CN102482679B - 无抗生素的质粒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了不使用抗生素选择压力而保持革兰氏阴性细菌质粒的方法。进一步，本发明涉及了所产生的无药物质粒，包括含异源基因的无药物质粒。本发明还提供了包含含有异源基因的无药物质粒的制剂和/或组合物，包含用该无药物质粒表达的蛋白质或免疫原的制剂和/或组合物，以及将所述制剂和/或组合物施用于宿主的方法。本发明涉及含所述无药物质粒的革兰氏阴性细菌。
Description
纳入参考
本申请要求2009年5月22日提交的美国临时申请No.61/180,755的权益。
发明领域
本发明涉及不使用抗生素选择压力而在革兰氏阴性细菌中保持和产生质粒的方法。此外，本发明涉及所产生的无药物质粒以及含所述无药物质粒的剂型和/或组合物，以及含有用该无药物质粒产生的蛋白质或免疫原的剂型和/或组合物，以及将所述剂型和/或组合物施用于宿主的方法。本发明涉及含所述无药物质粒的革兰氏阴性细菌。
发明背景
迄今为止，仍然缺乏被认为安全、强力、高效用于医疗用途的质粒DNA载体。在被递送质粒内抗生素抗性基因的存在是现代基因治疗和DNA疫苗应用的缺陷之一。
质粒是与染色体DNA分开的并且能不依赖于染色体DNA而进行复制的染色体外DNA分子(Lipps G.(editor).(2008).Plasmids：Current Research and FutureTrends.Caister Academic Press.ISBN978-1-904455-35-6)。质粒通常天然存在于细菌中，但有时可以在真核生物中找到。它们被认为是能在合适宿主内自主复制的可转移遗传元件或复制子。质粒是裸DNA并且不编码包裹遗传物质以转移至新宿主所必需的基因。因此质粒从宿主向宿主的转移需要通过接合的直接机械性转移或允许利用转化有意摄取遗传元件的宿主基因表达的改变(Lipps G.2008)。
将质粒DNA(pDNA)用于基因治疗和疫苗接种是在人和动物卫生保健中具有相当大潜力的新技术(Mairhofer，J.et al.，Biotechnol.J.，3，83-89，2008)。此外，质粒在遗传和生物工程实验室中被用作重要的工具，它们通常被用于增殖或表达特殊基因(Russell，David W.；Sambrook，Joseph(2001)，Molecular cloning：a laboratory manual.ColdSpring Harbor，N.Y：Cold Spring Harbor Laboratory)。
质粒提供了在微生物种群内进行横向基因转移的有关机制并且通常在给定环境状态下提供了选择优势。例如，质粒可携带提供抗天然存在抗生素之抗性的基因。除了抗生素之外还存在备选的标记物。例如，质粒所产生的蛋白质可充当在给定环境状态下也提供选择优势的毒素。质粒还提供在营养缺失的条件下提供优势的具有固定元素氮或降解顽固有机化合物的能力的细菌(Lipps G.，2008)。
为了用抗生素抗性基因进行选择，所制备的质粒中插入了能产生使细胞耐特殊抗生素的蛋白质的基因。接着通过被称为转化的过程将质粒插入细菌。然后，将细菌暴露于该特殊抗生素中。只有摄入质粒拷贝的细菌在抗生素中存活，因为质粒使它们具有抗性。
可用含抗生素抗性标记物的质粒递送目的基因。这样的基因通常插入多克隆位点(MCS，或多接头)。抗生素抗性基因被表达并且该表达蛋白质分解抗生素。以此方式抗生素充当了过滤器以便只选择经修饰的细菌。然后可大量培养这些细菌、收获并裂解(经常/使用碱裂解方法)以分离目的质粒。
抗生素在医疗实践中的绝对成功目前已成为了一个问题。许多细菌包括传染性疾病的病原体已具有抗性，并且不再能被这种特殊的抗生素控制住。抗生素已被过于频繁的用于人和动物的医疗实践中。此外，更重要的是事实上长期以来它们被作为性能增效剂添加入动物饲料中。此惯例目前已被广泛禁止，但普遍深入的抗生素已使得那些具有相应抗性基因的细菌具有了生存优势。此外，细菌中的抗性基因通常位于可移动的DNA单元上，它可在不同物种之间进行交换。
针对此背景，人们关注于细菌会吸收标记物基因，最终导致而目前开具处方的抗生素对其无效的病原体。可能存在向环境微生物例如病原体的基因转移(Murphy，D.B.，Epstein，S.L.，Guidance for Industry：Guidance for human somatic cell therapyand gene therapy，Food and Drug Administration，Rockville 1998)。另一安全性的关注是抗生素抗性基因可能整合入人的染色体中(Smith，H.A.，Klinman，D.M.，Curr.Opin.Biotechnol.12，299-203，2001)。进一步的，这样的基因可能对质粒产生过程具有相当大的影响，因为这些基因的组成型表达给细菌宿主细胞造成了不必要的代谢负担(Cranenburgh，R.M.，et al.，Nucleic Acids Res.2001，29，e26；Rozkov，A.，et al.，Enzyme Microb.Technol.2006，39，47-50)。通过缺失这些基因而降低质粒的大小可使得由发酵过程所获得的pDNA的稳定性和产率提高(Smith，M.A.，et al.，Can.J.Microbiol.1998，44，351-355)。
因此，本领域内确实需要避免在最终(商品化)产物(裸DNA疫苗)中使用抗生素抗性基因，因为公众/消费者在遵从管理当局的建议后存在潜在的接受风险。美国食品和药物管理局(FDA)和世界卫生组织(WHO)管控抗生素抗性标记物的使用以保证DNA疫苗的质量并预防传染性疾病。同样的，自2002年有效的欧盟特别发布指令(EU Deliberate ReleaseDirective)要求“淘汰在遗传修饰生物中使用可能对人健康或环境具有害影响的抗生素抗性标记物”。
传统标记物的缺陷甚至在实际研究中也越来越明显。例如，对于细菌感染(bactofection)技术的商业应用需要具有无抗生素的递送系统。细菌感染(bactofection)技术是利用侵入性细菌将质粒DNA递送入真核细胞内。此外，存在减少发酵过程中之不必要的代谢负担的需求，这将实现DNA质量的更高OD和更高产率。
已设计可能的选择策略来解决关注抗生素抗性基因向患者肠细菌的散播的问题，包括营养缺陷型互补、阻抑蛋白滴定、基于蛋白质的解毒剂/毒物选择方案以及使用基于RNA的可选择标记物(参阅Williams J.A.et al.，Plasmid DNA vaccine vector design：Impact on效力，safety and upstream production，Biotechnol Adv(2009)，doi：10.1016/j.biotechadv.1009.02.003)。
Cranenburgh，R.M.等报道了促进在复杂培养基中重组质粒的无抗生素选择和稳定保持的两个新大肠杆菌菌株(DH1 lacdapD和DH1 lacP2dapD)的构建。它们包含在lac操纵基因/启动子控制下的必要染色体基因dapD(Cranenburgh，R.M.，et al.，2001)。除非补充IPTG(诱导dapD表达)或DAP，否则这些细胞会溶解，不过，当用含lac操纵基因的多拷贝质粒转化所述菌株时，该操纵基因竞争性的滴定LacI阻抑蛋白并允许dapD从lac启动子开始表达。由此转化子仅仅由于其通过阻抑蛋白滴定选择而在任何培养基上生长的能力而被分离并繁殖。质粒上不必需有抗生素抗性基因或其它蛋白质表达序列，并且质粒选择也不需要有抗生素。
Mairhofer等人最近研究了将细菌宿主菌株设计成在质粒上无需使用任何选择标记物或其它附加序列即可选择和保持质粒。若干细菌菌株被修饰，以便质粒复制抑制子RNAI可经由RNA-RNA反义反应抑制生长必需基因的翻译(Mairhofer，J.et al.，Biotechnol.J.，3，83-89，2008)。对必需基因(murA)进行修饰以使阻抑蛋白(tetR)会阻碍其表达(Mairhofer，J.et al.，2008)。只有在质粒存在并因此RNA I存在的情形下，tetR被调低并且murA表达。作者报告了可经由各种修饰的大肠杆菌菌株选择不同的市售质粒。他们进一步设计了没有任何选择标记物的最小质粒。
此申请书中任何文件的引用或提及并不等于承认所述文件是可以作为本发明的现有技术获得的。
发明简述
提供了无抗生素的质粒以及包含无抗生素质粒的革兰氏阴性细菌。此外还提供了包含含有编码免疫原或蛋白质之异源基因的无抗生素质粒的组合物以及包含用该抗生素质粒表达的免疫原或蛋白质的组合物。所述革兰氏阴性细菌被设计成在细菌染色体的非必需区包含一个或多个异源多核苷酸。该无抗生素质粒包含编码调控该异源多核苷酸在细菌染色体上表达的阻抑蛋白的多核苷酸。无抗生素质粒可进一步包含编码免疫原或蛋白质的一个或多个多核苷酸。
本发明的方法包括产生无抗生素质粒的方法和用该无抗生素质粒将外源基因转移入哺乳动物细胞的方法。
这些及其它实施方案也有公开，或者从以下详述中更易于理解并且涵盖在其中。
附图简述
以下详述以举例方式给出，并且不意图于将本发明限制在所述的特定实施方案上，它们可结合收编于此作为参考的附图进行理解，其中：
图1描述了无药物设想的第一部分，它是在革兰氏阴性细菌中克隆编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因，导致被转化细菌在接种于含蔗糖的培养基上时迅速死亡。
图2描述了无药物或无抗生素设想的第二和第三部分，它是噬菌体λ的免疫区，其中cI编码cI阻抑蛋白；cro编码Cro蛋白；N编码转录抗终止子；cII编码cI激活剂；cI II编码cIII蛋白酶抑制剂；OL1，2和3以及OR 1，2和3是操纵基因；PL和PR是右向的和左向的启动子；PRE是用于建立阻抑蛋白的启动子；PRM是用于阻抑蛋白保持的启动子。
图3描述了”无药物”设想的理论性概况，其中表达自pDL1(无药物质粒)质粒的cI阻抑蛋白活性抑制了放置在位于细胞宿主染色体上λPr启动子下的有毒sacB基因产物的转录，并且其中通过来自质粒的足够表达水平的λcI阻抑蛋白保证了宿主大肠杆菌细胞在蔗糖存在时的生存能力。
图4描述了失活系统的”蔗糖敏感性”，其中温度转变为42℃抑制了cI阻抑蛋白对λPr启动子的结合活性并使得宿主细胞对蔗糖敏感。
图5阐释了用pDL1转化所产生之含无抗生素的pDL1质粒的宿主菌株与在含蔗糖的培养基中培养相结合导致无药物的质粒产生。
图6A-6C阐释实验设计。图6A提供了一个纵览；图6B阐释了ΔpurN(或ΔedA)亲代菌株是抗卡那霉素的，并且当细胞在30℃-37℃孵育时组成型表达赋予其蔗糖敏感性的SacB+。当用pPB829或pPB838质粒转化ΔpurN(或ΔedA)亲代菌株时，这些细胞获得了在30-37℃孵育时于蔗糖存在条件下存活和生长的能力；图6C阐释用pPB829或pPB838质粒(cI质粒)转化的ΔpurN(或ΔedA)亲代菌株也能生长于含卡那霉素、蔗糖或氯霉素的LB培养基中。当在蔗糖存在条件下接种时，温度从30-37℃转变成42℃导致细胞死亡。
图7描述了两种质粒(pPB829和pPB838)，其均标记有编码氯霉素乙酰转移酶(CatR)的基因并且包含λcI基因。pB838是其中氯霉素乙酰转移酶基因(cat)取代了氨苄青霉素抗性基因的pMCS5衍生物。此质粒包含置于卡那霉素基因(P1)弱启动子调控下的cI基因。pPB829是包含cat基因的pVR1012质粒衍生物。所述质粒包含置于弱启动子(P1)调控下的cI基因。当引入ΔpurN(或ΔedA)亲代大肠杆菌菌株时，这些质粒使得细胞能在蔗糖存在下生长。氯霉素可以验证此设想的可行。
图8A-E阐释宿主菌株的设计。图8A和8B阐释了分别经由edA或purN基因等位置换插入大肠杆菌染色体的λPr::sacB Ωkan盒的产生。图8C阐释了经由PCR和连接PCR用于将edA基因等位置换入ΔpurNΩλPr::sacB Km大肠杆菌宿主菌株以产生sacB盒大肠杆菌菌株的完整sacB盒(ΔpurNΩλPr::sacB cat)的设计。
图9A，9B和9C阐释了利用PCR去证实宿主菌的设计，即缺失大肠杆菌中的edA和purN。图9A部分阐释了两种PCR产物(分别151和729bp)被纯化并在经由PB1186和PB1189引物和Phusion DNA聚合酶的第二个PCR步骤中作为模板。图9B阐释了显示λPr::sacB+ΩKan盒被引入大肠杆菌染色体的PCR检查。图9C阐释了λPr::sacB+ΩKan盒通过edA和/或purN基因的等位置换被正确插入基因位点。图9D阐释了利用PCR证明双sacB盒宿主菌设计，即通过等位基因置换将大肠杆菌中的edA和purN二者缺失。正如测序所证实的，PCR检查显示λPr::sacB+ΩKan和λPr::sacB+ΩCat盒二者均被正确引入大肠杆菌染色体的特定位点。图9D中所示：泳道1：BJ5183野生型；2：BJ5138ΔpurN；3：BJ5138ΔedA；4：1μl未稀释的BJ5183ΔpurNΔedA；5：1/10稀释的BJ5183ΔpurN ΔedA；6：水，0bp(对照)；A：BJ5183野生型；B：BJ5138ΔpurN；C：BJ5138ΔedA；D：3μl未稀释的BJ5183ΔpurNΔedA；E：1μl未稀释的BJ5183ΔpurNΔedA；F：1/10稀释的BJ5183ΔpurNΔedA；G：1/50稀释的BJ5183 ΔpurN ΔedA；H：水，0bp(对照)。
图10A证明了宿主菌株(ΔpurN λPr::sacB+Ωkan)对蔗糖高度敏感(不生长)，其中经pPB829或pPB838质粒转化的细胞在蔗糖存在下于30℃生长良好，并且如以在氯霉素存在下生长之相似细胞所平行进行的对照实验所清楚证实的，sacB基因表达被自各个cI质粒合成的cI基因产物完全抑制且质粒的保持是100％有效。将温度提高至42℃引起cI基因产物失活和接种于含蔗糖或氯霉素之LB琼脂上的细胞死亡。在细胞于蔗糖或氯霉素存在下连续生长两代后进行质粒保持实验的稳固。图10B-C证明了双sacB盒大肠杆菌菌株(ΔpurN λPr::sacB+Ωkan ΔedAλPr::sacB+ΩCat)在30℃和42℃孵育时对蔗糖的存在高度敏感(不生长)，尽管一些自发突变体出现在接种于蔗糖上的单sacB盒大肠杆菌菌株中。图10C还证明了相较于单SacB盒大肠杆菌菌株而言，双SacB盒大肠杆菌菌株需要最低的蔗糖浓度(从10％至2％最终)。
图11阐释了pPB829和pPB838质粒在生长细胞中的稳定性。
图12A显示了在30℃时λPr::sacB单sacB盒中缺乏自发突变。图12B-C证明了两个SacB盒(而非一个)在30℃至37℃之间的温度范围内使其对蔗糖的敏感性(仍然最佳是2％蔗糖)更稳固。相似温度下蔗糖浓度在2％至4％范围内时大肠杆菌染色体上存在一个sacB盒较不稳固。正如在此铺板检验中所证实的，37℃孵育时在最低蔗糖浓度(2％)探测不到双sacB盒大肠杆菌菌株针对蔗糖的突变率，而具有一个sacB盒的大肠杆菌菌株的突变率则在3.8x10-6至5x10-5之间。独立的一套实验显示当2％蔗糖存在下孵育于37℃时，双sacB盒大肠杆菌菌株中的突变率接近5x10-10。
图13A-B显示了在琼脂板上不使用抗生素作为选择压力时，经由氯霉素(Cat)标记cI质粒筛选转化细胞的实验步骤。
图14A-C阐释了不使用抗生素作为选择压力挑选只具有cI质粒(pPB829和pPB838)之转化细胞的实验步骤效力。
图15A-B阐释了在包含一拷贝sacB盒的生长中大肠杆菌细胞内pPB829和pPB838质粒的稳定性和产率。图15C-E阐释了无cat的pPB885质粒在单和sacB盒大肠杆菌菌株(分别是ΔpurNλPr::sacB+Ωkan和ΔpurNλPr::sacB+ΩkanΔedAλPr::sacB+Ωcat)中的稳定性和产率。图15F阐释了在无抗生素质粒(pPB896/蔗糖作为选择压力)和抗生素质粒(以pCG105/Cat作为选择压力)的CHO细胞内的质粒转染效率(GFP表达)。就表达的GFP蛋白而言，这两种选择压力(蔗糖对作为抗生素的Cat)之间未观察到明显差异。
图16显示了pCRblunt+PB1184-1185质粒图。
图17显示了pPB828的限制性酶切图谱及特征。
图18显示了pPB829的限制性酶切图谱及特征。
图19显示了pPB838的质粒图谱及特征。
图20显示了pPB844的质粒图谱及特征。
图21显示了pPB845的质粒图谱及特征。
图22显示了pPB846的质粒图谱及特征。
图23显示了pPB847的质粒图谱及特征。
图24显示了pPB885的质粒图谱。pPB885特征图谱显示：两个CDS：cI阻抑蛋白：324-1037；AP(R)：2321-2990(互补的)，原始位置(互补物1626..2483)；两个复制起点：pUC起点：1500-2173(互补的)，原始位置(互补物805..1478)；f1起点：2991-3301(原始位置2615-3053)。
图25显示了pPB896的质粒图谱。pPB896特征图谱显示：3个CDS：GFP：1675-2397(原始位置1676…2398)；cI阻抑蛋白：4089-4802；Cm(R)：4828-5484(互补的)，互补物(950-1606)；一个内含子：内含子A：805-1625(原始位置805-1625)；一个真核启动子：CMV启动子：1-683；一个复制起点：3133-3640(原始位置2425..2932)；一个终止子：BGH转录终止子/PolyA：2405-2951(原始位置1697..2243)；一个5’UTR：CMV IE 5’UTR：684-804(原始位置684..804)。
图26显示了cI阻抑蛋白的序列比对和序列同一性百分比.
图27显示了sacB蛋白的序列比对和序列同一性百分比.
图28是显示指定给多核苷酸和蛋白质的SEQ ID NO的表。
图29显示了编码cI阻抑蛋白之多核苷酸的序列比对和在核苷酸水平的序列同一性百分比。
图30显示了编码sacB蛋白之多核苷酸的序列比对和在核苷酸水平的序列同一性百分比。
图31显示了关于P1启动子、cI天然启动子、λPr启动子、λPr启动子+5’UTR+sacB基因、P1启动子+cI基因和cI天然启动子+cI基因的序列。
详述
需要指出的是在此公开内容及特别是权利要求书中，术语诸如”包含”，“含有”，“包括”等等可具有美国专利法所认为的意思；例如，它们可意味着“包括”等等；而术语诸如”基本上由……组成具有美国专利法所归属它们的意思，例如，它们允许有未明白叙述的要素，但现有技术中已发现的或者影响本发明基本或新颖特性的要素除外。
除非另外解释，否则此处所用的所有技术和科学术语具有与此公开内容所属领域内普通技术人员所通常理解的相同的意思。单数术语“a”，”an”和“the”包括复数的对象，除非上下文中另外明确的指出。同样的，单词“或者”意在包括“和”，除非上下文中另外明确的指出。
“动物”意指哺乳动物、鸟等等。动物或宿主包括哺乳动物和人。动物可选自马科动物(例如马)、犬科动物(例如狗、狼、狐狸、山狗、豺)、猫科动物(例如狮子、老虎、家猫、野猫、其它大型猫科动物以及其它猫科动物包括猎豹和猞猁)、似绵羊的动物(例如绵羊)、牛科动物(例如牛)、猪科动物(例如猪)、鸟类(例如鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和食火鸡)、灵长类(例如原猴类、眼镜猴、猴、长臂猿、猿)和鱼。术语“动物”还包括所有发育阶段的个体动物，包括胚胎的和胎儿的阶段。
术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在此可互换使用，指任何长度的氨基酸残基聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，它可能包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且它可被除氨基酸之外的化学组成部分打断。所述术语还涵盖已被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物，例如二硫键形成、糖基化作用、脂化(lipidation)、乙酰化作用、磷酸化作用或者其它处理或修饰，诸如与标记或生物活性组分缀合。
术语“核酸”或“多核苷酸”可互换使用，指线性或分支的、单链或双链的RNA或DNA或它们的杂合物。该术语还涵盖RNA/DNA杂合物。以下是非限制性的多核苷酸例子：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、uracyl、其它糖和连接基团诸如氟代核糖(fluororibose)和羟硫基，以及核苷酸分支。核苷酸序列可在聚合后进行进一步的修饰，诸如通过与标记组分缀合。在此定义涵盖的其它类型的修饰包括加帽、用类似物置换一个或多个天然存在核苷酸、和引入用于将多核苷酸粘附于蛋白质、金属离子、标记组分、其它多核苷酸或固体支持物上的方式。多核苷酸可经由化学合成获得或来源于微生物。
术语“无药物质粒”或“无抗生素质粒”可互换使用，指不包含抗生素选择基因的DNA质粒。
术语“基因”广泛用于指与生物学功能相关的任何多核苷酸区段。因此，基因包括在基因组序列中的内含子和外显子，或者如在cDNA中一样仅是编码序列和/或它们表达所需的调控序列。例如，基因还指表达mRNA或功能性RNA或者编码特定蛋白质的核酸片段，并且包括调控序列。
本文所披露内容涉及通过避开使用抗生素抗性基因以产生较安全的疫苗和免疫原性组合物而产生细菌质粒DNA载体的新方法。
本文所披露内容证明了基于三部分而在革兰氏阴性细菌宿主细胞内保持高数目质粒拷贝的新设想。第一部分是在限定培养条件下表达对细菌有毒之产物的革兰氏阴性细菌宿主，其中所述有毒基因插入细菌染色体的非必需区域。第二部分是革兰氏阴性细菌染色体上存在基因，其中该基因编码可被紧密调控的组成型启动子控制下的有毒产物。第三部分是调控与宿主染色体上有毒基因可操作性连接之启动子的来自质粒的特异阻抑蛋白的表达。
本发明所涉及的革兰氏阴性细菌包括但不局限于禽杆菌属(Avibacterium)，布鲁氏杆菌属(Brucella)，大肠杆菌，嗜血杆菌属(Haemophilus)(例如猪嗜血杆菌(Hemophilussuis))，沙门氏菌属(Salmonella)(例如肠炎沙门氏菌(Salmonella enteridis)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis))，志贺氏菌属(Shigella)，巴斯德菌属(Pasteurella)和Rimeirella。
在某一实施方案中，所述有毒基因是编码果聚糖蔗糖酶的结构sacB基因。在另一实施方案中，有毒基因是编码枯草杆菌果聚糖蔗糖酶的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)结构sacB基因。sacB在其天然环境中的表达对革兰氏阳性细菌而言是无害的，但当其表达于革兰氏阴性细菌中时，它导致了被转化细菌在接种于含蔗糖的培养基上时迅速死亡。
一方面，本发明提供了sacB蛋白(果聚糖蔗糖酶)。另一方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO：4，60，62，64，66，68，70，72或74中所述之序列的sacB蛋白及其变体或片段。在另一方面，本发明提供了与SEQ ID NO：4，60，62，64，66，68，70，72或74中所述序列之多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的sacB蛋白。在另一方面，本发明提供了可由本领域技术人员利用众所周知的分子生物学技术容易制备的鉴别如上(SEQ ID NO：4，60，62，64，66，68，70，72或74)之sacB蛋白的片段和变体。变体是具有与本发明之多肽，尤其是如SEQ ID NO：4，60，62，64，66，68，70，72或74中所述之氨基酸序列具有至少大约75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列的同源多肽。
另一方面，本发明提供了多核苷酸，诸如编码sacB蛋白(果聚糖蔗糖酶)的sacB基因，例如，编码具SEQ ID NO：4，60，62，64，66，68，70，72或74中所述序列之sacB蛋白的多核苷酸。在另一方面，本发明提供了编码与具SEQ ID NO：4，60，62，64，66，68，70，72或74中所述序列之多肽有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性之sacB蛋白、或保守变体、等位基因变体、同系物或包含这些多肽之一的至少8个或至少10个连续氨基酸的片段、或者这些多肽之组合的多核苷酸。另一方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO：3，61，63，65，67，69，71或73中所述核苷酸序列的多核苷酸或其变体。在另一方面，本发明提供了与SEQ ID NO：3，61，63，65，67，69，71或73中所述序列之多核苷酸之一具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的多核苷酸或其变体。
可能在本发明中被利用的其它有毒基因包括但不局限于李斯特菌属(Listeria)或葡萄球菌属(Staphylococcus)基因。有毒基因可以是作为有毒基因产物(有毒蛋白质或RNA)表达的DNA，或者可以在其自身中和自身有有毒。所述有毒基因产物的例子在本领域中是众所周知的，包括但不局限于限制性内切酶(例如DpnI)、CcdA/CcdB(Maki S.等，J.Mol.Biol.256：473-482，1996)和在抑制功能缺乏下杀死宿主的基因，例如kicB。有毒基因或者可以是在体外可选择的，例如限制性位点。
用于此处时，术语“同系物”包括直系同源物、类似物和旁系同源物。野生型多肽的类似物、直系同源物和旁系同源物可以通过翻译后修饰、通过氨基酸序列差异或通过二者而不同于野生型多肽。特别是，本发明的同系物通常会表现出与野生型多肽或多核苷酸序列的全部或部分具至少80-85％，85-90％，90-95％或95％，96％，97％，98％，99％序列同一性，并且会表现出相似的功能。
“变体”意图指基本上相似的序列。对于多核苷酸而言，变体包含天然多核苷酸内一个或多个位点的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加以及/或者天然多核苷酸内一个或多个位点的一个或多个核苷酸的取代。用于此处时，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。还可通过比较变体多核苷酸所编码多肽和参照多核苷酸所编码多肽之间的序列同一性百分比来评估本发明之特定多核苷酸(即参照多核苷酸)的变体。“变体”蛋白质意指通过天然蛋白质内一个或多个位点的一个或多个氨基酸缺失或添加以及/或者天然蛋白质内一个或多个位点的一个或多个氨基酸取代而衍生自天然蛋白质的蛋白质。本发明所包含的变体蛋白质是生物学活性的，即它们具有引起免疫反应的能力。
变体包括等位基因变体。术语″等位基因变体″指包含导致蛋白质氨基酸序列改变并且存在于天然种群内的多态(例如病毒物种或品种)的多核苷酸或多肽。这样的天然等位基因变异通常可导致多核苷酸或多肽中1-5％的差异。可通过对许多不同物种中的目的核酸序列进行测序来鉴定等位基因变体，这可以通过利用杂交探针来鉴定那些物种中相同的遗传位置从而方便的进行。由于天然等位基因变异造成的并且不改变目的基因功能活性的任何及所有这些核酸变异和由此产生的氨基酸多态或变异均在本发明的范围内。
术语″保守变异″指用另一生物学上相似的残基置换某一氨基酸残基，或者置换核酸序列中的核苷酸，使得所编码的氨基酸残基不改变或是另一个生物学上相似的残基。就这一点而言，如上所述，尤其优选的取代将通常是性质上保守的。
本公开内容之多核苷酸包括由遗传密码简并成的序列，例如针对特定宿主的最优化密码子使用。用于此处时，“最优化的”指遗传上设计成增加其在给定物种中表达的多核苷酸。为了提供编码本发明多肽的最优化多核苷酸，可将所述多肽的DNA序列修饰成1)包含特定物种中高表达基因所优选的密码子；2)在核苷酸碱基组成中包含在所说物种中显著存在的A+T或G+C含量；3)形成所说物种的起始序列；或4)消除引起不稳定、不适当聚腺苷酸化、RNA的降解或终止、或者形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列。通过利用真核生物和原核生物或特定物种中密码子使用的分布频率，可达到在所说物种中增加本发明多肽诸如sacB蛋白或cI阻抑蛋白的表达。术语”优选密码子使用频率”指特定宿主细胞在核苷酸密码子使用上所表现的对指定已知氨基酸的偏爱。有20种天然氨基酸，其中大部分由一个以上的密码子指示。因此，所有的简并核苷酸序列均包括在本公开内容内，只要由所述核苷酸序列编码的多肽氨基酸序列在功能上未改变即可。
关于序列的“同一性”指具有完全相同的核苷酸或氨基酸的位点数目除以两个序列中较短者的核苷酸或氨基酸数目，其中可依照Wilbur和Lipman运算法则(Wilbur andLipman)确定两个序列的比对。当RNA序列被提到相似或与DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源时，DNA序列中的胸腺嘧啶脱氧核苷(T)被认为等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，RNA序列在本发明的范围内并且可来源于DNA序列，其中DNA序列中的胸腺嘧啶脱氧核苷(T)被认为等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。两个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性或者两个核苷酸序列之间的序列同一性可利用Vector NTI软件包(Invitrogen，1600FaradayAve.，Carlsbad，CA)确定。
在另一实施方案中，与本发明有毒基因可操作性连接的启动子是来自λ噬菌体的启动子。λ噬菌体是生活在大肠杆菌内的温和噬菌体。一旦噬菌体进入其宿主，它可能将其自身整合入宿主的DNA中。在此情形下，λ被称为原噬菌体并保持驻留于宿主基因组中，不对宿主造成大的伤害。以这种方式，原噬菌体得以随宿主的每一次细胞分裂而加倍。在此情形下表达的原噬菌体DNA编码找出宿主细胞内压力迹象的蛋白质。压力可以是饥饿、毒物(类似抗生素)和可能损害或破坏宿主的其它因素的结果。当检测到压力条件时，原噬菌体再次变得活跃，将其自身从宿主细胞DNA中切下然后进入它的裂解循环。复活的噬菌体拆散宿主DNA并重塑其蛋白质工厂以产生多拷贝的新噬菌体。当宿主的所有资源由于组装新噬菌体而耗竭时，细胞被溶解(细胞膜破裂)，然后新的噬菌体被释放。
λ阻遏基因系统组成如下(在染色体上从左至右)：cI基因，OR3，OR2，OR1，cro基因。cI基因编码λ阻抑蛋白(“cI阻抑蛋白”)。编码cI阻抑蛋白的基因组区域被称为不敏感区。cI阻抑蛋白是基因转录的正的和负的调控子。它允许噬菌体λ保持“潜伏”于其宿主细菌的染色体上。通过将调控蛋白cI与分别来自λP1和λPr启动子的OR(右操纵基因)和OL(左操纵基因)结合来保持λ噬菌体的溶源性状态，阻止裂解阶段所必须的蛋白质的转录。含溶源性λ噬菌体的细菌细胞对于噬菌体的进一步感染是免疫的。cI阻抑蛋白抑制任何额外感染噬菌体颗粒的裂解发生。
在实施方案的一方面，启动子包含具SEQ ID NO：5中所述序列的多核苷酸。在另一方面，启动子包含与SEQ ID NO：5中所述序列之多核苷酸具至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的多核苷酸。
在某一实施方案中，本发明的阻抑蛋白是cI阻抑蛋白，诸如温度敏感的cI857阻抑蛋白。携带cI857作为溶源体的λ噬菌体将在低于39℃的温度下生长，然后通过提高温度诱导裂解性生长。在30℃，cI阻抑蛋白是有活性的并与感染性噬菌体的右和左操纵基因结合。这阻碍了任何噬菌体蛋白质的转录并由此阻止了裂解。不过，在42℃时，cI阻抑蛋白失活并且不能结合启动子操纵基因。
一方面，本发明提供了cI阻抑蛋白。另一方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO：2，44，46，48，50，52，54，56或58中所述之序列的cI阻抑蛋白及其变体或片段。另一方面，本发明提供了与SEQ ID NO：2，44，46，48，50，52，54，56或58中所述序列的多肽具至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的cI阻抑蛋白。在又一方面，本发明提供了如上表征之cI阻抑蛋白(SEQ ID NO：2，44，46，48，50，52，54，56或58)的片段和变体，它们可由本领域技术人员利用众所周知的分子生物学技术制备。变体是具有与本发明多肽、尤其是SEQ ID NO：2，44，46，48，50，52，54，56或58中所述氨基酸序列有至少大约75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一性之氨基酸序列的同源多肽。
另一方面，本发明提供了多核苷酸，诸如编码cI阻抑蛋白的cI基因，诸如编码具SEQ ID NO：2，44，46，48，50，52，54，56或58中所述序列之cI阻抑蛋白的多核苷酸。在另一方面，本发明提供了编码与具SEQ ID NO：2，44，46，48，50，52，54，56或58中所述序列之多肽有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性之cI阻抑蛋白或保守变体、等位基因变体、同系物或包含这些多肽之一的至少8个或至少10个连续氨基酸的片段、或者这些多肽之组合的多核苷酸。另一方面，本发明提供了具SEQ ID NO：1，45，47，49，51，53，55，57或59中所述核苷酸序列的多核苷酸或其变体。另一方面，本发明提供了与SEQ ID NO：1，45，47，49，51，53，55，57或59中所述序列的多核苷酸具至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的多核苷酸，或其变体。
在某一实施方案中，驱动cI基因的启动子是天然cI基因启动子。在另一实施方案中，驱动cI基因的启动子是卡那霉素基因的弱启动子(P1)。在另一实施方案中，启动子包含具SEQ ID NO：29，83或30中所述序列的多核苷酸。在另一实施方案中，启动子包含与SEQ IDNO：29，83或30中所述序列的多核苷酸具至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的多核苷酸。
可于本发明方法中应用的其它启动子/阻抑蛋白对包括但不局限于由CarA-CarS阻抑蛋白-抗阻抑蛋白对控制的carB启动子，生长激素基因启动子和阻抑蛋白以及Lac阻抑蛋白(lac1)和Ptrc-2启动子。
用作诱变底物的突变启动子/阻抑蛋白对可选自目前可用的和本领域所述的突变体。突变阻抑蛋白与它们的操纵基因结合的研究[参阅，例如Nelson and Sauer，Cell，42：549(1985)；Nelson and Sauer，J.Mol.Biol.192：27(1986)；and Gussin，et al.，LambdaII，(Hendrix，Roberts，Stahl，and Weisberg，eds)Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，p.93-123(1983)]允许选择可能提供降低但非消除的转录速率的已知突变启动子和/或突变阻抑蛋白序列。将此选定的启动子区掺入异源表达质粒，然后通过常规的定点诱变加以改变(参阅，例如Morinaga，et al.，Biotechnology，2：636，1984)。或者，以类似方式改变阻抑蛋白编码序列。通过与未经受定点诱变的野生型质粒进行表达比较来分析所产生的突变阻抑蛋白/启动子对促进异源蛋白质分泌的能力。
本文所披露内容提供了无药物或非抗生素选择设想，其中表达自质粒的阻抑蛋白活性(诸如cI阻抑蛋白)抑制了被置于位于细胞宿主染色体上之λ噬菌体启动子下的有毒基因产物(诸如sacB基因产物)的转录，并且其中在诸如蔗糖等底物存在下宿主细胞的生存能力通过表达足够水平的来自质粒之阻抑蛋白(诸如λcI阻抑蛋白)而得到保证。含无抗生素质粒之宿主菌株在蔗糖存在下的生长保证了维持和产生DNA质粒的有效体系。
术语质粒覆盖了包含依照本发明之多核苷酸及其它在预期宿主或靶标的一个或多个细胞中进行体内表达所必需元件的任何DNA转录单位；并且，就这一点而言，需要指出的是超螺旋的或非超螺旋的环状质粒以及线性形式均在本发明的范围内。
本发明的某一实施方案涉及包含与一个或多个启动子可操作性连接的一个或多个阻抑蛋白基因的无药物质粒。一方面，所述无药物质粒包含编码cI阻抑蛋白的多核苷酸。另一方面，该无药物质粒包含与编码cI阻抑蛋白之多核苷酸可操作性连接的启动子。启动子可能是天然cI基因启动子或卡那霉素基因的弱启动子。另一方面，无药物质粒进一步包含编码免疫原或蛋白质的异源多核苷酸。另一方面，无药物质粒包含与编码免疫原或蛋白质之异源多核苷酸可操作性连接的启动子。本领域已知的任何合适的启动子均可应用于本发明的无药物质粒中，包括细菌、酵母、真菌、昆虫、哺乳动物和植物的启动子。启动子可以是但不局限于人或小鼠来源的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)，或任选的有另一来源，诸如大鼠或豚鼠的超级启动子(Super启动子)(Ni，M.et al.，Plant J.7，661-676，1995)。CMV-IE启动子可包含实际的启动子部分，该部分可以与或可以不与增强子部分联合。可参阅EP-A-260148，EP-A-323 597，美国专利Nos.5,168,062，5,385,839，和4,968,615，以及PCT申请No WO87/03905。来自革兰氏阴性细菌的其它启动子也是合适的，包括但不局限于，分离自禽杆菌属(Avibacterium)，布鲁氏杆菌属(Brucella)，大肠杆菌，嗜血杆菌属(Haemophilus)(例如猪嗜血杆菌(Haemophilus suis))，沙门氏菌属(Salmonella)(例如肠炎沙门氏菌(Salmonella enteridis)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis))，志贺氏菌属(Shigella)，巴斯德菌属(Pasteurella)和Rimeirella的启动子。
质粒可包含其它的表达调控元件。尤其有利的是掺入稳定序列，例如内含子序列，例如hCMV-IE的第一内含子(PCT申请No.WO1989/01036)，兔β-珠蛋白基因的内含子II(vanOoyen et al.，1979)。在另一实施方案中，质粒可包含3’UTR。3’UTR可以是但不局限于农杆菌胭脂碱合酶(Nos)3’UTR。
至于适合质粒和除痘病毒之外的病毒载体的聚腺苷酸化信号，可使用牛生长激素(BGH)基因的poly(A)信号(参阅U.S.5,122,458)或兔β-珠蛋白基因的poly(A)信号或SV40病毒的poly(A)信号。
“宿主细胞”指已被遗传改变的或者能够通过施加外源多核苷酸诸如重组质粒或载体进行遗传改变的原核或真核细胞。当提到遗传改变的细胞时，该术语指最初被改变的细胞及其后代。
本发明的另一实施方案涉及含无药物质粒的革兰氏阴性细菌宿主菌株。所述实施方案的一方面涉及包含该无药物质粒和在宿主染色体之一个或多个非必需区插入的异源多核苷酸的革兰氏阴性细菌宿主菌株，其中所述异源多核苷酸与可被阻抑蛋白紧密调控的启动子可操作性连接。在此实施方案的另一方面，插入宿主染色体的异源多核苷酸是sacB基因。在所述实施方案的另一方面，sacB基因与启动子诸如λ噬菌体的右启动子可操作性连接。人们认识到，sacB基因和启动子可以多拷贝例如两个或三个拷贝插入宿主染色体中。宿主菌株的非必需区可以是大肠杆菌染色体上的deA或purN基因。deA和purN基因是非必需的，缺失这些基因不影响细菌的生长速率(Kim，J.et al.，Biochemistry.46，44：12501-12511)。一方面，一拷贝sacB基因和启动子盒通过等位基因置换插入deA位点或purN位点。另一方面，两拷贝sacB基因和启动子盒通过等位基因置换插入deA位点或purN位点。在又一方面，两拷贝sacB基因和启动子盒被插入宿主染色体，其中一拷贝sacB基因和启动子盒插入deA位点而另一拷贝则插入purN位点。sacB基因和启动子盒指包含与启动子可操作性连接之sacB基因的多核苷酸。一方面，所述sacB基因和启动子盒包含sacB基因和λ噬菌体的右启动子。另一方面，所述sacB基因和启动子盒包含具SEQ ID NO：75中所述序列的多核苷酸。
本文所披露内容进一步涉及包含含有编码免疫原或蛋白质之异源基因的无药物质粒的疫苗或组合物，或者包含用该无药物质粒所表达的免疫原或蛋白质的疫苗或组合物。所述疫苗或组合物可进一步包含药用可接受载体。
在某一实施方案中，免疫原选自猫科动物病原体，例如但不局限于猫泡疹病毒(FHV)、猫杯状病毒(FCV)、猫白血病病毒(FeLV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、狂犬病病毒等等及它们的组合。
在另一实施方案中，免疫原选自犬科动物病原体，包括但不局限于狂犬病病毒、犬疱疹病毒(CHV)、犬细小病毒病(CPV)、犬冠状病毒、犬型端螺旋体、Leptospiraicterohaemorragiae、感冒伤寒型钩端螺旋体、伯氏疏螺旋体、支气管炎博德特菌等等和它们的组合。
在另一实施方案中，免疫原选自马科动物病原体，诸如马疱疹病毒(1型或4型)、马流感病毒、破伤风杆菌、西尼罗河病毒、马链球菌、马红球菌等等或它们的组合。
在另一实施方案中，免疫原选自牛科动物病原体，诸如狂犬病病毒、牛轮状病毒，牛副流感病毒3型(bPIV-3)，牛冠状病毒，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，口蹄疫病毒(FMDV)，牛呼吸道合胞病毒(BRSV)，牛传染性鼻气管炎病毒(IBR)，大肠杆菌，多杀巴斯德菌，溶血巴斯德菌，沙门氏菌属(Salmonella)，隐孢子虫等等以及它们的组合。
在另一实施方案中，免疫原选自猪的病原体，例如但不局限于猪流感病毒(SIV)，猪圆环病毒2型(PCV-2)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，伪狂犬病病毒(PRV)，猪细小病毒(PPV)，FMDV，猪肺炎支原体，猪红斑丹毒丝菌，多杀巴斯德菌，支气管炎博德特菌，大肠杆菌，蓝舌病病毒，非洲马瘟病毒，裂谷热，尼帕病毒等等以及它们的组合。
术语“抗原”或”免疫原”可互换使用，意指诱导宿主动物内特异免疫反应的物质。抗原可包含含有具免疫原特性之插入片段的重组载体；呈递给宿主动物时能引起免疫反应的DNA断片或片段；蛋白质、多肽、肽、表位、半抗原或它们的组合。或者，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。
用于此处时，术语”药用可接受载体”和“药用可接受媒介”可互换使用，指用于包含疫苗抗原、可被注射入宿主而无副作用的流体媒介物。本领域已知的合适的药用可接受载体包括但不局限于无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖或缓冲溶液。载体可包括助剂，包括但不局限于稀释剂、稳定剂(即糖和氨基酸)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂、粘度增强剂、色素等等。
含季铵盐、对质粒有利但不是唯一合适的阳离子脂质有利地是具有以下分子式的那些脂质：
其中R1是具有12至18个碳原子的饱和或不饱和直链脂族基团，R2是含2或3个碳原子的另一个脂族基团，而X是胺或羟基，例如DMRIE。在另一实施方案中，阳离子脂质可与中性脂质联合，例如DOPE。
在这些阳离子脂质中，优选DMRIE(N-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-双(十四烷氧基)-1-丙烷铵；WO96/34109)，其有利的与中性脂质优选DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺；Behr，1994)联合，形成DMRIE-DOPE。
有利地，在施用所述制品时即时或方便的同时或者在施用所述制品之前不久形成带佐剂的质粒混合物；例如，在施用之前不久或在施用前，有利地形成质粒-佐剂混合物，以便在施用之前给出足够的混合时间以形成复合物，例如在施用之前约10至约60分钟之间，诸如在施用前大约30分钟时。
当存在DOPE时，DMRIE∶DOPE的摩尔比有利的是约95∶约5至约5∶约95，更有利地是大约1∶大约1，例如1∶1。
DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂∶质粒重量比可以在大约50∶大约1和大约1∶大约10之间，例如大约10∶大约1和大约1∶大约5，且有利地大约1∶大约1和大约1∶大约2，例如1∶1和1∶2。
在另一实施方案中，制药学上或兽医学上可接受载体、赋形剂或媒介物可以是油包水乳剂。合适的油包水乳剂的例子包括基于油的油包水疫苗乳剂，它们在4℃是稳定和流体态的，并且包含以下成分：6至50v/v％(优选12至25v/v％)的含抗原水相，50至94v/v％的含全部或部分不可代谢油(例如矿物油诸如石蜡油)和/或可代谢油(例如植物油，或脂肪酸，多元醇或醇酯)的油相，0.2至20p/v％(优选3至8p/v％)的表面活性剂，后者全部或部分或混和地是聚甘油酯，所说的聚甘油酯优选是聚甘油蓖麻醇酯或聚氧乙烯蓖麻油或氢化聚氧乙烯蓖麻油。可用于油包水乳剂中的表面活性剂例子包括乙氧基化脱水山梨醇酯(例如聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单油酸酯(Tween 80)，可获自AppliChem，Inc.，Cheshire，CT)和脱水山梨醇酯(例如脱水山梨醇单油酸酯(Span 80)，可获自Sigma Aldrich，St.Louis，MO)。此外，关于油包水乳剂，还可参阅美国专利No.6,919,084，例如其实施例8，收编于此作为参考。在某些实施方案中，含抗原的水相包含含有一种或多种缓冲剂的盐溶液。合适的缓冲溶液的例子是磷酸缓冲盐水。在一个有利的实施方案中，油包水乳剂可以是水/油/水(W/O/W)三重乳剂(参阅，例如美国专利No.6,358,500，收编于此作为参考)。其它合适的乳剂例子参阅美国专利No.7,371,395，收编于此作为参考。
疫苗或组合物可以医学或兽医领域内技术人员众所周知的剂量和技术施用，其中考虑到诸如年龄、性别、体重、物种和接受动物的状况以及施用途径等因素。施用途径可以是通过皮肤的、经由粘膜施用(例如经口，经鼻，经肛门，经阴道)或通过肠胃外的途径(皮内，肌肉内，皮下，静脉内，或腹膜内)。疫苗或组合物可单独施用，或者可与其它处理或治疗共同施用或顺序施用。施用形式可包括悬浮液、糖浆或酏剂，以及适于肠胃外、皮下、皮内、肌肉内或静脉内施用(例如可注射施用)的制剂诸如无菌悬浮液或乳剂。疫苗或组合物可作为喷雾或混于食物和/或水中施用，或者与合适的载体、稀释剂、或赋形剂诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖等等混合递送。组合物可包含辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、胶凝剂或粘度增强剂、防腐剂、增味剂、色素等等，取决于预期制品和施用途径。可参考标准的制药学教科书诸如”Remington′s Pharmaceutical Sciences，”1990来制备合适的制品，而无需进行不适当的试验。
本文所披露内容进一步涉及产生无药物质粒的方法，包含以下步骤：1)设计包含通过等位基因置换插入在宿主染色体的一个或多个非必需区内的异源多核苷酸的革兰氏阴性细菌宿主菌株；2)构建包含编码cI阻抑蛋白的多核苷酸的DNA质粒；3)用包含编码cI阻抑蛋白之基因的DNA质粒转化所述细菌宿主菌株；4)将经转化的细菌宿主菌株在蔗糖存在下于30℃至42℃的温度范围内进行培养；和5)回收DNA质粒。
在该实施方案的一方面，所述DNA质粒进一步包含编码免疫原或蛋白质的异源多核苷酸，其中所述异源多核苷酸与启动子可操作性的连接。所述启动子可以是在原核或真核细胞内起作用的启动子，诸如CMV启动子。
本文所披露内容进一步涉及利用所述无药物质粒生产蛋白质或免疫原的方法，包含以下步骤：1)设计包含通过等位基因置换插入在宿主染色体的一个或多个非必需区内的异源多核苷酸的革兰氏阴性细菌宿主菌株；2)构建包含编码cI阻抑蛋白之多核苷酸和编码免疫原或蛋白质之基因的DNA质粒；3)用包含编码cI阻抑蛋白之多核苷酸和编码免疫原或蛋白质之基因的DNA质粒转化细菌宿主菌株；4)将经转化的细菌宿主菌株在蔗糖存在下于30℃至42℃的温度范围内进行培养；和5)回收免疫原或蛋白质。
在该实施方案的一方面，将编码免疫原或蛋白质的基因与在原核细胞内起作用的启动子可操作性的连接。所述启动子可以是来自革兰氏阴性细菌的启动子，包括但不局限于，分离自禽杆菌属(Avibacterium)，布鲁氏杆菌属(Brucella)，大肠杆菌，嗜血杆菌属(Haemophilus)(例如猪嗜血杆菌(Haemophilus suis))，沙门氏菌属(Salmonella)(例如肠炎沙门氏菌(Salmonella enteridis)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis))，志贺氏菌属(Shigella)，巴斯德菌属(Pasteurella)和Rimeirella的启动子。
在该实施方案的一方面，插入宿主染色体内的异源多核苷酸编码sacB蛋白质。另一方面，蔗糖浓度可以在0％至大约20％，大约1％至大约20％，大约1％至大约15％，大约1％至大约10％的范围内。在另一方面，蔗糖浓度在大约1％至大约10％，大约1％至大约2％，大约2％至大约3％，大约3％至大约4％，大约4％至大约5％，大约5％至大约6％，大约6％至大约7％，大约7％至大约8％，大约8％至大约9％，或大约9％至大约10％的范围内。在又一方面，蔗糖浓度可以是大约1％，大约2％，大约3％，大约4％，大约5％，大约6％，大约7％，大约8％，大约9％，或大约10％。
在该实施方案的一方面，温度可以在大约30℃至大约42℃的范围内。另一方面，温度可以在大约30℃至大约41℃，大约30℃至大约39℃，大约30℃至大约38℃，大约30℃至大约37℃的范围内。在另一方面，温度可以是大约30℃，大约31℃，大约32℃，大约33℃，大约34℃，大约35℃，大约36℃，大约37℃，大约38℃，大约39℃，大约40℃，或大约41℃。
术语回收包括但不局限于从培养基中收集、提取、收获或纯化。
“分离的”生物学组分(诸如多核苷酸、DNA质粒、蛋白质或细胞器)指某一组分已基本上与该组分天然存在之生物体的细胞内的其它生物学组分分开或纯化出来，例如，其它染色体的和染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞器。已被“分离的”的多核苷酸(包括DNA质粒)和蛋白质包括用标准纯化方法纯化的多核苷酸和蛋白质，例如，参阅Russell，DavidW.；Sambrook，Joseph(2001)，Molecular cloning：a laboratory manual.Cold SpringHarbor，N.Y：Cold Spring Harbor Laboratory。该术语还包含通过重组技术及化学合成制备的多核苷酸和蛋白质。
术语“纯化的”用于此处时不要求绝对的纯净；更确切的，它意图作为一个相对的术语。因此，例如，纯化的多肽或多核苷酸制品是其中所述多肽或多核苷酸与其然环境中之多肽或多核苷酸相比是更富集的。即所述多肽或多核苷酸与细胞组分分开。因此“基本上纯化的”意思是至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，或至少98％，或更多的细胞组分或物质已被去除。同样地，多肽或多核苷酸可以是被部分纯化的。“部分纯化”的意思是少于60％的细胞组分或物质被去除。
本发明进一步提供了用于诱导动物内免疫或保护性反应的方法，包括对动物施加免疫学组合物、依照本发明的疫苗或组合物。所引起的免疫反应显著的是抗体和/或细胞免疫反应，特别是γ-干扰素反应。
特别是，本发明提供了免疫对抗或预防或减少动物被致病生物感染(例如，被病毒、细菌、真菌或原生动物寄生虫感染)所引起的症状。本发明的方法可用于脊椎动物，包括但不局限于人、犬科动物(例如狗)，猫科动物(例如猫)；马科动物(例如马)，牛科动物(例如牛)和猪科动物(例如猪)以及鸟类包括但不局限于鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉，鹦鹉、雀、鹰、乌鸦和平胸鸟(鸵鸟，鸸鹋，食火鸡，等等)。本发明方法还可用于提供鱼DNA疫苗。
在本发明的一个特定方面，这些方法包括在分娩之前通过施加依照本发明制备的疫苗组合物而对怀孕的雌性进行免疫接种。这些方法进一步包括诱导由疫苗接种方案引起的保护性抗体并将这些保护性抗体从被接种疫苗的怀孕雌性传递至她们的后代。所述从母亲继承来的抗体传递随后保护后代免受疾病困扰。
依照本发明制备的疫苗组合物的剂量将取决于待接种疫苗动物的物种、家系、年龄、大小、疫苗接种史和健康状况。其它因素类似抗原浓度、另外的疫苗组分和施用途径(即皮下，皮内，经口，肌肉内或静脉内施用)也将影响有效剂量。基于疫苗的抗原浓度、施用途径和待接种疫苗之动物的年龄和状况可很容易的确定待施用疫苗的剂量。每批抗原可被个别校准。或者，可用系统的不同剂量的免疫原性试验以及MPD(最小保护剂量)研究和其它筛选步骤来确定依照本发明之疫苗组合物的有效剂量而无需过度试验。从下文提出的实施例中，显而易见对于使用本文所述疫苗组合物而言大概什么剂量和大概什么体积会是合适的。关键因素是所述剂量至少提供了针对自然感染的部分保护作用，正如由自然感染相关死亡率和发病率降低所证明的。同样的，本领域普通技术人员很容易确认合适的体积。例如，在鸟类物种中，一剂的体积可以是从大约0.1ml至大约0.5ml，且有利地是从大约0.3ml至大约0.5ml。对于猫科动物、犬科动物和马科动物物种而言，一剂的体积可以是从大约0.2ml至大约3.0ml，有利的是从大约0.3ml至大约2.0ml，而更有利的是从大约0.5ml至大约1.0ml。对于牛科动物和猪科动物物种而言，一剂的体积可以是从大约0.2ml至大约5.0ml，有利的是从大约0.3ml至大约3.0ml，而更有利的是从0.5ml至大约2.0ml。
以周期性时间间隔加强最初免疫反应的情况下或者当自最后一剂后过去了一段长时间时重复的疫苗接种可能是更可取的。在本发明的某一实施方案，疫苗组合物作为肠胃外注射剂施用(即，皮下的、皮内的或肌肉内的)。组合物可作为一剂施用，或者在备选的实施方案中，间隔大约2至大约6周(优选大约2至大约5周)给予大约2至大约5剂的重复剂量施加。不过，本领域技术人员将认识到药剂数目和疫苗接种之间的时间间隔取决于许多因素，包括但不局限于，被接种疫苗的动物年龄；动物的状况；免疫途径；每剂可利用的抗原量；等等。对于初始的疫苗接种，周期通常长于一周，且优选在大约2至大约5周之间。对于先前已被接种疫苗的动物，可在怀孕之前或怀孕期间以一年的时间间隔进行加强疫苗接种。
本发明还涵盖用无针注射器诸如PigjetAvijetDermojet或Biojector(Bioject，Oregon，USA)施加疫苗组合物。本领域普通技术人员能根据有关因素诸如待接种疫苗动物的物种；动物的年龄和体重等等调整注射器的规格，而无需过度试验。
本发明进一步涉及含有包含活性成分诸如免疫原或药用组合物之第一个小瓶和包含依本发明配制的稀释剂的第二个小瓶的试剂盒。免疫原可以是冻干形式、干燥形式的或在如本文所述的水溶液中。
现在将以以下非限制性实施例的方式对本发明进行进一步的描述。
实施例
实施例1：无抗生素质粒保持设想
以下实施例证明了基于三个部分在革兰氏阴性宿主细胞内保持高质粒拷贝数目的新设想：
1.在确定的培养条件下表达对所述革兰氏阴性细菌有毒的产物的革兰氏阴性细菌宿主，其中所述有毒基因插入在细菌宿主染色体的一个或多个非必需区域内。
2.在细菌染色体上存在可被紧密调控的组成型启动子控制的编码该有毒产物的基因；和
3.从质粒表达特异阻抑蛋白，其调控与宿主染色体上有毒基因可操作性连接的启动子。
在此设计中，所述质粒的存在控制了在确定培养条件下(例如，存在蔗糖)革兰氏阴性细菌宿主的倍增。
在第一部分中，革兰氏阴性细菌被转化以表达编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因(参见图1)。第二和第三部分涉及cI阻抑蛋白基因产物和右λ启动子。λ噬菌体的cI基因编码λ阻抑蛋白。
编码cI阻抑蛋白的基因组区域被称为不敏感区。该不敏感区如图2中所阐释。表达cI基因产物的质粒系统应抑制处于λ启动子控制下的sacB基因的转录。这样的阻抑应赋予对蔗糖的抗性并且使得质粒可在宿主细胞内保持和增殖(参见图1)。
图3描述了“无药物”设想的纵览，其中表达自质粒的cI阻抑蛋白活性抑制了处于细胞宿主染色体上的λPr启动子控制下的有毒sacB基因产物的转录，且其中在蔗糖存在下宿主大肠杆菌细胞的生存能力通过来自质粒的λcI阻抑蛋白的充分表达而得到保证。cI阻抑蛋白与其特异启动子的结合在30℃和37℃之间的温度下是最适的(参见图3)。
在特定的情形下(诸如当使用温度敏感性cI857阻抑蛋白时)，cI阻抑蛋白在高于40℃的温度时将不与启动子结合。因此，转变至42℃抑制了cI阻抑蛋白对λPr启动子的结合活性并且其结果应致使宿主细胞对蔗糖敏感(更具体的是果聚糖副产物)。在蔗糖存在下于42℃温度孵育是特别用于验证整个系统的功能性的条件，并且构成了支持该系统的全部功能性的“阴性试验”(参见图4和图6C)。事实上，用pPB829或pPB838质粒转化的亲代细胞λPr::sacB purNΩkan在存在Cat或蔗糖条件下进行培养时，当接种于LB蔗糖琼脂上并在42℃孵育时是不能存活的。这证明了亲代细胞的生存能力取决于含cI基因的质粒的保持。
实施例2：包含λ启动子/果聚糖蔗糖酶基因的大肠杆菌宿主菌株的产生
制备了两种含λPr::sacBΩkan盒的工程宿主菌株，其中包含处于λ启动子(λPr)控制下之sacB基因的盒被卡那霉素标记，然后通过edA或purN基因的等位基因置换被引入大肠杆菌染色体中。这些基因不是必需的，并且它们的缺失不影响生长速率。被转化的细胞变得对蔗糖高度敏感。
图8A-B显示了分别通过edA或purN基因的等位基因置换而插入大肠杆菌染色体的λPr::sacB Ωkan盒由6个独立部分组成，在经连接PCR融合之前被PCR扩增。
图8D显示了λPr::sacBΩkan盒通过edA或purN基因的等位基因置换而插入大肠杆菌染色体。此盒的插入是通过用线性DNA模板转化大肠杆菌完成的，所述模板包含两侧为染色体位点上下游同源区的被缺失基因，然后转移入易于重组的大肠杆菌菌株，诸如recD，recB recC sbcA突变体中。用于制备亲代菌株的大肠杆菌菌株是来自Stratagene的BJ5183菌株(ref#200154)，其中基因型是endA1 sbcBC recBC galK metthi-1 bioT hsdR(Strr)。如所示的，大肠杆菌野生型的初始表型是KanS，CatS和蔗糖R。在菌株转化后，表型转变成KanR，CatS和蔗糖S。此最新的表型是用于证明无抗生素质粒功能性的进一步实验的亲代菌株之一。
图8C显示了待通过edA基因的等位基因置换插入Prλ::sacBΩkan大肠杆菌染色体的λPr::sacB Ωcat盒由6个独立部分组成，其在经连接PCR融合之前被PCR扩增。靶向于通过等位基因交换缺失edA基因的新λPr::sacBΩcat盒的目的是制备表达两个sacB盒的双缺失突变体ΔedA ΔpurN。
图8E显示当用cI质粒(pPB829或pPB838)转化亲代菌株时，细胞(亲代菌株+cI质粒[pPB829或pPB838])变得对卡那霉素(KanR)，氯霉素(CatR)和蔗糖(蔗糖R)有抗性。该图阐释了工程宿主菌株(ΔpurNλPr::sacB+Ωkan)或(ΔedA λPr::sacB+Ωkan)与药物质粒的共存以证明何时sacB基因处于λ启动子控制下且构建体通过edA或purN基因的等位基因置换被引入大肠杆菌染色体的设想。被转化的细胞变得对蔗糖高度敏感。当包含cI阻抑蛋白的氯霉素标记质粒(pPB838或pPB829)被引入ΔpurN λPr::sacB+Ωkan或ΔedA λPr::sacB+Ωkan菌株时，被转化的细胞变得对卡那霉素，氯霉素和蔗糖有抗性。
针对purN缺失，用PB1232和PB1233引物扩增λ启动子(λPr)。
PB1232引物(SEQ ID NO：6)：
(CCGAACAACGCGTGGTTATCGACACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCG)；和
PB1233引物(SEQ ID NO：7)：
(CAAACTTTTTGATGTTCATATCCATCTGATCCTCTTCAAAAGGCCACCTG)。
针对edA缺失，用PB1234和PB1233引物扩增λ启动子(λPr)。
PB1234(SEQ ID NO：8)：
(GACGACAAATTTGTAATCAGGCGAGAGCACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCG)，
用pLDR8质粒(ATCC#77357)作为DNA模板进行λ启动子(λPr)(SEQ ID NO：5)的扩增。当利用连接PCR制备λPr::sacBΩkan盒时，以PB1192(SEQ ID NO：9)(ATGGATATGAACATCAAAAAGTTTGC)和PB1193(SEQ ID NO：10)(AAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCTTG)为引物，用pNB350(Merial专有产品)作DNA模板扩增sacB基因(SEQ ID NO：3)(参见图8A-B)。为了构建λPr::sacBΩcat盒，用反向引物PB1320(SEQ ID NO：80)
(GCCGATCAACGTCTCATTTTCGCCGTTAACAGATCTTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCTTG)代替PB1193。用PB1194(SEQ ID NO：11)(ATGTGCGCGGAACCCCTATTTG)和PB1195(SEQ ID NO：12)
(GACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGC)引物、以pCMVβ作为DNA模板扩增bla启动子。用PB1196(SEQ ID NO：13)(ATGAGCCATATTCAACGGGAAACG)和PB1197(SEQ ID NO：14)(GAAAAACGCCAGCGGCAGAGCTGGCGCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG)引物、以质粒pLL14(包含卡那霉素基因的弱启动子，Merial专有材料)作为DNA模板扩增卡那霉素抗性基因。用PB1321(SEQ ID NO：81)(AGATCTGTTAACGGCGAAAATGAG)和PB1322(SEQID NO：82)(AAAACGCTACAAAAATGCCCGATCCTTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGC)引物、以pPB829作为DNA模板扩增置于天然cat启动子调控下的氯霉素(cat)抗性基因。用PB1237(SEQ IDNO：15)
(TTTGCGGCCGCTGGTGGTGGTCGCCATGTGCGTTAATGACC)和PB1199(SEQ ID NO：16)(TATTCGATAACCACGCGTTGTTCGG)、以大肠杆菌SCS1菌株的DNA作为DNA模板扩增purN基因的5’侧翼区。利用PB1200(SEQ ID NO：17)(GCGCCAGCTCTGCCGCTGGCGTTTTTC)和PB1238(SEQ IDNO：18)(TTTGGATCCGCTGGTGGATATCATCAAGGCAGTAACGCAGAATG)引物、以大肠杆菌SCS1菌株的DNA作为DNA模板扩增purN基因的3’侧翼区。用PB1235(SEQ ID NO：19)(TTTGCGGCCGCTGGTGGTTGAGAACCAGGTGATTGAAGCGCC)和PB1209(SEQ ID NO：20)(CTCTCGCCTGATTACAAATTTGTCGTC)引物、以SCS1的基因组DNA作为DNA模板扩增edA基因的5’侧翼区。用随后的引物PB1210(SEQ ID NO：21)(AGGATCGGGCATTTTTGTAGCGT)和PB1236(SEQID NO：22)(TTTCTAGAGCTGGTGGCGACTACCGTGAATCCTGGCAACC)做引物、以质粒pLDR8为模板DNA扩增edA基因的3’侧翼区。
待转移入大肠杆菌染色体之λPr::savBΩkan盒或λPr::sacBΩcat的这6个PCR产物经连接PCR后融合在一起(图8A-B-C)。用PCR净化试剂盒(Geneclean turbo kit；MPBiomedicals，CA，USA)纯化这6个扩增片段并用所有6个片段无需引物进行第二轮PCR。PCR条件如下：PCR混合物(终体积25μl)，1μl的各种PCR片段，2μl的dNTP(各2.5mM)，5μl的5xPCR缓冲液，11.5μl无菌蒸馏水，0.5μl Phusion DNA聚合酶(Finenzymes，Finland)；PCR循环：98℃30秒，(98℃10秒，60℃30秒，72℃5分钟)*15个循环，然后72℃10分钟。通过使用针对purN(等位基因置换)的PB1235和PB1236引物和针对edA(等位基因置换)的PB1237和PB1238引物，用1μl纯化的第二轮产物进行第三轮PCR扩增。PCR条件如下：PCR混合物(终体积50μl)，1μl的第二轮PCR片段，1μl的dNTP(各2.5mM，10μl的5xPCR缓冲液，37μl无菌蒸馏水，0.25μl正向引物，0.25μl反向引物，0.5μl Phusion DNA聚合酶(Finenzymes，Finland)；PCR循环：98℃30秒，(98℃15秒，60℃30秒，72℃4分钟)*35个循环，然后72℃10分钟。将最终的PCR连接扩增子(对于purN等位基因置换而言是4007bp，对于edA等位基因置换是3407bp)在琼脂糖凝胶上进行检查，并在转化入大肠杆菌之前进行纯化。用限制性酶切分析检查各个连接PCR扩增子。
将编码处于λPr启动子控制下之sacB基因(SEQ ID NO：75)和处于bla启动子控制下之Kan抗性基因且两侧是与毗接靶位点(edA或purN)之DNA序列同源的两个长区域的线性DNA片段(λPr::sacB Ωkan)通过电穿孔整合入大肠杆菌的染色体中。在包含卡那霉素作为选择压力的LB琼脂平板上获得了大约300个候选转化子(ΔpurN λPr::sacB Ωkan或ΔedAλPr::sacB Ωkan单一突变体)。随机挑选20个菌落并通过在含卡那霉素的平板上划线进行纯化，然后通过PCR证实在edA或purN位点的λPr::sacB Ωkan盒插入(参见图9B)。用PB1196和PB1197进行PCR来检查染色体上的卡那霉素插入。用PB1192和PB1193进行PCR来验证染色体上sacB基因的存在。用PB1204(SEQ ID NO：23)(GTGGTGCTTATTTCCGGCAACGG)和PB1205(SEQ ID NO：24)(CCAGCCACGCGGCGTTTTCGTGC)引物进行PCR来验证染色体上purN基因的缺失。用PB1214(SEQ ID NO：25)(GACCACCGGCCCGGTTGTACCGG)和PB1215(SEQ ID NO：26)(CGGACCCGCGATCGCCTGCAGG)进行PCR来验证edA基因的缺失(参见图9B)。用PB1213(SEQ IDNO：27)(GGTGGATGGCGTCCATTTCTGTGC)和PB1196引物进行PCR验证所述盒在edA位点处的右边正确插入。用PB1212(SEQ ID NO：28)(CAAAAGTGTTAAGCGGTAACCTG)和PB1233引物进行PCR来验证所述盒在edA位点的左边正确插入。用PB1203和PB1196引物进行PCR来验证所述盒在purN位点的右边正确插入。用PB1202和PB1233引物进行PCR来验证所述盒在purN位点的左边正确插入(参见图9C)。全部PCR检查证明了在正确位点的整合。此外，如图10中所示，还证实了sacB基因的功能性。构建好的亲代菌株ΔpurNλPr::sacB Ωkan不能在含蔗糖的LB琼脂平板上生长(图10)。
将编码sacB基因(处于λPr启动子控制下)和Cat抗性基因(处于其天然cat启动子控制下)且两侧是与毗接靶位点(edA)之DNA序列同源的两个长区域的线性DNA片段(λPr::sacB Ωcat)通过电穿孔整合入ΔpurNλPr::sacB Ωkan大肠杆菌菌株的染色体中。在包含氯霉素作为选择压力的LB琼脂平板上获得了大约200个候选转化子(ΔpurNλPr::sacB ΩkanΔedA λPr::sacB Ωcat双突变体)。随机挑选20个菌落并通过在含氯霉素的平板上划线进行纯化，然后用引物对PB1212和PB1213(参见图9C)通过PCR验证在edA位点的λPr::sacB Ωcat盒插入(参见图9C)。通过测序检查PCR产物来验证λPr::sacBΩcat的身份。
图8D中阐释了宿主菌株的构建。图8E阐释了宿主菌株(一个sacB盒[λPr::sacB Ωkan])和无药物质粒共存。初始的大肠杆菌基因型是KanS，CatS，蔗糖R。盒整合进入大肠杆菌ΔpurN Prλ::sacBΩKan染色体产生了新的基因型KanR，CatS，蔗糖S。引入含cI阻抑蛋白的质粒产生了最终的基因型KanR，CatR，蔗糖R。
实施例3：包含cI阻抑蛋白表达盒的质粒(质粒pPB838-pPB844至pPB847-pPB885-pPB896)的产生
质粒构建简述
产生pPB828-衍生质粒，诸如pPB829和pPB844-pPB847，其中包含处于其自身启动子或卡那霉素基因弱启动子(P1)控制下的λ噬菌体之cIORF。
用其中氯霉素乙酰转移酶基因(cat)替代氨苄青霉素抗性基因的中间质粒商业载体pMCS5产生了包含处于卡那霉素基因弱启动子(P1)控制下之cI基因的pPB838质粒(图19)。
pPB844和pPB845质粒包含克隆入含cat基因之pVR1012衍生物(pVR1020或1012质粒，VICAL Inc.；Luke et al.，1997；Hartikka et al.，1996，参阅，例如美国专利Nos.5,846,946和6,451,769)即pPB828载体内的cI基因(处于P1启动子控制下)。所述质粒的差异在于进入质粒的cI基因方位不同(图20-21)。
pPB846和pPB847质粒包含克隆入含cat基因之pVR1012衍生物即pPB828载体的cI基因(处于其自身(天然)启动子SEQ ID NO：30控制下)。所述质粒的差异在于进入质粒的cI基因方位不同(图22-23)。
pPB885制备自其中氯霉素乙酰转移酶基因(cat)被AvrII限制酶消化去除的pPB838质粒[cI基因处于卡那霉素基因之弱启动子(P1)控制下](图24)。
pPB829-衍生质粒诸如pPB896包含处于卡那霉素基因之弱启动子(P1)控制下的cI基因。pPB896质粒包含处于真核CMV启动子控制下的GFP标记基因(图25)。
这些质粒用作载体来克隆异源多核苷酸，无药物系统的目的基因(转基因)。各个质粒包含可被唯一的限制性酶切下并去除的抗生素抗性基因(cat)，从而使得质粒可无需抗生素选择压力(诸如氯霉素)而在蔗糖存在下于合适的大肠杆菌sacB菌株内增殖。
这些质粒上的抗生素抗性基因(cat)只用于证实设想。Cat基因最终在最后的无药物质粒中被去除(参见图13-15和实施例4)。
来自质粒pLDR8(ATCC编号#77357)的cI基因序列产生了阻抑蛋白cI857突变体(NCBI：AB248924，克隆载体pND707，Love，C.A.et al.，Gene.17；176(1-2)：49-53；1996)。
A.包含处于弱启动子P1控制下之cI阻抑蛋白ORF的质粒pPB829的构建
pPB828质粒：(基于pVR1012的质粒+Cat基因)(图17)
产生pPB828-衍生质粒，诸如pPB829，其中包含处于卡那霉素基因弱启动子(P1)控制下的λ噬菌体之cI ORF和可经唯一的EcoRI消化位点被切除的Cat基因。生成基于pVR1012的表达载体，其包含氯霉素乙酰转移酶(cat)基因，得到pPB828质粒。来自pPB627(Merial专有材料)的cat基因是来自pNB335(Merial专有材料)的衍生物，pNB335自身是来自初始质粒pSW23T(来自GenBank Accession No.AY733066的克隆质粒)的衍生物。利用引物PB1184(SEQ ID NO：33)(GAATTCCGGTCCGGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGC3)[包含EcorI位点(加下划线)]和PB1185(SEQ ID NO：34)(CCTAGGCTGTGTTAATTAAGGCGCGCCGAATTCCGGTCCGTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGC)[包含EcoRI位点(加下划线)]、以pNB350为模板，用PhusionTM高保真DNA聚合酶(Finnzymes，02150Espoo，Finland)通过PCR获得相应于cat基因(798bp)(相对于DNA是SEQ ID NO：31，相对于蛋白质是SEQ ID NO：32)的DNA片段。将产生的PCR产物(832bp)连入pCR平端Topo载体(Invitrogen，CA，USA)中，获得质粒pCRblunt/PB1184-1185(4351bp)(图16)。通过限制性分析(PvuII消化)证实pCRblunt/PB1184-1185的身份。通过用Ecl136II和EcoRV酶切消化pCRblunt/PB1184-1185质粒获得相应于Cat基因的DNA片段。将897bp的片段连入事先用MscI和StuI消化的pVR1012衍生质粒(3303pb)中，以产生质粒pPB828(图17)。通过限制性酶切分析证实pPB828的身份(用PvuII和NcoI消化以确定插入物的大小，而用EcoRI来证实基因cat被很好的去除了)。
pPB829质粒：(pPB828质粒+P1::cI基因)(图18)
经由融合PCR获取包含处于P1启动子(卡那霉素抗性基因的弱启动子)控制下之cI基因的构建体。利用引物PB1186(SEQ ID NO：35)(TCATACCAGGCCTAGGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATG)和PB1187(SEQ IDNO：36)(AACACCCCTTGTATTACTGTTTATG)，以pLL14(参见Merial专利申请US2005/0164946)为模板并用Phusion DNA聚合酶通过PCR获得相应于P1弱启动子的DNA片段。利用引物PB1188(SEQ IDNO：37)(AATACAAGGGGTGTTATGAGCACAAAAAAGAAACCATTAACAC)[5’端包含P1序列的互补区(加下划线)]和PB1189(SEQ ID NO：38)(CCGGAATTCGGCGCGTCAGCCAAACGTCTCTTCAGGCCACTG)、以pLDR8(ATCC#77357)为模板并用Phusion DNA聚合酶通过PCR获得相应于cI基因(SEQ IDNO：1)的DNA片段。将两个PCR产物(分别是151和729bp)进行纯化并在经由PB1186和PB1189引物和Phusion DNA聚合酶(Finnzymes，Finland)的第二步PCR中用作模板(参见图24)。将两个PCR产物(分别是151和729bp)进行纯化，并与用AscI和AvrII消化的质粒pPB828连接，产生质粒pPB829(4970bp)(图9A)。用来自Clontech(Takara Bio Europe，St-Germain-en-Laye，France)的“In-Fusion PCR Cloning Kit”(cat.No.740590.250)完成连接。在HindII消化分析后选择克隆pPB829。对质粒pPB829进行测序证实cI基因和P1启动子的序列完整性。
pPB896质粒：(pPB829质粒+P1::cI基因+GFP)(图25)
将GFP标记物基因置于真核CMV启动子(SEQ ID NO：43)的控制下。用NotI/BglII二者酶切消化pCG105质粒(具有处于真核CMV启动子控制下之GFP基因的pPB828-衍生质粒，Merial专有材料)制备GFP基因。将此消化好的GFP基因克隆入事先经NotI/BglII酶切的pPB829质粒中，产生pPB896质粒。
B.包含处于P1启动子(卡那霉素基因之弱启动子)控制下之cI基因的中间质粒pPB838和质粒pPB844-pPB845的构建
pPB837.1质粒：(pMCS5质粒+Cat基因)
利用引物PB1182(SEQ ID NO：39)(AGATCTGTTAACGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGC)[包含在5’端的BglII位点(加下划线)]和PB1183(SEQ ID NO：40)(GTCGACGTTAACTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGC)[包含在5’端的SalI位点(加下划线)]、以pPB791[质粒pNB350的衍生物]为模板并用PhusionDNA聚合酶通过PCR获得相应于Cat基因的DNA片段。
基于pNB350的cat序列设计PCR引物。汇合三个独立的PCR产物(779bp)并连接入pCRII载体中，获得质粒pCRII+PB1182-1183(4734bp)。经SalI/BglII消化后选择pCRII+PB1182-1183的克隆。用SalI和BglII消化pMCS5质粒(MoBiTec，Germany)以获取DNA片段A(2950bp)。用SalI和BglII消化pCRII+PB1182-1183并将片段SalI-BglII从琼脂糖凝胶中分离(797pb：片段B)。将片段A和B连接，产生质粒pPB837.1(3747bp)。
pPB837.2：无bla启动子的(pMCS5+Cat)
产生不包含bla启动子区的质粒pPB837.2。用NaeI和XmnI消化质粒pPB837.1，并从琼脂糖凝胶中分离和纯化出3300bp的片段NaeI-XmnI(片段A)。连接片段A以获得pPB837.2质粒(3300bp)。经BglI消化后选择克隆pPB837.2。
pPB838质粒(pMCS5+Cat，无bla启动子)+P1::cI(图22)
利用融合PCR获得包含处于P1启动子(卡那霉素抗性基因的弱启动子)控制下之cI基因的构建体。利用引物PB1186和PB1187、作为模板的pLL14和Phusion DNA聚合酶通过PCR获得相应于P1弱启动子的DNA片段。利用引物PB1188和PB1189、作为模板的pLDR8(ATCC#77357)和Phusion DNA聚合酶(Finnzymes，Finland)通过PCR获得相应于cI基因的DNA片段。将两个PCR产物(分别是151和729bp)进行纯化，并在经由PB1186和PB1189引物和PhusionDNA聚合酶的第二步PCR中用作模板。汇合两次独立PCR产物(880bp)并连接入pCRII平端载体中，获得质粒pCRblunt+PB1186-1189(4400bp)。经EcoRV/SpeI消化后选择pCRII blunt+PB1186-1189的克隆。
用EcoRV和SpeI消化pCRII blunt+PB1186-1189以获得EcoRV-SpeI片段A(936bp)。用EcoRV和SpeI消化pPB837.2，然后从琼脂糖凝胶中分离片段EcoRV-SpeI(3464pb：片段B)。连接片段A和B，产生质粒pPB838(4216bp)。经HindIII消化后选择克隆pPB838。通过测序验证cI基因和P1启动子序列的完整性。
pPB885质粒(pMCS5+Cat，无bla启动子)+P1::cI(图24)
此质粒衍生自其中氯霉素乙酰转移酶基因(cat)被AvrII限制酶消化去除的pPB838质粒(图24)。pPB885质粒包含处于卡那霉素基因之弱启动子(P1)控制下的cI基因。在转化ΔpurN λPr::sacB Ωkan大肠杆菌宿主菌株后，如实施例4(参见下文)中所述通过在补充有10％蔗糖的LB琼脂板上直接选择而分离pPB885质粒。
质粒pPB844-pPB845(图23-24)
用引物PB1186和PB1263(SEQ ID NO：41)(TCAGCCAAACGTCTCTTCAGGCCAC)、作为模板的pPB838质粒和Phusion DNA聚合酶通过PCR获得相应于在P1启动子控制下之cI基因的DNA片段。汇合4次独立的PCR产物PB1186-PB1263(864bp)，并连接入pCRblunt载体以获得质粒pCRblunt+PB1186-1263(4383bp)。在HindIII消化后选择pCRblunt+PB1186-1263的克隆。
用EcoRI消化pCRblunt+PB1186-1263质粒，并用Klenow聚合酶补平末端以产生平端片段(929bp：片段A)。用XmnI消化PPB828质粒，并纯化产生的XmnI-XmnI片段(片段B：4135bp)。将片段A和B连接以产生质粒pPB844或pPB845。用BamHI/HindIII消化筛选候选者。在pPB844质粒(参见图20)中，cI基因的方向与处于CMV启动子(SEQ ID NO：43)控制下的待克隆入载体MCS(多克隆位点)之目的转基因的相同。在pPB845质粒(参见图21)中，cI朝向相反的方向。
C.获得天然启动子控制下的cI基因的质粒pPB846-pPB847
利用引物PB1266(SEQ ID NO：42)(GCTGACTCATACCAGGCACGCACGGTGTTAGATATTTATCCC)和PB1263、做为模板的pLDR8质粒和Phusion DNA聚合酶，通过PCR获得处于其自身启动子(cI天然启动子：SEQ ID NO：30)控制下之cI基因的相应DNA片段。
pPB846-pPB847质粒
汇合4次独立的PCR产物PB1266-PB1263(777bp)，并连接入pCRblunt载体，以获得质粒pCRblunt+PB1266-1263(4296bp)。经HindIII消化后选择pCRblunt+PB1266-1263的克隆。
用EcoRI消化pCRblunt+PB1266-1263质粒，并用Klenow聚合酶补平末端以产生平端片段(842bp：片段A)。用XmnI消化pPB828质粒，并纯化片段XmnI-XmnI(片段B：4135bp)。连接片段A和B以产生质粒pPB846(4999bp)或pPB847。用BamI/HindIII消化筛选候选者。在pPB846质粒(参见图22)中，cI基因的方向与处于CMV启动子控制下的待克隆入载体MCS位点之目的基因的相同。在pPB847质粒(参见图23)中，cI朝向相反的方向。
D.构建结果
图7显示了包含cI阻抑蛋白、用于制备无药物质粒的pPB838和pPB829构建体。两个质粒均标记了氯霉素(CatR)基因。这些质粒上的Cat基因仅在验证设想时需要，但最终可被去除(参见图13-15和实施例4)。
实施例4：用cI质粒转化大肠杆菌宿主菌株并在蔗糖琼脂平板上直接选择
能通过氯霉素(Cat)标记cI质粒(s)筛选转化细胞而无需在琼脂平板上使用抗生素作为选择压力的实验步骤已被有效验证(参见图13-15)。用1μg的pPB838或pPB829质粒转化大肠杆菌λPr::sacB+ΔpurNΩKan的感受态细胞，并在30℃于LB液体培养基中孵育3小时。将100μl等分试样的稀释(10-3和10-4)转化细胞(用pPB838和pPB829质粒)铺在含10％蔗糖的LB琼脂板上。范围在10-3至10-4的这些稀释液显现出适于选择正确的转化子细胞(例如，具有cI质粒)，因为生长于含蔗糖LB琼脂板上的98-100％蔗糖抗性细胞是CatR。这表明这些转化细胞具有cI质粒(pPB829或pPB838)。
图13A显示用1μg的pPB838或pPB829质粒转化大肠杆菌λPr::sacB+ΔpurNΩKan的感受态细胞，并于30℃在LB液体培养基中孵育3小时，然后进行点接(每个点4μl)。该图显示了在含氯霉素(15μg/ml)或蔗糖(10％)的LB琼脂板上的对数稀释度(从未稀释至6个对数稀释度)。将大肠杆菌λPr::sacB+的未转化感受态亲代菌株细胞用作标准细胞培养于相似条件下。如所预期的，标准细胞在选择性平板诸如cat和蔗糖上不生长。不过，由于长期孵育(3天)，在此条件下出现了针对蔗糖的某些自发的突变抗性。此自发突变体的水平确定了筛选正确转化子细胞所待考虑的基线。用在此实验条件下生长于cat和蔗糖上的转化细胞观察到两个Log差异。每一定义的感受态细胞出现短暂的细胞壁薄弱。电穿孔后将被转化细胞在LB液体培养基中孵育能使前述细胞壁薄弱和电穿孔后细胞壁和细胞膜的次生孔隙再生。因为感受态细胞由于λPr::sacB+ΔpurNΩKan盒的插入而在遗传上对蔗糖敏感，在蔗糖存在下转化细胞的恢复就比在Cat上的细胞恢复降低了两个Log。通过将100ul转化细胞铺在选择性平板上证实了这些观察结果(参见图13B)。
图13B显示了将100μl转化的(用pPB838和pPB829质粒)和未转化的标准细胞铺于含cat或蔗糖的选择性LB琼脂板上，利用合适的对数稀释度来确定在cat和蔗糖上的转化效率的比率，并且将标准铺于蔗糖上以便更好的确定成功筛选能生长于LB蔗糖琼脂板上之正确转化子细胞所待考虑的自发突变率的基线。与先前的点接细胞实验(参见图13A)一致，当将10-3稀释度的转化子细胞铺于含蔗糖的LB琼脂板上时，未探测到抗蔗糖的自发突变体。如先前所显示的(参见图13A)，在此条件下于cat和蔗糖上进行选择，两者之间的转化效率存在2个Log差异。铺于含蔗糖的LB琼脂上时10-3至10-4的稀释度范围看起来适合选择正确的转化子细胞(例如，具有cI质粒)。
图14A-C阐释了只用cI质粒(pPB829和pPB838)而不使用抗生素作为选择压力选择转化细胞的实验步骤的效力。
图14A显示了用复制平板检验法来验证筛选含cI质粒之正确转化子细胞的实验纵览。与图13B中所示相似，用cI质粒(pPB829和pPB838)转化亲代感受态细胞λPr::sacB+ΔpurNΩKan，并将合适的对数稀释液铺于选择性(Cat或蔗糖)LB琼脂板上，然后在30℃孵育3天。然后，将显示CFUs(菌落形成单位)滴度在20至150范围内的平板复制于含Cat或蔗糖或二者联合的新的新鲜LB琼脂板上，然后在30℃再孵育3天。理论上，Cat抗性菌落应相当于增殖cI质粒的细胞。
图14B显示了证实复制平板检验后在蔗糖LB琼脂平板和在Cat/蔗糖LB琼脂平板上获得的CatR CFUs数目是相同的实验结果。如图14B(组图B)中所证实的，CatR CFUs是i)全部蔗糖抗性，并且ii)全部抗Cat和蔗糖的联合，表示在转化后所有的亲代细胞均包含cI质粒。组图C显示用蔗糖直接选择的10-3和10-4稀释的转化子细胞也抗蔗糖以及蔗糖和Cat二者的联合，同样表示了这些蔗糖抗性CFUs相当于包含cI质粒的正确转化细胞。事实上，当将非转化亲代细胞铺于含蔗糖的LB琼脂板上时，复制于蔗糖和Cat的组合上的蔗糖抗性CFUs如所预期的不生长，因为氯霉素抗性是由pPB829或pPB838质粒带来的表型特征。
图14C描述了从复制平板检验(参见图14B)中获得的统计数据，以及更具体的是未使用抗生素所选择的含cI质粒的菌落百分比。在此实验条件下，含cI质粒的菌落百分比在98％至100％之间。
实施例5：显示cI质粒可被保持的加蔗糖和不加蔗糖的不同培养条件
在存在或不存在蔗糖的条件下培养表达sacB，ΔpurNλPr::sacB+Ωkan的大肠杆菌细胞，以便检查插入大肠杆菌染色体的λPr::sacB+盒的功能性。
图4描述了失活系统的”蔗糖敏感性”，其中温度转变成42℃抑制了cI阻抑蛋白对λPr启动子的结合活性并使得宿主细胞对蔗糖敏感。质粒所表达的cI阻抑蛋白抑制了处于宿主细胞染色体上λPr启动子控制下的有毒sacB基因产物的转录。宿主大肠杆菌细胞在蔗糖存在时的生存能力通过来自质粒的cI阻抑蛋白充分表达得到保证。图5描述了在蔗糖存在下将宿主菌株与非抗生素选择pDL1质粒联合以产生无药物质粒(pDL：无药物质粒)。为了证实设想的此实验设计进一步阐释于图6A，6B，和6C中。
在蔗糖存在或不存在条件下培养时表达sacB，ΔpurN ΩλPr::sacB+Ωkan的宿主细胞的生理特性见表1。
表1.在有蔗糖和没有蔗糖条件下培养时sacB+宿主细胞ΔpurN ΩλPr::sacB+的生理特性
在有或没有蔗糖下进行培养时，含和不含pDL1质粒的表达sacB(λPr::sacB+)的宿主细胞的生理特性见表2。
表2.在有或没有蔗糖下进行培养时，含和不含pDL1质粒的(λPr::sacB+)宿主细胞的生理特性
图10-11提供了证明遗传构建宿主菌株在30-37℃对蔗糖具高抗性而在42℃未观察到生长的结果。图10显示，含pPB829质粒或pPB838质粒的大肠杆菌宿主菌株ΔpurN λPr::sacB+Ωkan的第二代在蔗糖存在下于32℃生长良好。sacB基因表达被合成自两个cI质粒的cI基因产物很好的抑制了。质粒保持100％有效(相对于CatR上的对照而言)，且细胞在蔗糖存在时能存活。在42℃，cI基因产物失活。质粒不能被保持且细胞在蔗糖存在时死亡。这证明了细胞在蔗糖存在时能存活是由于存在功能性的cI质粒所致。
实施例6：显示cI质粒在整个5代内是稳定的、无抗生素选择压力、并且缺少对蔗糖抗性的自发突变体的培养条件
一旦无药物质粒产生，即在含蔗糖或Cat的新鲜液体培养基中检测它们的稳定性和跨越若干代的稳固。
图11阐释pPB829和pPB838质粒在生长细胞中的稳定性，包括在用氯霉素或蔗糖进行选择的过程中没有明显的遗传重排。即使在连续5代后仍观察到在蔗糖和氯霉素下生长之培养物中产生并保持着相当的质粒。抗生素和非抗生系统知识在质粒保持和生长细胞的选择方面而言是相当的。
图12阐释了当细胞生长于30℃时在插入亲代大肠杆菌菌株的λPr::sacB盒中没有自发突变。此观察结果清楚的证明了当细胞在蔗糖存在下生长时在所述大肠杆菌遗传背景下cI质粒的稳定性(参见图10)。用亲代菌株(缺失purN，表达sacB基因)进行此突变率实验。已显示在30℃孵育18小时后没有发生突变。在其染色体上含sacB+盒的亲代细胞克隆培养物生长于含蔗糖的LB中。在OD为1.0时收获细胞并将100μL的等分试样铺于含蔗糖的LB琼脂板上。由于sacB基因的存在引起细胞死亡，所以通过在30℃培养过夜后计算蔗糖抗性菌落来评估自发突变率。含sacB+盒但经cI质粒(pPB829或pPB838)转化的标准细胞变得对蔗糖有抗性，并且DO 1.0的培养物需要稀释5个Log后才铺(100uL)在补充有蔗糖的LB琼脂板上供计分用。在培养过夜(18小时孵育)后，用亲代细胞培养物(ΔpurNλPr::sacBΩkan)未检测到蔗糖抗性菌落，而用pPB829或pPB838质粒转化的ΔpurNλPr::sacBΩkan的5个Log稀释的培养物则生长。当细胞在37℃孵育时需要36小时来检测某些蔗糖抗性菌落(ΔpurNλPr::sacBΩkan)。
在37℃孵育36小时后自发突变以1个突变/1.3X 105个细胞的比率发生。在30℃培养过夜后于蔗糖存在下生长的细胞内cI质粒的保持是有效的，并且未检测到母本菌株生长。
实施例7：通过将第二个sacB盒(ΔedAλPr::sacBΩcat)加入前述一个sacB盒的大肠杆菌宿主菌株(ΔpurNλPr::sacBΩkan)中改善亲状大肠杆菌宿主菌株，以降低针对蔗糖的自发突变率
图8C和图9D二者阐释了含两个sacB盒的新亲代大肠杆菌宿主菌株(ΔpurN λPr::sacBΩkan ΔedA λPr::sacBΩcat)是如何设计的。
图10B-C表明了当孵育于30℃和42℃时双sacB盒大肠杆菌菌株(ΔpurN λPr::sacB+Ωkan ΔedA λPr::sacB+ΩCat)对蔗糖的存在高度敏感(无生长)，而用一个sacB盒的大肠杆菌菌株接种在即使10％蔗糖(ΔpurN λPr::sacBΩkan)上也出现了一些自发突变体。
图10C还阐释了相较于单sacB盒大肠杆菌菌株(10％终浓度)而言，双sacB盒大肠杆菌菌株所需的最低蔗糖浓度(2％终浓度)。此外，正如以低蔗糖％和最高温度诸如42℃所显示的，两个sacB盒的大肠杆菌菌株看起来对蔗糖要敏感的多。这表明了大约37℃的温度和大约2％(或稍低)的蔗糖浓度可能符合在生长细胞中保持含cI基因阻抑蛋白的质粒的最适条件。
图12B-C表明了存在两个sacB盒(而非一个)在30℃至37℃的温度范围内赋予了更稳固的对蔗糖的敏感性(最适仍在2％蔗糖)。将用含两个sacB盒的质粒转化的大肠杆菌细胞BJ5183 ΔpurNΩ λPr::sacB KmΔedaΩ λPr::sacBCat克隆#1和BJ5183 ΔpurNΩ λPr::sacB KmΔedaΩλPr::sacB Cat克隆#2以及用含一个sacB盒的质粒转化的大肠杆菌细胞BJ5183 ΔpurNΩλPr::sacB Km克隆#16和BJ5183 ΔedAΩ λPr::sacBKm克隆#11培养至OD600为大约1.0。将每种培养物大约100ul铺于含0％，2％和4％蔗糖的LB/琼脂板上(稀释度10-5)供CFU计分。将平板在30℃至37℃保温。在37℃保温用于评估2％和4％蔗糖存在下表达双sacB盒的亲代菌株的稳固。图12B-C和下文的表3-7显示，在相似温度诸如30℃和37℃下，于2至4％的蔗糖浓度范围内，大肠杆菌染色体中一个sacB盒的存在就没有那么稳固。正如此铺板检验中所证实的，当37℃保温时，最低蔗糖浓度(2％)未检测到具有两个sacB盒的大肠杆菌菌株对蔗糖的突变率，而具有一个sacB盒的大肠杆菌菌株的突变率则在3.8×10-6至5×10-5的范围内。一组独立的实验显示了当存在2％蔗糖并培养于37℃时，在两个sacB盒的大肠杆菌菌株中的突变率接近5×10-10。
表3
表4
表5
表6
表7
1*：BJ5183ΔpurNΩ λPr::sacB Km ΔedaΩλPr::sacB Cat克隆#1
2*：BJ5183ΔpurNΩ λPr::sacB Km ΔedaΩλPr::sacB Cat克隆#2
3*：BJ5183ΔpurNΩ λPr::sacB Km克隆#16
4*：BJ5183ΔedAΩ λPr::sacB Km克隆#11
实施例8：在没有抗生素选择压力下获得的质粒保持和产率(在宿主菌株中保持高拷贝数的cI质粒)
在没有抗生素选择压力(例如，存在蔗糖)或存在Cat作为对照时培养表达sacB并包含cI质粒(pPB829或pPB838)的大肠杆菌宿主细胞。
在图11中，在第2代和第5代测定质粒产率。从保持于30℃的培养物中提取质粒并进行凝胶电泳。HindII限制酶消化显示，在增殖及用Cat或蔗糖选择期间pPB829或pPB838中没有出现明显的基因重排。此外，在Cat或蔗糖选择压力下cI质粒的选择期间观察到相似的cI质粒保持。
图15A-B阐释了培养物中cI质粒(pPB829和pPB838，包含一个拷贝的sacB盒)的稳定性和效力的保持，包括在经氯霉素或蔗糖选择后没有基因重排。在蔗糖或氯霉素存在下培养时观察到有效的质粒保持和cI质粒的稳定性。而且当用pPB838或pPB829转化的亲代宿主菌株在30℃以蔗糖存在作为选择压力进行培养时，质粒产率(拷贝数)远远高于(每个细胞大约700拷贝)以Cat存在作为选择压力进行培养所获得的产率。质粒保持和产率高度有效，且拷贝数比Cat存在下培养的细胞高2倍。蔗糖存在时培养宿主细胞的这种更好的cI质粒产率归因于控制cI表达的弱启动子(P1)。事实上，在卡那霉素基因之弱启动子(P1)控制下的cI阻抑蛋白表达对质粒产率有积极影响，以更好的抵消在λPr启动子控制下的sacB基因的毒性。
如较早所证明的(参见图11A)，抗生素和非抗生素系统在含cI质粒的培养细胞的质粒保持和选择方面是相当的。图15B表明，当用pPB838或pPB829转化的亲代宿主菌株在以蔗糖存在作为选择压力下生长而非培养于以Cat存在作为选择压力的条件下时，质粒产率(拷贝数)要高得多(每个细胞大约700拷贝)。质粒保持和产率非常高效，且拷贝数比在抗生素选择譬如Cat的条件下进行培养的细胞中要高2倍。
实施例9：cI质粒中没有抗生素基因的质粒保持和产率：在一个和两个sacB盒的两种大肠杆菌菌株之间的比较分析
图15C-E阐释了在一个和两个sacB盒的两种大肠杆菌菌株(分别是ΔpurN λPr::sacB+Ωkan和ΔpurN λPr::sacB+Ωkan ΔedA λPr::sacB+Ωcat)中无cat的pPB885质粒的稳定性和产率。用无cI cat的pPB885质粒转化ΔpurNΩλPr::sacB km(一个sacB盒)和ΔpurNΩλPr::sacB km Δeda ΩλPr::sacB cat(两个sacB盒)两种亲代菌株，并在LB上培养3小时，然后接种于蔗糖平板上，随后在补充了蔗糖的LB液体生长培养基中进行培养(3代)。在补充了5％和10％蔗糖的LB中分别针对两个或一个sacB盒大肠杆菌菌株测定第3代时的质粒产率。从保持于37℃的培养物中提取PPB885质粒并进行凝胶电泳。PvuII限制酶消化表明，在增殖和用蔗糖选择期间，任一pPB885中均未出现明显的基因重排(参见图15D)。如此凝胶中所表明的，在用10％和5％的任一浓度蔗糖选择后，在分别有一个和两个sacB盒的两种大肠杆菌宿主菌株内均未出现明显的基因重排。
图15E阐释了在一个和两个sacB盒的两种大肠杆菌菌株(分别是ΔpurN λPr::sacB+Ωkan和ΔpurN λPr::sacB+Ωkan ΔedA λPr::sacB+Ωcat)中无cat的pPB885质粒的产率。有趣的是，在两个sacB盒的大肠杆菌菌株中质粒产率(拷贝数)(大约每个细胞278个拷贝)比从一个sacB盒的大肠杆菌菌株获得的质粒产率(拷贝数)(大约每个细胞142个拷贝)要高得多。在此实验中获得的质粒产率看起来低于先前的比较研究中所获得的质粒产率(参见图15B)。这主要归因于以下事实：i)在用pPB885转化后有更多的克隆需要进行评估以鉴定最好的一个，并且ii)此外，用无cat的pPB885质粒转化的两个sacB盒大肠杆菌菌株的生长条件不是最适合的培养条件。事实上，我们已证明了对此最后的菌株而言最适生长条件是大约37℃和大约2％蔗糖(或稍低)。不过，此结果表明在最适稳固条件下，在两个sacB盒大肠杆菌菌株中质粒产率较包含一个sacB盒的大肠杆菌菌株要高。
实施例10：CHO细胞中的非抗生素选择cI质粒转染
图15F和下文的表8阐释了CHO细胞中无抗生素质粒(pPB896/以蔗糖为选择压力)和抗生素质粒(pCG105/以Cat作为选择压力)的质粒转染效力(GFP表达)。在这两种选择压力(蔗糖对作为抗生素的Cat)之间观察到所表达的GFP蛋白没有明显差异。将pCG105质粒(含有处于CMV启动子控制下的GFP基因的pPB828-衍生质粒[Merial专有])和pPB896(pPB829质粒+P1::cI基因+GFP)质粒用于CHO细胞转染中，以评估无抗生素质粒设想相对于当前的抗生素质粒的功能性。用分离自含有一个sacB盒之大肠杆菌宿主菌株培养物的质粒进行此实验。用卡那霉素作为选择压力在大肠杆菌中增殖pCG105，而用10％蔗糖作为选择压力在大肠杆菌中增殖pPB896。提取DNA质粒并以相同浓度施用。
图15F阐释了利用Lipofectamine 2000瞬时转染CHO-K1细胞后由pCG105和pPB896所编码的GFP蛋白的体外表达。依照制造商的说明书用各5μg质粒和10uL Lipofectamine转染在6cm直径平板内90％汇合的CHO-K1细胞。转染后，将细胞在含1％SVF的MEM-glutamax培养基中培养24小时。收获培养物并用荧光显微术(图15G)和流式细胞术(FACS Calibur[Becton Dickinson])(表8)进行分析。
图15F显示了在两种被转染CHO-K1细胞中均可见相似的GFP表面荧光。在氯霉素和蔗糖的选择压力下pCG105和pPB96质粒能以相当的效率转染CHO-K1细胞。
表8显示了用pCG105和pPB896质粒进行CHO转染的效力。如该表中所示，当用pCG105(59％GFP表达)和pPB896(48％GFP表达)转染CHO时，测定到表达GFP蛋白质的CHO细胞有相当的％。这些结果验证了基于蔗糖的无抗生素质粒系统最终适用于CHO转染和DNA疫苗中。
表8
这些实施例证明了可通过位于质粒上的阻抑蛋白实现对位于染色体上的有毒基因的控制。该系统在无抗生素选择压力下完全是有功能的。该细胞在跨越5代的宿主细胞内是稳定的。该系统使得宿主细胞能获得每个细胞内高质粒拷贝数。该系统与最小合成培养基的使用完全兼容。
***
此处详述了本发明的优选实施方案，应当理解，由以上段落所阐释的本发明并不局限于以上描述中所提出的具体细节，因为有可能作许多显然的改变而不脱离本发明的精神或范围。
此处所引用或参考的所有文件(“此处引用文件”)和此处引用文件中引用或参考的所有文件以及有关本文中或收编于此作为参考的任何参考文件中所提及之任何产品的任何制造商的说明书、描述、产品说明书和产品清单均收编于此作为参考，且可应用于本发明的实施中。
Claims (27)
1.包含编码cI阻抑蛋白的多核苷酸的无药物质粒，其中所述多核苷酸编码序列如SEQID NO：2中所示的cI阻抑蛋白，其中所述cI阻抑蛋白的表达调节宿主中毒性基因产物的表达，并且其中所述质粒进一步包含编码免疫原或蛋白质的异源多核苷酸。
2.包含编码cI阻抑蛋白的多核苷酸的无药物质粒，其中所述多核苷酸编码序列如SEQID NO：44，46，48，50，52，54，56或58中所示的cI阻抑蛋白，其中所述cI阻抑蛋白的表达调节宿主中毒性基因产物的表达，并且其中所述质粒进一步包含编码免疫原或蛋白质的异源多核苷酸。
3.权利要求1或2的无药物质粒，其中所述多核苷酸与启动子可操作性连接。
4.权利要求3的无药物质粒，其中所述启动子是P1启动子或天然cI启动子。
5.权利要求1或2的无药物质粒，其中所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO：1，45，47，49，51，53，55，57或59中所示。
6.权利要求1的无药物质粒，其中所述异源多核苷酸与在真核或原核细胞中有功能的启动子可操作性连接。
7.权利要求6的无药物质粒，其中所述启动子是CMV启动子或分离自革兰氏阴性细菌的启动子。
8.权利要求4的无药物质粒，其中所述P1启动子由SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：83所示序列组成。
9.权利要求4的无药物质粒，其中所述天然cI启动子由SEQ ID NO：30所示序列组成。
10.包含权利要求1-9中任一项所述无药物质粒的基因工程化革兰氏阴性细菌宿主菌株，其中所述细菌宿主包含在细菌染色体的非必需区内的一个或多个异源多核苷酸，并且其中所述异源多核苷酸编码对宿主有毒的产物，以及所述异源多核苷酸包含sacB基因，并且与由SEQ ID NO：5所示序列组成的来自λ噬菌体的启动子可操作性连接。
11.权利要求10的细菌宿主菌株，其中所述sacB基因编码由SEQ ID NO：4，60，62，64，66，68，70，72，或74中所示序列组成的SacB蛋白。
12.权利要求10或11的细菌宿主菌株，其中所述非必需区包含deA基因或purN基因。
13.权利要求10或11的细菌宿主菌株，其中所述sacB基因编码由SEQ ID NO：4中所示序列组成的SacB蛋白。
14.权利要求10或11的细菌宿主菌株，其中所述细菌菌株包含由SEQ ID NO：75中所述序列组成的sacB盒的一个或多个拷贝。
15.权利要求14的细菌宿主菌株，其中所述细菌菌株包含两拷贝的SEQ ID NO：75多核苷酸，其插入在宿主染色体的deA基因和purN基因内。
16.权利要求10或11的细菌宿主菌株，其中所述细菌菌株选自禽杆菌属(Avibacterium)，布鲁氏杆菌属(Brucella)，大肠杆菌，嗜血菌属(Haemophilus)，沙门氏菌属(Salmonella)，志贺氏菌属(Shigella)，巴斯德菌属(Pasteurella)和Rimeirella。
17.权利要求16的细菌宿主菌株，其中所述细菌菌株选自猪嗜血杆菌(Haemophilussuis)，肠炎沙门氏菌(Salmonella enteridis)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis)。
18.权利要求10的细菌宿主菌株，其中所述革兰氏阴性细菌选自禽杆菌属(Avibacterium)，布鲁氏杆菌属(Brucella)，大肠杆菌，嗜血菌属(Haemophilus)，沙门氏菌属(Salmonella)，志贺氏菌属(Shigella)，巴斯德菌属(Pasteurella)和Rimeirella。
19.权利要求18的细菌宿主菌株，其中所述革兰氏阴性细菌选自猪嗜血杆菌(Haemophilus suis)，肠炎沙门氏菌(Salmonella enteridis)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis)。
20.权利要求10的细菌宿主菌株，其中所述无药物质粒包含编码cI阻抑蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸编码由SEQ ID NO：2中所示序列组成的cI阻抑蛋白。
21.权利要求10的细菌宿主菌株，其中所述无药物质粒包含编码cI阻抑蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸编码由SEQ ID NO：2，44，46，48，50，52，54，56或58中所示序列组成的cI阻抑蛋白。
22.权利要求10和20-21中任一项的细菌宿主菌株，其中所述多核苷酸与由SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：83所示序列组成的P1启动子可操作连接。
23.权利要求10和20-21中任一项的细菌宿主菌株，其中所述多核苷酸与由SEQ ID NO：30所示序列组成的天然cI启动子可操作连接。
24.权利要求20或21的细菌宿主菌株，其中所述革兰氏阴性细菌选自禽杆菌属(Avibacterium)，布鲁氏杆菌属(Brucella)，大肠杆菌，嗜血菌属(Haemophilus)，沙门氏菌属(Salmonella)，志贺氏菌属(Shigella)，巴斯德菌属(Pasteurella)和Rimeirella。
25.权利要求24的细菌宿主菌株，其中所述革兰氏阴性细菌选自猪嗜血杆菌(Haemophilus suis)，肠炎沙门氏菌(Salmonella enteridis)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis)。
26.生产权利要求1或2所述的无药物质粒的方法，包括以下步骤：
1)加工包含通过等位基因置换插入在宿主染色体的一个或多个非必需区内的异源多核苷酸的革兰氏阴性细菌宿主菌株，其中所述异源多核苷酸编码对宿主有毒的产物，并且所述异源多核苷酸包含sacB基因，与由SEQ ID NO：5所示序列组成的来自λ噬菌体的启动子可操作性连接；
2)构建包含编码cI阻抑蛋白的多核苷酸的DNA质粒；
3)用包含编码cI阻抑蛋白的基因的DNA质粒转化细菌宿主菌株；
4)在30℃至42℃的温度范围内于蔗糖存在下培养被转化的细菌宿主菌株；并
5)回收DNA质粒。
27.生产蛋白质或免疫原的方法，包括以下步骤：
1)加工包含通过等位基因置换而插入在宿主染色体的一个或多个非必需区内的异源多核苷酸的革兰氏阴性细菌宿主菌株，其中所述异源多核苷酸编码对宿主有毒的产物，并且所述异源多核苷酸包含sacB基因，与由SEQ ID NO：5所示序列组成的来自λ噬菌体的启动子可操作性连接；
2)构建权利要求1或2所述的包含编码cI阻抑蛋白的多核苷酸和编码免疫原或蛋白质的基因的DNA质粒；
3)用包含编码cI阻抑蛋白的多核苷酸和编码免疫原或蛋白质的基因的所述DNA质粒转化该细菌宿主菌株；
4)在30℃至42℃的温度范围内于蔗糖存在下培养被转化的细菌宿主菌株；并
5)回收所述免疫原或蛋白质。
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|---|---|---|---|
| US18075509P | 2009-05-22 | 2009-05-22 | |
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|---|---|---|---|---|
| US6306639B1 (en) * | 1997-02-19 | 2001-10-23 | Enol Energy Inc. | Genetically modified cyanobacteria for the production of ethanol, the constructs and method thereof |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6306639B1 (en) * | 1997-02-19 | 2001-10-23 | Enol Energy Inc. | Genetically modified cyanobacteria for the production of ethanol, the constructs and method thereof |
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| Title |
|---|
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