JP2012527249A - 抗生物質フリープラスミド - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図3
Description
本出願は、米国仮特許出願61/180,755号(2009年5月22日出願)の利益を主張する。
本発明は、抗生物質選別圧を用いることなくグラム陰性細菌でプラスミドを維持および製造する方法に関する。さらにまた、本発明は、製造したドラッグレスプラスミド、並びに前記ドラッグレスプラスミドを含む処方物および/または組成物、および前記ドラッグレスプラスミドを用いて製造したタンパク質または免疫原を含む処方物および/または組成物、および前記処方物および/または組成物を宿主に投与する方法に関する。本発明は、前記ドラッグレスプラスミドを含むグラム陰性細菌に関する。
プラスミドは、染色体DNAから分離し、染色体DNAとは別個に複製することができる染色体外DNA分子である(G. Lipps, ed. (2008). Plasmids: Current Research and Future Trends. Caister Academic Press. ISBN978-1-904455-35-6)。天然では、プラスミドは細菌中に通常存在するが、時に真核細胞生物で見出される。それらは、適切な宿主内で自律的に複製することができる、伝達可能な遺伝的エレメント(またはレプリコン)と考えられる。プラスミドは裸のDNAであり、新しい宿主に伝達されるために遺伝物質を包み込むために必要な遺伝子をコードしない。したがって、宿主から宿主へのプラスミドの伝達には、接合または遺伝的エレメントの意図的取り込みを可能にする形質転換による宿主遺伝子発現の変化によって直接的で機械的な伝達が要求される(G. Lipps, 2008)。
遺伝子療法およびワクチン免疫を目的とするプラスミドDNA(pDNA)の使用は、ヒトおよび動物のヘルスケアで顕著な潜在能力を有する新規な技術である(J. Mairhofer et al. (2008) Biotechnol J, 3:83-89)。さらにまた、プラスミドは遺伝学および生物工学研究室で重要なツールとして供される(そのような研究室では、プラスミドは個々の遺伝子の増幅または発現に通常的に用いられる)(David W Russell, Joseph Sambrook (2001), Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory)。
抗生物質耐性遺伝子を用いる選別の場合、細胞を該当する抗生物質に対して耐性にするタンパク質を生成する遺伝子が挿入されたプラスミドが調製される。次に、このプラスミドは形質転換と称されるプロセスによって細菌に挿入される。続いて、この細菌は該当する抗生物質に曝露される。前記プラスミドは細菌を前記抗生物質に対して耐性にするので、前記プラスミドのコピーを取り込んだ細菌をのみがこの抗生物質から生き残る。
問題の遺伝子は抗生物質耐性マーカーを含むプラスミドを用いてデリバ−される。そのような遺伝子は、典型的にはマルチクローニング部位(MCS(またはポリリンカー))に挿入される。抗生物質耐性遺伝子が発現され、発現されたタンパク質は当該抗生物質を分解する。このようにして、抗生物質は、改変された細菌のみを選別するフィルターとして機能する。ここでこれらの細菌を大量に増殖させ採集して溶解し(しばしばアルカリ溶解方法が用いられる)、問題のプラスミドを単離することができる。
このような背景に対して、細菌はマーカー遺伝子を同化し、最終的に、これまで処方されてきた抗生物質が効かない病原体を生じる懸念がある。環境中の微生物(例えば病原体)への遺伝子の伝達も起こり得よう(D.B. Murphy, S.L. Epstein, Guidance for Industry: Guidance for humann somatic cell therapy and gene therapy, Food and Drug Administration, Rockville 1998)。別の安全性に関する懸念は、ヒトの染色体への抗生物質耐性遺伝子の組み込みの可能性である(H.A. Smith, D.M. Klinman (2001) Curr Opin Biotechnol, 12:299-203)。
さらにまた、これらの遺伝子の構成的発現は細菌宿主細胞に不必要な代謝負荷を負わせるので、そのような遺伝子は、プラスミドの製造過程に相当な影響を及ぼす可能性がある(R.M. Cranenburgh et al. (2001) Nucleic Acids Res, 29, e26;A. Rozkov et al. (2006) Enzyme Microb Technol 39:47-50)。これらの遺伝子を除去することによりプラスミドのサイズを縮小することは、pDNAの安定性および発酵プロセスによって得られる収量の改善をもたらすであろう(M.A. Smith et al. (1998) Can J Microbiol, 44:351-355)。
慣習的マーカーの短所は実際的研究においてすら明白になりつつある。例えば、バクトフェクション技術の産業利用のために抗生物質フリーデリバリー系をもつことが所望される。バクトフェクション技術は、侵入細菌を用いる真核細胞へのプラスミドDNAのデリバリーである。さらにまた、発酵過程中の不要な代謝負荷を軽減する技術的な要求が存在する(前記はより高いODおよびDNAプラスミドのより高い収量をもたらすであろう)。
患者の腸内細菌に抗生物質耐性遺伝子をまき散らすという懸念に対して、また別の選別方法が設計された。前記には、栄養要求性補完、リプレッサー滴定、タンパク質系解毒薬/毒素選別系、およびRNA系選別性マーカーの使用が含まれる(以下を参照されたい:J.A. Williams et al. Plasmid DNA vaccine vector design: Impact on efficacy, safety and upstream production, Biotechnol Adv (2009). Doi:10.1016/j.biotechadv.1009.02.003)。
最近Mairhoferらは、いずれの選別マーカーおよび他の付加配列もプラスミドで使用することなくプラスミドを選別および維持するために供される細菌宿主株の設計を探索した。プラスミドの複製阻害因子RNA IがRNA-RNAアンチセンス反応によって増殖に必須の遺伝子の翻訳を抑圧することができるように、いくつかの細菌株を改変した(J. Mairhofer et al. (2008) Biotechnol J 3:83-89)。必須遺伝子(murA)をリプレッサータンパク質(tetR)がその発現を妨害するように改変した(J. Mairhofer et. al., 2008)。プラスミド(したがってRNA I)が存在する場合のみ、tetRが弱まりmurAが発現される。前記著者らは、多様な改変大腸菌株によって市場で入手可能な種々のプラスミドを選別できることを報告した。彼らはさらに、いずれの選別マーカーも含まないミニマリスト的プラスミドを設計した。
本出願におけるいずれの文書の引用または認定も、そのような文書が本発明の先行技術として利用可能であることを容認するものではない。
本発明の方法は、抗生物質フリープラスミドを製造する方法および前記抗生物質フリープラスミドを用いて哺乳動物細胞に外来遺伝子を導入するための方法を含む。
これらの実施態様および他の実施態様は、以下の詳細な説明によって開示されまたは以下の詳細な説明から明白であり、さらにそれら実施態様は以下の詳細な説明に包含されている。
例示の手段により提供する以下の詳細な説明(記載した具体的実施態様に本発明を限定しようとするものではない)は、付随の図面(参照により本明細書に含まれる)と一緒にして理解されよう。
本開示および特に特許請求の範囲では、例えば“comprises”、“comprised”および“comprising”などのような用語は、米国特許法でそれらに与えられた意味を有し得る。例えば、それら用語は“includes”、“included”および“including”などを意味することができ、さらに、例えば“consisting essentially of”および“consists essentially of”のような用語は、米国特許法でそれらに与えられた意味を有し得る。例えば、それら用語は明示的に列挙されていない成分も許容するが、しかし従来技術で見出されている成分、または当該発明の基本的なまたは新規な特徴に影響を及ぼす成分は除かれる。
特段の説明がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語および学術用語は、本開示が属する分野の業者のある者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。単数用語の“a”、“an”および“the”は、文脈が明らかにそうでないことを示していないかぎり、対応する複数形を含む。同様に、“or”という語は、文脈が明らかにそうでないことを示していないかぎり、“and”を含むことが意図される。
“タンパク質”、“ペプチド”、“ポリペプチド”および“ポリペプチドフラグメント”という用語は本明細書で互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸残基ポリマーを指す。ポリマーは線状でも分枝していてもよく、改変アミノ酸またはアミノ酸アナローグを含むことができ、さらにアミノ酸以外の化学的部分によって中断されていてもよい。前記用語はまた、天然に改変されているか、または介入(例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、リピド化、アセチル化、リン酸化)または他の任意の操作もしくは修飾(例えば標識または生物活性成分との結合)によって改変されているアミノ酸ポリマーを包含する。
“ドラッグレスプラスミド”または“抗生物質フリープラスミド”という用語は互換的に用いられ、抗生物質選別遺伝子を含まないDNAプラスミドを指す。
“遺伝子”という用語は広範囲に用いられ、生物学的機能と結びついた任意のポリヌクレオチドセグメントを指す。したがって、遺伝子には、ゲノム配列の場合のイントロンおよびエキソン、cDNAの場合のコード配列および/または前記配列のための調節配列が含まれる。例えば、遺伝子はまた、mRNAまたは機能的RNAを発現するか、または具体的なタンパク質をコードする核酸フラグメントを指し、前記には調節配列が含まれる。
本明細書に開示する主題は、グラム陰性宿主細菌細胞内で多数のプラスミドコピーを維持するための新規な概念(3つの構成成分に基づく)を提示する。第一の構成成分はグラム陰性宿主細菌であり、前記細菌は規定の培養条件下で当該細菌にとって有毒な生成物を発現し、前記有毒遺伝子は当該細菌染色体の非必須領域に挿入されている。第二の構成成分は、当該グラム陰性細菌の染色体上の遺伝子の存在であり、前記遺伝子は、厳密に制御され得る構成的プロモーターの制御下で有毒生成物をコードする。第三の構成成分は、前記宿主染色体上の有毒遺伝子に作動できるように連結されたプロモーターを調節するプラスミド由来の特異的なリプレッサーの発現である。
本発明で意図されるグラム陰性細菌には、アビバクテリウム(Avibacterium)、ブルセラ(Brucella)、大腸菌(Escherichia coli)、ヘモフィルス(Haemophilus)(例えばヘモフィルス・スイス(Haemophilus suis))、サルモネラ(Salmonella)(例えばサルモネラ・エンテリディス(Salmonella enteridis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、サルモネラ・インファンチス(Salmonella infantis))、シゲラ(Shigella)、パスツレラ(Pasteurella)およびリメイレラ(Rimeirella)が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
ある実施態様では、有毒遺伝子は、レバンスクラーゼをコードするsacB構造遺伝子である。別の実施態様では、枯草菌(Bacillus subtilis)のレバンスクラーゼをコードする枯草菌のsacB構造遺伝子である。その天然の環境でのsacBの発現はグラム陽性細菌にとっては無害であるが、グラム陰性細菌で発現される場合、ショ糖含有培地にグラム陰性細菌がプレートされたとき形質転換細菌の急速な死を引き起こす。
本明細書で用いられるように、“ホモローグ”という用語にはオルトローグ、アナローグおよびパラローグが含まれる。野生型ポリペプチドのアナローグ、オルトローグおよびパラローグは、翻訳後修飾により、アミノ酸配列の相違により、またはその両方により野生型ポリペプチドと相違し得る。特に、本発明のホモローグは、一般的には野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の全体または部分に関して少なくとも80−85%、85−90%、90−95%または95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を示し、かつ類似の機能を示すであろう。
“保存的変種”という用語は、アミノ酸残基の生物学的に類似する別の残基による置換、またはコードされるアミノ酸残基が変化しないかまたは生物学的に類似する別の残基となるような核酸配列内のヌクレオチドの置換を指す。これに関して特に好ましい置換は、上記に記載したように一般的に性質が保存的であろう。
この実施態様のある特徴では、プロモーターは配列番号:5に示す配列を有するポリヌクレオチドを含む。別の特徴では、プロモーターは、配列番号:5に示す配列を有するポリヌクレオチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
ある特徴では、本発明はcIリプレッサータンパク質を提供する。別の特徴では、本発明は、配列番号:2、44、46、48、50、52、54、56または58に示す配列を有するcIリプレッサータンパク質およびその変種またはフラグメントを提供する。さらに別の特徴では、本発明は、配列番号:2、44、46、48、50、52、54、56または58に示す配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するcIリプレッサータンパク質を提供する。さらに別の特徴では、本発明は上記で認定したcIリプレッサータンパク質(配列番号:2、44、46、48、50、52、54、56または58)のフラグメントおよび変種を提供する(前記は周知の分子生物学的技術を用いて当業者によって容易に調製され得る)。変種は、本発明のポリペプチド、特に、配列番号:2、44、46、48、50、52、54、56または58に示すアミノ酸配列と少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有する相同なポリペプチドである。
本発明の方法で利用できる他のプロモーター/リプレッサー対には、CarA-CarSリプレッサー-アンチリプレッサー対により制御されるcarBプロモーター、成長ホルモン遺伝子プロモーターおよびリプレッサー、並びにLacリプレッサー(lacl)およびPtrc-2プロモーターが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本明細書に開示する主題はドラッグレスまたは抗生物質フリーの概念を提供する。本概念では、プラスミドから発現されるリプレッサー活性(例えばcIリプレッサー)は、細胞宿主染色体上に存在するλファージプロモーターの下に配置された有毒遺伝子生成物(例えばsacB遺伝子生成物)の転写を阻害し、さらに基質(例えばショ糖)の存在下における宿主細胞の生存活性は、プラスミド由来リプレッサータンパク質(例えばλcIリプレッサータンパク質)がプラスミドから十分なレベルで発現されることによって担保される。抗生物質フリープラスミドを含む宿主株のショ糖存在下での増殖は、効率的な系のDNAプラスミドの維持および産生を担保する。
プラスミドという用語は、本発明のポリヌクレオチドおよび所望の宿主または標的の細胞における前記ポリヌクレオチドのin vivo発現に必要なエレメントを含む任意のDNA転写ユニットをカバーし、さらに前記ユニットに関して、スーパーコイルまたは非スーパーコイルプラスミド、環状プラスミドが、線状形と同様に本発明の範囲内に含まれることが特記される。
プラスミドおよびポックスウイルス以外のウイルスベクターのためのポリアデニル化(ポリA)シグナルに関しては、ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子のポリ(A)シグナル(US 5,122,458参照)、またはウサギβグロビン遺伝子ポリ(A)シグナル、またはSV40ウイルスのポリ(A)シグナルが有用であり得る。
“宿主細胞”は、外因性ポリヌクレオチド(例えば組換えプラスミドまたはベクター)の投与によって既に遺伝的に改変されているかまたは遺伝的に改変することができる原核細胞または真核細胞を意味する。遺伝的に改変された細胞というとき、前記用語は最初に改変された細胞およびその子孫の両方を指す。
ある実施態様では、免疫原は、ネコの病原体、例えばネコヘルペスウイルス(FHV)、ネコカリシウイルス(FCV)、ネコ白血病ウイルス(FeLV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)(ただしこれらに限定されない)、狂犬病ウイルスなどおよび前記の組み合わせから選択される。
別の実施態様では、免疫原は、イヌの病原体(狂犬病ウイルス、イヌヘルペスウイルス(CHV)、イヌパルボプイルス(CPV)、イヌコロナウイルス、レプトスピラ・カニコラ(Leptospira canicola)を含むが、ただしこれらに限定されない)、レプトスピラ・イクテロヘモラージアエ(L. ichterohaemorragiae)、レプトスピラ・グリッポチフォサ(L. grippotyphosa)、ボレリア・バーグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、ボルデテラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica)など、および前記の組み合わせから選択される。
さらに別の実施態様では、免疫原は、ウマの病原体、例えばウマヘルペスウイルス(1型または4型)、ウマインフルエンザウイルス、破傷風、西ナイルウイルス、ストレプトコッカス・エクィ(Streptococcus equi)、ロドコッカス・エクィ(Rhodococcus equi)など、または前記の組合せから選択される。
さらに別の実施態様では、免疫原は、ブタの病原体(例えばブタインフルエンザウイルス(SIV)、ブタシルコウイルス2型(PCV-2)、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス(PRRS)、仮性狂犬病ウイルス(PRV)、ブタパルボウイルス(PPV)を含むが、ただしこれらに限定されない)、FMDV、マイコプラズマ・ヒオプニューモニアエ(Mycoplasma hyopneumoniae)、エリシペロトリクス・リューシオパシアエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、パスツレラ・マルトシダ、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、大腸菌、ブルータングウイルス、アフリカウマ病ウイルス、リフトバレー熱、ニパ(Nipah)ウイルスなど、および前記の組合せから選択される。
本明細書で用いられるように、“医薬的に許容できる担体”および“医薬的に許容できるベヒクル”は相互に用いることができ、副作用を示さずに宿主に注射できる、ワクチン抗原収容のための液体ベヒクルを指す。当分野で公知の医薬的に許容できる適切な担体には、無菌的な水、食塩水、グルコース、デキストロースまたは緩衝溶液が含まれるが、ただしこれらに限定されない。担体は補助剤を含むことができ、前記には、希釈剤、安定化剤(すなわち糖類およびアミノ酸)、保存料、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤、粘性強化添加剤、着色剤などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
これらの陽イオン性脂質でとりわけ好ましいものはDNRIE(N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアンモニウム(WO96/34109)であり、有利には中性脂質(有利にはDOPE(ジオレオイル-ホスファチジル-エタノールアミン))(Behr, 1994)と結合してDMRIE-DOPEを生成する。
有利には、アジュバントを含むプラスミド混合物は即席に、有利には調製物の投与と同時にまたは調製物の投与前近くに(例えば投与前近くまたは投与の前に)形成される。プラスミド-アジュバント混合物は、有利には投与前に十分な時間、例えば投与前に約10から約60分、例えば投与前にほぼ30分を与えて混合物が複合体を生じるように形成される。
DOPEが存在するときは、DMRIE:DOPE分子比は有利には約95:約5から約5:95、より有利には約1:約1、例えば1:1である。
DMRIEまたはDMRIE-DOPEアジュバント:プラスミド重量比は、約50:約1から約1:約10、例えば約10:約1から約1:約5、有利には約1:約1から約1:約2、例えば1:1から1:2である。
この実施態様のある特徴では、DNAプラスミドはさらに免疫原またはタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、このプラスミドでは異種ポリヌクレオチドは作動できるようにプロモーターに連結される。前記プロモーターは原核細胞または真核細胞で機能するプロモーター、例えばCMVプロモーターでもよい。
本明細書に開示する主題はさらに、以下の工程を含む、ドラッグレスプラスミドを用いてタンパク質または免疫原を製造する方法に関する:1)宿主染色体の1つまたは2つ以上の非必須領域に対立遺伝子置換によって挿入された異種ポリヌクレオチドを含むグラム陰性細菌宿主株を操作する工程;2)cIリプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび免疫原またはタンパク質をコードする遺伝子を含むDNAプラスミドを構築する工程;3)cIリプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび免疫原またはタンパク質をコードする遺伝子を含むDNAプラスミドで細菌宿主株を形質転換する工程;4)形質転換細菌宿主株をショ糖の存在下において30℃から42℃の範囲の温度で増殖させる工程;および5)免疫原またはタンパク質を回収する工程。
この実施態様のある特徴では、宿主染色体に挿入される異種ポリヌクレオチドはsacBタンパク質をコードする。別の特徴では、ショ糖濃度は、0%から約20%、約1%から約20%、約1%から約15%、約1%から約10%の範囲であり得る。さらに別の特徴では、ショ糖濃度は、約1%から約10%、約1%から約2%、約2%から約3%、約3%から約4%、約4%から約5%、約5%から約6%、約6%から約7%、約7%から約8%、約8%から約9%または約9%から約10%であり得る。さらに別の特徴では、ショ糖濃度は、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%または約10%であり得る。
この実施態様のある特徴では、温度は約30℃から約42℃の範囲であり得る。別の特徴では、温度は、約30℃から約41℃、約30℃から約39℃、約30℃から約38℃、約30℃から約37℃の範囲であり得る。さらに別の特徴では、温度は、約30℃、約31℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、約39℃、約40℃または約41℃であり得る。
“単離された”生物学的成分(例えばポリヌクレオチド、DNAプラスミド、タンパク質または細胞小器官)とは、前記成分が通常存在する生物の細胞内の他の生物学的成分、例えば他の染色体性および染色体外DNAおよびRNA、タンパク質並びに細胞小器官から実質的に分離または精製されている成分を指す。“単離されている”ポリヌクレオチド(DNAプラスミドを含む)およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製されたポリヌクレオチドおよびタンパク質が含まれる(例えば以下を参照されたい:David W. Russell, Joseph Sambrook (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory)。前記用語はまた、化学的合成と同様に組み換え技術によって調製されたポリヌクレオチドおよびタンパク質を包含する。
本明細書で用いられる“精製された”という用語は完全に純粋であることを要求せず、むしろ相対的用語として意図される。したがって、例えば、精製されたポリペプチドまたはポリヌクレオチド調製物は、当該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがその天然の環境で存在するよりも濃縮されている調製物である。すなわち、当該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは細胞性成分から分離されてある。“実質的に精製された”とは、細胞性成分または物質の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%、またはそれ以上が取り除かれているようなものが意図される。同様に、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは部分的に精製されてあってもよい。“部分的に精製”とは、細胞性成分または物質の60%未満が除去されることを意味する。
特に、本発明は、病原微生物による動物の感染(例えばウイルス、細菌、菌類または原生動物寄生による感染)に対して免疫するか、または前記を予防するか、または前記によって引き起こされる症状を緩和するための方法を提供する。本発明の方法は脊椎動物で有用であり、前記脊椎動物にはヒト、イヌ科の動物(例えばイヌ)、ネコ科の動物(例えばネコ)、ウマ科の動物(例えばウマ)、ウシ科の動物(例えばウシ)およびブタのような動物(例えばブタ)だけでなく鳥類(ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、カモ、ウズラ、キジ、オウム、ウソ、タカ、カラスおよび走鳥類(ダチョウ、エミュおよびヒクイドリ)を含むが、ただしこれらに限定されない)が含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明の方法はまた魚類にDNAワクチンを提供するために有用である。
本発明の具体的な特徴では、これらの方法は、本発明にしたがって製造したワクチン組成物を投与することによって分娩前に妊娠雌動物をワクチン接種することから成る。これらの方法はさらに、ワクチン接種プロトコルにより誘引される防御抗体の誘導およびワクチン接種妊娠雌動物からそれらの子孫への前記防御抗体の伝達を含む。そのような母性抗体の伝達は続いて当該子孫を病気から防御する。
本発明はまた、無針注入器(例えばPigjet(登録商標)、Avijet(登録商標)、Dermojet(登録商標)またはBiojector(登録商標)(Bioject, Oregon, USA))を用いてワクチン組成物を投与すること意図する。当業者は、煩雑な実験を実施することなく、複数の要件(例えばワクチン接種される動物の種、動物の齢および体重など)に関して要求されるように前記注入器の詳細を調節することができる。
本発明はさらに、活性成分(例えば免疫原または医薬組成物)を含む第一のバイアルおよび第二のバイアルに本発明にしたがって作製した希釈剤を含むキットに関する。前記免疫原は凍結乾燥形、乾燥形であっても、または本明細書に記載した水溶液中に存在してもよい。
本発明は、以下の非限定的な実施例の手段によってこれからさらに説明されるであろう。
以下の実施例は、グラム陰性宿主細胞内に多数のプラスミドコピーを維持するための、3つの成分に基づく新規な概念を示す:
1.所定の培養条件下でグラム陰性細菌にとって有毒な生成物を発現するグラム陰性細菌(前記有毒な遺伝子は、細菌宿主染色体の1つまたは2つ以上の非必須領域に挿入される);
2.厳密に調節することができる構成的プロモーターの制御下にある有毒生成物をコードする遺伝子が細菌染色体に存在すること;および
3.宿主染色体上で有毒遺伝子に作動できるように連結されたプロモーターを調節する特異的リプレッサーがプラスミドから発現されること。
この設計では、グラム陰性細菌宿主が所定の培養条件下(例えばショ糖の存在下)にあるときは、前記宿主の増殖を制御するのはプラスミドの存在である。
第一の成分では、グラム陰性細菌は形質転換され、レバンスクラーゼをコードするsacB遺伝子を発現する(図1参照)。第二および第三の成分は、cIリプレッサー遺伝子生成物および右λプロモーターに関する。λバクテリオファージのcI遺伝子はλリプレッサーをコードする。
cIリプレッサータンパク質をコードするゲノム領域は免疫領域として知られている。免疫領域は図2に示されている。cI遺伝子生成物を発現するプラスミド系は、λプロモーターの制御下に配置されたsacB遺伝子の転写を阻害するはずである。そのような抑圧はショ糖に対する耐性を付与し、プラスミドの維持および宿主細胞の増殖の両方を可能にするはずである(図1参照)。
図3は“ドラッグレス”の概念を示す。この概念では、cIリプレッサー活性(プラスミドから発現される)が、細胞宿主染色体に存在するλPrプロモーター下に配置されたsacB遺伝子生成物の転写を阻害し、さらにショ糖の存在下における宿主大腸菌の生存活性は、プラスミドから発現されるλcIリプレッサータンパク質の十分なレベルによって担保される。cIリプレッサーとその特異的プロモーターとの結合は、30℃から37℃の温度で最適である。
特定の事例では(例えば温度感受性cI857リプレッサーを用いるとき)、cIリプレッサーは40℃より高い温度ではプロモーターと結合しないであろう。したがって、42℃への切換えは、cIリプレッサーのλPrプロモーターとの結合活性を阻害し、結果として宿主細胞をショ糖(より具体的にはレバン副生成物)に感受性にするはずである。ショ糖の存在下における42℃でのインキュベーションは完全系における機能性の有効性を立証するためのad hoc条件であり、この系の完全な機能性を支持する“負の証明”を構成する(図4および図6C参照)。実際、Catまたはショ糖のどちらかの存在下で増殖するpPB829またはpPB838のどちらかで形質転換した親細胞λPr::sacBpurNΩkanは、LBショ糖寒天に播種し42℃でインキュベートしたとき生存しなかった。このことは、親細胞の生存活性はcI遺伝子を含むプラスミドの維持に依存することを示している。
λPr::sacBpurNΩkanカセットを含む2つの操作宿主株を調製した。この場合、カセット(ラムダプロモーター(λPr)の制御下にsacB遺伝子を含む)にカナマイシンで目印を付し、続いてedAまたはpurN遺伝子の対立遺伝子置換によって大腸菌染色体に導入する。これらの遺伝子は必須ではなく、前記の欠失は増殖速度に影響を与えない。形質転換細胞はショ糖に対して高度に感受性になった。
図8A−Bは、大腸菌染色体にそれぞれedAまたはpurN遺伝子の対立遺伝子置換によって挿入されるべきλPr::sacBpurNΩkanカセットが、結合PCRによって融合される前にPCR増幅された6つの別個の成分を含むことを示す。
図8Dは、λPr::sacBpurNΩkanカセットが、edAまたはpurN遺伝子の対立遺伝子置換によって大腸菌の染色体に挿入されたことを示す。このカセット挿入は、線状DNA鋳型(染色体遺伝子座の上流および下流の相同領域によってフランキングされた欠失遺伝子を含む)で大腸菌を形質転換することによって実施し、さらに組換え熟練大腸菌株(例えばrecD, recB recC sbcA変異体)に伝達した。親株の操作のための大腸菌株はStratageneのBJ5183株(ref# 200154)で、遺伝子型はendA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR(Strr)であった。提示したように、この大腸菌野生型の最初の表現型はKanS、CatSおよびSucroseRであった。この最新の表現型は、抗生物質フリープラスミドの機能性の提示に関する更なる実験に用いられた親株のものであった。
図8Cは、Prλ::sacBΩkan大腸菌染色体にedA遺伝子の対立遺伝子置換によって挿入されるべきλPr::sacBΩcatカセットが、結合PCRによって融合される前にPCR増幅された6つの別個の成分を含んでいたことを示す。対立遺伝子交換によりedA遺伝子の欠失を標的とする新規なλPr::sacBΩcatカセットの目的は、2つのsacBカセットを発現する二重欠失変異体ΔedAΔpurNを操作することであった。
図8Eは、親株をcIプラスミド(pPB829またはpPB838)で形質転換したとき、細胞がカナマイシン耐性(KanR)、クロラムフェニコール耐性(CatR)およびショ糖耐性(SucroseR)になったことを示す(親株+cIプラスミド[pPB829またはpPB838])。図は、概念を立証するために、sacBがラムダプロモーターの制御下に配置され、構築物がedAまたはpurN遺伝子の対立遺伝子置換によって大腸菌の染色体に導入されたときに、操作された宿主株(ΔpurNλPr::sacB+Ωkan)または(ΔedAλPr::sacB+Ωkan)およびドラッグプラスミドが同時に存在することを示している。形質転換細胞は高度にショ糖感受性になった。cIリプレッサーを含むクロラムフェニコールの目印をもつプラスミド(pPB838またはpPB829)がΔpurNλPr::sacB+ΩkanまたはΔedAλPr::sacB+Ωkan株に導入されたとき、形質転換細胞はカナマイシン、クロラムフェニコール、およびショ糖耐性になった。
PB1232プライマー(配列番号:6):
(CCGAACAACGCGTGGTTATCGACACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCG) および
PB1232プライマー(配列番号:7)
(CAAACTTTTTGATGTTCATATCCATCTGATCCTCTTCAAAAGGCCACCTG)
λプロモーター(λPr)が、edA欠失のためにPB1234およびPB1233を用いて増幅された。
PB1234プライマー(配列番号:8):
(GACGACAAATTTGTAATCAGGCGAGAGCACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCG)。
λプロモーター(λPr)(配列番号:5)の増幅はDNA鋳型としてpLDR8プラスミド(ATCC#77357)を用いて実施した。sacB遺伝子(配列番号:3)は、λPr::sacBΩkanカセットの操作のために結合PCRを用いたときは、PB1192(配列番号:9)(ATGGATATGAACATCAAAAAGTTTGC)およびPB1193(配列番号:10)(AAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCTTG)プライマーを用い、DNA鋳型としてはpNB350(Merialの特許物)を用いて増幅した(図8A−B参照)。λPr::sacBΩcatカセットの操作のためには、リバースプライマーPB1320(配列番号:80)(GCCGATCAACGTCTCATTTTCGCCGTTAACAGATCTTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCTTG)がPB1193の代わりに用いられた。blaプロモーターは、PB1194(配列番号:11)(ATGTGCGCGGAACCCCTATTTG)およびPB1195(配列番号:12)(GACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGC)プライマーを用い、DNA鋳型としてはpCMVβを用いて増幅された。カナマイシン耐性遺伝子は、PB1196(配列番号:13)(ATGAGCCATATTCAACGGGAAACG)およびPB1197(配列番号:14)(GAAAAACGCCAGCGGCAGAGCTGGCGCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG)プライマーを用い、DNA鋳型としてはプラスミドpLL14(カナマイシン遺伝子の弱いプロモーターを含む、Merialの特許物)を用いて増幅された。その天然のcatプロモーターの制御下に配置されたクロラムフェニコール(cat)耐性遺伝子は、PB1321(配列番号:81)((AGATCTGTTAACGGCGAAAATGAG)およびPB1322(配列番号:82)(AAAACGCTACAAAAATGCCCGATCCTTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGC)プライマーを用い、DNA鋳型としてはpPB829を用いて増幅された。purN遺伝子の5'フランキング領域は、PB1237(配列番号:15)(TTTGCGGCCGCTGGTGGTGGTCGCCATGTGCGTTAATGACC)およびPB1199(配列番号:16)(TATTCGATAACCACGCGTTGTTCGG)を用い、DNA鋳型としては大腸菌SCS1株のゲノムDNAを用いて増幅された。purN遺伝子の3'フランキング領域は、PB1200(配列番号:17)(GCGCCAGCTCTGCCGCTGGCGTTTTTC)およびPB1238(配列番号:18)(TTTGGATCCGCTGGTGGATATCATCAAGGCAGTAACGCAGAATG)プライマーを用い、DNA鋳型としては大腸菌SCS1株のゲノムDNAを用いて増幅された。edA遺伝子の5'フランキング領域は、PB1235(配列番号:19)(TTTGCGGCCGCTGGTGGTTGAGAACCAGGTGATTGAAGCGCC)およびPB1209(配列番号:20)(CTCTCGCCTGATTACAAATTTGTCGTC)プライマーを用い、DNA鋳型としてはSCS1のゲノムDNAを用いて増幅された。edA遺伝子の3'フランキング領域は、以下のプライマーPB1210(配列番号:21)(AGGATCGGGCATTTTTGTAGCGT)およびPB1236(配列番号:22)(TTTCTAGAGCTGGTGGCGACTACCGTGAATCCTGGCAACC)を用い、DNA鋳型としてはプラスミドpLDR8を用いて増幅された。
標的遺伝子座(edAまたはpurN)の境界のDNA配列に相同な2つの長い領域によってフランキングされた、λPrプロモーター(配列番号:75)の制御下に配置されたsacB遺伝子およびblaプロモーターの制御下に配置されたKan耐性遺伝子をコードする線状DNAフラグメント(λPr::sacBΩkan)が、エレクトロポレーションによって大腸菌の染色体に組み込まれた。ほぼ300の形質転換候補体(ΔpurNλPr::sacBΩkanまたはΔedAλPr::sacBΩkanシングル変異体)が、選別圧としてカナマイシンを含むLB寒天プレートで得られた。20個のコロニーをランダムに採取し、カナマイシン含有プレートでストリーキングすることにより精製し、PCRによってedAまたはpurN遺伝子座へのλPr::sacBΩkanカセットの挿入を立証した(図9B参照)。PB1196およびPB1197を用いたPCRを実施し、染色体へのKanamycinの挿入をチェックした。PB1192およびPB1193を用いてPCRを実施し、染色体にsacB遺伝子が存在することを立証した。PB1204(配列番号:23)(GTGGTGCTTATTTCCGGCAACGG)およびPB1205(配列番号:24)(CCAGCCACGCGGCGTTTTCGTGC)を用いてPCRを実施し、染色体にpurN遺伝子が存在しないことを立証した。PB1214(配列番号:25)(GACCACCGGCCCGGTTGTACCGG)およびPB1215(配列番号:26)(CGGACCCGCGATCGCCTGCAGG)を用いてPCRを実施し、edA遺伝子が存在しないことを立証した(図9B参照)。PB1213(配列番号:27)(GGTGGATGGCGTCCATTTCTGTGC)およびPB1196プライマーを用いてPCRを実施し、edA遺伝子座の右側に正しくカセットが挿入されていることを立証した。PB1212(配列番号:28)(CAAAAGTGTTAAGCGGTAACCTG)およびPB1233プライマーを用いてPCRを実施し、edA遺伝子座の左に正しくカセットが挿入されていることを立証した。PB1203およびPB1196プライマーを用いてPCRを実施し、purN遺伝子座の右に正しくカセットが挿入されていることを立証した。PB1202およびPB1233プライマーを用いてPCRを実施し、purN遺伝子座の左に正しくカセットが挿入されていることを立証した(図9C参照)。全てのPCRチェックによって正しい遺伝子座への組込みが確認された。さらにまた、sacB遺伝子の機能性もまた図10Bに示すように確認された。この操作した親株ΔpurNλPr::sacBΩkanはショ糖を含むLB寒天プレートでは増殖できなかった(図10)。
標的遺伝子座(edA)の境界のDNA配列に相同な2つの長い領域によってフランキングされた、sacB遺伝子(λPrプロモーターの制御下に配置されている)およびCat耐性遺伝子(その天然のcatプロモーターの制御下に配置されている)をコードする線状DNAフラグメント(λPr::sacBΩcat)が、エレクトロポレーションによってΔpurNλPr::sacBΩkan大腸菌株の染色体に組み込まれた。ほぼ200の形質転換候補体(ΔpurNλPr::sacBΩkanΔedAλPr::sacBΩcatダブル変異体)が、選別圧としてクロラムフェニコールを含むLB寒天プレートで得られた。20個のコロニーをランダムに採取し、クロラムフェニコール上でストリーキングすることにより精製し、プライマーセットPB1212およびPB1213を用いたPCRによって、edA遺伝子座へのλPr::sacBΩcatカセットの挿入を立証した(図9C参照)。PCR生成物はシークェンシングによってチェックし、λPr::sacBΩcatとの同一性を立証した。
宿主株の操作は図8Dに示されている。図8Eは、宿主株(1つのsacBカセット[λPr::sacBΩkan])およびドラッグレスプラスミドの同時存在を示す。最初の大腸菌の遺伝子型はKanS、CatS、SucroseRである。大腸菌ΔpurN Prλ::sacBΩkanの染色体へのカセットの組込みは、新規な遺伝子型KanR、CatS、SucroseSを生じた。cIリプレッサーを保持するプラスミドの導入によって、最終的な遺伝子型KanR、CatR、SucroseRが生成された。
プラスミド構築の要旨
pPB828から誘導したプラスミド、例えばpPB829およびpPB844-pPB847を作製した。前記は、それ自身のプロモーターまたはカナマイシン遺伝子の弱いプロモーター(P1)のどちらかの制御下にあるλファージのcI ORFを含む。カナマイシン遺伝子の弱いプロモーター(P1)の制御下に配置されたcI遺伝子を含むpPB383プラスミドを中間プラスミドの市販ベクターpMCS5を用いて作製した(pMCS5ではアンピシリン耐性遺伝子がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(cat)に置換されていた)(図19)。
pPB844およびpPB845プラスミドはcI遺伝子(P1プロモーターの制御下に配置されている)を含む。前記cI遺伝子は、cat遺伝子を含むpVR1012誘導体(pVR1020または1012プラスミド、VICAL Inc.(Luke et al. 1997;Hartikka et al. 1996;例えば米国特許5,846,946号および6,451,769号参照))であるpPB828でクローニングされた。pPB844およびpPB845プラスミドは、cI遺伝子の当該プラスミド中での向きが異なっている(図20−21)。
pPB846およびpPB847プラスミドはcI遺伝子(それ自身の(天然の)プロモーター(配列番号:30)の制御下に配置されている)を含む(前記cI遺伝子は、cat遺伝子を含むpVR1012誘導体であるpPB828でクローニングされた)。これらのプラスミドは、cI遺伝子の当該プラスミド中での向きが異なっている(図22−23)。
pPB885はpPB838プラスミド(cI遺伝子はカナマイシン遺伝子の弱いプロモーター(P1)の制御下に配置されている)から調製され、前記では、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(cat)はAvrII制限消化によって除去された(図24)。
pPB829から誘導されたプラスミド、例えばpPB896は、カナマイシン遺伝子の弱いプロモーター(P1)の制御下に配置されたcI遺伝子を含む。pPB896プラスミドは、真核細胞CMVプロモーターの制御下に配置されたGFPマーカー遺伝子を含む(図25)。
これらのプラスミドをドラッグレス系で異種ポリヌクレオチド、対象の遺伝子(トランスジーン)のクローニングのためにベクターとして用いた。各プラスミドは抗生物質耐性遺伝子(cat)を含み、前記は、固有の制限酵素によって切り出して除去し、適切な大腸菌sacB+株でショ糖の存在下において抗生物質選別圧(例えばクロラムフェニコール)によることなくプラスミドの増殖を可能にすることができる。
これらのプラスミドの抗生物質耐性遺伝子(cat)は概念の証明のためにのみ用いられた。最終的なドラッグレスプラスミドではこのcat遺伝子は最終的に除去される(図13−15および実施例4を参照)。
プラスミドpLDR8(ATCC No#77357)由来のcI遺伝子はリプレッサータンパク質cI857変異体を生成する(NCBI: AB248924, Cloning vector pND707, C.A. Love et al. Gene 1996, 17; 176(1-2):49-53)。
pPB828プラスミド:(pVR1012系プラスミド+Cat遺伝子)(図17)
pPB828誘導プラスミド、例えばpPB829を作製した。前記はカナマイシン遺伝子の弱いプロモーター(P1)の制御下にあるλファージのcI ORFおよび固有のEcoRI消化部位によって切り出すことができるCat遺伝子を含む。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(cat)遺伝子を含み、pPB828プラスミドを生じる、pVR1012系発現ベクターを作製した。pPB627(Merialの特許物質)由来のcat遺伝子はpNB335(Merialの特許物質)の誘導体であった(pNB335はそれ自体最初のプラスミドpSW23T(クローニングプラスミドGenBankアクセッション番号AY733066)の誘導体である)。cat遺伝子に対応するDNAフラグメント(798bp)(DNAについては配列番号:31、タンパク質については配列番号:32)は、プライマーPB1184(配列番号:33)(GAATTCCGGTCCGGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGC3)(EcoRI部位(下線部)を含む)およびPB1185(配列番号:34)(CCTAGGCTGTGTTAATTAAGGCGCGCCGAATTCCGGTCCGTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGC)(EcoRI部位(下線部)を含む)を用い、鋳型のpNB350およびPhusionTM High-Fidelity DNAポリメラーゼ(Finnzymes, 02150 Espoo, Finland)を用いてPCRによって入手した。得られたPCR生成物(832bp)をpCRblunt Topoベクター(Invitrogen, CA, USA)に連結し、プラスミドpCRblunt/PB1184-1185(4351bp)を得た(図16)。pCRblunt/PB1184-1185の実体は制限分析(PvuII消化)によって確認した。Cat遺伝子に対応するDNAフラグメントは、pCRblunt/PB1184-1185プラスミドのEcl136IIおよびEcoRVによる酵素消化によって入手した。897bpフラグメントをpVR1012系プラスミド(先にMscIおよびStuIで消化しておいた(3303bp))に連結してプラスミドpPB828を作製した(図17)。pPB828の実体は制限分析によって確認した(挿入物のサイズ決定のためにはPvuIIおよびNcoI消化、および遺伝子catが良好に除去されていることを立証するためにはEcoRI消化)。
pPB829プラスミド:(pPB828プラスミド+P1::cI遺伝子)(図18)
P1プロモーター(カナマイシン耐性遺伝子の弱いプロモーター)の制御下にあるcI遺伝子を含む構築物は融合PCRを用いて入手した。弱いプロモーターP1に対応するDNAフラグメントは、プライマーPB1186(配列番号:35)(TCATACCAGGCCTAGGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATG)およびPB1187(配列番号:36)(AACACCCCTTGTATTACTGTTTATG)を用い、鋳型としてpLL14(Merialの特許出願US2005/0164946を参照されたい)、さらにPhusion DNAポリメラーゼを用いたPCRによって入手した。cI遺伝子(配列番号:1)に対応するDNAフラグメントは、プライマーPB1188(配列番号:37)(AATACAAGGGGTGTTATGAGCACAAAAAAGAAACCATTAACAC)(5'末端のP1配列の相補性領域(下線部)を含む)およびPB1189(配列番号:38)(CCGGAATTCGGCGCGTCAGCCAAACGTCTCTTCAGGCCACTG)を用い、鋳型としてpLDR8(ATCC#77357)、さらにPhusion DNAポリメラーゼを用いたPCRによって入手した。2つのPCR生成物(それぞれ151および729bp)を精製し、第二のPCR工程(PB1186およびPB1189プライマーおよびPhusion DNAポリメラーゼ(Finnzymes, Finland)を使用)で鋳型として用いた(図24参照)。2つのPCR生成物(それぞれ151および729bp)を精製し、AscIおよびAvrIIで消化したpPB828と連結して、プラスミドpPB829(4970bp)を作製した(図9A)。連結は、Clontech(Takara Bio Europe, St-Germain-en-Laye, France)の“In-Fusion PCR Cloning Kit”(Cat No. 740590.250)を用いて実施した。HindIII消化分析に続いてクローンpPB829を選別した。cI遺伝子およびP1プロモーターの配列の完全性は、プラスミドpPB829のシークェンシングによって確認した。
pPB896プラスミド:(pPB829プラスミド+P1::cI遺伝子+GFP)(図25)
GFPマーカー遺伝子は、真核細胞CMVプロモーター(配列番号:43)の制御下に配置した。GFP遺伝子は、pCG105プラスミド(真核細胞CMVプロモーターの制御下に配置されたGFP遺伝子を有するpPB828誘導プラスミド、Merialの特許物)のNotI/BglIIの両方による制限消化により調製した。この消化GFP遺伝子を、先にNotI/BglIIで切断しておいたpPB829プラスミドでクローニングしpPB896プラスミドを生成した。
pPB837.1プラスミド:(pMCS5プラスミド+Cat遺伝子)
Cat遺伝子に対応するDNAフラグメントは、プライマーPB1182(配列番号:39)(AGATCTGTTAACGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGC)(5'末端にBglII部位を含む)およびPB1183(配列番号:40)(GTCGACGTTAACTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGC)(5'末端にSalI部位を含む)、鋳型としてpPB791(プラスミドpNB350の誘導体)、およびPhusion DNAポリメラーゼを用いてPCRによって入手した。
PCRプライマーはpNB350のcat配列を土台にして設計した。3つの別個のPCR生成物(779bp)をプールし、pCRIIベクターに連結してプラスミドpCRII+PB1182-1183(4734bp)を入手した。pCRII+PB1182-1183のクローンをSalI/BglII消化に続いて選別した。DNAフラグメントA(2950bp)を得るために、pMCS5プラスミド(MoBiTec, Germany)をSalIおよびBglIIで消化した。pCRII+PB1182-1183をSalIおよびBglIIで消化し、フラグメントSalI-BglIIをアガロースゲルから単離した(797bp:フラグメントB)。フラグメントAおよびBを連結してプラスミドpPB837.1(3747bp)を生成した。
pPB837.2:blaプロモーターをもたない(pMCS5+Cat)
blaプロモーター領域を含まないプラスミドpPB837.2を作製した。プラスミドpPB837.1をNaeIおよびXmnIで消化し、3300bpのフラグメントNaeI-XmnIを単離し、アガロースゲルで精製した(フラグメントA)。このフラグメントAを連結してpPB837.2(3300bp)を得た。BglI消化に続いてクローンpPB837.2を選別した。
pPB838プラスミド(blaプロモーターのないpMCS5+Cat)+P1::cI(図22)
P1プロモーター(カナマイシン耐性遺伝子の弱いプロモーター)の制御下にあるcI遺伝子を含む構築物は融合PCRを用いて入手した。弱いプロモーターP1に対応するDNAフラグメントは、プライマーPB1186およびPB1187、鋳型としてPLL14、およびPhusion DNAポリメラーゼを用いてPCRにより入手した。cI遺伝子に対応するDNAフラグメントは、プライマーPB1188およびPB1189、鋳型としてpLDR8(ATCC#77357)、およびPhusion DNAポリメラーゼ(Finnzymes. Finland)を用いてPCRによって入手した。2つのPCR生成物(それぞれ151および729bp)を精製し、第二のPCR工程でPB1186およびPB1189プライマー並びにPhusion DNAポリメラーゼとともに鋳型として用いた。2つのPCR生成物(880bp)をプールし、pCRIIbluntベクターに連結してプラスミドpCRblunt+PB1186-1189(4400bp)を得た。クローンpCRblunt+PB1186-1189をEcoRV/SpeI消化に続いて選別した。
EcoRV-SpeIフラグメントA(936bp)を得るために、pCRblunt+PB1186-1189をEcoRVおよびSpeIで消化した。pPB837.2をEcoRVおよびSpeIで消化し、フラグメントEcoRV-SpeIをアガロースゲルから単離した(3464p:フラグメントB)。フラグメントAおよびBを連結してプラスミドpPB838(4216bp)を生成した。HindIII消化に続いてクローンpPB838を選別した。cI遺伝子およびP1プロモーターの配列の完全性はシークェンシングによって確認した。
pPB885プラスミド(blaプロモーターのないpMCS5+Cat)+P1::cI(図24)
このプラスミドはpPB838プラスミドから誘導した(前記では、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(cat)はAvrII制限消化によって除去された)(図24)。pPB885プラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子の弱いプロモーター(P1)の制御下にcI遺伝子を含む。pPB885プラスミドは、ΔpurNλPr::sacBΩkan大腸菌宿主株の形質転換に続いて、実施例4(下記に示す)に記載するように10%ショ糖補充LB寒天プレート上での直接選別によって単離された。
プラスミドpPB844-pPB845(図23−24)
P1プロモーターの制御下のcI遺伝子に対応するDNAフラグメントは、プライマーPB1186およびPB1263(配列番号:41)(TCAGCCAAACGTCTCTTCAGGCCAC)、鋳型としてpPB838、並びにPhusion DNAポリメラーゼを用いてPCRによって入手した。4つの別個のPCR生成物PB1186-PB1263(864bp)をプールし、pCRbluntベクターに連結してプラスミドpCRblunt+PB1186-1263(4383bp)を入手した。pCRblunt+PB1186-1263のクローンをHindII消化に続いて選別した。
pCRblunt+PB1186-1263プラスミドをEcoRIで消化し、末端をクレノーポリメラーゼで充填して平滑端フラグメント(929bp:フラグメントA)を生成した。pPB828プラスミドをXmnIで消化し、得られたXmnI-XmnIフラグメント(フラグメントB:4135bp)を精製した。フラグメントAおよびBを連結してプラスミドpPB844またはpPB845を生成した。候補物をBamHI/HindIII消化によってスクリーニングした。pPB844プラスミド(図20参照)では、cI遺伝子は、ベクターのMCS(マルチクローニング部位)でクローニングされるべき対象のトランスジーンとCMVプロモーター(配列番号:43)の制御下で同じ向きに存在する。pPB845プラスミド(図21参照)では、cIは反対方向に向いている。
それ自身のプロモーター(cIの天然のプロモーター:配列番号:30)の制御下のcI遺伝子に対応するDNAフラグメントは、プライマーPB1266(配列番号:42)(GCTGACTCATACCAGGCACGCACGGTGTTAGATATTTATCCC)およびPB1263、鋳型としてpLDR8、並びにPhusion DNAポリメラーゼを用いてPCRによって入手した。
pPB846-pPB847プラスミド
4つの別個のPCR生成物PB1266-PB1263(777bp)をプールし、pCRbluntベクターに連結してプラスミドpCRblunt+PB1266-1263(4296bp)を入手した。pCRblunt+PB1266-1263のクローンをHindII消化に続いて選別した。
pCRblunt+PB1266-1263プラスミドをEcoRIで消化し、末端をクレノーポリメラーゼで充填して平滑端フラグメント(842bp:フラグメントA)を生成した。pPB828プラスミドをXmnIで消化し、得られたXmnI-XmnIフラグメント(フラグメントB:4135bp)を精製した。フラグメントAおよびBを連結してプラスミドpPB846またはpPB847を生成した。候補物をBamHI/HindIII消化によってスクリーニングした。pPB846プラスミド(図22参照)では、cI遺伝子は、ベクターのMCS部位でクローニングされるべき対象のトランスジーンとCMVプロモーターの制御下で同じ向きに存在する。pPB847プラスミド(図23参照)では、cI遺伝子は反対方向に向いている。
D.構築の結果
図7は、ドラッグレスプラスミドの調製に用いられたcIリプレッサーを保持するpPB838およびpPB829の構築を示す。両プラスミドはクロラムフェニコール(CatR)遺伝子で目印を付されていた。これらのプラスミドのCat遺伝子は概念の証明のためにのみ要求されたが、最終的には除去することができる(図13−15および実施例4を参照されたい)。
クロラムフェニコール(Cat)の目印をもつcIプラスミドによって形質転換した細胞を選別圧として抗生物質を使用することなく寒天プレートでスクリーニングできる実験的方法は有効であることが示された(図13−15参照)。大腸菌λPr::sacB+ΔpurNΩkanのコンピテント細胞を1μgのpPB838またはpPB829プラスミドで形質転換し、LB液体ブロスにて30℃で3時間インキュベートした。希釈した(10-3から10-4)形質転換細胞(pPB838またはpPB829プラスミドで)の100μLアリコットを10%のショ糖を含むLB寒天プレートに播種した。10-3から10-4の範囲のこれら希釈物は本物の形質転換細胞(例えばcIプラスミドを有する)の選別に適切であるように思われる。なぜならば、ショ糖含有LB寒天プレートで増殖するショ糖耐性細胞の98−100%がCatRであったからである。このことは、これら形質転換細胞はcIプラスミド(pPB838またはpPB829)を有することを示唆している。
図13Aは、大腸菌λPr::sacB+ΔpurNΩkanのコンピテント細胞が、1μgのpPB838またはpPB829プラスミドで形質転換され、ドットスポット(各ドットに4μL)の前にLB液体ブロスにて30℃で3時間インキュベートされたことを示す。図は、クロラムフェニコール(15μg/mL)またはショ糖(10%)を含むLB寒天プレートでのLog希釈(未希釈から6Log希釈の範囲)を示す。大腸菌λPr::sacB+の非形質転換コンピテント親株細胞を同様な条件下での標準細胞増殖として用いた。期待したとおり、標準細胞はcatおよびショ糖のような選別プレートでは増殖しなかった。それにもかかわらず、長期間(3日間)のインキュベーションのために、いくつかの偶発的ショ糖耐性変異体がこの条件下で出現した。このレベルの偶発的変異体は、本物の形質転換細胞のスクリーニングについて考慮されるべきベースラインを規定する。この実験条件下では、2Log差がcatおよびショ糖で増殖する形質転換細胞で観察された。前記各規定のコンピテント細胞は、一時的に細胞壁の脆弱を示す。形質転換細胞をエレクトロポレーション後にLB液体培地でインキュベーションすることによって、エレクトロポレーションに続く前述の細胞壁の脆弱並びに細胞壁および細胞膜の誘発孔の復活が可能になる。コンピテント細胞は、λPr::sacB+ΔpurNΩkanカセットの挿入のために遺伝的にショ糖に感受性であるので、ショ糖の存在下での形質転換細胞の回復は、Catでの細胞の回復と比較して2Log低下した。これらの観察は、100μLの形質転換細胞を選別プレートに播種することによって確認された(図13B参照)。
図13Bは、catおよびショ糖上での形質転換有効率を決定し、さらにLBショ糖寒天プレートで増殖できる本物の形質転換細胞のスクリーニングの成功のために考慮すべき偶発的変異体出現率のベースラインをより厳密に規定するために、100μLの形質転換細胞および非形質転換標準細胞を適切なLog希釈を用いてcatまたはショ糖含有LB寒天プレートに播種したことを示す。以前のドットスポット細胞実験(図13A参照)と一致して、偶発的ショ糖耐性変異体は、形質転換細胞の10-3希釈をショ糖含有LB寒天プレートに播種したときは検出できなかった。以前に示したように(図13A参照)、この条件下ではcatおよびショ糖上での選別で形質転換効率に2Log差が存在した。10-3から10-4の範囲の希釈は、ショ糖含有LB寒天に播種したとき、本物の形質転換細胞(例えばcIプラスミドを有する)の選別に適切であるように思われた。
図14A−Cは、選別圧として抗生物質を使用することなく、プラスミド(pPB829およびpPB838)で形質転換した細胞を選別する実験的方法の有効性を示す。
図14Aは、cIプラスミドを有する本物の形質転換細胞のスクリーニングの有効性を立証するためにレプリカプレートアッセイを用いた実験の概要を示す。図13Bに示したものと同様に、コンピテント親細胞λPr::sacB+ΔpurNΩkanをcIプラスミド(pPB829およびpPB838)で形質転換し、30℃で3日間インキュベートする前に適切なLog希釈物を選別(Catまたはショ糖)LB寒天プレートに播種した。その後、20から50の範囲のCFU(コロニー形成単位)を示したプレートのレプリカを、30℃でさらに3日間インキュベートする前にCatまたはショ糖またはその組合せを含む別の新しいLB寒天プレートで作成した。理論的には、Cat耐性コロニーはcIプラスミドを増殖させる細胞と一致するはずである。
図14Bは、CatR CFUは、レプリカプレートアッセイ後にショ糖LB寒天プレートおよびCat/ショ糖LB寒天プレートで得られた数と同一であることを確認した実験結果を示す。図14B(パネルB)に示すように、CatR CFUは、i)全てがショ糖耐性、ii)全てがCatおよびショ糖の組合せに耐性であり、全ての親株は形質転換後にcIプラスミドを保持することを示している。パネルCは、ショ糖上で直接選別した10-3および10-4希釈の形質転換細胞はまた、ショ糖耐性であり、さらにCatおよびショ糖の組合せに耐性であることを示し、これらショ糖耐性CFUはまたcIプラスミドを含む形質転換細胞と一致することを示す。実際、非形質転換親細胞をショ糖含有LB寒天プレートに播種したとき、ショ糖耐性CFUは、ショ糖およびCatの組合せ上で複製させたとき期待したように増殖しなかった(クロラムフェニコール耐性はpPB829またはpPB838プラスミドのどちらかによって持ち込まれた表現型の属性であるからである)。
図14Cは、レプリカプレートアッセイ(図14B参照)から得られた統計学的データ、より具体的には、抗生物質を使用することなく選別されたcIプラスミド保有コロニーのパーセンテージを示す。この実験条件下では、cIプラスミド保有コロニーのパーセンテージは98%から100%の範囲である。
大腸菌の染色体に挿入されたλPr::sacB+カセットの機能性をチェックするために、 sacBを発現する大腸菌細胞、ΔpurNλPr::sacB+Ωkanをショ糖の存在下または非存在下で増殖させた。
図4はこの不活化系の“ショ糖感受性”を示す(前記不活化系では、42℃への切換えは、cIリプレッサーのλPrプロモーターとの結合活性を阻害し、宿主細胞をショ糖感受性にする)。cIリプレッサータンパク質(プラスミドから発現される)は、宿主染色体に位置するλPrプロモーターの制御下に置かれた有毒なsacB遺伝子生成物の転写を阻害する。ショ糖の存在下での宿主大腸菌細胞の生存活性は、プラスミドから発現されるλcIリプレッサータンパク質の十分なレベルによって担保される。図5は、ショ糖存在下での宿主細胞と抗生物質フリーpDL1プラスミドとの組合せによるドラッグレスプラスミド(pDL:DrugLess Plasmid)の生成を示す。概念の証明のための実験計画はさらに図6A、6Bおよび6Cに示される。
ショ糖の存在下または非存在下で増殖させたときのsacB発現宿主細胞、ΔpurNΩλPr::sacB+Ωkanの生理学的特徴を表1に示す。
表1:ショ糖の存在下および非存在下で増殖させたときのsacB+宿主細胞(ΔpurNΩλPr::sacB+)の生理学的特徴
表2:ショ糖の存在下および非存在下で増殖させたときのpDL1プラスミド保持および非保持(λPr::sacB+)宿主細胞の生理学的特徴
図10−11は、遺伝的に操作した宿主株は30−37℃でショ糖に対して高度に耐性であるが、42℃では増殖は認められないことが確認された結果を提供する。図10は、pPB829プラスミドまたはpPB838プラスミドを保持する大腸菌宿主株(ΔpurNλPr::sacB+Ωkan)の2回目の継代はショ糖の存在下において32℃で良好に増殖したことを示す。sacB遺伝子発現は、両方のcIプラスミドから合成されたcI遺伝子生成物によって完全に抑圧された。プラスミドの維持は100%有効で(CatRのコントロールに対して)、細胞はショ糖の存在下で生存できた。42℃では、cI遺伝子生成物は不活化された。プラスミドは維持されず、細胞はショ糖の存在下で死滅した。このことは、ショ糖の存在下における細胞の生存活性は機能的cIプラスミドの存在に帰せられることを示している。
ドラッグレスプラスミドを生成したら、安定性およびショ糖またはCat含有新鮮ブロス培養液中での数代にわたるそれらの強固さについて試験した。
図11は、増殖細胞中でのpPB829およびpPB838プラスミドの安定性を示す。前記安定性には、クロラムフェニコールまたはショ糖による選別中に明白な遺伝的再編成が存在しないことが含まれる。ショ糖およびクロラムフェニコールの存在下で増殖する培養に匹敵し得るプラスミドの収量および維持が5連続継代の後でも認められた。抗生物質系および非抗生物質系は、プラスミドの維持および増殖細胞からの選別に関しては少なくとも等価であった。
図12は、細胞を30℃で増殖させたときは、親大腸菌に挿入されたλPr::sacBカセットで偶発的変異は発生しないことを示す。この観察は、細胞をショ糖の存在下で増殖させたとき、そのような大腸菌の遺伝的背景におけるcIプラスミドの安定性をはっきりと示している(図10参照)。この変異発生率実験は、親株(purNが欠失しsacB遺伝子を発現する)を用いて実施した。30℃では18時間インキュベートした後で変異は発生しないことが示された。染色体にsacB+カセットを保持する親細胞のクローン培養をショ糖含有LBで増殖させた。細胞を1.0のODで採集し、100μLアリコットをショ糖含有LB寒天プレートに播種した。sacB遺伝子の存在は細胞死を引き起こすので、偶発的変異発生率は、30℃での一晩インキュベーション後のショ糖耐性コロニーのスコアによって判定した。sacB+カセットを保持するがcIプラスミド(pPB829およびpPB838)で形質転換されていない標準細胞はショ糖耐性となり、スコア判定のために、ショ糖補充LB寒天プレートに播種(100μL)する前にOD1.0の培養を5Log希釈することが必要であった。一晩(18時間インキュベーション)培養の後で親細胞培養(ΔpurNλPr::sacBΩkan)に関してショ糖耐性コロニーは検出されず、一方、pPB829およびpPB838プラスミドで形質転換したΔpurNλPr::sacBΩkanの5Log希釈は増殖した。細胞を37℃でインキュベートしたとき、36時間がいくつかのショ糖耐性コロニー(ΔpurNλPr::sacBΩkan)の検出に必要であった。
37℃でインキュベートしたときには、偶発的変異発生は、36時間後に1.3 x 105細胞当たり1変異発生率で生じた。ショ糖の存在下で増殖している細胞でのcIプラスミドの維持は30℃での一晩インキュベーションで有効であるが、一方、親株の増殖は検出されなかった。
図8Cおよび図9Dの両図は、2つのsacBカセット(ΔpurNλPr::sacBΩkan ΔedAλPr::sacBΩcat)を保有する大腸菌の新規な親宿主株の操作態様を示す。
図10B−Cは、二重sacBカセット大腸菌株(ΔpurNλPr::sacB+ΩkanΔedAλPr::sacB+ΩCat)は、30℃および42℃でインキュベートしたとき、ショ糖の存在下で高度に感受性である(増殖しない)が、一方、1つのsacBカセットを有する大腸菌株に関しては10%ショ糖に播種したときでさえ、いくつかの偶発的変異体(ΔpurNλPr::sacBΩkan)が出現したことを示す。
図10Cはまた、1つのsacBカセットをもつ大腸菌(最終ショ糖濃度10%)と比較して二重sacBカセット大腸菌株が要求する最低ショ糖濃度(最終2%)を示す。さらにまた、低いショ糖%および最高温度(例えば42℃)で示されるように、2つのsacBカセットをもつ大腸菌株はショ糖に対してはるかに感受性のようである。このことは、約37℃の温度および約2%の(またはわずかに低い)ショ糖濃度が、増殖細胞でcI遺伝子リプレッサーを保持するプラスミドを維持するための最適条件と一致し得ることを示唆する。
図12B−Cは、2つの(1つではなく)sacBカセットの存在は、30℃から37℃の範囲の温度でショ糖感受性に対する強固さの向上を付与することを示す(しかもなお2%ショ糖が最適である)。2つのsacBカセットを含むプラスミドで形質転換した大腸菌細胞、BJ5183ΔpurNΩλPr::sacBKmΔedaΩλPr::sacBCatクローン#1およびBJ5183ΔpurNΩλPr::sacBKmΔedaΩλPr::sacBCatクローン#2、並びに1つのsacBカセットを含むプラスミドで形質転換した大腸菌細胞、BJ5183ΔpurNΩλPr::sacBKmクローン#16およびBJ5183ΔedaΩλPr::sacBKmクローン#11を約1.0のOD600まで増殖させた。各培養の(10-5希釈)約100μLを、0%、2%および4%のショ糖を含むLB/寒天プレートにCFUスコア判定のために播種した。このプレートを30℃から37℃でインキュベートした。37℃でのインキュベーションは、2%および4%のショ糖の存在下における二重sacBカセット発現親株の強固さを判定するために用いた。図12B−Cおよび下記の表3−7は、大腸菌染色体中の1つのsacBカセットの存在は、同様の温度(例えば30℃および37℃)での2%から4%の範囲のショ糖濃度では強固さは低下することを示す。このプレートアッセイで確認されたように、2つのsacBカセットをもつ大腸菌株に関するショ糖に対する変異発生率は、37℃でインキュベートしたとき最低ショ糖濃度(2%)では検出できなかったが、1つのsacBカセットをもつ大腸菌株に関する変異発生率は、3.8 10-6から5 10-5の範囲であった。別個の実験セットによって、2つのsacBカセットをもつ大腸菌株の変異発生率は、2%のショ糖の存在下において37℃でインキュベートしたときほぼ5.10-10であることが示された。
sacBを発現しcIプラスミド(pPB829またはpPB838)を保持する大腸菌宿主細胞を抗生物質選別圧の非存在下(例えばショ糖の存在下)で、またはコントロールとしてCatの存在下で増殖させた。
図11では、プラスミド収量は2および5継代で決定した。30℃で維持した培養からプラスミドを抽出し、ゲル電気泳動に付した。HindII制限消化は、増殖中およびCatまたはショ糖による選別中にpPB829またはpPB838で明白な遺伝的再編成は発生しなかったことを示している。さらにまた、Catまたはショ糖選別圧下でのcIプラスミド選別中に、同様なcIプラスミド維持が認められた。
図15A−Bは、培養におけるcIプラスミド(pPB829およびpPB838、sacBカセットの1コピーを含む)の安定性および維持の有効性を示す。前記安定性には、クロラムフェニコールまたはショ糖による選別後に遺伝的再編成が発生しないことが含まれる。ショ糖またはクロラムフェニコールの存在下で増殖させたcIプラスミドの効率的なプラスミド維持および安定性が観察された。さらにまた、プラスミド収量は、pPB829またはpPB838で形質転換した親宿主株を選別圧としてショ糖の存在下において30℃で増殖させたとき、選別圧としてCatの存在下で培養したときよりもはるかに高かった(約700/細胞)。プラスミドの維持および収量は極めて効率的であり、コピー数は、Catの存在下で培養した細胞と比較して2倍多かった。宿主細胞をショ糖の存在下で培養したときのこのcIプラスミド収量の向上は、cI発現を制御する弱いプロモーター(P1)によるものであった。実際、カナマイシン遺伝子の弱いプロモーター(P1)の制御下でのcIリプレッサーの発現は、λPrプロモーターの制御下に置かれたsacB遺伝子の毒性をより良好に無効にするためにプラスミド収量に対して正の作用を有していた。
以前に示したように(図11A参照)、抗生物質系および非抗生物質系は、プラスミドの維持およびcIプラスミド保持増殖細胞の選別に関しては等価である。図15Bは、プラスミド収量(コピー数)は、pPB829またはpPB838で形質転換した親宿主株を選別圧としてショ糖の存在下で増殖させたとき、選別圧としてCatの存在下で培養したときよりもはるかに高かった(約700/細胞)ことを示している。プラスミドの維持および収量は極めて効率的であり、コピー数は、抗生物質選別、例えばCatの存在下で培養した細胞と比較して2倍多かった
1つのsacBカセットおよび2つのsacBカセットをもつ大腸菌株(それぞれΔpurNλPr::sacB+ΩkanおよびΔpurNλPr::sacB+ΩkanΔedAλPr::sacB+Ωcat)の両方におけるcatフリーpPB885プラスミドの安定性および収量を示す。ΔpurNΩλPr::sacBKm(1つのsacBカセット)およびΔpurNΩλPr::sacBKmΔedaΩλPr::sacBcat(2つのsacBカセット)の両親株をcIcatフリーpPB885プラスミドで形質転換し、ショ糖プレートへの播種とその後の培養の前に3時間インキュベートした。プラスミド収量は、2つのsacBカセットの大腸菌株および1つのsacBカセットの大腸菌株に対してそれぞれ5%および10%ショ糖補充LBで3継代して決定した。37℃で維持した培養からpPB885を抽出し、ゲル電気泳動に付した。PvuII制限消化は、増殖およびショ糖選別の間にどちらのpPB885でも明白な遺伝的再編成は発生しないことを示した(図15D参照)。このゲルが示すように、10%および5%のどちらのショ糖選別後でもそれぞれ1つのsacBカセットおよび2つのsacBカセットをもつ両大腸菌で、明白な遺伝的再編成は生じなかった。
図15Eは、1つのsacBカセットおよび2つのsacBカセットをもつ両大腸菌株(それぞれΔpurNλPr::sacB+ΩkanおよびΔpurNλPr::sacB+ΩkanΔedAλPr::sacB+Ωcat)でのcatフリーpPB885プラスミドの収量を示す。興味深いことに、プラスミド収量(コピー数)は、1つのsacBカセットをもつ大腸菌株から得られたプラスミド収量(ほぼ142/細胞)と比較して2つのsacBカセットをもつ大腸菌株ではるかに高かった(ほぼ278/細胞).この実験で得られたプラスミド収量は以前の比較実験で得られたプラスミド収量より低いように思われる(図15B参照)。これは主として以下の事実によるものである:i)pPB885による形質転換後に、最良のクローンを同定するためにより多くのクローンを評価する必要があること、およびii)さらにcatフリーpPB885プラスミドで形質転換した2つのsacBカセットをもつ大腸菌株の増殖条件は最適ではなかったということ。実際、我々は、このもっとも新しい株の最適増殖条件は約37℃で約2%(またはわずかに低い)ショ糖であることを示した。しかしながら、この実験結果は、最適で強固な条件下では、プラスミド収量は、1つのsacBカセットをもつ大腸菌株と比較して2つのsacBカセットをもつ大腸菌株でより多量であり得ることを示唆している。
図15Eおよび下記の表8は、抗生物質フリープラスミド(pPB896/選別圧としてショ糖)および抗生物質プラスミド(pCG105/選別圧としてCat)のCHO細胞へのプラスミドトランスフェクション効率(GFP発現)を示す。発現されるGFPに関してこれら2つの選別圧(ショ糖対抗生物質としてCat)間で明白な差異は認められない。pCG105プラスミド(CMVプロモーターの制御下に配置されたGFP遺伝子を有するpPB828誘導プラスミド(Merialの特許物))およびpPB896(pPB829プラスミド+P1::cI遺伝子+GFP)プラスミドをCHO細胞のトランスフェクションに用いて、従来の抗生物質プラスミドに対して抗生物質フリープラスミド概念の機能性を評価した。この実験は、1つのsacBカセットをもつ大腸菌宿主株の培養から単離したプラスミドを用いて実施した。pCG105は選別圧としてカナマイシンを用いて大腸菌で増殖させ、一方、pPB896は選別圧として10%ショ糖を用いて大腸菌で増殖させた。DNAプラスミドを抽出し、同じ濃度で投与した。
図15は、リポフェクタミン2000を用いたCHO-K1細胞の一過性トランスフェクション後の、pCG105およびpPB896によりコードされるGFPタンパク質のin vitro発現を示す。直径6cmのプレート中の90%コンフルエンシーのCHO-K1細胞に、各々5μgのプラスミドおよび10μLのリポフェクタミンを用い製造業者の指示にしたがいながらトランスフェクションを実施した。トランスフェクション後に、1%のSVFを含むMEM-glutamax培養液で細胞を培養した。培養を採集し、蛍光顕微鏡(図15)およびフローサイトメトリー(FACS Calibur(Becton Dickinson))(表8)を用いて解析した。
図15は、トランスフェクションを実施した両方のCHO-K1細胞で同様なGFPエピフルオレセンスが可視化されたことを示す。クロラムフェニコールおよびショ糖の選別圧下でpCG105およびpPB896プラスミドは比較可能な効率でCHO-K1細胞にトランスフェクトできた。
表8は、pCG105およびpPB896プラスミドのCHOトランスフェクション効率を示す。この表に示すように、CHO細胞にpCG105(59%のGFP発現)およびpPB896(48%のGFP発現)をトランスフェクトしたとき、比較可能なGFPタンパク質発現CHO細胞の%が測定された。これらの結果は、CHOのトランスフェクションおよび最終的にはDNAワクチンでの応用のためにショ糖系抗生物質フリープラスミドを使用することの有効性を立証した。
表8
これらの実験は、染色体上に存在する有毒遺伝子の制御はプラスミド上に存在するリプレッサーにより達成できることを示す。この系は、抗生物質の選別圧の非存在下で完全に機能を発揮する。この系は宿主細胞の5継代にわたって安定である。この系は、宿主細胞が細胞当たり高いプラスミドコピー数を達成することを可能にする。この系は、最少合成培養液と完ぺきに適合し得る。
これまで本発明の好ましい実施態様を詳細に説明してきたが、上記で規定した本発明は、その多くの変型が本発明の範囲を逸脱することなく可能であるので、上述の記載に示す具体的な内容に限定されないことは理解されよう。
本明細書に引用または参照した全ての文書(“本明細書引用文書”)、および本明細書引用文書中に引用または参照された全ての文書は、製造業者の指示、説明書、製品明細書および本明細書に記載したまたは参照により含まれる任意の文書中の任意の製品のプロダクトシートとともに、参照により本明細書に含まれ、本発明の実施で利用することができる。
Claims (24)
- cIリプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、ドラッグレスプラスミド。
- ポリヌクレオチドが、配列番号:2、44、46、48、50、52、54、56または58に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するcIリプレッサータンパク質をコードする、請求項1に記載のドラッグレスプラスミド。
- ポリヌクレオチドが作動できるようにプロモーターに連結される、請求項1または2に記載のドラッグレスプラスミド。
- プロモーターがP1プロモーターまたは天然のcIプロモーターである、請求項3に記載のドラッグレスプラスミド。
- ポリヌクレオチドが、配列番号:1、45、47、49、51、53、55、57または59に示される配列を有するポリヌクレオチドと少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1−4のいずれか1項に記載のドラッグレスプラスミド。
- プラスミドがさらに、免疫原またはタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、請求項1−5のいずれか1項に記載のドラッグレスプラスミド。
- 異種ポリヌクレオチドが、真核細胞または原核細胞で機能するプロモーターに作動できるように連結される、請求項6に記載のドラッグレスプラスミド。
- プロモーターがCMVプロモーターまたはグラム陰性細菌から単離されたプロモーターである、請求項7に記載のドラッグレスプラスミド。
- 請求項1−8のいずれか1項に記載のドラッグレスプラスミドを含む、操作されたグラム陰性細菌宿主株。
- 細菌宿主が、前記細菌の染色体の非必須領域に1つまたは2つ以上の異種ポリヌクレオチドを含む請求項9に記載の細菌宿主株であって、前記異種ポリヌクレオチドが宿主に有毒な生成物をコードする、前記細菌宿主株。
- ポリヌクレオチドがsacB遺伝子を含む、請求項10に記載の細菌株。
- sacB遺伝子が、配列番号:4、60、62、64、66、68、70、72または74に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも90%の配列を有するSacBタンパク質をコードする、請求項11に記載の細菌株。
- 異種ポリヌクレオチドがプロモーターに作動できるように連結される、請求項10−12のいずれか1項に記載の細菌株。
- プロモーターがλファージ由来プロモーターである、請求項13に記載の細菌株。
- 非必須領域がdeA遺伝子またはpurN遺伝子を含む、請求項10−14のいずれか1項に記載の細菌株。
- sacB遺伝子が、配列番号:4に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するSacBタンパク質をコードし、さらにsacB遺伝子が、配列番号:5に示される配列を有するプロモーターに作動できるように連結される、請求項11−15のいずれか1項に記載の細菌株。
- 細菌株が、配列番号:75に示される配列を有するポリヌクレオチドの1つまたは2つ以上のコピーを含む、請求項11−16のいずれか1項に記載の細菌株。
- 細菌株が、宿主染色体のdeA遺伝子およびpurN遺伝子に挿入された配列番号:75のポリヌクレオチドの2つのコピーを含む、請求項17に記載の細菌株。
- 細菌株が、アビバクテリウム、ブルセラ、大腸菌、ヘモフィルス(例えばヘモフィルス・スイス(Haemophilus suis))、サルモネラ(例えばサルモネラ・エンテリディス(Salmonella enteridis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、サルモネラ・インファンチス(Salmonella infantis))、シゲラ、パスツレラおよびリメイレラ(Rimeirella)から成る群から選択される、請求項10−18のいずれか1項に記載の細菌株。
- 請求項1−8のいずれか1項に記載のドラッグレスプラスミドを含む組成物。
- さらに医薬的に許容できる担体を含む、請求項20に記載の組成物。
- 以下の工程を含む、ドラッグレスプラスミドの製造方法:
1)宿主染色体の1つまたは2つ以上の非必須領域に対立遺伝子置換によって挿入された異種ポリヌクレオチドを含むグラム陰性細菌宿主株を操作する工程;
2)cIリプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むDNAプラスミドを構築する工程;
3)cIリプレッサータンパク質をコードする遺伝子を含むDNAプラスミドで細菌宿主株を形質転換する工程;
4)形質転換細菌宿主株をショ糖の存在下において30℃から42℃の範囲の温度で増殖させる工程;および
5)DNAプラスミドを回収する工程。 - 以下の工程を含む、タンパク質または免疫原の製造方法:
1)宿主染色体の1つまたは2つ以上の非必須領域に対立遺伝子置換によって挿入された異種ポリヌクレオチドを含むグラム陰性細菌宿主株を操作する工程;
2)cIリプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび免疫原またはタンパク質をコードする遺伝子を含むDNAプラスミドを構築する工程;
3)cIリプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび免疫原またはタンパク質をコードする遺伝子を含むDNAプラスミドで細菌宿主株を形質転換する工程;
4)形質転換細菌宿主株をショ糖の存在下において30℃から42℃の範囲の温度で増殖させる工程;および
5)免疫原またはタンパク質を回収する工程。 - 請求項23に記載の方法によって製造されたタンパク質または免疫原を含む組成物。
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