de producción de las cepas W3110 pVHH6, W3110ccdB pVHH6AKan y W31102ccdB pVHH6AKan en SDS-PAGE. Se observan diferencias entre muestras no inducidas (NI) e inducidas (l), pero especialmente entre muestras inducidas (rectángulo).

La Figura 4 es un mapa del vector pTraG.

La Figura 5 es una fotografía que muestra la comparación de producción de las cepas W3110ccdB pTraG y W31102ccdB pTraG en SDS-PAGe . Se observan diferencias entre muestras no inducidas (NI) e inducidas (I), pero no entre muestras inducidas.

La Figura 6 es una combinación de dos fotografías que muestran la comparación de producción de las cepas W3110 pD1.3, W3110ccdB pD1.3ccdAAAmp y W31102ccdB pD1.3ccdAAAmp en SDS-Pa Ge mediante tinción con azul de Coomassie (izquierda) o mediante transferencia Western (derecha). Las diferencias se observan bien por transferencia Western entre muestras no inducidas (NI) e inducidas (I).

La Figura 7 es una fotografía que muestra la detección de PCR en la cepa SE3 (BL21(DE3)2ccdB) después de 24 h de inducción de pStaby1.2 TraG. El cultivo después de la inducción se ha sembrado en placas de Petri y se ha realizado la PCR en 22 colonias. Se muestran los resultados de PCR sobre los genes TraG (A), ccdA (B), el primer ccdB (C) y el segundo ccdB (D). Las flechas de la izquierda muestran el tamaño esperado de los productos de PCR.

La Figura 8 es una fotografía de un gel de SDS-PAGE que muestra la comparación de producción de las cepas SE1 pStabyTraG y SE4 (BL21(DE3)2ccdB 2gyrA) pStabyTraG. Se observan diferencias entre muestras no inducidas e inducidas (I).

La Figura 9 es una fotografía que muestra la comparación de la producción de las cepas W3110ccdB pVHH6AKan, W31102ccdB pVHH6AKan y W31102ccdB 2gyrA pVHH6AKan en SDS-PAGE. Se observan diferencias entre muestras no inducidas (NI) e inducidas (I), pero especialmente entre muestras inducidas.

Ejemplos

La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1: La duplicación del gen ccdB aumenta el rendimiento en la producción

Para probar la estabilidad que aporta la tecnología Staby® (tecnología basada en la inserción de una copia del gen ccdB dentro del cromosoma del huésped, Delphi Genetics, productos StabyExpress®, patente WO9958652), se produjo una proteína secretada (un fragmento de anticuerpo de cadena pesada variable llamado VHH6) que parece tener también propiedades tóxicas en E. coli. Se usó la cepa de E. coli W3110 (antecedentes genéticos: E. coli K12, genotipo: F- lambda- INV (rrnD-rrnE) rph-1) como hospedador productor y la expresión se realizó con el promotor pTrc en un vector pBR322 (pVHH6; Figura 1). Se comparó la producción de la cepa W3110 usando el sistema clásico de estabilización de antibióticos (en este documento la resistencia a kanamicina) con la producción de la cepa W3110ccdB que ha sido modificada para utilizar la tecnología Staby® (gen ccdB que se introduce dentro del cromosoma de la cepa). Los vectores utilizados para esta comparación contenían ambos el gen ccdA y se eliminó el vector utilizado en W3110ccdB para el gen de resistencia a kanamicina (pVHH6AKan).

Las cepas se cultivaron a 30 °C en medio LB (10 ml) con o sin antibióticos y se indujeron (IPTG 0,5 mM) durante 4 h cuando la DO⁶⁰⁰alcanza 0,5. No se observó producción cuando se analizó mediante SDS-PAGE a pesar del 100% de estabilidad del plásmido en ambos sistemas de selección bajo estas condiciones de inducción suaves. Se ha aplicado una condición de inducción más fuerte de la siguiente manera (en este documento después de la fermentación continua basada en la perfusión). Las cepas se cultivaron en fermentadores de 500 ml y DO⁶⁰⁰se mantuvo constante a 0,3 por perfusión: adición de medio fresco (hasta 51) y eliminación del desbordamiento para mantener siempre la DO⁶⁰⁰a 0,3 en el fermentador. Después de 51 de perfusión, la DO⁶⁰⁰aumentó y la inducción finalmente se realizó durante 24 horas cuando los cultivos alcanzaron una DO⁶⁰⁰de 0,5. Cuando se usa el sistema de selección de antibióticos para estabilizar el vector de expresión, la estabilidad final del plásmido se determinó colocando bacterias en placas que contenían o no los antibióticos apropiados (de acuerdo con el gen de resistencia codificado por el plásmido). Las placas sin antibióticos se utilizan para determinar la cantidad total de bacterias y las placas que contienen antibióticos se utilizan para determinar la cantidad de bacterias que aún contienen el plásmido.

La estabilidad del plásmido se evaluó hasta aproximadamente el 0% para las bacterias usando antibióticos (sin colonia en placas que contienen antibióticos).

Cuando se utiliza el sistema Staby® basado en ccdA y ccdB, no está presente ningún gen de resistencia a los antibióticos. En consecuencia, la presencia o ausencia del plásmido se prueba mediante PCR. Dado que se está utilizando el sistema Staby®, se planteo la hipótesis de que debido a la presencia del gen ccdB de selección en el cromosoma de las bacterias y el gen de antídoto ccdA en el plásmido, todas las bacterias que crecen en las placas deben contener el plásmido. Inesperadamente, se observó una estabilidad de aproximadamente el 65% mediante experimentos de p Cr en colonias (Figura 2B). De hecho, incluso si la estabilidad aumenta drásticamente, esta es la primera vez que la tecnología Staby® no proporciona el 100% de estabilidad.

Además, entre el 65% de retención, el gen de interés (gen VHH6) fue mutado por eliminaciones parciales o totales en todos los plásmidos probados (Figura 2A). Se extrajeron y secuenciaron las bandas de la p Cr de ccdB que son superiores a las esperadas. Los resultados de la secuenciación muestran que el gen ccdB se inactiva mediante la inserción de una pequeña secuencia de inserción (insAB) (SEQ ID NO: 16). De acuerdo con los resultados de la PCR específica de la cepa (Figura 2C), la banda no amplificada sobre el gen ccdB podría deberse a una gran eliminación o inserción en la región de ccdB. Este experimento se ha replicado y se observaron resultados equivalentes.

Por lo tanto, la tecnología Staby® debe mejorarse para evitar este tipo de inactivación del sistema de estabilización. Se ha insertado una segunda copia del gen del veneno entre los genes yjjK y slt (resultando en la cepa W31102ccdB). Estos genes se han elegido porque se encuentran en el lado opuesto del cromosoma de E. coli con respecto a la primera ubicación del gen ccdB y porque el espacio intergénico parece no codificarse.

Para comparar la producción en las cepas W3110, W3110ccdB y W31102ccdB, se ha aplicado el siguiente protocolo. Se cultivaron colonias individuales durante la noche en 10 ml de medio LB a 37 °C. Al día siguiente, se utilizó 1 pl de cada cultivo para la inoculación de 10 ml de medio LB reciente. Los cultivos se hicieron crecer durante la noche a 37 °C. Esta etapa se repitió una vez más para realizar generaciones adicionales (como se realizó en el fermentador). Al día siguiente, se utilizaron 10 pl de cada cultivo para la inoculación de 10 ml de medio LB reciente. Los cultivos se hicieron crecer a 30 °C y se indujeron hasta una OD⁶⁰⁰0,5 por 24 h. Se usó kanamicina a lo largo de estas etapas solo para la cepa W3110. A pesar del uso de este antibiótico para mantener el plásmido de expresión, su estabilidad fue aproximadamente del 0% después de la inducción. Por otro lado, la estabilidad del plásmido fue aproximadamente del 100% para ambos sistemas Staby® (es decir, con 1 o 2 genes ccdB) bajo este protocolo más suave: cada PCR realizada sobre genes ccdB y genes ccdA del plásmido tenían el tamaño esperado. Solo algunos genes VHH6 fueron mutados (27%) para el cultivo de W31102ccdB.

Las producciones también se compararon mediante SDS-PAGE con azul de Coomassie (Figura 3). Inesperadamente, el rendimiento de producción de la cepa W31102ccdB es mucho mayor que con otras cepas (VHH6 = 27 kDa). Este tipo de aumento de rendimiento ya se ha informado mediante el uso de la tecnología Staby® pero con solo una copia del gen ccdB (Peubez et al., Microbial Cell Factories 2010, 9:65; Sodoyer et al., en: Antibiotic Resistant Bacteria - A Continuous Challenge in the New Millennium, 2012). En el presente documento, el aumento de rendimiento ocurre sorprendentemente solo cuando dos copias de ccdB están presentes a pesar del hecho de que el plásmido es estable y está presente en las bacterias con una copia del gen ccdB.

Ejemplo 2: Aplicación de la tecnología Staby® 2ccdB para producir otras proteínas

Para probar si el uso de las cepas con dos copias del gen ccdB es posible para todas las proteínas (incluidas las proteínas que ya están bien expresadas con una sola copia de ccdB), se probó la producción de la proteína TraG de 70 kDa (Szpirer et al., 2000, Mol. Microbiol. 37 (6) 1283-1292). Se construyeron las cepas W3110(DE3)ccdB y W3110 (DE3)2ccdB con el plásmido que codifica el antídoto CcdA y TraG (pTraG) (Figura 4). El gen traG estaba bajo el control del promotor de T7. Estas cepas y el plásmido utilizan la tecnología Staby® para estabilizar los plásmidos. La primera observación fue que en presencia del plásmido que codifica ccdA, la presencia de dos copias del gen ccdB no afecta la viabilidad ni el crecimiento de la cepa W3110: una copia del gen ccdA en el plásmido es suficiente para obtener la viabilidad completa.

La producción de TraG bajo el sistema clásico Staby® (1 gen ccdB) es equivalente al que tiene el nuevo sistema Staby® (2 genes ccdB) (Figura 5). Sin embargo, la producción con 1 ccdB ya da muy buen rendimiento, por lo que tal vez no sea posible un aumento de este rendimiento, incluso aplicando el nuevo sistema Staby®.

Para confirmar nuestros resultados anteriores, se ha realizado otra producción. Se eligió un fragmento de anticuerpo como modelo (D1.3 = 24 kDa para cadenas pesadas y ligeras o 50 kDa para las cadenas asociadas) y se expresó usando un promotor Para (inducción de arabinosa). El vector (pBAD24) se ha adaptado a las cepas que contienen el gen o genes ccdB (inserción de ccdA y eliminación del gen de resistencia a ampicilina).

Como se muestra en la Figura 6, el rendimiento de producción aumenta considerablemente al usar 1 o 2 copias de los genes ccdB, pero no observó una diferencia entre las dos cepas (incluido el crecimiento y la velocidad).

En conclusión, el uso de la cepa con 2 copias de ccdB puede usarse para la producción de cualquier proteína. Sin embargo, la ventaja del rendimiento depende de cada proteína y cuando el rendimiento ya es muy alto cuando se usa solo 1 copia de ccdB, la cepa que codifica 2 copias produce los mismos resultados. Dado que, como los productores industriales e investigadores nunca saben si una proteína será difícil de producir o no cuando están comenzando sus experimentos, es una ventaja poder usar la misma cepa para proteínas clásicas y difíciles de producir y comenzar inmediatamente con la cepa diseñada para las proteínas más duras.

Ejemplo 3: Aplicación de la tecnología 2ccdB para producir proteínas en otras cepas huésped

Las cepas de E. coli se dividen en los tipos K12 y B. Como la cepa W3110 es una cepa K12, se ha probado la aplicabilidad de la tecnología 2ccdB para las cepas B. Así, dos copias de ccdB han sido introducidas en el genoma de una E. coli B (tipo BL21(DE3) - Antecedentes genéticos: E. coli B - genotipo F— ompT gal dcm Ion hsdSe(rB- me-) A (DE3 [lacI lacUV5-T7 gen1])) para obtener la cepa SE3. Luego, se ha realizado la fermentación perfundida para producir la proteína TraG después de varias generaciones. La estabilidad de los plásmidos después de 24 h de inducción es del 100% (Figura 7). Cada uno de los genes ccdB están intactos en estas condiciones de expresión.

Se obtuvieron resultados similares en otra cepa derivada de K12 que tenía el siguiente genotipo: F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG 080dlacZAM15 A (lacZYA-argF) U169, hsdR17 (rK- mK), A—, dcm::FRTccdB yjjK ::FRTccdB. Esta cepa se derivó de DH5 alfa en la que 2 copias del gen ccdB se insertaron como se describió anteriormente.

Estos resultados muestran que es posible construir diferentes cepas de E. coli que contienen la inserción de 2 copias del gen ccdB. La presencia de estas 2 copias no es perjudicial.

Ejemplo 4: Duplicación del gen gyrA

Como se describió anteriormente, la tecnología Staby® se basa en la toxicidad de la proteína CcdB para E. coli. Como el antídoto CcdA inhibe la expresión del gen ccdB, no se aplica presión de selección contra este gen de la toxina. Es tan improbable encontrar algunas cepas resistentes de E. coli a CcdB. Sin embargo, este tipo de resistente ha sido aislada artificialmente aplicando varias rondas de crecimiento en presencia de un agente mutágeno (Bernard et al., J Mol Biol. 1992, 226: 735). Esta cepa resistente presenta una mutación en el gen gyrA (la diana de CcdB) que cambia la arginina 462 por una cisteína.

Durante la expresión de este modelo de proteína tóxica VHH6 (vease el Ejemplo 1), se aislaron cepas con el gen ccdB de tipo silvestre pero sin el plásmido (e igualmente el gen ccdA). Por lo tanto, estas cepas eran resistentes a CcdB. El gen gyrA de estas cepas se ha secuenciado para confirmar la modificación de la arginina 462 en otro aminoácido no descrito (serina).

Al duplicar el gen ccdB como se menciona en esta patente, se supone que la presión de la selección en el gen gyrA aumentará y generará más fácilmente cepas resistentes a CcdB.

Para evitar esos mutantes, se ha realizado también la duplicación del gen gyrA. Esta nueva copia de gyrA se ha integrado al mismo tiempo que la segunda copia de ccdB (en el mismo inserto) entre el gen yjjK y el gen slt en la cepa SE2 por transducción de un fragmento de ADN que contiene los genes gyrA de kanamicina y ccdB rodeados por regiones homólogas utilizadas como brazos de recombinación. El evento de recombinación se seleccionó utilizando

Claims

REIVINDICACIONES

1. Célula huésped bacteriana que comprende al menos 2 copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa y al menos una copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína antídoto para la proteína venenosa, siempre que dichas al menos 2 copias de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína venenosa se inserten dentro del cromosoma de la célula huésped bacteriana, en la que la célula huésped bacteriana es E. coli, en la que dicha proteína venenosa es CcdB y dicha proteína antídoto es CcdA, y en la que dicha secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antídoto es transportada por un plásmido que comprende además un sistema de expresión en el que una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés es o puede insertarse, en el que la inserción de una segunda copia de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína venenosa en el genoma de la célula huésped aumenta el rendimiento de la producción de proteína.

2. Célula huésped bacteriana de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la segunda copia de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa CcdB se inserta en un lado opuesto del cromosoma huésped bacteriano con respecto a la ubicación de la primera copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa CcdB.

3. Célula huésped bacteriana de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicha proteína venenosa CcdB está codificada por la SEQ ID NO: 1 o cualquier secuencia de ácido nucleico que tenga al menos un 75% de identidad con la SEQ ID NO: 1.

4. Célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha proteína antídoto CcdA está codificada por la SEQ ID NO: 13 o cualquier secuencia de ácido nucleico que tenga al menos un 75% de identidad con la SEQ ID NO: 13.

5. Célula huésped bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho sistema de expresión comprende un promotor seleccionado del grupo que comprende un promotor de T7, Ptrc, Para y Plac.

6. Célula huésped bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho sistema de expresión comprende un promotor de T7 y la célula huésped comprende además un gen de ARN polimerasa de T7, preferiblemente insertado en su genoma, más preferiblemente en un sistema de expresión de T7.

7. Célula huésped bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho sistema de expresión comprende un promotor de T7 y la célula huésped comprende además un fago modificado genéticamente insertado dentro de su genoma, preferiblemente dicho fago se define como un fago en el que:

- se inserta un sistema de expresión de T7,

- los genes S, R, y/o el Q están inactivos, y

- el gen Int y/o Xis están inactivados.

8. Célula huésped bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además la inactivación de al menos uno de los genes tonA, galK, araB, araA, lon, ompT, rcsA, hsdR, mrr, endA y recA.

9. Célula huésped bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además al menos una copia adicional del gen gyrA.

10. Un kit que comprende:

- una célula huésped bacteriana que comprende al menos 2 copias de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína venenosa, en la que dichas al menos 2 copias se insertan dentro del cromosoma de la célula huésped bacteriana y la célula huésped bacteriana es E. coli, y

- un vector que comprende:

- al menos una copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína antídoto y

- al menos una copia de un sistema de expresión en el que se inserta o puede insertarse una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés,

en el que dicha proteína venenosa es CcdB y dicha proteína antídoto es CcdA, y en el que la inserción de una segunda copia de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína venenosa en el genoma de la célula huésped aumenta el rendimiento de la producción de proteína.

11. El kit de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína de interés está bajo el control de un promotor seleccionado del grupo que comprende un promotor de T7, Ptrc, Para y Plac.

12. Un método para producir un péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés, en el que dicho método comprende cultivar la célula huésped bacteriana de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que un sistema de expresión, en el que se inserta una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés, está comprendido en dicho plásmido y la recuperación del péptido, polipéptido o proteína de interés.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la proteína recombinante es una proteína secretada, una proteína transmembrana o una proteína que es tóxica para la cepa bacteriana.

14. La célula huésped bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o el método de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en el que la célula huésped bacteriana comprende un plásmido que comprende un sistema de expresión en el que se inserta o puede insertarse una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés.

15. El kit de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en el que dicho kit comprende un vector que comprende al menos una copia de un sistema de expresión en el que se inserta o puede insertarse una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés.

16. La célula huésped bacteriana de acuerdo con la reivindicación 14, el método de acuerdo con la reivindicación 14, o el kit de acuerdo con reivindicación 15, en el que dicho péptido, polipéptido o proteína recombinante de interés es tóxico para la célula huésped bacteriana.