CN115404193A - 重组微生物及其用于生产1,5-戊二胺的方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供一种重组微生物，其包含表达载体，该表达载体包括编码磷酸吡哆醛基因的核苷酸序列以及控制该核苷酸序列表达的持续型启动子序列。本公开还提供使用该微生物生产1,5‑戊二胺的方法。

Description

重组微生物及其用于生产1,5-戊二胺的方法

技术领域

本公开涉及一种生产1,5-戊二胺的微生物，且特别涉及一种经基因重组 的微生物及使用该微生物生产1,5-戊二胺的方法。

背景技术

1,5-戊二胺是化工产业中用以合成多聚物的重要原料，其生产及制备方 法的改良及效率提升为该领域一直以来的主要课题。

全细胞催化法(in vitro whole-cell biotransformation)是现有以 微生物生产1,5-戊二胺的其中一种方法，其利用完整的生物有机体作为催化 剂而进行化学转化，即，将微生物培养至一定细胞量后，再加入基质进行催 化，进而转化为产物。例如，使用基因重组微生物使其表达赖氨酸脱羧酶 (lysine decarboxylase，CadA)，并通过高密度发酵提升菌量，借以增加赖 氨酸脱羧酶的表达量，进而提升其催化赖氨酸的转化效率以生产戊二胺。然 而，以全细胞催化法生产1,5-戊二胺时，还必须在反应系统中添加昂贵的磷 酸吡哆醛(pyridoxal 5’-phosphate，PLP)活化赖氨酸脱羧酶(CadA)， 以进一步提升全细胞催化法的效率。

磷酸吡哆醛(PLP)是维生素B6的活性形式，大肠杆菌细胞中具有两条 磷酸吡哆醛的自生成途径，分别是从头合成法，即利用葡萄糖生产磷酸吡哆 醛，而另一条则称为超级救援途径，即利用维生素B6的前体，如吡哆醛 (pyridoxal，PL)和吡哆醇(pyridoxine，PN)等经催化生成磷酸吡哆醛。

于先前技术中，已公开于催化过程中添加维生素B6的前体以取代磷酸 吡哆醛的方法，如专利公开号CN109536542A，其公开在反应系统中加入浓度 为0.05至0.5mM的吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺等辅酶；另外， 专利公开号CN109097408A则公开在连续酶反应器中加入赖氨酸脱羧酶和维 生素B6辅酶；而专利公开号CN108997141A还公开在赖氨酸和赖氨酸脱羧酶 混合系统中加入吡哆氨、吡哆醇、吡哆醛、磷酸吡哆醛等维生素B6辅酶。然而，上述直接添加磷酸吡哆醛前体对于生产1,5-戊二胺的效果不佳，仍需 开发其他提升1,5-戊二胺产能的全细胞催化法。

2015年，南京工业大学研究团队(Ma,W.,Cao,W.,Zhang,B.,Chen, K.,Liu,Q.,Li,Y.,&Ouyang,P.(2015).Engineering a pyridoxal 5’-phosphate supply forcadaverine production by using Escherichia coli whole-cellbiocatalysis.Scientific Reports,5(1),1-10)尝试 利用表达从头合成途径中的基因以提升戊二胺的产量，而韩国Kim等人的团 队(Kim,J.H.,Kim,J.,Kim,H.J.,Sathiyanarayanan,G.,Bhatia, S.K.,Song,H.S.&Yang,Y.H.(2017).Biotransformationof pyridoxal 5’-phosphate from pyridoxal by pyridoxal kinase(pdxY)to supportcadaverine production in Escherichia coli.Enzyme and Microbial Technology,104,9-15)则经由表达PdxY并添加PL作为前体的方法，其 获得最高33g/L的戊二胺，生产率为5.5g/L/h，但这些方法的产能及生产 效率并不符合需求，故仍需能进一步提高1,5-戊二胺产量的方法。

有鉴于此，本公开所属技术领域对可有效提升生产1,5-戊二胺产能的方 法仍有需求，以解决已知技术所存在的问题。

发明内容

为解决上述的问题，本公开提供一种生产1,5-戊二胺的重组微生物，其 包括至少两个基因，且该至少两个基因的其中至少一者位于表达载体上，其 中，该至少两个基因包括编码赖氨酸脱羧酶的基因以及编码生成磷酸吡哆醛 的酶的基因。于本公开的至少一个具体实施例中，该重组微生物所包括的赖 氨酸脱羧酶以及生成磷酸吡哆醛的酶的基因表达被增强。

于本公开的至少一个具体实施例中，生产1,5-戊二胺的重组微生物包括 至少两个外源基因，其中，该外源基因为编码赖氨酸脱羧酶(CadA)的基因 和编码生成磷酸吡哆醛(PLP)的酶的基因。

于本公开的至少一个具体实施例中，该编码生成磷酸吡哆醛的酶的基因 为pdxH、pdxY、pdK或其任意组合。

于本公开的至少一个具体实施例中，该重组微生物包含表达载体，其中， 该表达载体包括至少一个编码赖氨酸脱羧酶(CadA)、编码生成磷酸吡哆醛的 PdxH、PdxY或PdxK的核苷酸序列以及控制该核苷酸序列表达的持续型启动 子序列。

于本公开的至少一个具体实施例中，在该重组微生物所包含的表达载体 中，该编码赖氨酸脱羧酶(CadA)的核苷酸序列为具有与SEQ ID NO：11至 少有80％序列一致性且与SEQ ID NO：11具有相同活性的序列，该编码PdxH 的核苷酸序列为具有与SEQ ID NO：1至少有80％序列一致性且与SEQ ID NO： 1具有相同活性的序列，该编码PdxY的核苷酸序列为具有与SEQ ID NO：3 至少有80％序列一致性且与SEQ ID NO：3具有相同活性的序列，该编码PdxK 的核苷酸序列为具有与SEQ ID NO：5至少有80％相似度且与SEQ ID NO：5 具有相同活性的序列。

于本公开的至少一个具体实施例中，该持续型启动子为J系列持续型启 动子的其中一者。于本公开的一些具体实施例中，该J系列持续型启动子包 括J23100、J23101、J23102、J23103、J23104、J23105、J23106、J23107、 J23108、J23109、J23110、J23111、J23112、J23113、J23114、J23115、J23116、 J23117、J23118及J23119。于本公开的一些具体实施例中，该持续型启动子 为J23100、J23109或J23114。

于本公开的一些具体实施例中，该持续型启动子为PlacI持续型启动子。

于本公开的至少一个具体实施例中，该微生物属于大肠杆菌属 (Escherichia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙 雷氏菌属(Serratia)、普罗威登斯菌属(Providencia)、棒状杆菌属 (Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)。于本公开的一些具体 实施例中，该微生物为大肠杆菌K-12W3110菌株或BL21菌株。

于本公开的至少一个具体实施例中，本公开所提供的重组微生物为大肠 杆菌(Escherichia coli)JcadA-Wmut，于2021年1月11日以寄存编号DSM 33754寄存于德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ，德国，不伦瑞克市，D-38124， 因霍芬大街7B)。

本公开还提供一种生产1,5-戊二胺的方法，其包括：将上述微生物与赖 氨酸在第一溶液中混合，以将该赖氨酸转化为1,5-戊二胺；以及自该第一溶 液中分离得到1,5-戊二胺。

于本公开的一些具体实施例中，该方法进一步包括添加辅助因子至该第 一溶液中。于本公开的一些具体实施例中，该辅助因子为磷酸吡哆醛 (pyridoxal-5’-phosphate，PLP)或其前体，如吡哆醛(PL)或吡哆醇(PN)。 于本公开的至少一个具体实施例中，该第一溶液中赖氨酸的浓度为0.1M至 2M，例如0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、 1.9M或2M。

于本公开的至少一个具体实施例中，该方法进一步包括：在分离得到 1,5-戊二胺后，回收溶液中的微生物；将回收的微生物加入包含赖氨酸的第 二溶液中；于第二溶液中加入前述微生物；以及自该第二溶液中分离得到 1,5-戊二胺。

于本公开的至少一个具体实施例中，该第二溶液中赖氨酸的浓度为0.1M 至2M，例如0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、 0.9M、1M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、 1.9M或2M。

于本公开的至少一个具体实施例中，该微生物加入至第二溶液中的量以 OD₆₀₀值计为1至10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，且不以此为限。

本公开透过使用非诱导型表达系统，于微生物宿主中同时表达赖氨酸脱 羧酶(CadA)及生成磷酸吡哆醛(PLP)而作为全细胞催化剂，免除额外添 加PLP作为辅酶的步骤及成本，并进一步提高微生物的戊二胺催化效能及产 量。该全细胞催化剂还可回收并循环利用，更进一步降低1,5-戊二胺的生产 成本。以该全细胞催化剂生产1,5-戊二胺时，无须添加额外的磷酸吡哆醛 (PLP)辅酶，可因而降低1,5-戊二胺的生产成本，并简化生产程序，进而 提升戊二胺的产量和生产速率，使1,5-戊二胺的大规模生产得以实现。

附图说明

图1显示在W3110及BL21菌株中添加吡哆醛(PL)或吡哆醇(PN)等不 同的前体，以包含自发型启动子pSU-J23100或pSU-PlacI的持续型质粒驱动 pdxH、pdxY或pdxK基因的蛋白质表达。图中分别以箭头指出PdxH(25.5KDa)、 PdxY(31.7KDa)及PdxK(31.2KDa)于蛋白质电泳中的位置。JH：以pSU-J23100 启动子驱动pdxH基因的表达；PH：以pSU-PlacI启动子驱动pdxH基因的表 达；JY：以pSU-J23100启动子驱动pdxY基因的表达；PY：以pSU-PlacI启动子驱动pdxY基因的表达；JK：以pSU-J23100启动子驱动pdxK基因的表达； PK：以pSU-PlacI启动子驱动pdxK基因的表达。

图2显示在W3110及BL21菌株中，在添加吡哆醛(PL)或吡哆醇(PN) 下，以包含自发型启动子pSU-J23100或pSU-PlacI的持续型质粒驱动pdxH、 pdxY或pdxK基因的PLP生成量。WT：未经任何质粒转形的原始菌株；JH： 以pSU-J23100启动子驱动pdxH基因的表达；PH：以pSU-PlacI启动子驱动 pdxH基因的表达；JY：以pSU-J23100启动子驱动pdxY基因的表达；PY：以 pSU-PlacI启动子驱动pdxY基因的表达；JK：以pSU-J23100启动子驱动pdxK 基因的表达；PK：以pSU-PlacI启动子驱动pdxK基因的表达。DCW：细胞干 重(dry cell weight)。*P<0.05。

图3A至图3C显示包含CadA质粒及PdxY或PdxK质粒的双质粒BL21菌 株的戊二胺生产情形。图3A显示细胞的生长情形；图3B显示戊二胺的产量； 图3C显示胞内PLP的自生成量。DCW：细胞干重(dry cell weight)。*P< 0.05。

图4显示共表达CadA及PdxY或PdxK的双质粒BL21菌株在不同浓度赖 氨酸中的戊二胺生产量及赖氨酸消耗率。

图5显示PLP自生成菌株经pSU-J23100-CadA质粒克隆后(JcadA-Wmut 菌株)的赖氨酸脱羧酶(CadA)的活性分析。柱状图中的白色柱代表添加磷 酸吡哆醛(PLP)作为辅助因子，浅灰色柱代表添加吡哆醇(PN)作为辅助因 子，深灰色柱代表添加吡哆醛(PL)作为辅助因子。DAP：戊二胺 (1,5-diaminopentane)

图6显示PLP自生成菌株经pSU-J23100-CadA质粒克隆后(JcadA-Wmut 菌株)，利用PN或PL作为前体时催化赖氨酸(1.2M)生产戊二胺 (1,5-diaminopentane，DAP)的产量与转化率。

图7显示PLP自生成菌株经pSU-J23100-CadA质粒克隆后 (JcadA-Wmut菌株)循环利用的赖氨酸转化率。

具体实施方式

以下通过特定的具体实施例说明本公开的实施方式，本领域技术人员可 由本说明书所描述的内容轻易地了解本公开的优点及功效。本公开也可通过 其它不同的实施方式加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同 的观点与应用，在不悖离本公开所描述的范围下赋予不同的修饰与变更。此 外，本文所有范围和数值皆为包含及可合并的。落在本文中所述范围内的任 何数值或点，例如任何整数，都可以作为最小值或最大值以导出下位的范围。

除非文中另有说明，否则本公开说明书及所附权利要求书中所使用的单 数形式“一”和“该”包括多个个体。

除非文中另有说明，否则本公开说明书及所附权利要求书中所使用的术 语“或”包括“和/或”的含义。

本公开提供一种表达载体，其包括编码生成磷酸吡哆醛的酶的基因，其 包括pdxH、pdxY及pdxK的核苷酸序列，以及控制该赖氨酸脱羧酶的核酸分 子表达的持续型启动子序列。本公开还提供一种包含该表达载体的重组微生 物，以及利用该微生物生产1,5-戊二胺的方法。

如本文中所使用，术语“磷酸吡哆醛”(PLP)是指催化生物体反应生成 1,5-戊二胺的赖氨酸脱羧酶的辅酶(或称为辅助因子)，磷酸吡哆醛为维生素 B6的活性形式。如前所述，在大肠杆菌细胞内存在2条PLP的自生成途径， 分别为从头合成法，即利用葡萄糖生产PLP，而另一条为超级救援途径，即 利用维生素B6的前体，包括吡哆醛(PL)和吡哆醇(PN)等经催化生成PLP。

根据本公开的至少一个具体实施例，编码生成磷酸吡哆醛的pdxH基因 的核苷酸序列为具有与SEQ ID NO：1至少有80％(例如：至少82％、至少 85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与SEQ ID NO： 1具有相同活性的序列，例如可表现出具有生成磷酸吡哆醛的PdxH活性的蛋 白质。于本公开的一些具体实施例中，生成磷酸吡哆醛的PdxH具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有保守变异的氨基酸序列。

根据本公开的至少一个具体实施例，编码生成磷酸吡哆醛的pdxY基因的 核苷酸序列为具有与SEQ ID NO：3至少有80％(例如：至少82％、至少85％、 至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与SEQ ID NO：3 具有相同活性的序列，例如可表现出具有生成磷酸吡哆醛的PdxY活性的蛋 白质。于本公开的一些具体实施例中，生成磷酸吡哆醛的PdxY具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4具有保守变异的氨基酸序列。

根据本公开的至少一个具体实施例，编码生成磷酸吡哆醛的pdxK基因 的核苷酸序列为具有与SEQ ID NO：5至少有80％(例如：至少82％、至少 85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与SEQ ID NO： 5具有相同活性的序列，例如可表现出具有生成磷酸吡哆醛的PdxK活性的蛋 白质。于本公开的一些具体实施例中，生成磷酸吡哆醛的PdxK具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列或与SEQ ID NO：6具有保守变异的氨基酸序列。

如本文中所使用，术语“序列一致性百分比”是指一候选蛋白质或核酸 片段的氨基酸或核苷酸残基与一参考蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸残 基完全相同的百分比。于进行上述比对时，可先将候选蛋白质或核酸片段与 所述的蛋白质或核酸片段并排(align)，并于必要时引入空位(gap)，以使二 序列形成最高的序列一致性。在计算序列一致性时，保守变异的氨基酸残基 将视为不同的残基；简并密码子的核苷酸残基也将视为不同的残基，例如同 样编码天门冬酰氨酸的密码子AAU和AAC之间，将视为有一个不同的残基U或C。

应当理解，相较于本公开中作为参考蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷 酸序列，序列中的至少一部分经修饰(如缺失、取代或添加)的候选蛋白质 或核酸片段的氨基酸或核苷酸序列也在本公开的范围内，只要所得的候选蛋 白质或核酸片段实质上具有与参考蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸相同 的生物活性，这是由于密码子的简并性(codondegeneracy)。举例而言，在 本公开所编码生成磷酸吡哆醛的酶的核苷酸序列中，可在编码区中产生各种 修饰，前提是其不改变自该编码区表达的多肽的活性。因此，本公开所编码生成磷酸吡哆醛的pdxH基因的核苷酸序列可为具有SEQ ID NO：1的核苷酸 序列或与SEQID NO：1至少有80％序列一致性的任何核苷酸序列，只要该 核苷酸序列所编码的蛋白质能够呈现生成磷酸吡哆醛的PdxH的活性。同理， 本公开中生成磷酸吡哆醛的PdxH可为具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或 与SEQ ID NO：2同源的任何蛋白质，只要该蛋白质实质上能够呈现生成磷 酸吡哆醛的PdxH的活性。

如本文中所使用，术语“持续型启动子”是指在多数或全部组织中保持 持续活性的启动子，相对于诱导型启动子必须受到外界信号或诱导物而调控， 持续型启动子可持续表达特定基因。

适用于本公开的持续型启动子包括属于J系列持续型启动子中的成员， 例如：J23100、J23101、J23102、J23103、J23104、J23105、J23106、J23107、 J23108、J23109、J23110、J23111、J23112、J23113、J23114、J23115、J23116、 J23117、J23118及J23119。于至少一个具体实施例中，本公开所使用的持续 型启动子可为J23100、J23109或J23114。于一些具体实施例中，本公开所使 用的持续型启动子具有SEQ ID NO：7的序列或与SEQ ID NO：7至少有80％ (例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％) 序列一致性且与SEQ ID NO：7具有相同活性的序列，例如同样可作为持续 型启动子的序列。

适用于本公开的持续型启动子进一步包括PlacI持续型启动子。于一些 具体实施例中，该持续型启动子具有SEQ ID NO：8的序列或与SEQ ID NO： 8至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％ 或100％)序列一致性且与SEQ ID NO：8具有相同活性的序列，例如同样可 作为持续型启动子的序列。

根据本公开的至少一个具体实施例，本公开的表达载体进一步包括选自 由下列所组成组的至少一者：标记基因序列、报告基因序列、抗生素抗性基 因序列、限制酶切割位置序列、聚腺苷酸化(polyadenylation)位置序列、加 强子序列、终止子序列以及调节子序列。

于一些具体实施例中，本公开的表达载体具有SEQ ID NO：9的序列或 与SEQ IDNO：9至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至 少95％、至少98％或100％)序列一致性且与SEQ ID NO：9具有相同活性 的序列。于一些具体实施例中，本公开的表达载体具有SEQ ID NO：10的序 列或与SEQ ID NO：10至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、 至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与SEQ ID NO：10具有相同活 性的序列。

如本文中所使用，术语“赖氨酸脱羧酶”是指参与生物体生成1,5-戊二 胺反应的酶，包括两种赖氨酸脱羧酶，即赖氨酸脱羧酶1(lysine decarboxylase 1，CadA)及赖氨酸脱羧酶2(lysine decarboxylase 2，LdcC)，其中CadA为 诱导型酶，由缺氧、过多赖氨酸供给及pH改变所诱导，而LdcC则为持续型 酶，不受外在pH改变所影响。

根据本公开的至少一个具体实施例，该编码赖氨酸脱羧酶CadA的核苷 酸序列为具有与SEQ ID NO：11至少有80％(例如：至少82％、至少85％、 至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与SEQ ID NO：11 具有相同活性的序列，例如可表现出具有赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质。于一 些具体实施例中，该赖氨酸脱羧酶CadA具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列 或与SEQ ID NO：12具有保守变异的氨基酸序列。于本公开至少一个具体实施例所提供的表达载体，其包括编码赖氨酸脱羧酶CadA的核苷酸序列，以 及控制该赖氨酸脱羧酶的核酸分子表达的持续型启动子序列。于本公开的一 些具体实施例中，提供有一种包含该赖氨酸脱羧酶CadA表达载体的重组微 生物，以及利用该微生物生产1,5-戊二胺的方法。于本公开的一些具体实施 例中，该表达载体具有SEQ ID NO：13的序列或与SEQ IDNO：13至少有 80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％) 序列一致性且与SEQ ID NO：13具有相同活性的序列。

根据本公开的至少一个具体实施例，本公开提供一种包含两种或两种以 上不同表达载体的微生物，其包括表达赖氨酸脱羧酶CadA的表达载体以及 表达生成磷酸吡哆醛的PdxH、PdxY或PdxK的重组微生物。于一些具体实 施例中，本公开所提供的重组微生物可同时表达赖氨酸脱羧酶CadA及生成 磷酸吡哆醛，生成该磷酸吡哆醛的酶为pdxH、pdxY或pdxK基因所编码的生 成磷酸吡哆醛的PdxH、PdxY或PdxK。于一些具体实施例中，本公开提供 一种可自行生成磷酸吡哆醛的重组微生物。

如本文中所使用，术语“重组”是指以人工方式组合两个彼此分离的序 列片段。一般而言，术语“重组”是指核酸、蛋白质或微生物含有源自于多 个不同来源的遗传物质，或由源自于多个不同来源的遗传物质编码，诸如源 自于两种或更多种不同品系或物种的生物。

如本文中所使用，术语“外源基因”是指源自于一个或多个不同来源的 遗传物质编码，诸如源自于两种或更多种不同品系或物种的生物，可以利用 已知的基因重组技术将外源基因于选定的宿主中表达，例如，使用表达载体 在宿主中表达外源基因。

如本文中所使用，术语“微生物”属于微观生物体，包括细菌、古细菌、 病毒或真菌等。如于本文中所使用，“微生物”的引述应理解为涵盖“细菌”。

适用于作为本公开的表达载体的微生物宿主包括，但不限于，属于大肠 杆菌属(Escherichia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)、 沙雷氏菌属(Serratia)、普罗威登斯菌属(Providencia)、棒状杆菌属 (Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)的微生物。于一些具体实 施例中，本公开所使用的微生物宿主能够于体内表达赖氨酸脱羧酶CadA及 pdxK、pdxH或pdxY所编码的磷酸吡哆醛生成酶。于一些具体实施例中，本 公开所使用的微生物宿主除了能够于体内表达赖氨酸脱羧酶CadA及pdxK、pdxH或pdxY所编码的磷酸吡哆醛生成酶外，对于戊二胺也具有耐受性。

如本文中所使用，术语“辅酶”或“辅助因子”包含正常酶活性所需的 非蛋白质化合物。该等化合物可为有机物或无机物，例如，适用于本公开的 辅酶或辅助因子包括，但不限于，磷酸吡哆醛(PLP)、吡哆醛(PL)和吡哆 醇(PN)等维生素B6的前体。

以下通过特定的具体实施例进一步说明本公开的特点及功效，但非用于 限制本公开的范围。

实施例

实施例1：构建表达载体

以大肠杆菌K-12MG1655的基因组作为模板，设计带有HindIII及SpeI 切位的引物以构建持续型启动子表达PLP的超级救援基因pdxH、pdxY及 pdxK，所使用的引物如下表一所示。

表一、用于构建表达载体的引物

以MG1655基因组作为模板并使用上述引物进行聚合酶链反应 (polymerasechain reaction，PCR)，得到相关基因的特定DNA序列扩增片段。 用于扩增特定DNA序列片段的PCR反应所需要的材料包含DNA模板、5’ 端引物、3’端引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、10x聚合酶缓冲液以及聚合 酶，其中在本实施例中所使用的聚合酶包括Ex-Taq。PCR产物以DNA电泳 分析并经割胶回收，得到扩增的PLP超级救援基因pdxH、pdxY及pdxK片段。

将扩增的基因片段以HindIII及SpeI进行酶切反应，接着将扩增的PLP 超级救援基因片段插入pSU-J23100或pSU-PlacI载体内，构建成 pSU-J23100-pdxH(以JH表示，即以pSU-J23100启动子驱动pdxH基因表达)、 pSU-PlacI-pdxH(以PH表示，即以pSU-PlacI启动子驱动pdxH基因表达)、 pSU-J23100-pdxY(以JY表示，即以pSU-J23100启动子驱动pdxY基因表达)、 pSU-PlacI-pdxY(以PY表示，即以pSU-PlacI启动子驱动pdxY基因表达)、 pSU-J23100-pdxK(以JK表示，即以pSU-J23100启动子驱动pdxK基因表达)、 以及pSU-PlacI-pdxK(以PK表示，即以pSU-PlacI启动子驱动pdxK基因表 达)等质粒，再将质粒转化送入DH5α菌株。

进行热转化时，取一管市售的DH5α胜任细胞，加入上述所得的质粒约 10μL，先于冰上放置30分钟，再置于42℃水浴加热1.5分钟，之后置于冰 上5至10分钟，接着加入400μL的LB(Luria Bertani)液态培养基或SOC (super optimal broth with catabolitesrepression)培养基，置于37℃培养箱震 荡培养约60至90分钟，再以4,000rpm离心3分钟，去除300μL的上清液， 将含有重组DNA的胜任细胞全数涂布于含抗生素的固态培养基上，并置于 37℃环境下过夜培养。由此固态培养基上所生成的菌落，选取数颗接种于含 抗生素的液态培养基中，于37℃培养箱过夜培养，获得含有各种质粒的DH5α 菌液。

实施例2：持续型自生成PLP菌株的制备及其PLP表达量

抽取实施例1所制得并保存于DH5α细胞中的各质粒pSU-J23100-pdxH、pSU-PlacI-pdxH、pSU-J23100-pdxY、pSU-PlacI-pdxY、pSU-J23100-pdxK及 pSU-PlacI-pdxK，经热转化送入大肠杆菌BL21或W3110菌株，将含有上述 质粒的BL21或W3110菌株的胜任细胞涂布于含抗生素的固态培养基上，并 置于37℃环境下过夜培养，再取数颗接种于含抗生素的液态培养基中，于 37℃培养箱过夜培养，获得含有各质粒的BL21或W3110菌株，即为持续型 自生成PLP的菌株。

将前述制得的持续型自生成PLP的菌株培养于液态培养基中，在其中添 加0.2mM的吡哆醇(PN)或吡哆醛(PL)进行培养，之后利用十二烷基硫 酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析各菌株的蛋白质表达量，并以野生型的BL21 或W3110作为对照。

在此进一步说明SDS-PAGE蛋白质分析法的步骤。首先，收集细胞并调 整至OD₆₀₀为4，以去离子水洗涤2次后，提取细胞蛋白质。取30μL蛋白质 样品后混合10μL的蛋白质染剂，以100℃加热10分钟，于SDS胶片样品 槽中加入15μL的样品溶液，即可进行SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE的 设定程序为先以80V进行30分钟，再以120V进行60分钟，待蓝色指示线 跑出胶片的底端时停止，再以考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)染色40 分钟至60分钟，并脱色约40分钟，视实际染色情况更换脱色液。待背景蓝 色完全脱去后，换上去离子水，待背景颜色清楚后进行扫描。结果如图1所 示，各种质粒在不同宿主菌株及添加PN或PL等不同前体所获得的蛋白质表 达量不同，例如，添加PL前体时，含有JY、PY及PK质粒的BL21菌株具 有较高的PLP蛋白质表达。

进一步针对菌株的胞内PLP进行定量。将过夜培养细胞定量至OD₆₀₀为 20，以无菌水洗涤3次，再以12,000rpm离心3分钟，再将细胞回溶于1mL 无菌水中。利用高压破碎仪以30KPsi破碎细胞，得到胞内代谢物，加入10％ 三氯醋酸，剧烈震荡后在冰上静置10分钟，以14,000g离心10分钟后去除 蛋白质，取上清液以高效液相层析(high performance liquidchromatography， HPLC)定量持续型自生成PLP菌株中的PLP产量。

HPLC定量PLP的方式和分析条件包括将待分析样品通过0.2μm滤膜以 进行过滤，使用的柱为反相色谱C18(YMC-C18色谱柱，4.6×250mm，粒 径为5μm)，洗提缓冲液为0.1M的磷酸二氢钾(pH 6.6)，洗提时间为0至 20分钟，流速设为0.8mL/min，进样量为50μL。柱温维持在35℃，并且在 340nm的波长处测量PLP。以不同浓度标准品PLP作为对照，即可测得样品中的PLP浓度。

图2显示BL21或W3110菌株中以不同质粒驱动PLP表达的PLP定量 结果，其显示pSU-J23100-pdxH(JH)质粒于W3110菌株宿主中的表达量相 较于未经任何质粒转形的原始菌株具有显著差异，而pSU-J23100-pdxH(JH)、 pSU-PlacI-pdxH(PH)、pSU-J23100-pdxY(JY)与pSU-PlacI-pdxK(PK)质 粒于BL21菌株宿主中的表达量相较于未经任何质粒转形的原始菌株具有显 著差异。

实施例3：双质粒菌株的制备及活性和产量的测试

构建pSIT-CadA表达载体，从大肠杆菌MG1655(GenBank：NC_000913) 的基因组DNA中扩增赖氨酸脱羧酶基因，使用限制性内切酶BamHI和NotI 切出粘性末端，再以连接酶接进pSIT载体(pSIT载体购自Addgene，载体 商品名称：pSKDuet16，编号：#41684)以生成pSIT-CadA(SEQ ID NO.20)。 将pSIT-CadA与pSU-J23100-pdxY或pSU-PlacI-pdxK同时送入BL21细胞， 并于含有卡那霉素(kanamycin)与氯霉素(chloramphenicol)的双抗性培养 基进行筛选，以构建双质粒菌株。

接着，进行生物发酵法，即，将上述双质粒系统在液态培养基中于37℃ 培养，并以200rpm震荡，当细胞培养至OD₆₀₀到达0.6时，添加0.01mM的 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-d-1-thiogalactopyranoside，IPTG)、0.2 mM的PN与50g/L的赖氨酸，并将细胞改至30℃，并以200rpm震荡培养。 定时取样，以测量细胞生长情形、赖氨酸的消耗量与戊二胺的生成量。

如图3A的结果所示，含有pSIT-CadA与pSU-J23100-pdxY(AJY)和含 有pSIT-CadA与pSU-PlacI-pdxK(APK)的双质粒系统在10小时后，其生 物质(biomass)均较仅含有pSIT-CadA(A)的菌株多，代表其生长情形较 佳。图3B显示AJY可在短时间内促进戊二胺的生产，而APK则可以达到最 大的转化。图3C另显示双质粒系统具有较高的自生成PLP能力。

以双质粒系统进行全细胞转化，其步骤包括将过夜培养的细胞以8,000g 离心5分钟后收集，使用纯水清洗2次后投入不同浓度的赖氨酸溶液中，在 37℃下，以200rpm的震荡条件进行全细胞催化反应。于一定时间后将反应 液置于100℃下水煮10分钟，再以高速离心取上清液，并以HPLC定量分 析赖氨酸消耗率与戊二胺生成率。

以HPLC定量分析赖氨酸与戊二胺衍生化体系由340μL的0.05M硼酸 缓冲液(pH9)、240μL的100％甲醇、6μL的样品和12μL的200mM的乙 氧基亚甲基丙二酸二乙酯(diethylethoxymethylenemalonate，DEEMM)组成。 将上述样品在70℃下加热2小时，以完全降解过量的DEEMM和衍生化副 产物。使用DEEMM进行衍生化后，再利用HPLC进行分析。C18柱(YMC-C18 柱，4.6×250mm，粒径5μm)维持在35℃。流动相A由100％乙腈组成，流 动相B由25mM乙酸钠水溶液(pH 4.8)组成。使用0.8mL/min的流速，并 采用以下梯度程序：0–2分钟，20–25％A；2–32分钟，25–60％A；32–40分 钟，60–20％A。检测在284nm进行。

图4显示双质粒系统于不同浓度赖氨酸的催化效果，结果显示，APK系 统催化能力最佳，且具有最高的戊二胺产率及赖氨酸消耗率。

实施例4：自生成PLP驯化菌株活性比较

以驯化方式获得一持续型自生成PLP菌株，包括将含有 pSU-J23100-CadA的W3110菌株培养于含有高浓度吡哆醛(PL)的LB液态 培养基中，此处吡哆醛(PL)的浓度为10至150μM，过夜培养后将该菌 株接种于新鲜的含有高浓度的吡哆醛(PL)的培养基中，如此反复继代10 次。将上述菌株均匀涂布在含有20g/L赖氨酸和100μM吡哆醛(PL)的 LB琼脂培养基上(pH 5.0)，挑选所得到的单菌落，进行CadA酶活性测试， 从中筛选出酶活性最高的菌株，而获得同时表达CadA及PLP相关基因的自 生成PLP菌株(本文后以JcadA-Wmut代表此经驯化的菌株)。

将过夜培养的细胞以8000x g离心共5分钟后进行收集，使用纯水清洗 2次后投入1.2M的赖氨酸溶液中，并添加PLP、PN或PL等不同的前体， 在37℃、200rpm震荡的条件下进行全细胞催化反应，并参考文献以溴甲酚 紫分析法(bromophenol purple test，BP test)测定CadA活性(Ting,W.W., Huang,C.Y.,Wu,P.Y.,Huang,S.F.,Lin,H.Y.,Li,S.F.,Chang,J.S.&Ng,I.S. (2021).Whole-cell biocatalyst for cadaverine production usingstable,constitutive and high expression of L-lysine decarboxylase inrecombinant Escherichia coli W3110.Enzyme and Microbial Technology,109811)。

测定赖氨酸脱羧酶(CadA)活性的BP分析步骤如下，首先取得OD₆₀₀定量为5的液体培养后所得的细菌细胞，进行高压破菌(30Kpsi)后，以12,000 rpm离心5分钟，可得到含有赖氨酸脱羧酶的可溶性蛋白样品。初步测试不 同浓度赖氨酸对最大反应速率的关系，发现初始赖氨酸浓度为40mM时可得 到戊二胺与HPLC结果最佳的关联性。BP分析法在碱性会呈现紫色，在酸性 则会呈现黄色。经过赖氨酸脱羧酶的反应，可增加戊二胺，并使pH上升， 故BP分析法可侦测在波长595nm下的呈色，以测定赖氨酸脱羧酶(CadA) 的活性。

使用下表二中的反应条件测量赖氨酸脱羧酶的活性，最后加入3％的三 氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)使赖氨酸脱羧酶所进行的反应终止，并借由 波长595nm的变化(△OD₅₉₅)经由HPLC戊二胺的定量得到校准曲线。

表二、赖氨酸脱羧酶活性测量方法的反应条件

项目	浓度	体积(μL)
			赖氨酸	40mM	40
PLP	0.01mM	10*
			BP分析	0.2g/L	25
试样(OD<sub>600</sub>)	5	25
			醋酸钠缓冲液，pH＝6	0.5M	400
总体积		500μL

*测试突变株CadA酶活性时可不加PLP

如图5所示，JcadA-Wmut的CadA活性以添加PL作为辅助因子时为最 高，甚至高于添加PLP作为辅助因子时。

另外，如图6所示，使用PL作为前体，并使用JcadA-Wmut作为生物催 化剂时，可催化1.2M赖氨酸完全转化为戊二胺，而不需添加辅助因子PLP， 最终可达95％以上的戊二胺转化率及124g/L的戊二胺产量。

实施例5：使用JcadA-Wmut作为循环利用催化剂

将上述于2M赖氨酸的全细胞催化液中的细胞以12,000rpm离心1分钟 后回收，再投入至2M的赖氨酸溶液中，并添加新的JcadA-Wmut菌株细胞， 添加量以OD₆₀₀值计分别为1、2、3及5，如此循环利用2次。每次催化时 间为4小时。催化后的溶液使用HPLC定量赖氨酸与戊二胺浓度。

结果如图7所示，JcadA-Wmut在每次补料OD₆₀₀值为5的条件下，可以 循环利用至少2次，且仍维持95％以上的赖氨酸转化率。

上述实施例仅为例示性说明，而非用于限制本公开。任何本领域技术人 员均可在不违背本公开的范围下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本 公开的权利保护范围将由所附权利要求所定义，只要不影响本公开的效果及 实施目的，皆应涵盖于本公开的内容中。

生物材料寄存

本公开所提供的重组微生物为大肠杆菌(Escherichia coli) JcadA-Wmut，于2021年1月11日以寄存编号DSM 33754寄存于德国微生物 保藏中心(Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen， DSMZ，德国，不伦瑞克市，D-38124，因霍芬大街7B)。

序列表

<110> 台湾中国石油化学工业开发股份有限公司

<120> 重组微生物及其用于生产1,5-戊二胺的方法

<130> 115589

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 657

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 1

atgtctgata acgacgaatt gcagcaaatc gcgcatctgc gctgtgaata caccaaaggc 60

gggttacgcc gccgcgatct tcccgccgat ccattaaccc tttttgaacg ttggctctct 120

caggcttgtg aagccaaact ggcggaccct accgcgatgg tggtcgctac cgtggatgaa 180

catggtcagc cttatcagcg catcgtttta ctcaaacatt acgacgaaaa aggcatggtg 240

ttttacacca acctcggcag ccgtaaagca catcaaatcg aaaataatcc gcgcgttagc 300

ctgctgttcc cgtggcatac ccttgagcgc caggtgatgg tgatcggtaa agcagaacga 360

ctttcgactc tcgaagtgat gaaatatttt catagccgcc cgcgtgatag ccagattggt 420

gcatgggttt cgaagcagtc cagtcgcatt tctgcccgcg gtatccttga aagtaaattc 480

ctggagctga agcagaagtt tcaacagggc gaagtgccat tgccgagctt ttggggcggt 540

tttcgcgtca gccttgaaca gattgagttc tggcagggtg gtgagcatcg cctgcatgac 600

cgctttttgt accagcgtga aaatgatgcg tggaagattg atcgtcttgc accctga 657

<210> 2

<211> 218

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 2

Met Ser Asp Asn Asp Glu Leu Gln Gln Ile Ala His Leu Arg Cys Glu

1 5 10 15

Tyr Thr Lys Gly Gly Leu Arg Arg Arg Asp Leu Pro Ala Asp Pro Leu

20 25 30

Thr Leu Phe Glu Arg Trp Leu Ser Gln Ala Cys Glu Ala Lys Leu Ala

35 40 45

Asp Pro Thr Ala Met Val Val Ala Thr Val Asp Glu His Gly Gln Pro

50 55 60

Tyr Gln Arg Ile Val Leu Leu Lys His Tyr Asp Glu Lys Gly Met Val

65 70 75 80

Phe Tyr Thr Asn Leu Gly Ser Arg Lys Ala His Gln Ile Glu Asn Asn

85 90 95

Pro Arg Val Ser Leu Leu Phe Pro Trp His Thr Leu Glu Arg Gln Val

100 105 110

Met Val Ile Gly Lys Ala Glu Arg Leu Ser Thr Leu Glu Val Met Lys

115 120 125

Tyr Phe His Ser Arg Pro Arg Asp Ser Gln Ile Gly Ala Trp Val Ser

130 135 140

Lys Gln Ser Ser Arg Ile Ser Ala Arg Gly Ile Leu Glu Ser Lys Phe

145 150 155 160

Leu Glu Leu Lys Gln Lys Phe Gln Gln Gly Glu Val Pro Leu Pro Ser

165 170 175

Phe Trp Gly Gly Phe Arg Val Ser Leu Glu Gln Ile Glu Phe Trp Gln

180 185 190

Gly Gly Glu His Arg Leu His Asp Arg Phe Leu Tyr Gln Arg Glu Asn

195 200 205

Asp Ala Trp Lys Ile Asp Arg Leu Ala Pro

210 215

<210> 3

<211> 864

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 3

atgatgaaaa atattctcgc tatccagtct cacgttgttt atggtcatgc gggtaacagt 60

gcggcagagt ttccgatgcg ccgcctgggc gcgaacgtct ggccgctgaa caccgttcaa 120

ttttctaatc acacccaata cggcaaatgg actggctgcg tgatgccgcc cagccattta 180

accgaaattg tgcaaggcat tgccgccatt gataaattac acacctgtga tgccgtatta 240

agtggctatc tgggatcggc ggagcagggt gaacatatcc tcggtatcgt ccgtcaggtg 300

aaagccgcga atccgcaggc gaaatatttt tgcgatccgg taatgggtca tccggaaaaa 360

ggctgtatcg ttgcaccggg tgtcgcagag tttcatgtgc ggcacggttt gcctgccagc 420

gatatcattg cgccaaatct ggttgagctg gaaatactct gtgagcatgc ggtaaataac 480

gtcgaagaag cggttctggc agcgcgcgaa ctcattgcgc aagggccaca aattgtgttg 540

gttaaacacc tggcgcgagc tggctacagc cgtgaccgtt ttgaaatgct gctggtcacc 600

gccgatgaag cctggcatat cagccgtccg ctggtggatt ttggtatgcg ccagccggta 660

ggtgttggtg atgtgacgag cggtttactg ctggtgaaac cgcttcaggg ggcaacgctg 720

caggaggcgc tggaacatgt gaccgctgca gtctacgaaa tcatggtgac caccaaagca 780

atgcaggaat atgagctgca agtggtggct gctcaggatc gtattgccaa accagaacat 840

tacttcagcg caacaaagct ctga 864

<210> 4

<211> 287

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 4

Met Met Lys Asn Ile Leu Ala Ile Gln Ser His Val Val Tyr Gly His

1 5 10 15

Ala Gly Asn Ser Ala Ala Glu Phe Pro Met Arg Arg Leu Gly Ala Asn

20 25 30

Val Trp Pro Leu Asn Thr Val Gln Phe Ser Asn His Thr Gln Tyr Gly

35 40 45

Lys Trp Thr Gly Cys Val Met Pro Pro Ser His Leu Thr Glu Ile Val

50 55 60

Gln Gly Ile Ala Ala Ile Asp Lys Leu His Thr Cys Asp Ala Val Leu

65 70 75 80

Ser Gly Tyr Leu Gly Ser Ala Glu Gln Gly Glu His Ile Leu Gly Ile

85 90 95

Val Arg Gln Val Lys Ala Ala Asn Pro Gln Ala Lys Tyr Phe Cys Asp

100 105 110

Pro Val Met Gly His Pro Glu Lys Gly Cys Ile Val Ala Pro Gly Val

115 120 125

Ala Glu Phe His Val Arg His Gly Leu Pro Ala Ser Asp Ile Ile Ala

130 135 140

Pro Asn Leu Val Glu Leu Glu Ile Leu Cys Glu His Ala Val Asn Asn

145 150 155 160

Val Glu Glu Ala Val Leu Ala Ala Arg Glu Leu Ile Ala Gln Gly Pro

165 170 175

Gln Ile Val Leu Val Lys His Leu Ala Arg Ala Gly Tyr Ser Arg Asp

180 185 190

Arg Phe Glu Met Leu Leu Val Thr Ala Asp Glu Ala Trp His Ile Ser

195 200 205

Arg Pro Leu Val Asp Phe Gly Met Arg Gln Pro Val Gly Val Gly Asp

210 215 220

Val Thr Ser Gly Leu Leu Leu Val Lys Pro Leu Gln Gly Ala Thr Leu

225 230 235 240

Gln Glu Ala Leu Glu His Val Thr Ala Ala Val Tyr Glu Ile Met Val

245 250 255

Thr Thr Lys Ala Met Gln Glu Tyr Glu Leu Gln Val Val Ala Ala Gln

260 265 270

Asp Arg Ile Ala Lys Pro Glu His Tyr Phe Ser Ala Thr Lys Leu

275 280 285

<210> 5

<211> 852

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 5

atgagtagtt tgttgttgtt taacgataag agtagggcac tgcaggcgga tatcgtcgcc 60

gtgcagtcgc aggtggttta cggcagcgtg ggcaacagca ttgccgtgcc tgctatcaaa 120

cagaacggcc tgaatgtctt tgccgtgccg acggtattgc tgagcaatac gccgcattat 180

gacactttct acggtggtgc gattccggac gaatggttta gcggctattt gcgtgcgctt 240

caggagcgtg atgcgctgcg ccaacttcgt gctgtaacca cgggctatat gggaacggca 300

tcgcaaatca aaatccttgc cgagtggctg actgcgctac gcaaagacca tcctgaccta 360

ttgatcatgg tcgatccggt gattggcgat attgatagcg gaatttatgt caaacctgac 420

cttcccgaag cgtatcgaca atatttactg ccgctggcgc agggaattac ccccaatatc 480

tttgagttgg aaatcctgac cggtaaaaat tgccgcgatc tcgacagtgc cattgctgcc 540

gcaaaaagtc tgctttcaga cacattaaaa tgggtggtgg ttaccagcgc ctccggtaat 600

gaagaaaatc aggagatgca ggttgtggtg gtcactgccg acagcgtgaa tgtcatttcc 660

cattcacggg taaaaaccga cctgaaaggg actggcgacc tgttttgtgc tcagctcatc 720

agtggcttgc tgaaagggaa ggcgttaacc gatgcagtgc accgagcggg gttgcgcgta 780

ctggaagtga tgcgctacac ccagcagcat gagagcgatg aattgatttt gccgccgctg 840

gcggaagcat aa 852

<210> 6

<211> 283

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 6

Met Ser Ser Leu Leu Leu Phe Asn Asp Lys Ser Arg Ala Leu Gln Ala

1 5 10 15

Asp Ile Val Ala Val Gln Ser Gln Val Val Tyr Gly Ser Val Gly Asn

20 25 30

Ser Ile Ala Val Pro Ala Ile Lys Gln Asn Gly Leu Asn Val Phe Ala

35 40 45

Val Pro Thr Val Leu Leu Ser Asn Thr Pro His Tyr Asp Thr Phe Tyr

50 55 60

Gly Gly Ala Ile Pro Asp Glu Trp Phe Ser Gly Tyr Leu Arg Ala Leu

65 70 75 80

Gln Glu Arg Asp Ala Leu Arg Gln Leu Arg Ala Val Thr Thr Gly Tyr

85 90 95

Met Gly Thr Ala Ser Gln Ile Lys Ile Leu Ala Glu Trp Leu Thr Ala

100 105 110

Leu Arg Lys Asp His Pro Asp Leu Leu Ile Met Val Asp Pro Val Ile

115 120 125

Gly Asp Ile Asp Ser Gly Ile Tyr Val Lys Pro Asp Leu Pro Glu Ala

130 135 140

Tyr Arg Gln Tyr Leu Leu Pro Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Asn Ile

145 150 155 160

Phe Glu Leu Glu Ile Leu Thr Gly Lys Asn Cys Arg Asp Leu Asp Ser

165 170 175

Ala Ile Ala Ala Ala Lys Ser Leu Leu Ser Asp Thr Leu Lys Trp Val

180 185 190

Val Val Thr Ser Ala Ser Gly Asn Glu Glu Asn Gln Glu Met Gln Val

195 200 205

Val Val Val Thr Ala Asp Ser Val Asn Val Ile Ser His Ser Arg Val

210 215 220

Lys Thr Asp Leu Lys Gly Thr Gly Asp Leu Phe Cys Ala Gln Leu Ile

225 230 235 240

Ser Gly Leu Leu Lys Gly Lys Ala Leu Thr Asp Ala Val His Arg Ala

245 250 255

Gly Leu Arg Val Leu Glu Val Met Arg Tyr Thr Gln Gln His Glu Ser

260 265 270

Asp Glu Leu Ile Leu Pro Pro Leu Ala Glu Ala

275 280

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子序列

<400> 7

ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc 35

<210> 8

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子序列

<400> 8

caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca 60

ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc 120

attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga 180

gcggataaca atttcacaca 200

<210> 9

<211> 3077

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒序列

<400> 9

ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagcggatc caaagaggag aaaaagctta 60

tgatgaaaaa tattctcgct atccagtctc acgttgttta tggtcatgcg ggtaacagtg 120

cggcagagtt tccgatgcgc cgcctgggcg cgaacgtctg gccgctgaac accgttcaat 180

tttctaatca cacccaatac ggcaaatgga ctggctgcgt gatgccgccc agccatttaa 240

ccgaaattgt gcaaggcatt gccgccattg ataaattaca cacctgtgat gccgtattaa 300

gtggctatct gggatcggcg gagcagggtg aacatatcct cggtatcgtc cgtcaggtga 360

aagccgcgaa tccgcaggcg aaatattttt gcgatccggt aatgggtcat ccggaaaaag 420

gctgtatcgt tgcaccgggt gtcgcagagt ttcatgtgcg gcacggtttg cctgccagcg 480

atatcattgc gccaaatctg gttgagctgg aaatactctg tgagcatgcg gtaaataacg 540

tcgaagaagc ggttctggca gcgcgcgaac tcattgcgca agggccacaa attgtgttgg 600

ttaaacacct ggcgcgagct ggctacagcc gtgaccgttt tgaaatgctg ctggtcaccg 660

ccgatgaagc ctggcatatc agccgtccgc tggtggattt tggtatgcgc cagccggtag 720

gtgttggtga tgtgacgagc ggtttactgc tggtgaaact gcttcagggg gcaacgctgc 780

aggaggcgct ggaacatgtg accgctgcag tctacgaaat catggtgacc accaaagcaa 840

tgcaggaata tgagctgcaa gtggtggctg ctcaggatcg tattgccaaa ccagaacatt 900

acttcagcgc aacaaagctc tgaactagta gcggccgctg cagtccggca aaaaagggca 960

aggtgtcacc accctgccct ttttctttaa aaccgaaaag attacttcgc gttatgcaga 1020

tctattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 1080

cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 1140

actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 1200

gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 1260

ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 1320

acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 1380

ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 1440

cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 1500

tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 1560

gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 1620

ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 1680

acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 1740

gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 1800

ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 1860

tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 1920

gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 1980

tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 2040

ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 2100

taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagagt 2160

cgacaaatta cgccccgccc tgccactcat cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc 2220

tgccgacatg gaagccatca caaacggcat gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca 2280

ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca tggtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca 2340

tattggccac gtttaaatca aaactggtga aactcaccca gggattggct gagacgaaaa 2400

acatattctc aataaaccct ttagggaaat aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat 2460

cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg 2520

aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca 2580

ccagctcacc gtctttcatt gccatacgaa attccggatg agcattcatc aggcgggcaa 2640

gaatgtgaat aaaggccgga taaaacttgt gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg 2700

ccgtaatatc cagctgaacg gtctggttat aggtacattg agcaactgac tgaaatgcct 2760

caaaatgttc tttacgatgc cattgggata tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt 2820

tctccatttt agcttcctta gctcctgaaa atctcgataa ctcaaaaaat acgcccggta 2880

gtgatcttat ttcattatgg tgaaagttgg aacctcttac gtgcccgatc aactcgagtg 2940

ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 3000

acgaggcaga atttcagata aaaaaaatcc ttagctttcg ctaaggatga tttctggaat 3060

tcgcggccgc ttctaga 3077

<210> 10

<211> 3230

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒序列

<400> 10

caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca 60

ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc 120

attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga 180

gcggataaca atttcacaca ggatccaaag aggagaaaaa gcttatgagt agtttgttgt 240

tgtttaacga taagagtagg gcactgcagg cggatatcgt cgccgtgcag tcgcaggtgg 300

tttacggcag cgtgggcaac agcattgccg tgcctgctat caaacagaac ggcctgaatg 360

tctttgccgt gccgacggta ttgctgagca atacgccgca ttatgacact ttctacggtg 420

gtgcgattcc ggacgaatgg tttagcggct atttgcgtgc gcttcaggag cgtgatgcgc 480

tgcgccaact tcgtgctgta accacgggct atatgggaac ggcatcgcaa atcaaaatcc 540

ttgccgagtg gctgactgcg ctacgcaaag accatcctga cctattgatc atggtcgatc 600

cggtgattgg cgatattgat agcggaattt atgtcaaacc tgaccttccc gaagcgtatc 660

gacaatattt actgccgctg gcgcagggaa ttacccccaa tatctttgag ttggaaatcc 720

tgaccggtaa aaattgccgc gatctcgaca gtgccattgc tgccgcaaaa agtctgcttt 780

cagacacatt aaaatgggtg gtggttacca gcgcctccgg taatgaagaa aatcaggaga 840

tgcaggttgt ggtggtcact gccgacagcg tgaatgtcat ttcccattca cgggtaaaaa 900

ccgacctgaa agggactggc gacctgtttt gtgctcagct catcagtggc ttgctgaaag 960

ggaaggcgtt aaccgatgca gtgcaccgag cggggttgcg cgtactggaa gtgatgcgct 1020

acacccagca gcatgagagc gatgaattga ttttgccgcc gctggcggaa gcataaacta 1080

gtagcggccg ctgcagtccg gcaaaaaagg gcaaggtgtc accaccctgc cctttttctt 1140

taaaaccgaa aagattactt cgcgttatgc agatctatta atgaatcggc caacgcgcgg 1200

ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1260

cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1320

cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1380

accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1440

acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1500

cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1560

acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 1620

atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 1680

agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 1740

acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 1800

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg 1860

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 1920

gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 1980

gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 2040

acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 2100

tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 2160

ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 2220

catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 2280

ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag agtcgacaaa ttacgccccg ccctgccact 2340

catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac atggaagcca tcacaaacgg 2400

catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta taatatttgc 2460

ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa tcaaaactgg 2520

tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac cctttaggga 2580

aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga atatatgtgt agaaactgcc 2640

ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc tcatggaaaa 2700

cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc accgtctttc attgccatac 2760

gaaattccgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg aataaaggcc ggataaaact 2820

tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat atccagctga acggtctggt 2880

tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga tgccattggg 2940

atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc ttagctcctg 3000

aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct tatttcatta tggtgaaagt 3060

tggaacctct tacgtgcccg atcaactcga gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt 3120

atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc agaatttcag ataaaaaaaa 3180

tccttagctt tcgctaagga tgatttctgg aattcgcggc cgcttctaga 3230

<210> 11

<211> 2148

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 11

atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60

gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120

gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180

aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240

gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300

agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360

actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420

cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480

agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540

tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600

gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660

tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcggcac cattctgatt 720

gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780

tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840

cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900

gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960

acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020

ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080

gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140

aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200

ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260

ggtaagcgtc tgattaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320

cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380

acgactgaat gctggccgct gcgtcctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440

aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500

gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560

catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620

atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680

gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740

tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800

aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860

tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccggag aagtttacct cgacgaaatg 1920

gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980

ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040

gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100

gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaatga 2148

<210> 12

<211> 715

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 12

Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

20 25 30

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

115 120 125

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Gly Thr Ile Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Leu Arg Pro Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465 470 475 480

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590

Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Gly Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625 630 635 640

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys

705 710 715

<210> 13

<211> 4267

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒序列

<400> 13

ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagcggatc caaagaggag aaaaagctta 60

tgaacgttat tgcaatattg aatcacatgg gggtttattt taaagaagaa cccatccgtg 120

aacttcatcg cgcgcttgaa cgtctgaact tccagattgt ttacccgaac gaccgtgacg 180

acttattaaa actgatcgaa aacaatgcgc gtctgtgcgg cgttattttt gactgggata 240

aatataatct cgagctgtgc gaagaaatta gcaaaatgaa cgagaacctg ccgttgtacg 300

cgttcgctaa tacgtattcc actctcgatg taagcctgaa tgacctgcgt ttacagatta 360

gcttctttga atatgcgctg ggtgctgctg aagatattgc taataagatc aagcagacca 420

ctgacgaata tatcaacact attctgcctc cgctgactaa agcactgttt aaatatgttc 480

gtgaaggtaa atatactttc tgtactcctg gtcacatggg cggtactgca ttccagaaaa 540

gcccggtagg tagcctgttc tatgatttct ttggtccgaa taccatgaaa tctgatattt 600

ccatttcagt atctgaactg ggttctctgc tggatcacag tggtccacac aaagaagcag 660

aacagtatat cgctcgcgtc tttaacgcag accgcagcta catggtgacc aacggtactt 720

ccactgcgaa caaaattgtt ggtatgtact ctgctccagc aggcggcacc attctgattg 780

accgtaactg ccacaaatcg ctgacccacc tgatgatgat gagcgatgtt acgccaatct 840

atttccgccc gacccgtaac gcttacggta ttcttggtgg tatcccacag agtgaattcc 900

agcacgctac cattgctaag cgcgtgaaag aaacaccaaa cgcaacctgg ccggtacatg 960

ctgtaattac caactctacc tatgatggtc tgctgtacaa caccgacttc atcaagaaaa 1020

cactggatgt gaaatccatc cactttgact ccgcgtgggt gccttacacc aacttctcac 1080

cgatttacga aggtaaatgc ggtatgagcg gtggccgtgt agaagggaaa gtgatttacg 1140

aaacccagtc cactcacaaa ctgctggcgg cgttctctca ggcttccatg atccacgtta 1200

aaggtgacgt aaacgaagaa acctttaacg aagcctacat gatgcacacc accacttctc 1260

cgcactacgg tatcgtggcg tccactgaaa ccgctgcggc gatgatgaaa ggcaatgcag 1320

gtaagcgtct gattaacggt tctattgaac gtgcgatcaa attccgtaaa gagatcaaac 1380

gtctgagaac ggaatctgat ggctggttct ttgatgtatg gcagccggat catatcgata 1440

cgactgaatg ctggccgctg cgtcctgaca gcacctggca cggcttcaaa aacatcgata 1500

acgagcacat gtatcttgac ccgatcaaag tcaccctgct gactccgggg atggaaaaag 1560

acggcaccat gagcgacttt ggtattccgg ccagcatcgt ggcgaaatac ctcgacgaac 1620

atggcatcgt tgttgagaaa accggtccgt ataacctgct gttcctgttc agcatcggta 1680

tcgataagac caaagcactg agcctgctgc gtgctctgac tgactttaaa cgtgcgttcg 1740

acctgaacct gcgtgtgaaa aacatgctgc cgtctctgta tcgtgaagat cctgaattct 1800

atgaaaacat gcgtattcag gaactggctc agaatatcca caaactgatt gttcaccaca 1860

atctgccgga tctgatgtat cgcgcatttg aagtgctgcc gacgatggta atgactccgt 1920

atgctgcatt ccagaaagag ctgcacggta tgaccggaga agtttacctc gacgaaatgg 1980

taggtcgtat taacgccaat atgatccttc cgtacccgcc gggagttcct ctggtaatgc 2040

cgggtgaaat gatcaccgaa gaaagccgtc cggttctgga gttcctgcag atgctgtgtg 2100

aaatcggcgc tcactatccg ggctttgaaa ccgatattca cggtgcatac cgtcaggctg 2160

atggccgcta taccgttaag gtattgaaag aagaaagcaa aaaatgaaga tctattaatg 2220

aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 2280

cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 2340

ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 2400

ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 2460

cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 2520

actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 2580

cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 2640

tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 2700

gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 2760

caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 2820

agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 2880

tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 2940

tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 3000

gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 3060

gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 3120

aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 3180

atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 3240

gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 3300

acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagagt cgacaaatta 3360

cgccccgccc tgccactcat cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg 3420

gaagccatca caaacggcat gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc 3480

ttgcgtataa tatttgccca tggtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca tattggccac 3540

gtttaaatca aaactggtga aactcaccca gggattggct gagacgaaaa acatattctc 3600

aataaaccct ttagggaaat aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata 3660

tatgtgtaga aactgccgga aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc 3720

agtttgctca tggaaaacgg tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc 3780

gtctttcatt gccatacgaa attccggatg agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat 3840

aaaggccgga taaaacttgt gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc 3900

cagctgaacg gtctggttat aggtacattg agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc 3960

tttacgatgc cattgggata tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt tctccatttt 4020

agcttcctta gctcctgaaa atctcgataa ctcaaaaaat acgcccggta gtgatcttat 4080

ttcattatgg tgaaagttgg aacctcttac gtgcccgatc aactcgagtg ccacctgacg 4140

tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggcaga 4200

atttcagata aaaaaaatcc ttagctttcg ctaaggatga tttctggaat tcgcggccgc 4260

ttctaga 4267

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

aaaagcttat gtctgataac gacgaattgc 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

ctactagttc agggtgcaag acgatcaatc 30

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

aagcttatga tgaaaaatat tctcgctatc c 31

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

ctactagttc agagctttgt tgcgctgaag t 31

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

aagcttatga gtagtttgtt gttgtttaac g 31

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

actagtttat gcttccgcca gcggcggcaa 30

<210> 20

<211> 5926

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒序列

<400> 20

tcccttatgc gactcctgca ttaggaaatt aatacgactc actatagggg aattgtgagc 60

ggataacaat tcccctgtag aaataatttt gtttaacttt aataaggaga tataccatgt 120

ctgaattcga cggatccatg aacgttattg caatattgaa tcacatgggg gtttatttta 180

aagaagaacc catccgtgaa cttcatcgcg cgcttgaacg tctgaacttc cagattgttt 240

acccgaacga ccgtgacgac ttattaaaac tgatcgaaaa caatgcgcgt ctgtgcggcg 300

ttatttttga ctgggataaa tataatctcg agctgtgcga agaaattagc aaaatgaacg 360

agaacctgcc gttgtacgcg ttcgctaata cgtattccac tctcgatgta agcctgaatg 420

acctgcgttt acagattagc ttctttgaat atgcgctggg tgctgctgaa gatattgcta 480

ataagatcaa gcagaccact gacgaatata tcaacactat tctgcctccg ctgactaaag 540

cactgtttaa atatgttcgt gaaggtaaat atactttctg tactcctggt cacatgggcg 600

gtactgcatt ccagaaaagc ccggtaggta gcctgttcta tgatttcttt ggtccgaata 660

ccatgaaatc tgatatttcc atttcagtat ctgaactggg ttctctgctg gatcacagtg 720

gtccacacaa agaagcagaa cagtatatcg ctcgcgtctt taacgcagac cgcagctaca 780

tggtgaccaa cggtacttcc actgcgaaca aaattgttgg tatgtactct gctccagcag 840

gcggcaccat tctgattgac cgtaactgcc acaaatcgct gacccacctg atgatgatga 900

gcgatgttac gccaatctat ttccgcccga cccgtaacgc ttacggtatt cttggtggta 960

tcccacagag tgaattccag cacgctacca ttgctaagcg cgtgaaagaa acaccaaacg 1020

caacctggcc ggtacatgct gtaattacca actctaccta tgatggtctg ctgtacaaca 1080

ccgacttcat caagaaaaca ctggatgtga aatccatcca ctttgactcc gcgtgggtgc 1140

cttacaccaa cttctcaccg atttacgaag gtaaatgcgg tatgagcggt ggccgtgtag 1200

aagggaaagt gatttacgaa acccagtcca ctcacaaact gctggcggcg ttctctcagg 1260

cttccatgat ccacgttaaa ggtgacgtaa acgaagaaac ctttaacgaa gcctacatga 1320

tgcacaccac cacttctccg cactacggta tcgtggcgtc cactgaaacc gctgcggcga 1380

tgatgaaagg caatgcaggt aagcgtctga ttaacggttc tattgaacgt gcgatcaaat 1440

tccgtaaaga gatcaaacgt ctgagaacgg aatctgatgg ctggttcttt gatgtatggc 1500

agccggatca tatcgatacg actgaatgct ggccgctgcg tcctgacagc acctggcacg 1560

gcttcaaaaa catcgataac gagcacatgt atcttgaccc gatcaaagtc accctgctga 1620

ctccggggat ggaaaaagac ggcaccatga gcgactttgg tattccggcc agcatcgtgg 1680

cgaaatacct cgacgaacat ggcatcgttg ttgagaaaac cggtccgtat aacctgctgt 1740

tcctgttcag catcggtatc gataagacca aagcactgag cctgctgcgt gctctgactg 1800

actttaaacg tgcgttcgac ctgaacctgc gtgtgaaaaa catgctgccg tctctgtatc 1860

gtgaagatcc tgaattctat gaaaacatgc gtattcagga actggctcag aatatccaca 1920

aactgattgt tcaccacaat ctgccggatc tgatgtatcg cgcatttgaa gtgctgccga 1980

cgatggtaat gactccgtat gctgcattcc agaaagagct gcacggtatg accggagaag 2040

tttacctcga cgaaatggta ggtcgtatta acgccaatat gatccttccg tacccgccgg 2100

gagttcctct ggtaatgccg ggtgaaatga tcaccgaaga aagccgtccg gttctggagt 2160

tcctgcagat gctgtgtgaa atcggcgctc actatccggg ctttgaaacc gatattcacg 2220

gtgcataccg tcaggctgat ggccgctata ccgttaaggt attgaaagaa gaaagcaaaa 2280

aaaagcttca tgcggccgca taatgcttaa gtcgaacaga aagtaatcgt attgtacacg 2340

gccgcataat cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc 2400

ccatcttagt atattagtta agtataagaa ggagatatac atatggcaga tctcaattgg 2460

atatcggccg gccacgcgat cgctgacgtc ggtaccctcg agtctggtaa agaaaccgct 2520

gctgcgaaat ttgaacgcca gcacatggac tcgtctacta gcgcagctta attaacctag 2580

gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg 2640

aggggttttt tgctgaaacc tcaggcattt gagaagcaca cggtcacact gcttccggta 2700

gtcaataaac cggtaaacca gcaatagaca taagcggcta tttaacgacc ctgccctgaa 2760

ccgacgacaa gctgacgacc gggtctccgc aagtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg 2820

aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgaattaatt 2880

cttagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt attcatatca ggattatcaa 2940

taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc 3000

ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac 3060

ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga 3120

ctgaatccgg tgagaatggc aaaagtttat gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc 3180

agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa accgttattc attcgtgatt 3240

gcgcctgagc gagacgaaat acgcggtcgc tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg 3300

aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat attttcacct gaatcaggat 3360

attcttctaa tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat 3420

catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt 3480

ttagtctgac catctcatct gtaacatcat tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa 3540

acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga 3600

cattatcgcg agcccattta tacccatata aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg 3660

gcctagagca agacgtttcc cgttgaatat ggctcatact cttccttttt caatattatt 3720

gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 3780

ataaacaaat aggcatgcag cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctacgctcgg 3840

tcgttcgact gcggcgagcg gtgtcagctc actcaaaagc ggtaatacgg ttatccacag 3900

aatcagggga taaagccgga aagaacatgt gagcaaaaag caaagcaccg gaagaagcca 3960

acgccgcagg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 4020

tcaagccaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 4080

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 4140

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gttggtatct cagttcggtg 4200

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 4260

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 4320

gcagcagcca ttggtaactg atttagagga ctttgtcttg aagttatgca cctgttaagg 4380

ctaaactgaa agaacagatt ttggtgagtg cggtcctcca acccacttac cttggttcaa 4440

agagttggta gctcagcgaa ccttgagaaa accaccgttg gtagcggtgg tttttcttta 4500

tttatgagat gatgaatcaa tcggtctatc aagtcaacga acagctattc cgttactcta 4560

gatttcagtg caatttatct cttcaaatgt agcacctgaa gtcagcccca tacgatataa 4620

gttgtaattc tcatgttagt catgccccgc gcccaccgga aggagctgac tgggttgaag 4680

gctctcaagg gcatcggtcg agatcccggt gcctaatgag tgagctaact tacattaatt 4740

gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 4800

atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gccagggtgg tttttctttt 4860

caccagtgag acgggcaaca gctgattgcc cttcaccgcc tggccctgag agagttgcag 4920

caagcggtcc acgctggttt gccccagcag gcgaaaatcc tgtttgatgg tggttaacgg 4980

cgggatataa catgagctgt cttcggtatc gtcgtatccc actaccgaga tgtccgcacc 5040

aacgcgcagc ccggactcgg taatggcgcg cattgcgccc agcgccatct gatcgttggc 5100

aaccagcatc gcagtgggaa cgatgccctc attcagcatt tgcatggttt gttgaaaacc 5160

ggacatggca ctccagtcgc cttcccgttc cgctatcggc tgaatttgat tgcgagtgag 5220

atatttatgc cagccagcca gacgcagacg cgccgagaca gaacttaatg ggcccgctaa 5280

cagcgcgatt tgctggtgac ccaatgcgac cagatgctcc acgcccagtc gcgtaccgtc 5340

ttcatgggag aaaataatac tgttgatggg tgtctggtca gagacatcaa gaaataacgc 5400

cggaacatta gtgcaggcag cttccacagc aatggcatcc tggtcatcca gcggatagtt 5460

aatgatcagc ccactgacgc gttgcgcgag aagattgtgc accgccgctt tacaggcttc 5520

gacgccgctt cgttctacca tcgacaccac cacgctggca cccagttgat cggcgcgaga 5580

tttaatcgcc gcgacaattt gcgacggcgc gtgcagggcc agactggagg tggcaacgcc 5640

aatcagcaac gactgtttgc ccgccagttg ttgtgccacg cggttgggaa tgtaattcag 5700

ctccgccatc gccgcttcca ctttttcccg cgttttcgca gaaacgtggc tggcctggtt 5760

caccacgcgg gaaacggtct gataagagac accggcatac tctgcgacat cgtataacgt 5820

tactggtttc acattcacca ccctgaattg actctcttcc gggcgctatc atgccatacc 5880

gcgaaaggtt ttgcgccatt cgatggtgtc cgggatctcg acgctc 5926

Claims (15)

1.一种生产1,5-戊二胺的重组微生物，其包括至少两个基因，且所述至少两个基因的其中至少一者位于表达载体上，其中，所述至少两个基因包括编码赖氨酸脱羧酶的基因以及编码生成磷酸吡哆醛的酶的基因。

2.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述表达载体包括编码赖氨酸脱羧酶、编码生成磷酸吡哆醛的酶或其组合的核苷酸序列以及控制所述核苷酸序列的表达的持续型启动子序列。

3.根据权利要求2所述的重组微生物，其特征在于，所述编码赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列为具有与SEQ ID NO：11至少有80％序列一致性且与SEQ ID NO：11具有相同活性的序列。

4.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述编码生成磷酸吡哆醛的酶的基因的核苷酸序列为表达PdxH、PdxY、PdxK或其任意组合的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的重组微生物，其特征在于：

所述编码表达PdxH的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1至少有80％序列一致性且与SEQID NO：1具有相同活性的序列；

所述编码表达PdxY的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：3至少有80％序列一致性且与SEQID NO：3具有相同活性的序列；或

所述编码表达PdxK的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：5至少有80％序列一致性且与SEQID NO：5具有相同活性的序列。

6.根据权利要求2所述的重组微生物，其特征在于，所述持续型启动子为J系列持续型启动子中的其中一者或PlacI持续型启动子。

7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述J系列持续型启动子为J23100、J23101、J23102、J23103、J23104、J23105、J23106、J23107、J23108、J23109、J23110、J23111、J23112、J23113、J23114、J23115、J23116、J23117、J23118或J23119。

8.根据权利要求1所述的重组微生物，其属于大肠杆菌属、克雷伯菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、普罗威登斯菌属、棒状杆菌属或短杆菌属。

9.根据权利要求8所述的重组微生物，其为经过重组的大肠杆菌K-12W3110菌株或BL21菌株。

10.根据权利要求9所述的重组微生物，其以寄存编号DSM 33754寄存于德国微生物保藏中心。

11.一种生产1,5-戊二胺的方法，包括：

将根据权利要求1至10中任一项所述的重组微生物与赖氨酸在第一溶液中混合，以将所述赖氨酸转化为1,5-戊二胺；以及

自所述第一溶液中分离得到1,5-戊二胺。

12.根据权利要求11所述的方法，进一步包括于所述第一溶液中添加辅助因子。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述辅助因子为磷酸吡哆醛、吡哆醛、吡哆醇或其任意组合。

14.根据权利要求11所述的方法，进一步包括：

在分离得到1,5-戊二胺后，回收溶液中的微生物；

将回收的所述微生物加入包含赖氨酸的第二溶液中；

于所述第二溶液中加入根据权利要求1至10中任一项所述的重组微生物；以及

自所述第二溶液中分离得到1,5-戊二胺。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述微生物加入所述第二溶液中的量以OD₆₀₀值计为1至10。

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