ES2975070T3 - Vector de ADN de terapia génica VTvaf17, método de producción; cepa de Escherichia coli SCS110-AF, método de producción; vector de ADN de terapia génica VTvaf17 que porta la cepa de Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17, método de producción - Google Patents
Vector de ADN de terapia génica VTvaf17, método de producción; cepa de Escherichia coli SCS110-AF, método de producción; vector de ADN de terapia génica VTvaf17 que porta la cepa de Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17, método de producción Download PDFInfo
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Abstract
La invención hace referencia a la ingeniería genética y puede ser utilizada en biotecnología, medicina y agricultura. Esta invención requiere la construcción del vector de ADN de terapia génica VTvaf17 de 3165 pb para la modificación genética de células animales y humanas que contienen la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1. El método de construcción del vector de ADN de terapia génica VTvaf17 de 3165 pb implica, en primer lugar, construir un Vector de 4182 pb que contiene una región promotora de 1188 pb del factor de elongación humano EF1A con un potenciador intrínseco, un polienlazador de 35 pb con sitios para endonucleasas de restricción BamHI, EcoRV, Sail, Hindll, Kpnl, EcoRI, un terminador de transcripción de 466 pb y una secuencia de poliadenilación del factor de crecimiento humano, un elemento regulador de 136 pb RNA-OUT del transposón Tn10 que permite la selección positiva sin antibióticos, un origen de replicación de 1299 pb para una replicación autónoma con una sustitución de un solo nucleótido para aumentar la producción de vectores en en las células de la mayoría de las cepas de Escherichia coli, un gen de resistencia a la kanamicina de 1010 pb, y luego se escinde mediante los sitios de restricción Spel y el fragmento restante se liga a sí mismo. El objetivo especificado se logra obteniendo la cepa SCS110-AF de Escherichia coli para la producción del vector de ADN de terapia génica VTvaf17 o vectores de ADN de terapia génica basados en él que permiten una selección positiva sin antibióticos. El método de obtención de la cepa SCS110-AF de Escherichia coli para la producción del vector de ADN de terapia génica VTvaf17 o vectores de ADN de terapia génica basados en él implica la construcción de un fragmento de ADN lineal de 64 pb que contiene el elemento regulador ARN-IN del transposón Tn10 que permite la administración de antibióticos. selección positiva libre, gen sacB de levansucrasa de 1422 pb cuyo producto asegura la selección dentro de un medio que contiene sacarosa, gen catR de resistencia al cloranfenicol de 763 pb necesario para la selección de clones de cepas en los que se produce la recombinación homóloga, y dos secuencias homólogas, 329- pb y 233 pb, asegurando la recombinación homóloga en la región del gen recA concurrente con la inactivación del gen, y luego las células de Escherichia coli se transforman mediante electroporación y se seleccionan los clones que sobreviven en un medio que contiene 10 μg/ml de cloranfenicol. La cepa de Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17 (registrada en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales con el número B-12990, AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL No. NCIMB 42801) que porta el vector de ADN de terapia génica VTvaf17 también está construida para su desarrollo posterior, lo que permite el uso sin antibióticos. selección. El método para obtener la cepa de Escherichia coli SCS110-AFA/Tvaf17 (registrada en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales con el número B-12990, AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL No. NCIMB 42801) que porta el vector de ADN de terapia génica VTvaf17 implica producir células electrocompetentes de la cepa de Escherichia coli. SCS110-AF y someter estas células a electroporación con el vector de ADN de terapia génica VTvaf17. Después,las células se vierten en placas de agar (placas de Petri) con un medio selectivo que contiene levadura, peptona, sacarosa al 6% y 10 μg/ml de cloranfenicol. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Vector de ADN de terapia génica VTvaf17, método de producción; cepa deEscherichia coliSCS110-AF, método de producción; vector de ADN de terapia génica VTvaf17 que porta la cepa deEscherichia coliSCS110-AF/VTvaf17, método de producción
Campo de la invención
La invención se refiere a la ingeniería genética y puede utilizarse en biotecnología, medicina y agricultura para la fabricación de productos de terapia génica. Es decir, el vector de ADN de terapia génica producido que contiene el gen diana se puede administrar a las células de seres humanos y animales que experimentan una expresión reducida o insuficiente de ese gen, asegurando así el efecto terapéutico deseado.
Antecedentes de la invención
La terapia génica es un enfoque innovador en medicina destinado a tratar enfermedades hereditarias y adquiridas mediante la administración de nuevo material genético a las células de un paciente para compensar o suprimir la función de un gen mutante y/o tratar un trastorno genético.
Los transportadores de material genético (vectores de terapia génica) se dividen en vectores virales y no virales. Los vectores virales más eficientes incluyen retrovirus, lentivirus, virus adenoasociados (AAV), herpesvirus, poxvirus y adenovirus (Lukashev AN, Zamyatnin AA Jr. Vectores virales para terapia génica: Current State and Clinical Perspectives. Biochemistry (Mosc). 2016. 81:700-708.). La administración no viral de material genético involucra principalmente plásmidos que portan un gen terapéutico y se combinan con varios transportadores como lípidos, polímeros catiónicos, dendrímeros, polipéptidos y nanopartículas (Mintzer MA, Simanek EE. Nonviral vectors for gene delivery. Chem Rev. 2009. 109:259-302).
A pesar de que un virus es, por naturaleza, un agente casi ideal para la introducción de ADN recombinante en la célula, en términos de velocidad y eficacia, existen algunas limitaciones prácticas para el uso de sistemas de administración viral. Éstas incluyen desafíos de fabricación, falta de selectividad, respuesta inmunitaria, posibles riesgos cancerígenos así como inflamación después de la transducción. Algunos de estos problemas aún no se han resuelto. Ésta es la razón por la que últimamente la terapia génica ha prestado cada vez más atención al desarrollo de sistemas de administración de genes no virales.
El plásmido es un ADN circular extracromosómico que se replica de forma autónoma. Los plásmidos pueden contener genes de resistencia a antibióticos, iones de metales pesados y genes que controlan el catabolismo de algunos compuestos orgánicos. Lipps G. (editor). (2008). Plasmids: Current Research and Future Trends. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-35-6). Como elementos genéticos móviles, los plásmidos son capaces de transmitirse de una célula bacteriana a otra por conjugación, facilitando así la transferencia horizontal de genes.
Los plásmidos están libres de las limitaciones inherentes a los vectores virales. En la célula diana, existen como un episoma sin integrarse en el genoma, mientras que producirlos es bastante barato y no hay respuesta inmunitaria ni efectos secundarios causados por la administración de plásmidos, lo que los convierte en una herramienta conveniente para la terapia génica (transferencia de genes terapéuticos) y prevención de enfermedades genéticas (vacunación con ADN) (Li L, Petrovsky N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Rev Vaccines.
2016;15(3):313-29).
Además de ser un medio de administración bastante prometedor en terapia génica, los plásmidos han sido fundamentales durante mucho tiempo en laboratorios especializados en biología molecular y otras biotecnologías, y se han aplicado con éxito en la clonación molecular y el desarrollo de proteínas recombinantes (Russell, David W.; Sambrook, Joseph (2001), Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y; Cold Spring Harbor Laboratory)
A pesar de las perspectivas obvias de la terapia génica, una limitación crítica para el uso de plásmidos como agentes terapéuticos es que contienen: i) genes de resistencia a los antibióticos para el desarrollo de construcciones en cepas portadoras, ii) varios elementos reguladores representados por secuencias de genomas virales. Otra limitación es el tamaño de los plásmidos terapéuticos, que determina la eficacia de la administración del vector a la célula diana.
Es bien sabido que en los últimos años el mundo entero ha sido testigo de una resistencia cada vez mayor de los agentes infecciosos a los fármacos antimicrobianos. El desarrollo de resistencia a los antimicrobianos es una respuesta biológica natural a los antibióticos, que provocan una presión selectiva que facilita la selección, supervivencia y crecimiento de cepas resistentes de microorganismos. La resistencia a los antibióticos es de gran importancia social y económica y se considera una amenaza para la seguridad nacional (MacPherson D.W., Gushulak B.D., Baine W.B., Bala S., Gubbins P.O., Holtom P., Segarra-Newnham M. 2009. Population mobility, globalization, and antimicrobial drug resistance. Emerg Infect Dis 15:1727-1732). Son los plásmidos los que garantizan la transferencia horizontal de genes, incluidos los genes de resistencia a los antibióticos, dentro de una micropoblación, lo que les confiere una ventaja selectiva. Por lo tanto, el crecimiento de agentes infecciosos humanos resistentes a los antibióticos actuales se atribuye a la transferencia horizontal de genes. Ramírez MS, Traglia GM, Lin DL, Tran T, Tolmasky ME. Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance and Virulence in Gram-Negatives: the Klebsiella pneumoniae Paradigm. Microbiol Spectr. 2014 (5).
Por este motivo, la Agencia Europea de Medicamentos considera necesario abstenerse de añadir genes marcadores de resistencia a los antibióticos a los plásmidos de nueva ingeniería para terapia génica (Documento de reflexión sobre modificaciones de diseño de medicamentos de terapia génica durante el desarrollo / 14 de diciembre de 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Comité de terapias avanzadas).
Una limitación más importante para el uso de vectores plasmídicos terapéuticos es que contienen elementos reguladores para aumentar la expresión de genes diana (promotores, potenciadores, elementos reguladores postraduccionales), que están representados principalmente por secuencias de nucleótidos de genomas de varios virus (Borrador Directriz sobre la calidad, aspectos clínicos y no clínicos de los medicamentos de terapia génica. http://www.ema.europa.eu/docs/en GB/documentlibrary/Sci ent¡ficgu¡del¡ne/2015/05/WC500187020.pdf).
Otra desventaja de los vectores plasmídicos existentes para terapia génica es su tamaño (longitud). Se sabe que cuanto mayor es la longitud del plásmido, menos eficazmente penetra en la célula diana. Los plásmidos existentes a menudo tienen sitios innecesarios y no funcionales que aumentan considerablemente su longitud (Mairhofer J, Grabherr R. Rational vector design for efficient non-viral gene delivery: challenges facing the use of plasmid DNA. Mol Biotechnol. 2008.39(2):97-104).
Se conoce un método para acumular plásmidos en cepas deEscherichia colisin utilizar antibióticos (Cranenburgh RM, Hanak JA, Williams SG, Sherratt DJ. Escherichia coli strains that allow antibiotic-free plasmid selection and maintenance by repressor titration. Nucleic Acids Res. 2001. 29(5):E26). Se construyeron las cepas DH1lacdapD y DH1lacP2dapD deEscherichia coli,donde el gen dapD, que codifica la enzima 2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato-N-succiniltransferasa involucrada en la biosíntesis de L-lisina, está controlado por el promotor lac. En ausencia del inductor IPTG (isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido), estas cepas se someten a lisis. Sin embargo, la administración del plásmido multicopia pORT que contiene el operón lac induce la expresión del gen dapD y, por lo tanto, los clones transformados pueden recogerse y reproducirse. Estas cepas, sin embargo, se caracterizan por niveles bajos e inestabilidad de transformación.
Además, se conoce un método para construir cepas deEscherichia colipara el desarrollo de plásmidos en un sistema de selección de plásmidos sin antibióticos (Mairhofer J, Pfaffenzeller I, Merz D, Grabherr R. A novel antibiotic free plasmid selection system: advances in safe and efficient DNA therapy. Biotechnol J. 2008. 3(1):83-89). Las cepas bacterianas seleccionadas (por ejemplo, DG5a, JM109, MG1655) se modificaron de tal manera que el ARN I inhibidor de la replicación del plásmido pudiera suprimir la traducción de genes esenciales para la actividad bacteriana (por ejemplo, murA que codifica la enzimaUDP-N-acetilglucosamina 1-carboxivinil-transferasa implicada en la biosíntesis del peptidoglicano de la pared celular bacteriana) mediante la formación de un dúplex de ARN/ARN antisentido. El gen murA estaba controlado por la proteína represora tetR y sólo podía expresarse en presencia del plásmido portador del ARN I construido. Sin embargo, se descubrió que la adición de IPTG daría como resultado la producción de colonias de Escherichia coli.libres del vector plasmídico objetivo. El mecanismo de inhibición de la selección sigue siendo desconocido.
Asimismo, se conoce un método para construir vectores de la mínima longitud. Se diseñó una pequeña molécula de ADN superenrollada que carece de todas las secuencias de nucleótidos procarióticos y sólo contiene orígenes de replicación y el gen de resistencia a los antibióticos (el llamado "minicírculo"). El vector se produjo mediante integración intramolecular mediada por integrasa utilizando el fago cpC31 (Chen ZY, He CY, Ehrhardt A, Kay MA. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Mol Ther. 2003.
8(3):495-500). Las desventajas de tales vectores plasmídicos incluyen la complejidad de su producción y la imposibilidad de construirlos a escala industrial.
Una invención se informa en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2011152377/10 que describe la preparación de una construcción de expresión sin resistencia a los antibióticos que contiene un polinucleótido que codifica la proteína represora. La expresión de dicha proteína represora regula la expresión del producto génico tóxico integrado en la región del genoma de E. coli. Sin embargo, como cualquier otro método de selección basado en el uso de proteínas represoras, este método se caracteriza por una transformación inestable e ineficaz.
Kulemzin SV et al. (Modular lentiviral vector system for chimeric antigen receptor design optimization, Russian Journal of Bioorganic Chemistry 2017. 43(2):107-114) informan sobre el desarrollo de una colección de construcciones de vectores lentivirales que, según se dice, permiten la producción y el ensayo en poco tiempo de diferentes variantes de CAR.
Curtin JA et al. (Bidirectional promoter interference between two widely used internal heterologus promoters in a lategeneration lentiviral construct, Gene Therapy 2008. 15:384-390) demuestran una interferencia de promotor entre dos promotores heterólogos internos en el contexto de un vector lentiviral de última generación.
La patente n.° US9644211 describe un método para producir un vector de la mínima longitud ("minicírculo"). Este vector no contiene procariotas y se produce mediante recombinación mediada por parA en una cepa cultivada de E. coli. La desventaja de este método de producción del vector más corto es la imposibilidad de utilizarlo a escala industrial.
El prototipo de esta invención en términos del uso de vectores de ADN recombinante para terapia génica es el método de producción de un vector recombinante para inmunización genética (patente de Estados Unidos n.° 9550998). El vector plasmídico es un vector de ADN plasmídico superenrollado que se utiliza para la expresión de genes clonados en células humanas y animales. El vector contiene un origen de replicación, elementos reguladores que comprenden el promotor y potenciador del citomegalovirus humano y secuencias reguladoras del virus linfotrópico de linfocitos T humanos.
El vector se acumula en una cepa específica de E. coli libre de antibióticos mediante complementación antisentido del gen sacB administrado en la cepa mediante un bacteriófago. El uso de este vector de ADN en terapia génica está limitado por la presencia de secuencias reguladoras de genomas virales.
Divulgación de la invención
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
El propósito de esta invención es construir un vector de ADN de terapia génica para la modificación genética de células humanas y animales, que combinaría razonablemente lo siguiente:
I) posibilidad de uso seguro en terapia génica de seres humanos y animales debido a la ausencia de genes de resistencia a antibióticos en el vector de ADN de terapia génica;
II) longitud que garantiza el suministro eficaz de genes a la célula diana;
III) presencia de elementos reguladores que garantizan la expresión eficaz de los genes diana sin estar representados por secuencias de nucleótidos de genomas virales;
IV) producibilidad y constructibilidad a escala industrial.
El punto I es fundamental y se proporciona en el presente documento de conformidad con los requisitos de los reguladores estatales para medicamentos de terapia génica y, específicamente, el requisito de la Agencia Europea de Medicamentos de abstenerse de añadir genes marcadores de resistencia a los antibióticos a los plásmidos de nueva ingeniería para terapia génica (Documento de reflexión sobre modificaciones de diseño de medicamentos de terapia génica durante el desarrollo / 14 de diciembre de 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Comité de terapias avanzadas).
El propósito especificado se logra construyendo primero un vector de ADN de terapia génica bicatenario circular de 3165 pb (también designado en el presente documento como VTvaf17) para la modificación genética de células animales y humanas que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID N.° 1. El método de construcción de un vector de ADN de terapia génica bicatenario circular de 3165 pb que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID N.° 1 (también designada en el presente documento como VTvaf17) implica, en primer lugar, construir un vector de 4182 pb en la siguiente etapa que contiene un región promotora de 1188 pb del factor de elongación humano EF1A con un potenciador intrínseco, un polienlazador de 35 pb con sitios para las endonucleasas de restricción BamHI, EcoRV, Sall, Hindll, Kpnl, EcoRl, un terminador de transcripción de 466 pb y una secuencia de poliadenilación del factor de crecimiento humano, un elemento regulador ARN-OUT de 136 pb del transposón Tn10 que permite la selección positiva sin antibióticos, un origen de replicación de 1299 pb para la replicación autónoma con una sustitución de un solo nucleótido para aumentar la producción de vectores en las células de la mayoría de las cepas deEscherichia coli,un gen de resistencia a la kanamicina de 1010 pb, y luego se escinde mediante sitios de restricción Spel y el fragmento restante se liga a sí mismo. El propósito especificado se logra mediante la obtención de la cepa deEscherichia coliSCS110-AF para la producción de un vector de ADN de terapia génica bicatenario circular de 3165 pb que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID N.° 1 (también designada en el presente documento como VTvaf17) o vectores de ADN de terapia génica basados en él que permiten la selección positiva sin antibióticos, obtenibles mediante el siguiente método. Dicho método de obtención de la cepa deEscherichia coliSCS 110-AF para la producción de un vector de ADN de terapia génica bicatenario circular de 3165 pb que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID N.° 1 (también designada en el presente documento como VTvafl7) o vectores de ADN de terapia génica basados en él implica la construcción de un fragmento de ADN lineal que contiene el elemento regulador ARN-IN de 64 pb del transposón Tn10 que permite la selección positiva sin antibióticos, gen de levansucrasasacBde 1422 pb cuyo producto garantiza la selección dentro de un medio que contiene sacarosa, gen de resistencia al cloranfenicolcatRde 763 pb necesario para seleccionar clones de cepas en las que se produce recombinación homóloga, y dos secuencias homólogas, de 329 pb y 233 pb, que garantizan la recombinación homóloga en la región del genrecAsimultáneamente con la inactivación del gen, y luego las cepas deEscherichia colise transforman mediante electroporación y se seleccionan los clones que sobreviven en un medio que contiene 10 pg/ml de cloranfenicol. La cepa deEscherichia coliSCS110-AF/VTvaf17 (registrada en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales con el número B-12990, AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL N.° NCIMB 42801) que porta un vector de ADN de terapia génica bicatenario circular de 3165 pb que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID N.° 1 (también designado en el presente documento como VTvaf17) también se construye para su desarrollo posterior que permite la selección sin antibióticos. El método de obtención de la cepa deEscherichia coliSCS110-AF/VTvaf17 (registrada en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales con el número B-12990, AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL N.° NCIMB 42801) que porta un vector de ADN de terapia génica bicatenario circular de 3165 pb que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID N.° 1 (también designado en el presente documento como VTvaf17) implica producir células electrocompetentes de la cepa deEscherichia coliSCS110-AF y someter estas células a electroporación con el vector de ADN de terapia génica bicatenario circular de 3165 pb que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID N.° 1 (también designado en el presente documento como VTvafl7). Después de eso, las células se vierten en placas de agar (placas de Petri) con un medio selectivo que contiene levadura, peptona, sacarosa al 6 % y 10 pg/ml de cloranfenicol.
La esencia de la invención se explica en los dibujos, donde
la Figura 1 muestra la estructura del vector de ADN de terapia génica VTvaf17, que es una molécula de ADN bicatenario circular de 3165 pb capaz de replicarse de forma autónoma en células deEscherichia coli.
La Figura 1 marca los siguientes elementos estructurales del vector:
(1) EF1a (1 a 1188 pb): la región promotora del factor de elongación humano EF1A con un potenciador intrínseco contenido en el primer intrón del gen. Garantiza una transcripción eficaz del gen recombinante en la mayoría de los tejidos humanos.
(2) MCS (1208 a 1243 pb) - el polienlazador (sitio de clonación múltiple) que contiene una secuencia de enzimas de restricción BamHl, EcoRV, Sall, Hindll, Kpnl y EcoRI y permite clonar los genes terapéuticos diana.
(3) hGH-TA (1244 a 1710 pb) - el terminador de la transcripción y la secuencia de poliadenilación del gen del factor de crecimiento humano.
(4) ARN-out (1717 a 1853 pb) - el elemento regulador ARN-OUT del transposón Tn 10 que permite la selección positiva sin antibióticos en caso de utilizar la cepa deEscherichia coliSCS 110.
(5) ori (1866 a 3165 pb) - el origen de la replicación para la replicación autónoma con una sustitución de un solo nucleótido para aumentar la producción de plásmidos en las células de la mayoría de las cepas deEscherichia coli.
La Figura 2 muestra la estructura del fragmento de ADN para la recombinación homóloga en la región del genrecAdeEscherichia colipara producir la cepa deEscherichia coliSCS 110.
El fragmento lineal consta de un casete que porta el elemento regulador ARN-IN del transposón Tn10 para la selección sin antibióticos (64 pb), el gen de la levansucrasa sacB, cuyo producto garantiza la selección dentro de un medio que contiene sacarosa (1422 pb) y el gen de resistencia al cloranfenicolcatRrequerido para la selección de clones de cepas en las que se produjo recombinación homóloga (763 pb). El casete está flanqueado por dos brazos de homología que aseguran el proceso de recombinación en la región del genrecAcon inactivación genética concurrente (329 pb y 233 pb para el brazo izquierdo y para el brazo derecho, respectivamente).
La Figura 3 muestra microimágenes de fluorescencia del cultivo de células HEK-293 48 horas después de la transfección de las células con el vector plasmídico pEFGP-C1 (Clontech) y el vector de ADN VTvaf17-eGFP (A), y un diagrama de la fluorescencia emitida por la proteína extraída de células HEK-293 48 horas después de la transfección de las células con el vector plasmídico pEFGP-C1 (Clontech) y el vector de ADN VTvaf17-eGFP (B) con el fin de comparar los niveles de acumulación del producto del gen diana, p. ej., proteína verde fluorescente (GFP), en las células HEK-29348 horas después de la transfección de las células con el vector plasmídico pEFGP-C1 (Clontech) y el vector de ADN VTvaf17-eGFP.
La Figura 4 muestra los patrones de acumulación de ARNm del gen de la elastina en células de queratinocitos HaCaT antes de la transfección y 48 horas después de la transfección de estas células con el vector de ADN VTvaf17-ELN que porta una región codificante del gen de la elastina humana con el fin de analizar los cambios en la acumulación del ARNm del gen diana, p. ej., ARNm del gen de la elastina, en células de queratinocitos HaCaT antes de la transfección y 48 horas después de la transfección de estas células con el vector de ADN VTvaf17-ELN que porta una región codificante del gen de la elastina humana.
La Figura 5 muestra el gráfico de la concentración de proteína elastina en muestras de biopsia de piel de tres pacientes después de la inyección en la piel de estos pacientes del vector de ADN de terapia génica vTvaf17-ELN que porta una región codificante del gen de la elastina humana con el fin de analizar los cambios en las concentraciones de proteína elastina en la piel humana tras la administración en la piel humana del vector de ADN de terapia génica vTvaf17 que porta el gen diana, p. ej., el gen de la elastina humana.
La Figura 6 muestra un gráfico de los cambios en la concentración de proteína verde fluorescente (GFP) en células de riñón bovino MDBK 48 horas después de la transfección celular con el vector de ADN VTvaf17 y el vector de ADN VTvaf17-eGFP que porta una región codificante de proteína verde fluorescente con el fin de comparar los niveles de acumulación del producto del gen diana, p. ej., proteína verde fluorescente (GFP), en células de riñón bovino MDBK 48 horas después de la transfección celular con el vector de ADN VTvaf17 y el vector de ADN VTvaf17-eGFP que porta una región codificante de proteína verde fluorescente.
Realización de la invención
La esencia de la invención se explica en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1.
Producción del vector de ADN de terapia génica VTvaf17 que contiene el promotor del gen del factor de elongación humano EF1A con un potenciador intrínseco, un polienlazador, un terminador de la transcripción y una secuencia de poliadenilación del factor de crecimiento humano, el elemento regulador ARN-OUT del transposón Tn10 y un origen de replicación con una sustitución de un solo nucleótido para aumentar la producción de plásmido.
El vector de ADN de terapia génica VTvaf17 se construyó mediante la consolidación de seis fragmentos de ADN derivados de diferentes fuentes:
(a) el origen de replicación se produjo mediante amplificación por PCR de una región del plásmido pBR322 disponible comercialmente con una mutación puntual utilizando los oligonucleótidos Ori-F, Ori-R, Ori-M1 y Ori-M2 (Lista de secuencias, (1)-(4));
(b) la región promotora EF1a se produjo mediante amplificación por PCR de un sitio de ADN genómico humano usando los oligonucleótidos EF1-F y EF1-R (Lista de secuencias, (5) y (6));
(c) el terminador de transcripción hGH-TA se produjo mediante amplificación por PCR de un sitio de ADN genómico humano usando los oligonucleótidos hGH-F y hGH-R (Lista de secuencias, (7) y (8));
(d) el sitio regulador ARN-OUT del transposón Tn10 se sintetizó a partir de los oligonucleótidos RO-F, RO-R, RO-1, RO-2 y RO-3 (Lista de secuencias, (9) -(13));
(e) el gen de resistencia a la kanamicina se produjo mediante amplificación por PCR de un sitio del plásmido pET-28 disponible comercialmente usando los oligonucleótidos Kan-F y Kan-R (Lista de secuencias, (14) y (15)); (f) el polienlazador se produjo hibridando dos oligonucleótidos sintéticos MCS1 y MCS2 (Lista de secuencias, (15) y (16)).
La amplificación por PCR se realizó utilizando el kit de ADN Polimerasa de alta fidelidad Phusion® disponible comercialmente (New England Biolabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos tienen regiones superpuestas que permiten su consolidación con una posterior amplificación por PCR. Los fragmentos (a) y (b) se consolidaron utilizando los oligonucleótidos Ori-F y EF1-R (Lista de secuencias, (1) y (6)) y los fragmentos (c), (d) y (e) se consolidaron utilizando los oligonucleótidos hGH-F y Kan-R (Lista de secuencias, (7) y (15)). Posteriormente, los sitios producidos se consolidaron mediante restricción con posterior ligación mediante los sitios BamHI y Ncol. Esto dio como resultado un plásmido todavía desprovisto del polienlazador. Para introducirlo, el plásmido se escindió por los sitios BamHI y EcoRI seguido de ligación con el fragmento (f). Por lo tanto, se construyó un vector de 4182 pb que porta el gen de resistencia a la kanamicina flanqueado por sitios de restricción Spel. Luego, este sitio se escindió mediante sitios de restricción de Spel y el fragmento restante se ligó a sí mismo. Esto dio como resultado un vector de ADN de terapia génica de 3165 pb, VTvaf17, que es recombinante y permite la selección sin antibióticos (SEQ ID N.° 1).
Ejemplo 2.
Para demostrar la eficacia del vector de ADN VTvaf17, el gen diana, p. ej., el gen de la proteína verde fluorescente (GFP), se clonó en el polienlazador.
Producción del vector de ADN de terapia génica VTvaf17-eGFP que porta un sitio que codifica el gen diana, p. ej., el gen que codifica la proteína verde fluorescente (GFP). La región codificante del gen de la proteína verde fluorescente se produjo mediante amplificación por PCR del plásmido pEGFP-C1 (Clontech) disponible comercialmente utilizando los oligonucleótidos MVGFP-F y M<v>GFP-R (Lista de secuencias, (30) y (31)). El fragmento de PCR producido se escindió mediante las endonucleasas de restricción BamHI y EcoRl, se ligó con un vector de ADN de 4182 pb que porta el gen de resistencia a la kanamicina y se escindió mediante las mismas enzimas. Además, se eliminó el gen de resistencia a la kanamicina del vector producido, como se describe en el Ejemplo 1. Esto dio como resultado un vector de ADN de 3874 pb, VTvaf17-eGFP, que permite la selección sin antibióticos.
Ejemplo 3.
Para demostrar la eficacia del vector de ADN VTvaf17, el gen diana, p. ej., el gen que codifica la elastina humana, se clonó en el polienlazador.
Producción del vector de ADN VTvaf17-ELN que porta una región que codifica el gen diana, p. ej., el gen que codifica la elastina humana. La región codificante de 2175 pb de longitud del gen de la elastina (SEQ ID N.° 2) se produjo extrayendo ARN total de la muestra de biopsia de piel del paciente con posterior transcripción inversa y amplificación por PCR. El material se tomó de piel intacta en la zona del antebrazo, utilizando el dispositivo de biopsia de piel Epitheasy 3.5 (Medax SRL). La piel del paciente se lavó preliminarmente con solución salina estéril y se anestesió con una solución de lidocaína. El tamaño de la muestra de la biopsia era de aprox. 2x2x2 mm y el peso era de hasta 20 mg. La muestra se colocó en 1 ml de reactivo Trizol (ThermoFisher Scientific), se homogeneizó y se calentó durante 5 minutos a 65 °C. La muestra se centrifugó a 14.000 g durante 10 minutos y se calentó nuevamente durante 10 minutos a 65 °C. A continuación, se añadieron 200 μl de cloroformo y la mezcla se agitó suavemente y se centrifugó a 14.000 g durante 10 minutos. Luego, la fase acuosa se aisló y se mezcló con 1/10 del volumen de acetato de sodio 3 M, pH 5,2, y un volumen igual de alcohol isopropílico. La muestra se incubó a -20 °C durante 10 minutos y luego se centrifugó a 14.000 g durante 10 minutos. Las células empaquetadas se enjuagaron en 1 ml de alcohol etílico al 70 %, se secaron al aire y se disolvieron en 10 j l de agua libre de RNasa. Para sintetizar la primera hebra de ADNc del gen de la elastina humana, se utilizó la transcriptasa inversa Mint (Evrogen, Rusia). Se añadieron 4 j l de tampón Mint, 2 j l de ditiotreitol, 2 j l de mezcla de dNTP, 2 j l de cada uno de los oligonucleótidos ELN-F y ELN-R (Lista de secuencias, (32) y (33)) y 2 j l de transcriptasa inversa Mint a 6 j l de ARN total, y la mezcla se incubó a 42 °C durante 2 horas. El ADNc sintetizado se utilizó como matriz en la amplificación por PCR utilizando los oligonucleótidos ELN-F y ELN-R (Lista de secuencias, (32) y (33)), que se realizó a 94 °C durante 3 minutos; 30 ciclos: a 94 °C durante 20 segundos, a 60 °C durante 20 segundos y a 72 °C durante 60 segundos, con elongación final a 72 °C durante 5 minutos. El fragmento de PCR producido se escindió mediante las endonucleasas de restricción BamHI y EcoRl, se ligó con un vector de 4182 pb que porta el gen de resistencia a la kanamicina y se escindió mediante las mismas enzimas. Además, se eliminó el gen de resistencia a la kanamicina del vector producido, como se describe en el Ejemplo 1. Esto dio como resultado un vector de ADN de terapia génica de 5322 pb, VTvaf17-ELN, que porta una región que codifica el gen de la elastina y permite la selección sin antibióticos.
Ejemplo 4.
Ingeniería de la cepa deEscherichia coliSCS 110-AF para la producción del vector de ADN de terapia génica VTvaf17 y vectores de terapia génica basados en él.
La cepa deEscherichia coliSCS 110-AF para la ingeniería del vector de ADN de terapia génica VTvaf17 y los vectores de terapia génica basados en él se produjo mediante recombinación homóloga mediante la administración a su cromosoma, específicamente a la región del genrecAdel fragmento lineal que contiene el elemento regulador ARN-IN del transposón Tn10 que permite la selección positiva sin antibióticos (64 pb), gen de la levansucrasa sacB cuyo producto garantiza la selección dentro de un medio que contiene sacarosa (1422 pb), gen de resistencia al cloranfenicolcatRrequerido para la selección de clones de cepas en las que se produjo la recombinación homóloga (763 pb), y dos secuencias homólogas (brazos de homología) que garantizan la recombinación homóloga en la región del genrecAconcurrente con la inactivación del gen (329 pb y 233 pb para el brazo izquierdo y para el brazo derecho, respectivamente).
Para sintetizar los brazos homológicos izquierdo y derecho, se sometieron a amplificación por PCR fragmentos del genrecAutilizando como matriz el ADN genómico deEscherichia coliSCS 110 (Agilent Technologies). Para sintetizar el brazo de homología izquierdo, se utilizaron los cebadores LHA-F y LHA-R (Lista de secuencias, (18) y (19)), mientras que para sintetizar los cebadores del brazo de homología derecho, se utilizaron RHA-F y RHA-R (Lista de secuencias, (28) y (29)). El fragmento de ARN-IN tenía una cola con oligonucleótidos sintéticos lN-F, IN-1, IN-2, IN-R (Lista de secuencias, (20), (21), (22), (23)). El gensacBse produjo mediante amplificación por PCR utilizando el ADN genómicoB.subtilis168HT como matriz, y SacB-F y SacB-R como cebadores (Lista de secuencias, (24) y (25)). Para sintetizar el gencatR,se realizó una amplificación por PCR utilizando la cepa deEscherichia coliBL21 pLysS como matriz, y CatR-F y CatR-R (Lista de secuencias, (26) y (27)) como cebadores. Los productos de p Cr LHA (el brazo de homología izquierdo), SacB y RHA (el brazo de homología derecho) se amplificaron a 94 °C durante 3 minutos; 30 ciclos: a 94 °C durante 20 segundos, a 60 °C durante 20 segundos y a 72 °C durante 60 segundos, con elongación final a 72 °C durante 5 minutos. El producto de PCR ARN-IN se sintetizó a 94 °C durante 3 minutos; 30 ciclos: a 94 °C durante 10 segundos, a 60 °C durante 10 segundos y a 72 °C durante 10 segundos, utilizando los oligonucleótidos IN-F, IN-1, IN-2, IN-R (Lista de Secuencias, ( 20), (21), (22), (23)) para el ensamblaje del fragmento. Para ello, se utilizaron 10 jM de los cebadores IN-F e IN-R, y 5 jM de los cebadores IN-1 e IN-2. La amplificación por PCR se realizó utilizando el kit de ADN Polimerasa de alta fidelidad Phusion® disponible comercialmente (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El fragmento lineal para la recombinación homóloga se sintetizó consolidando cinco productos de PCR. Los cinco productos tenían áreas superpuestas que permitían el ensamblaje posterior en un solo fragmento. Todos los fragmentos se mezclaron en alícuotas de 10 ng en un volumen de 50 jl. El producto de la PCR se derivó a 94 °C durante 3 minutos; 10 ciclos: a 94 °C durante 30 segundos, a 60 °C durante 30 segundos y a 72 °C durante 2 minutos, sin añadir cebadores. A continuación, se añadieron los cebadores LHA-F, RHA-R (Lista de Secuencias, (18), (19)) y se realizaron 25 ciclos de PCR más: a 94 °C durante 30 segundos, a 60 °C durante 30 segundos y a 72 °C durante 2 minutos, con elongación final a 72 °C durante 5 minutos. Esto dio como resultado un fragmento de PCR de 2811 pb de longitud que tiene la siguiente estructura: LHA-RNA-IN-SacB-CatR-RHA. Este fragmento se recuperó de forma preparativa de gel de agarosa utilizando el kit de elución de ADN (BioSilica, Rusia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para sintetizar la cepa deEscherichia coliSCS 110-AF, se prepararon células electrocompetentes. Para ello, se usó una sola colonia de la cepa deEscherichia coliSCS 110 (Agilent Technologies) para infectar 10 ml de caldo LB, y las células se cultivaron durante una noche en un agitador orbital a 150 rpm y 37 °C. Al día siguiente, se volvieron a sembrar 1/20 en 100 ml de caldo LB y se cultivaron en un agitador orbital a 150 rpm y 37 °C para alcanzar una DO<600>= 0,5. Una vez alcanzada la densidad óptica requerida, las células se enfriaron a 0 °C y se centrifugaron durante 10 minutos a 4000 g. A continuación, se eliminó el medio y las células se enjuagaron dos veces con 100 ml de agua bidestilada helada para eliminar el medio restante y luego se enjuagaron con 20 ml de glicerina al 10 %. Después de eso, las células se resuspendieron en 1 ml de glicerina al 10 % y se usaron para la transformación.
La transformación con el fragmento lineal producido se realizó mediante electroporación en cubetas de 1 mm a 2 kV, 200 ohmios, 25 pF utilizando el Gene Pulser Xcell (Bio-Rad, EE.UU.). La duración del pulso fue de 4,9 ms a 5,1 ms. Después de eso, las células se cultivaron en un medio SOC durante 2,5 horas en una incubadora con agitador a 30 °C. A continuación, las células se vertieron en placas de agar LB (placas de Petri) que contenían 10 pg/ml de cloranfenicol. Las células se cultivaron durante 48 horas a 30 °C. Se analizó la supervivencia de los clones seleccionados en un medio selectivo que contenía levadura, peptona, sacarosa al 6 % y 10 pg/ml de cloranfenicol. El genotipo de la cepa resultante esrecA rpsL (Strr) thr leu endA thi-1 lacY galK galT ara tonA tsx dam dem supE44 A(lac-proAB) [F' traD36 proAB laclq ZAM15]ChmR sacB+
Ejemplo 5.
Construcción de la cepa deEscherichia coliSCS110-AF/VTvaf17 (registrada en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales con el número B-12990, AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL N.° NCIMB 42801) que porta el vector de ADN de terapia génica VTvaf17 para su desarrollo posterior.
Para preparar células electrocompetentes de la cepa deEscherichia coliSCS110-AF, se usó una sola colonia para infectar 10 ml de caldo LB y las células se cultivaron durante una noche en un agitador orbital a 150 rpm y 37 °C. Al día siguiente, se volvieron a sembrar 1/20 en 100 ml de caldo LB y se cultivaron en un agitador orbital a 150 rpm y 37 °C para alcanzar una DO<600>= 0,5. Una vez alcanzada la densidad óptica requerida, las células se enfriaron a 0 °C y se centrifugaron durante 10 minutos a 4000 g. A continuación, se eliminó el medio y las células se enjuagaron dos veces con 100 ml de agua bidestilada helada para eliminar el medio restante y luego se enjuagaron con 20 ml de glicerina al 10%. Después de eso, las células se resuspendieron en 1 ml de glicerina al 10% y se usaron para la transformación por electroporación. La electroporación se realizó en cubetas de 1 mm a 2 kV, 200 ohmios, 25 pF utilizando el Gene Pulser Xcell (Bio-Rad, EE.UU.). La duración del pulso fue de 4,9 ms a 5,1 ms y se utilizaron 1-10 ng del vector. Después de eso, las células se cultivaron en un medio SOC durante 2,5 horas en una incubadora con agitador a 30 °C. A continuación, las células se vertieron en placas de agar (placas de Petri) con un medio selectivo que contenía levadura, peptona, sacarosa al 6 % y 10 pg/ml de cloranfenicol. Este procedimiento dio como resultado la producción de la cepa deEscherichia coliSCS110-AF/VTvaf17 (registrada en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales con el número B-12990, AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL N.° NCIMB 42801) que porta el vector de ADN de terapia génica VTvaf17. 48 horas después, se usó una única colonia para infectar 10 ml de un medio selectivo líquido que contenía levadura, peptona, sacarosa al 6% y 10 pg/ml de cloranfenicol, y el medio se cultivó durante una noche en un agitador orbital a 150 rpm y 37 °C. Al día siguiente, se sedimentaron las células y se extrajo el vector de ADN mediante lisis alcalina utilizando el kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 6.
Para demostrar la eficacia del vector de ADN de terapia génica VTvaf17, el gen diana, p. ej., el gen de la proteína verde fluorescente (GFP), se clonó en el polienlazador.
Comparación de los niveles de acumulación del gen diana, p. ej., la proteína verde fluorescente (GFP), en células HEK-293 48 horas después de la transfección celular con el vector plasmídico pEFGP-C1 (Clontech) y el vector de ADN de terapia génica VTvaf17-eGFP.
Para medir el nivel de acumulación de la proteína verde fluorescente (GFP), en células HEK-293 (células de riñón embrionario humano transformadas con ADN de adenovirus 5, ATCC CRL-1573), se realizó la transfección de las células con el vector plasmídico pEFGP-C1 (Clontech) y el vector de ADN de terapia génica VTvaf17-eGFP.
Las células se cultivaron en un medio DMEM (ThermoFisher Scientific, EE.UU.) que contenía suero bovino fetal al 10 % (ThermoFisher Scientific, EE.UU.), 4,5 g/l de glucosa y 10 pg/ml de gentamicina, con una superposición del 5 % de CO<2>a 37 °C. Para lograr una confluencia del 90 %, 24 horas antes del procedimiento de transfección, las células se sembraron en una placa de 24 pocillos en una cantidad de 4x104 células por pocillo. Se utilizó Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, EE.UU.) como reactivo de transfección. En el tubo de ensayo 1, se añadieron 1 pl de la solución del vector plasmídico pEFGP-C1 y del vector de ADN de terapia génica VTvaf17-eGFP (500 ng/pl cada uno) y 1 pl de reactivo P3000 a 25 pl de medio Opti-MEM (Gibco). La preparación se mezcló mediante agitación suave. En el tubo de ensayo 2, se añadió 1 pl de solución Lipofectamine 3000 a 25 pl de medio Opti-MEM (Gibco). La preparación se mezcló mediante agitación suave. El contenido del tubo de ensayo 1 se añadió al contenido del tubo de ensayo 2 y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. La solución resultante se añadió gota a gota a las células en un volumen de 40 pl.
Los resultados se registraron 48 horas después utilizando el microscopio de fluorescencia Olympus ix53 (Japón) con un juego de filtros de 485/535 nm (Fig. 3A). Estos resultados demuestran que la transfección de células HEK-293 con el vector de ADN de terapia génica VTvaf17-eGFP provoca un aumento significativo en la acumulación de la proteína verde fluorescente en comparación con la transfección de las mismas células con el vector plasmídico pEFGP-C1 (Clontech).
Los resultados se registraron midiendo la fluorescencia de la proteína extraída de la línea celular transfectada. Para hacer esto, las células se enjuagaron del pocillo mediante pipeteo y se sedimentaron a 6000 rpm durante 10 minutos, se enjuagaron dos veces y a continuación las células empaquetadas se resuspendieron en 1 ml de tampón de fosfato de sodio. Las células se lisaron en tres ciclos de congelación/descongelación a -70 °C. A continuación, se sedimentó el homogeneizado de células lisadas a 13.000 g durante 15 minutos. Los sobrenadantes se transfirieron a una placa de cultivo de 96 pocillos (Grainer Bio-one) en cuatro réplicas para cada muestra y, a continuación, se midió la fluorescencia relativa de GFP (absorción 455 nm/emisión 538 nm) utilizando el fluorómetro de microplacas Fluoroskan Ascent (Labsystems). Los valores resultantes se normalizaron de acuerdo con la concentración de proteína total en la muestra, que se midió mediante el ensayo de proteínas de Bradford. Para ello, se utilizó como tinte Coomassie Brilliant Blue R-250. Cada réplica se diluyó en los pocillos de la placa de 96 pocillos (4 réplicas para cada muestra) con agua por un factor de 100 y, a continuación, se añadió el tinte. Después de eso, se midió la densidad óptica de todas las muestras a 620 nm utilizando Multiskan Ascent (Thermo). Los valores resultantes se compararon con la curva de calibración construida para la seroalbúmina bovina (Bio-Rad) con una serie de diluciones secuenciales de 20 a 2,5 μg/ml. Los cálculos se realizaron usando la siguiente fórmula:
^ contenido de proteínas (pg) = {[x] - a} ^ k * M,
donde [x] es el valor medio de DO<620>de las cuatro réplicas para cada muestra,a-desviación media, kes el coeficiente de pendiente de la curva de calibración para BSA,Mes el factor de dilución de la muestra.
Basándose en los valores de la concentración total de proteína extraída de las células, la fluorescencia de GFP en las muestras se normalizó mediante la siguiente fórmula:
OEn = [OE] ^ contenido de proteínas (mg)
Donde [OE] es el promedio de las cuatro réplicas de cada muestra, en unidades relativas de fluorescencia (RFU).
Los resultados se muestran en la Fig. 3B y demuestran que la transfección de células HEK-293 con el vector de ADN de terapia génica VTvaf17-eGFP duplica el nivel de acumulación de la proteína verde fluorescente en comparación con la transfección de las mismas células con el vector plasmídico pEFGP-C1 (Clontec).
Ejemplo 7.
Para demostrar la eficacia del vector de ADN de terapia génica VTvaf17, el gen diana, p. ej., el gen que codifica la elastina, se clonó en el polienlazador.
Análisis de los cambios en la acumulación de ARNm del gen diana, p. ej., el gen de la elastina, en células de queratinocitos HaCaT 48 horas después de la transfección de estas células con el vector de ADN VTvaf17-ELN que porta una región codificante del gen de la elastina humana.
Las células HaCaT (queratinocitos humanos inmortalizados, ThermoFisher Scientific, EE.UU.) se cultivaron en un medio DMEM (ThermoFisher Scientific, EE.UU.) que contenía suero bovino fetal al 10% (ThermoFisher Scientific, EE.UU.), 4,5 g/l de glucosa y 2 mM de glutamina con una superposición del 5 % de CO<2>a 37 °C. Para lograr una confluencia del 90 %, 24 horas antes del procedimiento de transfección, las células se sembraron en una placa de 24 pocillos en una cantidad de 5x104 células por pocillo. Se utilizó Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, EE.UU.) como reactivo de transfección. La transfección de las células con el vector de ADN de terapia génica VTvaf17-ELN que expresa el gen de la elastina humana se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 6. Se utilizaron como referencia células HaCaT transfectadas con el vector de a Dn de terapia génica VTvaf17. La extracción del ARN total de las células transfectadas y la construcción de la primera hebra de ADNc se realizaron de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 3. Para medir el nivel de expresión del ARNm del gen de la elastina después de la transfección, se utilizó PCR en tiempo real (SYBR Green Real Time PCR). Para la amplificación del ADNc de la elastina humana se utilizaron los oligonucleótidos EL1F y EL1R (véase la lista de secuencias, (34), (35)). La longitud del producto de amplificación es de 227 pb. Se usó beta-2 microglobulina (B2M) como gen de referencia.
La amplificación por PCR se realizó con el uso del kit QuantiTect SYBR Green RT-PCR (Qiagen, EE.UU.) u otro kit de PCR en tiempo real en 20 j l de la mezcla de amplificación que contenía 25 j l de QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master Mix, 2,5 mM de cloruro de magnesio, 0,5 jM de cada cebador y 5 j l de ARN total. Para la amplificación se utilizó el módulo de reacción CFX96 (Bio-Rad, EE.UU.) en las siguientes condiciones: 1 ciclo de transcripción inversa a 42 °C durante 30 minutos, desnaturalización a 98 °C durante 15 minutos, seguido de 40 ciclos que comprenden desnaturalización a 94 °C durante 15 s, hibridación de cebadores a 60 °C durante 30 s y elongación a 72 °C durante 30 s. El control positivo incluyó amplicones de PCR en matrices representadas por plásmidos en concentraciones conocidas que contienen secuencias de ADNc de los genes ELN y<b>2<m>. El control negativo incluía agua desionizada.
La cuantificación en tiempo real de los productos de PCR, es decir, los ADNc de los genes ELN y B2M obtenidos mediante amplificación, se realizó utilizando el software Bio-Rad CFX Manager 2.1.
Para demostrar el aumento de la expresión del gen ELN en células de queratinocitos humanos después de la transfección de estas células con el vector de ADN de terapia génica VTvaf17-ELN que porta una región que codifica el gen de la elastina, la Figura 3 muestra un diagrama de acumulación de productos de PCR correspondientes a lo siguiente:
1 - ADNc del gen ELN después de la transfección con el vector de terapia génica VTvaf17;
2 - ADNc del gen ELN después de la transfección con el vector de terapia génica VTvaf17-ELN que porta la región codificante del gen de la elastina;
3 - ADNc del gen B2M después de la transfección con el vector de terapia génica VTvaf17;
Figura 4 - ADNc del gen<b>2<m>después de la transfección con el vector de terapia génica VTvaf17-ELN que porta la región codificante del gen de la elastina.
De la figura se deduce que la transfección con el vector de ADN de terapia génica VTvaf17-ELN que porta el gen diana, p. ej., el gen de la elastina humana, hace que el nivel de ADNc específico del gen de la elastina humana aumente enormemente.
Ejemplo 8.
Para demostrar la eficacia del vector de ADN de terapia génica VTvaf17, el gen diana, p. ej., el gen que codifica la elastina, se clonó en el polienlazador.
Se realizaron mediciones de los cambios en la concentración de la proteína elastina en la piel humana tras la inyección del vector de ADN de terapia génica VTvaf17 que porta el gen diana, p. ej., el gen de la elastina humana, en la piel humana.
Para analizar los cambios en la concentración de la proteína elastina, se inyectó el vector de ADN de terapia génica VTvaf17-ELN que porta una región que codifica el gen de la elastina en la piel del antebrazo de tres pacientes que presentaban cambios visibles específicos de la edad, con la introducción simultánea de un placebo, que era el vector de ADN de terapia génica VTvaf17 desprovisto del ADNc del gen ELN. Paciente 1, mujer, 56 años, envejecimiento caracterizado por líneas finas (P1); Paciente 2, mujer, 67 años, envejecimiento caracterizado por deformación o surcos profundos (P2); Paciente 3, hombre, 60 años, envejecimiento caracterizado por deformación (P3).
Se inyectaron el vector de ADN de terapia génica VTvaf17 (placebo) y el vector de ADN de terapia génica VTvaf17-ELN que porta una región que codifica el gen de la elastina en una cantidad de 1 mg para cada una de las construcciones genéticas utilizando el método de túnel con una aguja 30G hasta una profundidad de 3 mm. El volumen de la solución inyectada del vector de ADN de terapia génica VTvaf17 (placebo) y del vector de ADN de terapia génica VTvaf17-ELN que porta una región que codifica el gen de la elastina es de 0,3 ml para cada una de las construcciones genéticas. Los puntos de introducción de cada una de las construcciones genéticas se situaron a intervalos de 5 a 10 cm.
Las muestras de biopsia se tomaron el 2° día después de la introducción de los vectores de ADN de terapia génica.
Las muestras de biopsia se tomaron de la piel de los pacientes en la zona de introducción del vector de ADN de terapia génica VTvaf17-ELN que porta una región que codifica el gen de la elastina (I), del vector de ADN de terapia génica VTvaf17 (placebo) (II) y de piel intacta (III), utilizando el dispositivo de biopsia de piel Epitheasy 3.5 (Medax SRL). La piel de los pacientes se lavó previamente con solución salina estéril y se anestesió con una solución de lidocaína. El tamaño de la muestra de la biopsia fue de aprox. 2x2x2 mm y el peso era de hasta 10 mg. La muestra se colocó en una solución tampón que contenía 50 mM de Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA y 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, y se homogeneizó para obtener una suspensión homogeneizada. A continuación, la suspensión se centrifugó durante 10 minutos a 14.000 g. Se recogió el sobrenadante y se usó para ensayar la proteína diana.
La proteína elastina en las muestras de biopsia de piel de los pacientes se cuantificó mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas utilizando el kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para elastina (ELN) (SEB337Hu, Cloud-Clone Corp., EE.UU.).
Del kit se utilizaron anticuerpos altamente específicos contra la proteína elastina adsorbidos en los pocillos de la microplaca. Se añadieron a los pocillos 100 pl de cada una de las muestras de referencia diluidas y de las muestras analizadas y se incubaron durante 2 horas a 37 °C. A continuación, se añadieron 100 pl de reactivo A, la placa se cubrió con cinta adhesiva y se incubó durante 1 hora a 37 °C. A continuación, los pocillos se enjuagaron tres veces con 350 pl de tampón de lavado y se añadieron 100 pl de reactivo B con posterior incubación durante 30 minutos a 37 °C. Después de la incubación, los pocillos se lavaron cinco veces con 350 pl de tampón de lavado, se añadieron 90 pl de solución de sustrato y se incubaron durante 20-25 minutos a 37 °C. La reacción se terminó añadiendo 50 pl de tampón de eliminación de inhibidores y se midió la densidad óptica a 450 nm utilizando el analizador totalmente automatizado para bioquímica y ensayos ligados a enzimas ChemWell (Awareness Technology Inc., EE.UU.). Para medir el valor numérico de la concentración se utilizó la curva de calibración construida utilizando las muestras de referencia del kit con concentraciones conocidas de la proteína elastina. Para el tratamiento estadístico de los resultados y la visualización de datos se utilizó R-3.0.2 (https://www.r-project.org/).
La piel de cada uno de los tres pacientes muestra una mayor concentración de la proteína elastina en el área de introducción del vector de ADN de terapia génica VTvaf17 que porta el gen diana, p. ej., el gen de la elastina humana, en comparación con la concentración de la proteína elastina en el área de introducción del vector de ADN de terapia génica VTvaf17 (placebo) desprovisto de la región que codifica el gen de la elastina humana. Los valores resultantes de las concentraciones de elastina en la piel de los pacientes P1, P2 y P3 se muestran en la Figura 5.
Ejemplo 9.
Para demostrar la eficacia del vector de ADN de terapia génica VTvaf17, el gen diana, p. ej., el gen que codifica la proteína verde fluorescente (GFP) en células de riñón bovino MDBK, se clonó en el polienlazador.
Los niveles de acumulación del gen diana, p. ej., la proteína verde fluorescente (GFP), en células de riñón bovino MDBK 48 horas después de la transfección celular, se compararon con el vector de ADN de terapia génica VTvaf17-eGFP.
Para cuantificar el nivel de acumulación de la proteína verde fluorescente (GFP) en células MDBK (células de riñón bovino, ATCC CLL-22), las células se transfectaron con el vector de ADN de terapia génica VTvaf17-eGFP.
Las células se cultivaron en un medio MEM (ThermoFisher Scientific, EE.UU.) que contenía suero fetal bovino al 10 % (ThermoFisher Scientific, EE.UU.), 1 g/l de glucosa y 2 mM de glutamina, con una superposición del 5 % de CO<2>a 37 °C. Para lograr una confluencia del 90 %, 24 horas antes del procedimiento de transfección, las células se sembraron en una placa de 24 pocillos en una cantidad de 3x104 células por pocillo. Se utilizó Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, EE.<u>U.) como reactivo de transfección. La transfección se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 6. Se utilizó como referencia el vector de terapia génica recombinante VTvaf17 libre del gen de la proteína verde fluorescente. Los resultados se registraron midiendo la fluorescencia de la proteína extraída de la línea celular transfectada, como se describe en el Ejemplo 6.
Los resultados se muestran en la Figura 6 y permiten concluir que la transfección de la línea celular de riñón bovino MDBK con el vector de ADN de terapia génica VTvaf17-eGFP que porta el gen de la proteína verde fluorescente conduce a un mayor nivel de acumulación de la proteína verde fluorescente en comparación con la transfección de las mismas células con el vector de terapia génica VTvaf17 desprovisto del gen de la proteína verde fluorescente.
Ejemplo 10.
Para demostrar la producibilidad y constructibilidad del vector de ADN de terapia génica VTvaf17 a escala industrial, se realizó una fermentación a gran escala de la cepa deEscherichia coliSCS110-AF/VTvaf17 (registrada en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales con el número B-12990, AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL N.° NCIMB 42801) que porta el vector de ADN de terapia génica VTvaf17.
La fermentación de la cepa deEscherichia coliSCS110-AF/VTvaf17 que porta el vector de ADN de terapia génica VTvaf17 se realizó en un biorreactor/fermentador de 10 I con extracción posterior del vector de ADN de terapia génica VTvaf17.
Para la fermentación de la cepa deEscherichia coliSCS110-AF/VTvaf17 se preparó un medio que contenía (por 10 l de volumen) 100 g de triptona, 50 g de levadura (Becton Dickinson), a continuación el medio se diluyó con agua hasta 8800 ml y se esterilizó en autoclave a 121 °C durante 20 minutos y luego se añadieron 1200 ml de sacarosa al 50 % (peso a volumen). Después de eso, el cultivo de siembra de la cepa deEscherichia coliSCS110-AF/VTvaf17 se inoculó en un matraz de cultivo en un volumen de 100 ml. El cultivo se incubó en una incubadora con agitador durante 16 horas a 30 °C. El cultivo de siembra se transfirió al biorreactor Techfors S (Infors HT, Suiza) y se cultivó hasta alcanzar una fase estacionaria. El proceso se controló midiendo la densidad óptica del cultivo a 600 nm. Las células se sedimentaron durante 30 minutos a 5000-10.000 g. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento celular se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato al 10% (en volumen). Las células se centrifugaron nuevamente durante 30 minutos a 5000-10.000 g. Se eliminó el sobrenadante, se añadió al sedimento celular una solución de Tris-HCl 20 mM, EDTA 1 mM, sacarosa 200 g/l, pH 8,0, en un volumen de 1000 ml, y la mezcla se agitó vigorosamente hasta obtener una suspensión homogeneizada. A continuación, se añadió solución de lisozima de huevo hasta una concentración final de 100 pg/ml. La mezcla se incubó durante 20 minutos en hielo mientras se agitaba suavemente. A continuación, se añadieron 2500 ml de NaOH 0,2 M, 10 g/l de dodecil sulfato sódico (SDS), la mezcla se incubó durante 10 minutos en hielo mientras se agitaba suavemente y después se añadieron 3500 ml de acetato sódico 3M, ácido acético 2M, pH 5-5,5, y la mezcla se incubó durante 10 minutos en hielo mientras se agitaba suavemente. La muestra resultante se centrifugó durante 20-30 minutos a 15.000 g o un valor superior. La solución se decantó delicadamente y el precipitado residual se eliminó pasándolo a través de un filtro grueso (papel de filtro). A continuación, se añadió RNasa A (Sigma) hasta la concentración final de 20 pg/ml y la solución se incubó durante una noche durante 16 horas a temperatura ambiente. A continuación, la solución se centrifugó durante 20-30 minutos a 15.000 g y se pasó a través de un filtro de membrana de 0,45 pm (Millipore). A continuación, se realizó una ultrafiltración con una membrana de 100 kDa (Millipore) y la mezcla se diluyó hasta el volumen inicial con una solución tampón de Tris-HCl 25 mM, pH 7,0. Esta manipulación se realizó de tres a cuatro veces. La solución se aplicó a la columna con 250 ml de DEAE Sepharose HP (GE, EE.UU.), equilibrada con Tris-HCl 25 mM, pH 7,0. Después de la aplicación de la muestra, la columna se lavó con tres volúmenes de la misma solución y a continuación se eluyó el vector de ADN de terapia génica VTvaf17 usando un gradiente lineal de Tris-HCl 25 mM, pH 7,0, para obtener una solución de Tris-HCl 25 mM. HCl, pH 7,0, NaCl 1 M, cinco veces el volumen de la columna. El proceso de elución se controló midiendo la densidad óptica de la solución de escorrentía a 260 nm. Las fracciones cromatográficas que contenían el vector de ADN de terapia génica VTvaf17 se unieron y se sometieron a filtración en gel usando Superdex 200 (GE, EE.UU.). La columna se equilibró con solución salina tamponada con fosfato. El proceso de elución se controló midiendo la densidad óptica de la solución de escorrentía a 260 nm y las fracciones se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Las fracciones cromatográficas que contenían el vector de ADN de terapia génica VTvaf17 se unieron y se mantuvieron a -20 °C. El rendimiento es suficiente para la producción industrial a gran escala del vector de ADN de terapia génica VTvaf17.
Por lo tanto, el propósito de esta invención, específicamente la construcción de un vector de ADN de terapia génica para la modificación genética de células humanas y animales, que combinaría razonablemente:
I) posibilidad de uso seguro en terapia génica de seres humanos y animales debido a la ausencia de genes de resistencia a antibióticos en el vector de ADN de terapia génica;
II) longitud que garantiza el suministro eficaz de genes a la célula diana;
III) presencia de elementos reguladores que garantizan la expresión eficaz de los genes diana sin estar representados por secuencias de nucleótidos de genomas virales; y
IV) producibilidad y constructibilidad a escala industrial,
se ha logrado, lo cual está respaldado por los siguientes ejemplos: para el Punto I - Ejemplo 1; para el Punto II -Ejemplos 1, 6, 7, 8; 9; para el Punto III - Ejemplos 1,6, 7, 8, 9; para el Punto IV - Ejemplos 5, 10.
Aplicabilidad industrial
Todos los ejemplos enumerados anteriormente respaldan la aplicabilidad industrial del vector de ADN de terapia génica VTvaf17 propuesto y el método de su producción, la cepa genéticamente modificada deEscherichia coliSCS110-AF para la construcción del vector de ADN VTvaf17 y vectores de ADN de terapia génica que portan genes diana basados en él, y el método de producción de la cepa deEscherichia coliSCS110-AF, la cepa modificada genéticamente deEscherichia coliSCS110-AF/VTvaf17 (registrada en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales con el número B-12990, AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL N.° NCIMB 42801) que porta el vector de ADN de terapia génica VTvaf17 para su construcción, y el método de producción de la cepa deEscherichia coliSCS110-AF/VTvaf17.
Lista de secuencias de oligonucleótidos:
(1) oligonucleótido ORI-F AGTCCATGGCTGCCTCGCGCGTTTCG
(2) oligonucleótido ORI-R AGCCTCACGGGAGTCAGGCAACTATG
(3) oligonucleótido Ori-M1 CTACACTAGAAGAACAGTATTTG
(4) oligonucleótido Ori-M2 CAAATACTGTTCTTCTAGTGTAG
(5) oligonucleótido EF1-F CCTGACTCCCGTGAGGCTCCGGTGCC
(6) oligonucleótido EF1-R
TCGGATCCTGGCTTTTAGGGGTAGTTTTC
(7) oligonucleótido hGH-F
AGGATCCGAATTCCCTGTGACCCCTCCCCAG
(8) oligonucleótido hGH-R
CTCTTTACCAATTCTACGCGTAAGGACAGGGAAGGGAGCA
(9) oligonucleótido RO-F
CTTCCCTGTCCTTACGCGTAGAATTGGTAAAGAGAGTCGT
(10) oligonucleótido RO-R
CCGTAGAAAACTAGTTAATGATTTTTATCAAAATCATTAAG
(11) oligonucleótido RO-1
GAATTGGTAAAGAGAGTCGTGTAAAATATCGAGTTCGCACATCTTGTTG
(12) oligonucleótido RO-2
GATTTTTGGCGAAACCATTTGATCATATGACAAGATGTGTATCTACC
(13) oligonucleótido RO-3
ATGATTTTTATCAAAATCATTAAGTTAAGGTAGATACACATCTTGTC
(14) oligonucleótido Kan-F
AAATCATTAACTAGTTTTCTACGGGGTCTGACGC
(15) oligonucleótido Kan-R
CAGCCATGGACTAGTGGTGGCACTTTTCGGGGA
(16) oligonucleótido MCS1
GATCCGATATCGTCGACAAGCTTGGTACCG
(17) oligonucleótido MCS2
AATTCGGTACCAAGCTTGTCGACGATATCG
(18) oligonucleótido LHA-F 5'-GCTGACGCTGCAGGTGATC
(19) oligonucleótido LHA-R 5'-GACAAGATGTGTGTCTACCGCTTCAGGTTACCCGCCAG
(20) oligonucleótido lN-F 5'-CTGGCGGGTAACCTGAAGCGGTAGACACACATCTTGTC
(21) oligonucleótido IN-1 5'-ATTTTTGGCGAAACCATTCTATCATATGACAAGATGTGTGTC
(22) oligonucleótido lN-25'-ATATGATAGAATGGTTTCGCCAAAAATCAATAATCAGACAAC
(23) oligonucleótido lN-R 5'-CAAACTTTTTGATGTTCATCTTGTTGTCTGATTATTG
(24) oligonucleótido SACB-F 5'-CAATAATCAGACAACAAGATGAACATCAAAAAGTTTG
(25) oligonucleótido SACB-R 5'-CTTACGTGCCGATCATTATTTGTTAACTGTTAATTGTC
(26) oligonucleótido CATR-F 5'-CAATTAACAGTTAACAAATAATGATCGGCACGTAAGAGG
(27) oligonucleótido CATR-R 5'-CGAGACGAACAGAGGCGTAGTTACGCCCCGCCCTGCCAC
(28) oligonucleótido RHA-F 5'-TGGCAGGGCGGGGCGTAACTACGCCTCTGTTCGTCTCGA
(29) oligonucleótido RHA-R 5'-CTCAGCAGCAACTCACGTAC
(30) oligonucleótido MVGFP-F 5'-GGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT
(31) oligonucleótido MVGFP-R 5'-GAATCCTCACAAATTTTGTAATCCAGAG
(32) oligonucleótido ELN-F 5'- GGATCCATGGCGGGTCTGACGG
(33) oligonucleótido ELN-R 5'- GAATCCTCATTTTCTCTTCCGGCCAC
(34) oligonucleótido EL 1F 5'- GAGTCCTCCTGCTCCTGCTGTCCAT
(35) oligonucleótido EL 1R 5'- AAAGGTAACTGCGGGGAAGGCG
Lista de abreviaturas
VTvaf17 - Vector de terapia génica que no contiene secuencias de genomas virales ni marcadores de resistencia a antibióticos (vector terapéutico libre de virus y antibióticos)
ADN - Ácido desoxirribonucleico
ADNc - Ácido desoxirribonucleico complementario
ARN - Ácido ribonucleico
ARNm - Ácido ribonucleico mensajero
pb - pares de bases
PCR - Reacción en cadena de la polimerasa
ml - mililitro, pl - microlitro
l - litro
pg - microgramo
mg - miligramo
g - gramo
pmol - micromol
mM - milimol
min - minuto
s - segundo
rpm - revoluciones por minuto
nm - nanómetro
cm - centímetro
mW - milivatios
RFU - Unidad de fluorescencia relativa
PBS - Solución salina tamponada con fosfato
Claims (6)
1. Un vector de ADN de terapia génica bicatenario circular de 3165 pb para la modificación genética de células animales y humanas que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID N.° 1.
2. Un método de construcción de un vector de ADN de terapia génica bicatenario circular de 3165 pb que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID N.° 1 que implica, en primer lugar, construir un vector de 4182 pb que contiene un región promotora de 1188 pb del factor de elongación humano EF1A con un potenciador intrínseco, un polienlazador de 35 pb con sitios para las endonucleasas de restricción BamHI, EcoRV, Sall, Hindll, Kpnl, EcoRl, un terminador de transcripción de 466 pb y una secuencia de poliadenilación del factor de crecimiento humano, un elemento regulador ARN-OUT de 136 pb del transposón Tn10 que permite la selección positiva sin antibióticos, un origen de replicación de 1299 pb para la replicación autónoma con una sustitución de un solo nucleótido para aumentar la producción de vectores en las células de la mayoría de las cepas deEscherichia coli,un gen de resistencia a la kanamicina de 1010 pb, y luego se escinde mediante sitios de restricción Spel y el fragmento restante se liga a sí mismo.
3. Un método de obtención de la cepa deEscherichia coliSCS 110-AF para la producción de un vector de ADN de terapia génica bicatenario circular de 3165 pb que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID N.° 1 o vectores de ADN de terapia génica basados en él, que implica la construcción de un fragmento de ADN lineal que contiene el elemento regulador ARN-IN de 64 pb del transposón Tn10 que permite la selección positiva sin antibióticos, gen de levansucrasasacBde 1422 pb cuyo producto garantiza la selección dentro de un medio que contiene sacarosa, gen de resistencia al cloranfenicolcatRde 763 pb necesario para seleccionar clones de cepas en las que se produce recombinación homóloga, y dos secuencias homólogas, de 329 pb y 233 pb, que garantizan la recombinación homóloga en la región del genrecAsimultáneamente con la inactivación del gen, y luego las cepas deEscherichia colise transforman mediante electroporación y se seleccionan los clones que sobreviven en un medio que contiene 10 μg/ml de cloranfenicol.
4. Cepa deEscherichia coliSCS110-AF para la producción de un vector de ADN de terapia génica bicatenario circular de 3165 pb que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID N.° 1 o vectores de ADN de terapia génica basados en él que permiten la selección positiva sin antibióticos, obtenibles mediante el método de la reivindicación 3.
5. Cepa deEscherichia coliSCS110-AF/VTvaf17 (registrada en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales con el número B-12990, AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL N.° NCIMB 42801) que porta un vector de ADN de terapia génica bicatenario circular de 3165 pb que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID N.° 1 para su producción posterior que permite la selección sin antibióticos.
6. Un método para obtener la cepa deEscherichia coliSCS110-AF/VTvaf17 (registrada en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales con el número B-12990, AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL N.° NCIMB 42801) que porta un vector de ADN de terapia génica bicatenario circular de 3165 pb que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID N.° 1, que implica producir células electrocompetentes de la cepa deEscherichia coliSCS110-AF y someter estas células a electroporación con el vector de ADN de terapia génica bicatenario circular de 3165 pb que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1 y, después de eso, las células se vierten en placas de agar (placas de Petri) con un medio selectivo que contiene levadura, peptona, sacarosa al 6 % y 10 jg/m l de cloranfenicol.
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