KR20120016661A - 항생제-미함유 플라스미드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항생제 선별 압박을 사용하지 않는 그람 음성 플라스미드를 유지하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 비상동 유전자를 함유하는 무약물 플라스미드를 비롯한 무약물 플라스미드 제조에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 비상동 유전자를 포함하는 무약물 플라스미드를 포함하는 제형 및/또는 조성물, 무약물 플라스미드를 사용하여 발현되는 단백질 또는 면역원을 포함하는 제형 및/또는 조성물, 그러한 제형 및/또는 조성물을 숙주에게 투여하는 방법을 제공한다. 본 발명은 무약물 플라스미드를 함유하는 그람 음성 박테리아에 관한 것이다.

Description

항생제-미함유 플라스미드{ANTIBIOTIC-FREE PLASMID}
인용참조
본 출원은 2009 년 5 월 22 일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/180,755 호의 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명은 항생제 선별 압박의 사용 없이 그람 음성 박테리아에서 플라스미드를 제조하고 유지하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 무약물 플라스미드를 함유하는 조성물 및/또는 제형뿐만 아니라 제조된 무약물 플라스미드에 관한 것이며, 상기 제형 및/또는 조성물은 무약물 플라스미드를 사용하여 제조된 면역원 또는 단백질을 함유하고, 숙주에게 제형 및/또는 조성물을 투여하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 무약물 플라스미드를 함유하는 그람 음성 박테리아에 관한 것이다.
최근까지, 의약용으로 안전하고 잠재성이 있고 효능적으로 여겨지는 플라스미드 DNA 벡터가 없었다. 플라스미드의 전달에서 항생제 내성 유전자의 존재는 유전자 현제 요법 및 DNA 적용의 단점 중 하나이다.
플라스미드는 염색체 DNA 염색체로부터 분리되어 있는 염색체-외 DNA 분자이고, 이는 염색체 DNA 를 독립적으로 복제할 수 있다 (Lipps G. (editor). (2008). Plasmids: Current Research and Future Trends. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-35-6). 플라스미드는 통상 박테리아에서 자연적으로 발생하나, 진핵 유기체에서 가끔 발견된다. 이들은 적합한 숙주 내에서 자가 복제할 수 있는 이동가능한 유전학적 요소 또는 복제단위인 것으로 여겨진다. 플라스미드는 네이키드 DNA 이고 새로운 숙주로의 이동을 위해 유전학적 물질을 감쌀 필요가 있는 유전자를 인코딩하지 않는다. 따라서, 플라스미드의 숙주에서 숙주로의 이동은 형질전환에 의한 유전학적 요소의 의도적 흡수를 허용하는 숙주 유전자 발현에서 접합 또는 변화에 의한 직접적인 기계적 이동을 요구한다 (Lipps G. 2008).
유전자 요법 및 백신화를 위한 플라스미드 DNA (pDNA) 의 사용은 인간 및 동물 건강 케어에서 상당한 잠재성을 갖는 신규한 기술이다 (Mairhofer, J. et al., Biotechnol. J., 3, 83-89, 2008). 또한, 플라스미드는 유전학 및 생물공학 실험실에서 중요한 도구로서 제공되고, 여기서 이들은 통상 특정 유전자의 다중화 또는 발현을 위해 사용된다 (Russell, David W.; Sambrook, Joseph (2001), Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory).
플라스미드는 미생물의 개체군 내에서 수평 유전자 이동을 위한 기전을 제공하고 전형적으로는 주어진 환경 상태 하에서 선별적인 이점을 제공한다. 예를 들어, 플라스미드는 자연 발생하는 항생제에 대한 내성을 제공하는 유전자를 운반할 수 있다. 대안적으로는, 항생제 외에도 마커 또한 존재한다. 예를 들어, 플라스미드에 의해 제조되는 단백질은 주어진 환경 상태 하에서 선별적 이점 또한 제공하는 독소로서 작용할 수 있다. 플라스미드는 또한 기본적인 질소를 고정하는 능력을 갖는 박테리아를 제공할 수 있거나 영양 박탈의 조건 하에서 이점을 제공하는 완강한 유기 화합물을 분해한다 (Lipps G., 2008).
항생제 내성 유전자를 사용하여 선별하기 위해, 플라스미드는 특정 항생제에 대해 내성이 있는 세포를 만드는 단백질을 생성하는 유전자가 삽입되어 제조된다. 다음으로, 플라스미드는 형질전환이라 불리는 공정에 의해 박테리아 내로 삽입된다. 그 후, 박테리아는 특정 항생제에 노출된다. 플라스미드가 박테리아로 하여금 내성을 갖게 하기 때문에, 해당 플라스미의 복제본을 갖는 박테리아 만이 항생제를 이겨낸다.
관심 유전자는 항생제-내성 마커를 함유하는 플라스미드를 이용하여 전달될 수 있다. 그러한 유전자는 전형적으로 다중 클로닝 자리 (MCS 또는 폴리링커) 에서 삽입된다. 항생제-내성 유전자가 발현되고, 발현된 단백질은 항생제를 분해한다. 이러한 방식으로, 항생제는 변형된 박테리아만을 선별하기 위한 필터로서 작용한다. 이제, 이들 박테리아를 대량으로 성장시키고, 수확하고, 관심 플라스미드를 단리하기 위해 용균시킬 수 있다 (종종 알칼리 용균 방법을 사용).
약제에서 항생제의 성공은 이제 문제가 되고 있다. 감염성 질환의 병원체를 포함하는 많은 박테리아가 이미 내성을 가지고 있고 특정 항생제로 더이상 제어되지 않을 수 있다. 항생제는 인간 및 동물 약제에서 너무 빈번하게 사용되어 왔다. 게다가, 더욱 중요한 것은, 장기간 동안 이들이 성능 인헨서로서 동물 사료에 첨가되었다는 사실이다. 이러한 실시는 이제 대체로 법으로 금지되고 있으나, 만연하는 항생제는 해당 내성 유전자를 갖는 박테리아에 대해 생존 이점을 제공해왔다. 더욱이, 박테리아에서 내성 유전자는 종종 이동가능한 DNA 단위 상에 위치하고, 이는 상이한 종간에 교환될 수 있다.
이러한 배경에서, 결국 병원체를 생성하는 박테리아가 마커 유전자를 흡수하여 현재 처방되고 있는 항생제가 효과가 없게 된다는 점이 염려되고 있다. 주위 미생물 (예: 병원체) 로의 유전자 이동이 있을 수 있다 (Murphy, D. B., Epstein, S. L., Guidance for Industry: Guidance for human somatic cell therapy and gene therapy, Food and Drug Administration, Rockville 1998). 인간 염색체로의 항생제 내성 유전자의 통합이 가능하다는 또다른 안정성 문제가 있다 (Smith, H. A., Klinman, D. M., Curr. Opin. Biotechnol. 12, 299-03, 2001).
또한, 이들 유전자의 구성요소의 발현이 박테리아 숙주 세포 상에 불필요한 대사성 적재를 부과하기 때문에 그러한 유전자는 플라스미드 제조 공정에 상당한 영양을 미칠 수 있다 (Cranenburgh, R. M., et al., Nucleic Acids Res. 2001, 29, e26; Rozkov, A., et al., Enzyme Microb. Technol. 2006, 39, 47-50). 이들 유전자를 제거함으로써 플라스미드의 크기를 감소시키는 것은, 발효 공정에 의해 수득되는 pDNA 의 수율 및 안정성을 개선시킨다 (Smith, M. A., et al., Can. J. Microbiol. 1998, 44, 351-355).
따라서, 현재 규제국으로부터의 권고에 따라 공공 / 소비자에게 잠재적인 위험성이 있는 최종 (시판되는) 생성물 (네이키드 DAN 백신) 에서 항생제 내성 유전자의 사용을 피해야 할 필요성이 있다. 미국 식품의약국 (Food and Drug Administration; FDA) 및 세계보건기구 (World Health Organization; WHO) 는 DNA 백신의 질을 확실히 하고 감염성 질환을 예방하기 위해 항생제 내성 마커의 사용을 규제하고 있다. 유사하게, 2002 년 이래로 개국한 EU Deliberate Release Directive 는 "인간 건강 또는 환경에 해로운 영향을 미치는 유전학적으로 변형된 미생물에서 항생제-내성 마커를 사용하지 않는 단계" 를 요구하고 있다.
전통적인 마커의 단점은 심지어 실제 연구에서 명백해지고 있다. 예를 들어, 박토펙션 기술의 상업적 적용을 위해 항생제-미함유 전달계를 갖는 것이 요구된다. 박토펙션 기술이란 침습성 박테리아를 사용하는 진핵 세포로의 플라스미드 DNA 의 전달이다. 더욱이, 발효 공정 동안 불필요한 대사 짐을 감소시키는 기술의 존재가 요구되고 있으며, 이는 DNA 플라스미드에서 보다 높은 수율 및 보다 높은 OD 를 달성할 것이다.
대안적인 선별 전략은, 항생제 내성 유전자가 영양요구성 상보관계, 억제인자 적정, 단백질계 안티도트/독소 선별 계획을 포함하는 환자의 장내 박테리아로 보급되는 것, 및 RNA 계 선별 가능한 마커를 사용하는 것에 접근하도록 설계되어 있다 (Williams J.A. et al., Plasmid DNA vaccine vector design: Impact on efficacy, safety and upstream production, Biotechnol Adv (2009), doi:10.1016/j.biotechadv.1009.02.003 참조).
Cranenburgh, R.M. 등은 복합 배지에서 재조합 플라스미드의 안정적인 유지 및 항생제-미함유 선별을 촉진하는 2개의 신규한 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli) 균주 (DH1lacdapD 및 DH1lacP2dapD) 의 구축을 보고하고 있다. 이들은 lac 오페레이터/프로모터의 제어 하에, 필수 염색체 유전자 dapD 를 함유한다 (Cranenburgh, R. M., et al., 2001). 그러나, IPTG (dapD 의 발현을 유도함) 또는 DAP 로 보충되지 않는 한, 이들 세포는 균주가 lac 오페레이터를 함유하는 다중복제본 플라스미드로 형질전환될 때 용균하고, 오페레이터는 경쟁적으로 LacI 억제인자를 적정하고 lac 프로모터로부터 dap D 의 발현을 허용한다. 따라서, 형질전환체는 단리되고 억제인자 적정 선별에 의해 임의의 배지 상에 성장시킬 수 있는 이들의 능력에 의해 단순히 번식된다. 항생제 내성 유전자 또는 다른 단백질 발현 서열이 플라스미드 상에 요구되지 않고, 항생제는 플라스미드 선별에 요구되지 않는다.
Mairhofer 등은 최근 플라스미드 상에 임의의 선별 마커 또는 다른 추가의 서열을 사용하지 않고 플라스미드를 선별하고 유지하도록 제공되는 박테리아 숙주 균주를 설계하는 것을 연구하였다. 수 개의 박테리아 균주가 변형되어, 플라스미드의 복제 저해제 RNA I 은 RNA-RNA 안티센스 반응에 의해 필수 성장 유전자의 번역을 억제할 수 있었다 (Mairhofer, J. et al., Biotechnol. J., 3, 83-89, 2008). 필수 유전자 (murA) 가 억제인자 단백질 (tetR) 이 이의 발현을 방해하도록 변형되었다 (Mairhofer, J. et al., 2008). 따라서, 플라스미드의 존재 하에서만 RNA I 은 terR 각하 및 murA 발현이었다. 발명자들은 상이한 시판되는 플라스미드가 다양한 변형된 에스케리챠 콜라이 균주에 의해 선별될 수 있었음을 보고하였다. 이들은 또한 임의의 선별 마커가 전혀 없는 최소한의 플라스미드를 설계하였다.
본 출원의 임의의 문헌의 언급 또는 확인은 이러한 문헌이 본 발명에 대한 종래 기술로서 이용가능하다는 승인이 아니다.
발명의 요약
항생제-미함유 플라스미드 및 항생제-미함유 플라스미드를 포함하는 그람-음성 박테리아가 제공된다. 면역원 또는 단백질을 인코딩하는 비상동 유전자를 포함하는 항생제-미함유 플라스미드를 포함하는 조성물 및 항생제-미함유 플라스미드를 이용하여 발현되는 단백질 또는 면역원을 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 그람-음성 박테리아는 박테리아 염색체의 비필수 영역에서 하나 이상의 비상동 폴리뉴클레오티드를 함유하도록 조작된다. 항생제-미함유 플라스미드는 박테리아 염색체 상의 비상동 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 억제인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 항생제-미함유 플라스미드는 면역원 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.
본 방법은 항생제-미함유 플라스미드의 제조 방법 및 항생제-미함유 플라스미드를 이용하여 포유동물 세포로 외래 유전자를 이동시키는 방법을 포함한다.
이들 구현예 및 다른 구현예는 하기 상세한 설명에 의해 개시된 것 또는 이로부터 명백한 것 및 이에 포함되는 것이다.
예로 제시되었으나, 본 발명을 기재된 구체적인 구현예에만 한정하는 것으로 의도되지 않는 하기 상세한 설명은 본원에 참조로서 포함되어 있는 하기와 같은 첨부된 도면과 함께 이해될 수 있다:
도 1 은 수크로오스를 함유하는 배지 상에 플레이팅될 때 형질전환된 박테리아의 신속한 사멸을 야기하는 그람-음성 박테리아에서의 레반수크라제를 코딩하는 sacB 유전자의 클로닝인 무약물 개념의 제 1 성분을 기재한다.
도 2 는 파지 λ 의 면역성 영역인 무약물 또는 항생제-미함유 개념의 제 2 및 제 3 성분을 기재하고, 이때 cI 는 cI 억제인자; cro 는 Cro 단백질; N 은 전사 항-종결자; cII 는 cI 활성자; cIII 는 cIII 프로테아제 저해제를 코딩하고; OL 1, 2 및 3, 및 OR 1,2 및 3 은 오퍼레이터이고; PL 및 PR 은 우향 및 좌향 프로모터이고; PRE 는 억제인자 수립에 대한 프로모터이고; PRM 은 억제인자 유지에 대한 프로모터이다.
도 3 은 "무약물" 개념의 이론적인 개요를 기재하고 있고, 이때 cI 억제인자 활성 (pDL1 (DrugLess Plasmid) 플라스미드로 표시) 은 숙주 세포 염색체 상에 위치한 λ Pr 프로모터 하에 놓여진 독성 sacB 유전자 산물의 전사를 저해하고, 이때 수크로오스의 존재 하의 숙주 E. coli 세포의 생존력은 플라스미드로부터 λ cI 억제인자 단백질의 충분한 발현 수준에 의해 보장된다.
도 4 는 불활성화 시스템의 "수크로오스 민감성" 을 기재하고 있고, 온도에서 42℃ 로의 전환은 λ Pr 프로모터에 대한 cI 억제인자의 결합 활성을 저해하고 수크로오스에 대해 숙주 세포가 민감해지게 한다.
도 5 는 항생제-미함유 pDL1 플라스미드와 숙주 균주의 조합을 기재하고 있고 (pDL1 와의 형질전환으로부터 생성됨) 무약물 플라스미드 수율을 야기하는 수크로오스를 함유하는 배지에서의 성장을 도시하고 있다.
도 6A-6C 실험 계획을 도시하고 있다. 도 6A 는 개요를 제공하고; 도 6B 는 ΔpurN (또는 ΔedA) 부모 균주가 카나마이신에 내성이 있고 세포가 30℃-37℃ 에서 인큐베이션될 때 수크로오스에 대해 이의 민감성을 부여하는 구성요소적 SacB+ 을 발현함을 도시하고 있다. ΔpurN (또는 ΔedA) 부모 균주가 pPB829 또는 pPB838 플라스미드로 형질전환 될 때, 이들 세포는 30-37℃ 에서 인큐베이션될 때 수크로오스의 존재 하에서 생존하고 성장할 능력을 얻고; 도 6C 는 pPB829 또는 pPB838 플라스미드 (cI 플라스미드) 로 형질전환된 ΔpurN (또는 ΔedA) 부모 균주가 카나마이신, 수크로오스 또는 클로람페니콜 또한 함유하는 LB 배지에서 성장할 수 있음을 도시하고 있다. 30-37℃ 에서 42℃ 로의 온도 전환은 수크로오스의 존재 하에 플레이팅될 때 세포사를 야기한다.
도 7 은 λ cI 유전자를 함유하고 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (CatR) 를 인코딩하는 유전자로 마킹된 둘 모두의 플라스미드 (pPB829 및 pPB838) 를 기재하고 있다. pB838 는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자 (cat) 가 암피실린 내성 유전자를 대체한 pMCS5 의 유도체이다. 이러한 플라스미드는 카나마이신 유전자 (P1) 의 약한 프로모터의 제어 하에 놓인 cI 유전자를 함유한다. pPB829 는 cat 유전자를 함유하는 pVR1012 플라스미드 유도체이다. 플라스미드는 약한 프로모터 (P1) 의 제어 하에 놓인 cI 유전자를 함유한다. ΔpurN (또는 ΔedA) 부모 E. coli 균주 내에서 도입될 때, 이들 플라스미드는 수크로오스의 존재 하에서 세포가 성장할 수 있게 할 것이다. 클로람페니콜은 개념의 증거를 입증하게 된다.
도 8A-E 는 숙주 균주 조작을 도시하고 있다. 도 8A 및 8B 는 edA 또는 purN 유전자 각각의 대립형질 대체에 의해 E. coli 염색체로 삽입되는 λPr::sacB Ωkan 카세트의 생성을 도시하고 있다. 도 8C 는 이중 sacB 카세트 E. coli 균주의 생성에 대해 ΔpurNΩλPr::sacB Km E. coli 숙주 균주로 edA 유전자의 대립형질 대체를 위해 사용되는 PCR 및 결합 (joining) PCR 에 의한 전체 sacB 카세트 (ΔpurNΩλPr::sacB cat) 의 조작을 도시하고 있다.
도 9A, 9B 및 9C 는 숙주 균주 조작, 즉 E. coli 에서 edA 및 purN 의 결실을 입증하기 위한 PCR 의 사용을 도시하고 있다. 도 9A 는 PB1186 및 PB1189 프라이머 및 Phusion DNA 폴리머라제를 갖는 제 2 PCR 단계에서 주형으로서 사용되고 정제되는 2 개의 PCR 산물 (각각 151 및 729 bp) 을 부분적으로 도시하고 있다. 도 9B 는 λPr::sacB+ΩKan 카세트가 E. coli 의 염색체로 도입되는 것을 보여주는 PCR 체크를 도시하고 있다. 도 9C 는 λPr::sacB+ΩKan 카세트가 edA 및/또는 purN 유전자(들)의 대립형질 대체에 의해 유전자자리에서 올바르게 삽입되는 것을 도시하고 있다. 도 9D 는 이중 sacB 카세트 숙주 균주 조작, 즉 대립형질 대체에 의해 E. coli 에서 edA 및 purN 둘 모두의 결실을 입증하기 위한 PCR 의 사용을 도시하고 있다. PCR 체크는 λPr::sacB+ΩKan 및 λPr::sacB+ΩCat 카세트 둘 모두가 서열분석에 의해 확인되는 바와 같이 특정 유전자자리에서 E. coli 의 염색체로 올바르게 도입되는 것을 보여준다. 도 9D 에서 나타낸 것은 하기와 같다: 레인 1: BJ5183 wt; 2: BJ5138 ΔpurN, 3: BJ5138 ΔedA; 4: BJ5183 ΔpurN ΔedA 희석되지 않음 1㎕; 5: BJ5183 ΔpurN ΔedA 희석됨 1/10; 6: 물, 0 bp (대조군); A: BJ5183 wt; B: BJ5138 ΔpurN; C: BJ5138 ΔedA; D: BJ5183 ΔpurN ΔedA 희석되지 않음 3 ㎕; E: BJ5183 ΔpurN ΔedA 희석되지 않음 l㎕; F: BJ5183 ΔpurN ΔedA 희석됨 1/10; G: BJ5183 ΔpurN ΔedA 희석됨 1/50; H: 물, 0 bp (대조군).
도 1OA 는 숙주 균주 (ΔpurN λPr::sacB+ Ωkan) 가 수크로오스에 대해 매우 민감하고 (성장 없음), pPB829 또는 pPB838 플라스미드로 형질전환된 세포가 30℃ 에서 수크로오스의 존재 하에서 잘 성장하고, sacB 유전자 발현이 각각의 cI 플라스미드로부터 합성된 cI 유전자 산물에 의해 완벽히 억제되었고, 플라스미드 유지가 클로람페니콜의 존재 하에 성장시킨 유사한 세포와 평행 수행한 대조군 실험에 의해 명확하게 입증된 바와 같이 100% 효율이었음을 입증한다. 온도를 42℃ 로 올리는 것은 수크로오스 또는 클로람페니콜을 함유하는 LB 아가 상에 플레이팅된 세포 사멸 및 cI 유전자 산물의 불활성화를 야기했다. 이러한 플라스미드 유지의 강건성 실험을 수크로오스 또는 클로람페니콜의 존재 하에 세포를 성장시키는 2 개의 연속적인 계대 후 수행하였다. 도 lOB-C 는 이중 sacB 카세트 E. coli 균주 (ΔpurN λPr::sacB+ Ωkan ΔedA λPr::sacB+ ΩCat) 가 3O℃ 및 42℃ 에서 인큐베이션될 때 수크로오스의 존재 하에 매우 민감한 (성장 없음) 반면, 수크로오스 상에 플레이팅된 하나의 sacB 카세트 E. coli 균주를 갖는 몇몇 자연발생 돌연변이체가 나타남을 입증한다. 또한, 도 1OC 는 하나의 sacB 카세트 E. coli 균주에 비해 이중 sacB 카세트 E. coli 균주에 요구되는 가장 낮은 수크로오스 농도를 입증한다 (10% 에서 최종 2% 까지).
도 11 은 세포를 성장시키는데 있어서 pPB829 및 pPB838 플라스미드의 안정성을 도시하고 있다.
도 12A 는 30℃ 에서 λPr::sacB 에서 하나의 sacB 카세트에서의 자연발생 돌연변이의 결핍을 보여준다. 도 12B-C 는 (1 개보다) 2 개의 sacB 카세트의 존재가 3O℃ 내지 37℃ 범위의 온도에서 수크로오스 민감성 (여전히 2% 수크로오스에서 최적임) 에 대해 보다 양호한 강건성을 부여한다는 것을 입증한다. E. coli 염색체 상의 하나의 sacB 카세트의 존재는 유사한 온도에서 2% 내지 4% 범위의 수크로오스 농도에서 보다 덜 강건했다. 이러한 플레이팅 검정에서 확인되는 바와 같이, 2 개의 sacB 카세트 E. coli 균주를 갖는 수크로오스로의 돌연변이률은 37℃ 에서 인큐베이션될 때 가장 낮은 수크로오스 농도 (2%) 에서 검출될 수 없었던 반면, 하나의 sacB 카세트 E. coli 균주를 갖는 돌연변이률은 3.8×lO-6 내지 5×lO-5 범위였다. 독립적인 실험 세트는 2 개의 sacB 카세트 E. coli 균주에서의 돌연변이률이 2% 수크로오스의 존재 하에 37℃ 에서 인큐베이션될 때 5×lO-10 에 근사했다는 것을 나타냈다.
도 13A-B 는 아가 플레이트 상에서 선별 압박으로서 항생제의 사용 없이 클로람페니콜 (Cat) 마킹된 cI 플라스미드에 의해 형질전환된 세포를 스크리닝할 수 있는 실험 절차를 나타낸다.
도 14A-C 는 선별 압박으로서 항생제의 사용 없이 오직 cI 플라스미드 (pPB829 및 pPB838) 로 형질전환된 세포를 선별하는 실험 절차의 효능을 도시하고 있다.
도 15A-B 는 sacB 카세트의 하나의 복제본을 함유하는 E .coli 세포의 성장에서 pPB829 및 pPB838 플라스미드의 수율 및 안정성을 도시하고 있다. 도 15C-E 는 1 개 및 2 개의 sacB 카세트 E. coli 균주 둘 모두에서 (ΔpurN λPr::sacB+Ωkan 및 ΔpurN λPr::sacB+Ωkan ΔedA λPr::sacB+Ωcat, 각각) cat-미함유 pPB885 플라스미드의 수율 및 안정성을 도시하고 있다. 도 15F 는 항생제-미함유 플라스미드 (선별 압박으로서 pPB896 / 수크로오스) 및 항생제 플라스미드 (선별 압박으로서 pCG105 / Cat) 의 CHO 세포에서 플라스미드 트랜스펙션 효능 (GFP 발현) 을 도시하고 있다. 이들 2 개의 선별 압박 (수크로오스 대 Cat (항생제로서)) 사이의 발현된 GFP 단백질 면에서 명백한 차이가 관찰되지 않았다.
도 16 은 pCRblunt + PB1184-1185 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 17 은 pPB828 의 제한 맵 및 특징을 나타낸다.
도 18 은 pPB829 의 제한 맵 및 특징을 나타낸다.
도 19 는 pPB838 의 플라스미드 맵 및 특징을 나타낸다.
도 20 은 pPB844 의 플라스미드 맵 및 특징을 나타낸다.
도 21 은 pPB845 의 플라스미드 맵 및 특징을 나타낸다.
도 22 는 pPB846 의 플라스미드 맵 및 특징을 나타낸다.
도 23 은 pPB847 의 플라스미드 맵 및 특징을 나타낸다.
도 24 는 pPB885 의 플라스미드 맵을 나타낸다. pPB885 의 특성 맵은 하기를 나타낸다: 2 개의 CDS: cI 억제인자: 324-1037; AP(R): 2321-2990 (상보적), 원래 위치 (상보 1626..2483); 2 개의 복제 기점: pUC 기점: 1500-2173 (상보적), 원래 위치 (상보 805..1478); f1 기점: 2991-3301 (원래 위치 2615-3053).
도 25 는 pPB896 의 플라스미드 맵을 나탄내다. pPB896 특성 맵은 하기를 나타낸다: 3 개의 CDS: GFP: 1675-2397 (원래 위치 1676...2398); cI 억제인자: 4089-4802; Cm(R): 4828-5484 (상보적), 상보 (950-1606); 하나의 인트론: 인트론 A: 805-1625 (원래 위치 805-1625); 하나의 진핵 프로모터: CMV 프로모터: 1-683; 하나의 복제 기점: 3133-3640 (원래 위치 2425..2932); 하나의 종결자: BGH 전사 종결자/PolyA: 2405-2951 (원래 위치 1697..2243); 하나의 5' UTR: CMV IE 5' UTR: 684-804 (원래 위치 684..804).
도 26 은 cI 억제인자 단백질의 서열 정렬 및 서열 일치성 백분율을 나타낸다.
도 27 은 sacB 단백질의 서열 정렬 및 서열 일치성 백분율을 나타낸다.
도 28 은 폴리뉴클레오티드 및 단백질에 할당된 SEQ ID NO 을 나타내는 표이다.
도 29 는 cI 억제인자 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열 정렬 및 뉴클레오티드 수준에서의 서열 일치성 백분율을 나타낸다.
도 30 은 sacB 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열 정렬 및 뉴클레오티드 수준에서의 서열 일치성 백분율을 나타낸다.
도 31 은 P1 프로모터, cI 천연 프로모터, λPr 프로모터, λPr 프로모터+5' UTR+sacB 유전자, P1 프로모터 + cI 유전자, 및 cI 천연 프로모터 + cI 유전자에 대한 서열을 나타낸다.
상세한 설명
본 명세서에서, 특히 청구항에서, "~ 을 포함하다", "~ 이 포함되는", "~ 을 포함하는" 등과 같은 용어는 미국 특허법에 속하는 의미를 가질 수 있으며; 예를 들어, 이 용어는 "~ 을 포함하다", "~ 이 포함되는", "~ 을 포함하는" 등을 의미할 수 있고; "~ 로 본질적으로 이루어지는" 및 "~ 로 본질적으로 이루어지다" 와 같은 용어는 미국 특허법에 속하는 의미를 가지고, 예를 들어, 이들은 요소를 명쾌하게 나열하지는 않으나, 종래 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특성에 영향을 주는 요소는 배제하는 것으로 명시된다.
다르게 표시되지 않는다면, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 단수형 용어에는 문맥상 명백하게 다르게 표시되지 않는다면 복수의 대상이 포함된다. 유사하게는, "또는" 이라는 단어는 문맥상 명백하게 다르게 표시되지 않는다면 "및" 이 포함되는 것으로 의도된다.
"동물" 이란 의도하는 포유동물, 조류 등을 말한다. 동물 또는 숙주는 포유동물 또는 인간을 포함한다. 동물은 말류 (예를 들어, 말), 개류 (예를 들어, 개, 늑대, 여우, 코요테, 자칼), 고양이류 (예를 들어, 사자, 호랑이, 집고양이, 들고양이, 기타 큰 고양이, 및 치타 및 스라소니를 비롯한 기타 고양이과), 양류 (예를 들어, 양), 소 류 (예를 들어, 소), 돼지류 (예를 들어, 돼지), 조류 (예를 들어, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩, 앵무새, 핀치, 매, 까마귀, 타조, 에뮤 및 화식조), 영장류 (예를 들어, 원원류, 안경원숭이, 원숭이, 긴팔원숭이, 유인원), 및 생선으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. "동물" 이라는 용어에는 또한 배아 및 태아 단계를 비롯한, 모든 발달 단계의 개별 동물이 포함된다.
용어 "단백질", "펩티드", "폴리펩티드" 및 "폴리펩티드 단편" 은 임의의 길이의 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 이는 변형된 아미노산 또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있고, 이는 아미노산 이외의 화학적 부분에 의해 방해받을 수 있다. 상기 용어는 또한, 자연적으로 또는 개입에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함하는데; 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 또는 생활성 성분과의 접합이 포함된다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중 가닥인 RNA 또는 DNA, 또는 그의 하이브리드를 지칭하고 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 또한 RNA/DNA 하이브리드를 포함한다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 라이보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 탐침 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체, 우라실, 다른 당 및 연결 기 예컨대 플루오로리보스 및 티올레이트, 및 뉴클레오티드 분지를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 중합 후, 예컨대 표지 성분에 의한 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 이 정의에 포함되는 다른 유형의 변형은 캡 (cap), 하나 이상의 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드의 유사체에 의한 치환, 및 폴리뉴클레오티드를 단백질, 금속 이온, 표지 성분, 다른 폴리뉴클레오티드 또는 고체 지지체에 부착시키기 위한 수단의 도입이다. 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성에 의해 수득되거나 미생물로부터 유래될 수 있다.
용어 "무약물 플라스미드" 또는 "항생제-미함유 플라스미드" 는 항생제 선별 유전자를 함유하지 않는 DNA 플라스미드를 지칭하고 상호교환적으로 사용된다.
용어 "유전자" 는 생물학적 기능과 연관되는 폴리뉴클레오티드의 임의의 분절을 언급하는데 폭넓게 사용된다. 따라서, 유전자에는 게놈 서열에서와 같은 인트론 및 엑손, 또는 단지 cDNA 에서와 같은 코딩 서열 및/또는 이의 발현에 필요한 조절성 서열이 포함된다. 예를 들어, 유전자는 mRNA 또는 기능성 RNA 를 발현하거나, 특정 단백질을 인코딩하고, 조절성 서열을 포함하는 핵산 단편을 또한 지칭한다.
본원에 개시된 주제는 보다 안전한 백신 및 면역성 조성물을 제조하기 위해 항생제 내성 유전자의 사용을 속여넘김으로써 박테리아 플라스미드 DNA 벡터를 생성시키는 신규한 접근법에 관한 것이다.
본원에 개시된 주제는 3 개의 성분에 기초한 그람 음성 박테리아 숙주 세포 내의 다수의 플라스미드 복제본을 유지시키는 신규한 개념을 입증하는 것이다. 제 1 성분은 소정의 배양 조건 하에서 박테리아에 대한 독성 산물을 발현하는 그람 음성 박테리아이고, 이때 독성 유전자는 박테리아 염색체의 비필수 영역에 삽입된다. 제 2 성분은 그람 음성 박테리아 염색체 상에서 엄격히 조절될 수 있는 구성요소적 프로모터의 제어 하의 독성 산물을 인코딩하는 유전자의 존재이다. 제 3 성분은 숙주 염색체 상의 독성 유전자에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 조절하는 플라스미드로부터 특정 억제인자의 발현이다.
본 발명에서 고려되는 그람 음성 박테리아 하기가 포함되나 이로써 한정되지 않는다: 아비박테리움 (Avibacterium), 부르셀라 (Brucella), 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli), 헤모필루스 (Haemophilus) (예: 헤모필루스 수이스 (Haemophilus suis)), 살모넬라 (Salmonella) (예: 살모넬라 엔터리디스 (Salmonella enteridis), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 인판티스 (Salmonella infantis)), 쉬겔라 (Shigella), 파스퇴렐라 (Pasteurella), 및 리메렐라 (Rimeirella).
하나의 구현예에서, 독성 유전자는 레반수크라제를 인코딩하는 구조적 sacB 유전자이다. 또다른 구현예에서, 독성 유전자는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 의 구조적 sacB 유전자이고, 이는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 레반수크라제를 인코딩한다. 이의 자연 환경에서의 sacB 의 발현은 그람 양성 박테리아에 대해서는 무해하나, 그람 음성 박테리아에서 발현될 때 이는 수크로오스를 함유하는 배지 상에 플레이팅될 때 형질전환된 박테리아의 신속한 사멸을 야기한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 sacB 단백질 (레반수크라제) 을 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 또는 74 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 sacB 단백질, 및 이의 변이체 또는 단편을 제공한다. 또다른 양태에서, SEQ ID NO:4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 또는 74 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 sacB 단백질을 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 잘 알려진 분자 생물학 기술을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있는 상기 동정된 sacB 단백질 (SEQ ID NO:4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 또는 74) 의 단편 및 변이체를 제공한다. 변이체는 본 발명의 폴리펩티드, 특히 SEQ ID NO:4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 또는 74 에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 상동 폴리펩티드이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드, 예컨대 sacB 유전자 (sacB 단백질 (레반수크라제) 을 인코딩함), 예를 들어, SEQ ID NO:4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 또는 74 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 sacB 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 또는 74 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 sacB 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는보존적 변이체, 대립형질 변이체, 상동체, 또는 이들 폴리펩티드 중 하나의 8 개 이상 또는 10 개 이상의 연이은 아미노산 또는 이들 폴리펩티드의 조합을 포함하는 단편을 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:3, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 또는 73 에서 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 변이체를 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:3, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 또는 73 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 변이체를 제공한다.
본 발명에 이용될 수 있는 다른 독성 유전자에는 리스테리아 (Listeria) 또는 스태필로코쿠스 (Staphylococcus) 유전자가 포함되나 이로써 한정되지 않는다. 독성 유전자는 독성 유전자 산물 (독성 단백질 또는 RNA) 로서 발현되는 DNA 일 수 있거나, 또는 그 안의 독성 및 독성 그 자체일 수 있다. 그러한 독성 유전자 산물의 예는 당업계에 잘 공지되어 있고, 하기를 포함하나 이로써 한정되지 않는다: 제한 엔도뉴클레아제 (예: DpnI), CcdA/CcdB (Maki S. et al. J. Mol. Biol. 256: 473-482, 1996) 및 억제 기능의 부재 하에서 숙주를 사멸시키는 유전자 (예: kicB). 독성 유전자는 대안적으로 시험관내에서 선별가능할 수 있다 (예: 제한 자리).
본원에서 사용되는 용어 "상동체 (homolog)" 에는 이종상동체 (ortholog), 유사체 (analog) 및 동족체 (paralog) 가 포함된다. 야생형 폴리펩티드의 유사체, 이종상동체, 및 동족체는 번역후 변형에 의해, 아미노산 서열 차이에 의해, 또는 둘 다에 의해 야생형 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 특히, 본 발명의 상동체는 일반적으로 야생형 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부와 80-85% 이상, 85-90%, 90-95%, 또는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 의 서열 일치성을 나타낼 것이고, 유사한 기능을 나타낼 것이다.
"변이체" 는 실질적으로 유사한 서열을 의미하는 것으로 의도된다. 폴리뉴클레오티드의 경우, 변이체는 천연 폴리뉴클레오티드 내 하나 이상의 자리에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실 및/또는 부가 및/또는 천연 폴리뉴클레오티드 내 하나 이상의 자리에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "천연" 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 각각 포함한다. 본 발명의 특정 폴리뉴클레오티드 (즉, 참조 폴리뉴클레오티드) 의 변이체는 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드와 참조 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 간의 백분 서열 일치성의 비교에 의해 또한 평가될 수 있다. "변이체" 단백질은 천연 단백질 내 하나 이상의 자리에서의 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 부가 및/또는 천연 단백질 내 하나 이상의 자리에서의 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 천연 단백질로부터 유래되는 단백질을 의미하는 것으로 의도된다. 본 발명에 포함되는 변이체 단백질은 생물학적으로 활성이며, 즉 면역 반응을 유발하는 능력을 갖는다.
변이체는 대립형질 변이체를 포함한다. 용어 "대립형질 변이체" 는 단백질의 아미노산 서열에 변화를 초래하고 자연 개체군 (예, 바이러스 종 또는 변종) 에 존재하는 다형성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 그러한 자연 대립형질 변이는 전형적으로는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 1-5% 분산을 초래할 수 있다. 대립형질 변이체는 다수의 상이한 종에서 관심의 핵산 서열을 서열분석함으로써 식별될 수 있고, 이는 하이브리드형성 탐침을 사용하여 이들 종에서 동일한 유전자 유전자자리를 식별함으로써 용이하게 수행될 수 있다. 자연 대립형질 변이의 결과이고 관심의 유전자의 기능적 활성을 변경하지 않는 임의의 모든 상기 핵산 변이 및 결과적인 아미노산 다형성 또는 변이가 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
용어 "보존성 변이" 는 아미노산 잔기의 또다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의한 대체, 또는 인코딩된 아미노산 잔기가 변화하지 않거나 또다른 생물학적으로 유사한 잔기가 되도록 하는 핵산 내 뉴클레오티드의 치환을 의미한다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 치환은 상기와 같이 일반적으로 성질에 있어서 보존성일 것이다.
본 개시의 폴리뉴클레오티드에는 유전적 코드, 예를 들어, 특정 숙주에 대해 최적화된 코돈 사용의 결과로서 축퇴성인 서열이 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "최적화된" 은 특정 종에서 그의 발현을 증가시키도록 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본 발명의 폴리펩티드에 대해 최적화된 폴리뉴클레오티드 코딩을 제공하기 위해, 폴리펩티드의 DNA 서열은 1) 특정 종에서 고발현되는 유전자에 의해 선호되는 코돈을 포함하거나; 2) 뉴클레오티드 염기 조성 중 A+T 또는 G+C 함량을 상기 종에서 실질적으로 발견되는 정도까지 포함하거나; 3) 상기 종의 개시 서열을 형성하거나; 또는 4) RNA 의 불안정화, 부적절한 폴리아데닐화, 붕괴 및 종결을 야기하거나, 2 차 구조 헤어핀 또는 RNA 스플라이스 자리를 형성하는 서열을 제거하도록 변형될 수 있다. 상기 종에서 sacB 단백질 또는 cI 억제인자 단백질과 같은 본 발명의 폴리펩티드의 증가된 발현은 진핵생물 및 원핵생물에서의, 또는 특정 종에서의 코돈 사용의 분포 빈도를 이용함으로써 달성될 수 있다. 용어 "바람직한 코돈 사용의 빈도" 는 특정 아미노산을 지정하는 뉴클레오티드 코돈의 사용시 특정 숙주 세포에 의해 나타나는 선호도를 지칭한다. 20 개의 천연 아미노산이 존재하고, 이들 중 대부분은 하나 초과의 코돈에 의해 지정된다. 그러므로, 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기능적으로 변화되지 않는 한 모든 축퇴성 뉴클레오티드 서열이 본 개시에 포함된다.
서열과 관련하여 "일치성" 은 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산이 있는 위치의 수를 2 개의 서열 중 더 짧은 것의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수로 나눈 값을 지칭할 수 있으며, 이 경우 2 개의 서열의 정렬은 Wilbur and Lipman algorithm (Wilbur and Lipman) 에 따라 측정될 수 있다. RNA 서열이 DNA 서열과 유사하다거나, 어느 정도의 서열 일치성 또는 상동성을 갖는다고 언급되는 경우, DNA 서열 내 티미딘 (T) 은 RNA 서열 내 우라실 (U) 과 동등하다고 여겨진다. 따라서, RNA 서열은 본 발명의 범주 안에 있고, DNA 서열 내 티미딘 (T) 을 RNA 서열 내 우라실 (U) 과 동등하다고 여김으로써 DNA 서열로부터 유래될 수 있다. 2 개의 아미노산 서열의 서열 일치성 또는 서열 유사성, 또는 2 개의 뉴클레오티드 서열 간의 서열 일치성은 벡터 NTI 소프트웨어 패키지 (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA) 를 사용하여 측정될 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 독성 유전자에 작동가능하게 연결되는 프로모터는 λ 파지로부터의 프로모터이다. λ 파지는 E. coli 에서 생존하는 용원성 파지이다. 일단 파지가 그의 숙주 내에 존재하면, 이는 숙주의 DNA 로 자신을 통합시킬 수 있다. 이러한 상태에서, λ 는 프로파지로 불리고 숙주에게 큰 해를 끼치지 않으면서 숙주의 게놈 내에 머무를 수 있다. 이러한 방식으로, 프로파지는 숙주의 매 세포 분열 내에서 복제된다. 이러한 상태에서 발현되는 프로파지의 DNA 는 숙주 세포에서 스트레스의 신호를 찾아내는 단백질을 코딩한다. 스트레스는 스타베이션, 포이즌 (항생제와 같이) 및 숙주를 손상입히거나 파괴할 수 있는 다른 인자의 결과일 수 있다. 스트레스 조건이 검출될 때, 프로파지는 활성이 되고, 숙주 세포의 DNA 로부터 그 자체를 잘라내고 그의 용균 사이클로 들어서게 된다. 재활성화된 파지는 숙주의 DNA 에서 떨어져 나와 이의 단백질 팩토리를 재프로그래밍하여 다중 복제본으로 새로운 파지를 생산한다. 숙주의 모든 원천이 새로운 파지를 만드는 것으로부터 고갈될 때, 세포는 용균되고 (세포막이 파괴됨) 새로운 파지가 방출된다.
람다 억제인자 유전자 시스템은 하기로 구성되어 있다 (염색체 상에서 좌측에서 우측으로): cI 유전자, OR3, OR2, ORl, cro 유전자. cI 유전자는 λ 억제인자 ("cI 억제인자 단백질") 를 코딩한다. cI 억제인자 단백질을 코딩하는 게놈 영역은 면역성 영역으로서 알려져 있다. cI 억제인자 단백질은 유전자 전사의 양성 및 음성 조절자 둘 다이다. 이는 파지 λ가 이의 숙주 박테리아의 염색체 상에 "잠복해" 있는 것을 허용한다. λ 박테리오파지의 용원성 상태는 λ Pl 및 λ Pr 프로모터 각각 (용균 단계에 필요한 단백질 전사를 방지함) 으로부터 조절 단백질 cI 의 OR (우측 오퍼레이터) 및 OL (좌측 오퍼레이터) 오퍼레이터로의 결합에 의해 유지된다. 용원성 λ 파지를 가지고 있는 박테리아 세포는 λ 파지에 의해 추가의 감염에 면역된다. cI 억제인자 단백질은 임의의 추가의 감염성 파지 입자의 용균 발전을 저해한다.
구현예의 하나의 양태에서, 프로모터는 SEQ ID NO:5 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또다른 양태에서, 프로모터는 SEQ ID NO:5 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 억제인자 단백질은 cI 억제인자 단백질, 예컨대 cI857 억제인자이다 (이는 온도에 민감함). 용원으로서 cI857 을 갖는 λ 파지는 39℃ 미만의 온도에서 자랄 것이나, 이후 온도 증가에 의해 용균성 성장을 유도할 것이다. 3O℃ 에서, cI 억제인자 단백질은 활성이고 감염성 파지의 우측 및 좌측 오퍼레이터에 결합한다. 이는 임의의 파지 단백질의 전사를 방해하고 따라서 용균을 방해한다. 그러나, 42℃ 에서, cI 억제인자는 불활성화되고 프로모터 오퍼레이터에 결합할 수 없다.
하나의 양태에서, 본 발명은 cI 억제인자 단백질을 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 또는 58 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 cI 억제인자 단백질, 및 이의 변이체 또는 단편을 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 또는 58 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 cI 억제인자 단백질을 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 상기 동정된 바와 같은 (SEQ ID NO:2, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 또는 58) cI 억제인자 단백질의 단편 및 변이체를 제공하고 이는 잘 알려진 분자 생물학 기술을 이용하여 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 변이체는 본 발명의 폴리펩티드, 특히 SEQ ID NO:2, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 또는 58 에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치성을 갖는 상동 폴리펩티드이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드, 예컨대 cI 유전자 (cI 억제인자 단백질을 인코딩함), 예컨대 SEQ ID NO:2, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 또는 58 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 cI 억제인자 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 또는 58 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 cI 억제인자 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 보존적 변이체, 대립형질 변이체, 상동체 또는 이들 폴리펩티드 중 하나의 8 개 이상 또는 10 개 이상의 연이은 아미노산 또는 이들 폴리펩티드의 조합을 포함하는 단편을 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 또는 59 에서 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 변이체를 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 또는 59 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 변이체를 제공한다.
하나의 구현예에서, cI 유전자를 몰고가는 프로모터는 천연 cI 유전자 프로모터이다. 또다른 구현예에서, cI 유전자를 몰고가는 프로모터는 카나마이신 유전자의 약한 프로모터 (P1) 이다. 또다른 구현예에서, 프로모터는 SEQ ID NO:29, 83, 또는 30 에서 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또다른 구현예에서, 프로모터는 SEQ ID NO:29, 83, 또는 30 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 방법에 이용될 수 있는 다른 프로모터/억제인자 쌍은 하기를 포함하나 이로써 한정되지 않는다: CarA-CarS 억제인자-항억제인자 쌍에 의해 제어되는 carB 프로모터, 성장 호르몬 유전자 프로모터 및 억제인자 및 Lac 억제인자 (lad) 및 Ptrc-2 프로모터.
돌연변이생성을 위한 기질로서 제공되는 돌연변이체 프로모터/억제인자 쌍은 당업계에 기재되어 있고 현재 입수가능한 그러한 돌연변이체 중에서 선택될 수 있다. 이들의 오퍼레이터로의 돌연변이체 억제인자의 결합의 연구 [참조, 예: Nelson 및 Sauer, Cell, 42:549 (1985); Nelson 및 Sauer, J. Mol. Biol. 192:27 (1986); 및 Gussin, et al, Lambda II, (Hendrix, Roberts, Stahl, and Weisberg, eds) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., p. 93-123 (1983)] 는 공지된 돌연변이체 프로모터 및/또는 돌연변이체 억제인자 서열의 선별을 허용하고 이는 감소될 수 있으나 폐지되지 않은 전사율을 제공할 수 있다. 이러한 선별된 프로모터 영역은 비상동 발현 플라스미드로 혼입된 후 통상적 자리-지향 돌연변이생성에 의해 변경된다 (참조, 예: Morinaga, et al., Biotechnology, 2:636 ,1984). 대안적으로는, 억제인자-인코딩 서열은 유사한 방식으로 변경된다. 생성되는 돌연변이체 억제인자/프로모터 쌍은 자리-지향 돌연변이생성 처리되지 않은 야생형 플라스미드와의 발현에 비해 비상동 단백질의 분비를 촉진하기 위한 이의 능력에 대해 분석된다.
본원에 개시된 주제는 무약물 또는 항생제-미함유 개념을 제공하는 것이고, 이때 플라스미드로부터 발현된 억제인자 활성 (예컨대, cI 억제인자) 은 숙주 세포 염색체 상에 위치한 λ 파지 프로모터 하에 놓인 독성 유전자 산물 (예컨대 sacB 유전자 산물) 의 전사를 저해하고, 이때 기질, 예컨대 수크로오스의 존재 하의 숙주 세포의 생존력은 플라스미드로부터의 억제인자 단백질 (예컨대 λ cI 억제인자 단백질) 의 플라스미드로부터의 충분한 발현 수준에 의해 보장된다. 수크로오스의 존재 하에 항생제-미함유 플라스미드를 함유하는 숙주 균주의 성장은 DNA 플라스미드를 생산하고 유지하기 위한 효율적인 시스템을 보장한다.
용어 플라스미드는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 DNA 전사 단위 및 목적 숙주 또는 표적 세포 또는 세포에서 이의 생체 내 발현에 요구되는 요소를 포함하고; 이와 관련하여, 선형 형태뿐 아니라 초나선 비-초나선 환형 플라스미드 또한 본 발명의 범위 내인 것으로 의도됨을 주목한다.
본 발명의 하나의 구현예는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결되는 하나 이상의 억제인자 유전자를 포함하는 무약물 플라스미드에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 무약물 플라스미드 cI 억제인자 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또다른 양태에서, 무약물 플라스미드는 cI 억제인자 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함한다. 프로모터는 천연 cI 유전자 프로모터 또는 카나마이신 유전자의 약한 프로모터일 수 있다. 또다른 양태에서, 무약물 플라스미드는 면역원 또는 단백질을 인코딩하는 비상동 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 또다른 양태에서, 무약물 플라스미드는 면역원 또는 단백질을 인코딩하는 비상동 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함한다. 당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 프로모터는 본 발명에 따른 무약물 플라스미드에서 이용될 수 있으며 하기를 포함한다: 박테리아, 효모, 곰팡이, 곤충, 포유동물, 및 식물 프로모터. 프로모터는 하기일 수 있으나 이로써 한정되지 않는다: 인간 또는 쥐과 기원의 전초기 거대세포바이러스 프로모터 (CMV-IE), 또는 임의로는 또다른 기원을 갖는 프로모터 예컨대 래트 또는 기니피그, 슈퍼 프로모터 (Ni, M. et al., Plant J. 7, 661-676, 1995). CMV-IE 프로모터는 실제 프로모터 부분을 포함할 수 있고, 이는 인헨서 부분과 연계되거나 연계되지 않을 수 있다. EP-A-260 148, EP-A-323 597, U.S. 특허 제 5,168,062 호, 5,385,839 호 및 4,968,615 호, 및 PCT 출원 제 WO87/03905 호를 참조할 수 있다. 그람-음성 박테리아로부터의 다른 프로모터는 하기로부터 단리된 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는 적합한 프로모터이다: 아비박테리움 (Avibacterium), 브루셀라 (Brucella), 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli), 헤모필러스 (Haemophilus) (예: 헤모필러스 수이스 (Haemophilus suis)), 살모넬라 (Salmonella) (예: 살모넬라 엔테리디스 (Salmonella enteridis), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 인판티스 (Salmonella infantis)), 쉬겔라 (Shigella), 파스퇴렐라 (Pasteurella) 및 리메렐라 (Rimeirella).
플라스미드는 다른 발현 대조군 요소를 포함할 수 있다. 특히, 하기와 같은 안정화 서열을 혼입하는 것이 유리하다: 인트론 서열, 예를 들어, hCMV-IE (PCT 출원 제 WO1989/01036 호) 의 제 1 인트론, 래빗 β-글로빈 유전자 (van Ooyen et al., 1979) 의 인트론 II. 또다른 구현예에서, 플라스미드는 3' UTR 을 포함할 수 있다. 3' UTR 은 아그로박테리움 노팔린 합성효소 (Nos) 3' UTR 일 수 있으나 이로써 한정되지 않는다.
수두바이러스 외에 다른 바이러스 벡터 및 플라스미드에 대한 폴리아데닐화 신호 (polyA) 에 대한 것으로서 소 성장 호르몬 (BGH) 유전자의 폴리(A) 신호 (U.S. 5,122,458 참조), 또는 래빗 β-글로빈 유전자의 폴리(A) 신호 또는 SV40 바이러스의 폴리(A) 신호를 사용할 수 있다.
"숙주 세포" 는 외인성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 재조합 플라스미드 또는 벡터의 투여에 의한 유전적으로 변경될 수 있거나, 유전적으로 변경된 원핵 또는 진핵 세포를 나타낸다. 유전적으로 변경된 세포를 지칭할 때, 상기 용어는 본래 변경된 세포 및 이의 자손 둘 모두를 지칭한다.
본 발명의 다른 구현예는 무약물 플라스미드를 포함하는 그람-음성 박테리아 숙주 균주에 관한 것이다. 구현예의 하나의 양태는 숙주 염색체의 비필수 영역 하나 이상에서 삽입되는 비상동 폴리뉴클레오티드 및 무약물 플라스미드를 포함하는 그람-음성 박테리아 숙주 균주에 관한 것이고, 이때 비상동 폴리뉴클레오티드는 억제인자에 의해 엄격히 조절될 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 구현예의 또다른 양태에서, 비상동 폴리뉴클레오티드는 sacB 유전자에서 숙주 염색체에서 삽입된다. 구현예의 또다른 양태에서, sacB 유전자는 프로모터, 예컨대 λ 파지의 우측 프로모터에 작동가능하게 연결된다. sacB 유전자 및 프로모터는 숙주 염색체에서 다중 복제본, 예를 들어, 2 개의 또는 3 개의 복제본 내에서 삽입될 수 있다는 것이 인식되고 있다. 숙주 균주의 비필수 영역은 E.coli 염색체 상의 deA 또는 purN 유전자일 수 있다. deA 및 purN 유전자는 비필수적이고 이들 유전자의 결실은 박테리아의 성장률에 영향 미치지 않는다 (Kim, J. et al., Biochemistry. 46, 44:12501-12511). 하나의 양태에서, sacB 유전자 및 프로모터 카세트의 하나의 본제본은 대립형질 대체에 의해 deA 유전자자리 또는 purN 유전자자리에서 삽입된다. 또다른 양태에서, 프로모터 카세트 및 sacB 유전자의 2 개의 복제본은 deA 유전자자리 또는 purN 유전자자리에서 삽입된다. 또다른 양태에서, 프로모터 카세트 및 sacB 유전자의 2 개의 복제본은 숙주 염색체에서 삽입되고, 이때 프로모터 카세트 및 sacB 유전자의 하나의 본제본은 deA 유전자자리에서 삽입되고 다른 복제본은 purN 유전자자리에서 삽입된다. sacB 유전자 및 프로모터 가세트는 프로모터에 작동가능하게 연결되는 sacB 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 하나의 양태에서, sacB 유전자 및 프로모터 가세트는 λ 파지의 우측 프로모터 및 sacB 유전자를 포함한다. 또다른 양태에서, 프로모터 카세트 및 sacB 유전자는 SEQ ID NO:75 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또한, 본원에 개시된 주제는 면역원 또는 단백질을 인코딩하는 비상동 유전자를 포함하는 무약물 플라스미드를 포함하는 백신 또는 조성물, 또는 무약물 플라스미드를 사용하여 발현되는 단백질 또는 면역원을 포함하는 백신 또는 조성물에 관한 것이다. 백신 또는 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 면역원은 하기와 같은 고양이과 병원체로부터 선택되나 이로써 한정되지 않는다: 고양이 허피스바이러스 (FHV), 고양이 칼리시바이러스 (FCV), 고양이 백혈병 바이러스 (FeLV), 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 광견병 바이러스 등 및 이들의 조합.
또다른 구현예에서, 면역원은 하기를 포함하는 개 병원체로부터 선택되나 이로써 한정되지 않는다: 광견병 바이러스, 개 허피스바이러스 (CHV), 개 파르보바이러스 (CPV), 개 코로나바이러스, 렙토스피라 카니콜라 (Leptospira canicola), 렙토스피라 이테로헤모모라게 (Leptospira icterohaemorragiae), 렙토스피라 그리포티포사 (Leptospira grippotyphosa), 보렐리아 버그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica) 등, 및 이들의 조합.
또다른 구현예에서, 면역원은 하기와 같은 말 병원체로부터 선택된다: 말 허피스바이러스 (유형 1 또는 유형 4), 말 인플루엔자 바이러스, 테타누스, 웨스트닐 바이러스, 스트렙토코쿠스 이퀴 (Streptococcus equi), 로도코쿠스 이퀴 (Rhodococcus equi) 등 및 이들의 조합.
또다른 구현예에서, 면역원은 하기와 같은 소과 병원체로부터 선택된다: 광견병 바이러스, 소 로타바이러스, 소 파라인플루엔자 바이러스 유형 3 (bPIV-3), 소 코로나바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV), 수족구병 바이러스 (FMDV), 소 호흡장애 바이러스 (BRSV), 감염성 소 비기관염 바이러스 (IBR), 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli), 파스퇴렐라 물토시다 (Pasteurella multocida), 파스퇴렐라 헤모라이티카 (Pasteurella haemolytica), 살모넬라 (salmonella), 크립토스포리디움 (Cryptosporidium) 등 및 이들의 조합.
여전히 또다른 구현예에서, 면역원은 하기와 같은 돼지 병원체로부터 선택되나 이로써 한정되지 않는다: 돼지 인플루엔자 바이러스 (SIV), 돼지 써코바이러스 유형 2 (PCV-2), 돼지생식기호흡기증후군바이러스 (PRRS), 슈도광견병 바이러스 (PRV), 돼지 파르보바이러스 (PPV), FMDV, 마이코플라즈마 폐렴 (Mycoplasma hyopneumoniae), 에리시펠로트릭스 러시오패티아 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 파스퇴렐라 물토시다 (Pasteurella multocida), 보르데텔라 브로키셉티카 (Bordetella bronchiseptica), 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli), 부루텅 바이이러스, 아프리카 마역 바이러스, 리프트 계곡열, 니파 바이러스 등 및 이들의 조합.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원" 또는 "면역원" 은 숙주 동물에서 특정 면역 반응을 유도하는 물질을 의미하고 상호교환적으로 사용된다. 항원은 면역성 특성을 가진 삽입물을 함유하는 재조합 벡터; 숙주 동물에 제시되는 경우 면역 반응을 유도할 수 있는 DNA 의 피어스 (pierce) 또는 단편; 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 에피토프, 합텐, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로, 면역원 또는 항원은 독소 또는 항독소를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체" 및 "약학적으로 허용가능한 운반체" 는 반대 효과 없이 숙주에게 주입될 수 있는 백신 항원을 함유하기 위한 유체 운반체를 지칭하고 상호교환적으로 사용된다. 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 당업계에 공지되어 있고, 멸균수, 염수, 글루코오스, 덱스트로스 또는 완충액을을 포함하나, 이로써 한정되지 않는다. 담체는 희석제, 안정화제 (즉, 당 및 아미노산), 보존제, 습윤제, 에멀젼화제, pH 완충제, 점도 증강 첨가제, 색 등을 포함하나 이로써 한정되지 않는다.
유리하게는 그러나 배타적이지는 않게 플라스미드에 적합한 4차 암모늄 염을 함유하는 양이온성 지질은 유리하게는 하기 화학식을 갖는 것이다:
Figure pct00001
(식 중, R1 은 탄소수가 12 내지 18 인 포화 또는 불포화 직쇄 지방족 라디칼이고, R2 는 탄소수가 2 또는 3 인 또다른 지방족 라디칼이고, X 는 아민 또는 히드록실기, 예를 들어 DMRIE 임). 또다른 구현예에서 양이온성 지질은 중성 지질, 예를 들어 DOPE 와 연합될 수 있다.
이들 양이온성 지질 중에서, 유리하게는 중성 지질, 유리하게는 DOPE (디올레오일-포스파티딜-에탄올 아민; Behr, 1994) 와 연합되어, DMRIE-DOPE 를 형성하는 DMRIE (N-(2-히드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판 암모늄; WO96/34109) 이 바람직하다.
유리하게는, 애쥬반트가 있는 플라스미드 혼합물이 임시로, 유리하게는 제제의 투여와 동시에 또는 제제의 투여 직전 형성된다; 예를 들어, 투여 직전 또는 투여에 앞서, 플라스미드-애쥬반트 혼합물이 형성되어, 유리하게는 투여에 앞서 혼합물이 복합체를 형성하기에 충분한 시간, 예를 들어 투여에 앞서 약 10 내지 약 60 분, 예컨대 투여에 앞서 대략 30 분을 제공한다.
DOPE 가 존재하는 경우, DMRIE:DOPE 몰비는 유리하게는 약 95:약 5 내지 약 5:약 95, 더욱 유리하게는 약 1:약 1, 예를 들어, 1:1 이다.
DMRIE 또는 DMRIE-DOPE 애쥬반트:플라스미드 중량비는 약 50:약 1 내지 약 1:약 10, 예컨대 약 10:약 1 내지 약 1:약 5, 및 약 1:약 1 내지 약 1:약 2, 예를 들어, 1:1 내지 1:2 일 수 있다.
제약적으로 또는 수의적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클은 유중수 에멀젼일 수 있다. 적합한 유중수 에멀젼의 예에는 4℃ 에서 유체이며 안정적인 하기를 함유하는 오일-기재 유중수 백신 에멀젼이 포함된다: 6 내지 50 v/v %, 바람직하게는 12 내지 25 v/v % 의 항원-함유 수성 상, 전체적으로 또는 부분적으로 비-대사가능 오일 (예, 광물 오일 예컨대 파라핀 오일) 및/또는 대사가능 오일 (예, 식물성 오일, 또는 지방산, 폴리올 또는 알코올 에스테르) 을 함유하는 50 내지 94 v/v % 의 오일 상, 0.2 내지 20 p/v %, 바람직하게는 3 내지 8 p/v % 의 계면활성제, 후자는 전체적으로 또는 부분적으로, 또는 혼합물로 폴리글리세롤 에스테르이고, 상기 폴리글리세롤 에스테르는 바람직하게는 폴리글리세롤 (폴리)리시놀레에이트, 또는 폴리옥시에틸렌 리신 오일 또는 그밖의 수소첨가된 폴리옥시에틸렌 리신 오일이다. 유중수 에멀젼에 사용될 수 있는 계면활성제의 예에는 에톡실화된 소르비탄 에스테르 (예, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트 (Tween 80？, AppliChem, Inc., Cheshire, CT 에서 입수가능) 및 소르비탄 에스테르 (예, 소르비탄 모노올레에이트 (Span 80？), Sigma Aldrich, St. Louis, MO 에서 입수가능) 가 포함된다. 또한, 유중수 에멀젼과 관련하여, 또한 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 6,919,084, 예를 들어, 이의 실시예 8 참조. 일부 구현예에서, 항원-함유 수성 상은 하나 이상의 완충제를 포함하는 식염수를 포함한다. 적합한 완충액의 예는 포스페이트 완충 식염수이다. 유리한 구현예에서, 유중수 에멀젼은 수/유/수 (W/O/W) 3중 에멀젼 (예를 들어 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 번호 6,358,500 참조) 일 수 있다. 다른 적합한 에멀젼의 예가 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 번호 7,371,395 에 기술되어 있다.
백신 또는 조성물은 의학 또는 수의학 업계에서 당업자에게 잘 공지되어 있는 기술에 의해 수용 동물의 연령, 성별, 체중, 종 및 상태, 및 투여 경로와 같은 인자를 고려한 투여량으로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경피, 점막 투여 (예: 경구, 비강, 항문, 질) 또는 비경구 경로 (피부내, 근내, 피하, 정맥내 또는 복강내) 일 수 있다. 백신 또는 조성물은 단독 투여될 수 있거나 다른 치료 또는 요법과 공동-투여되거나 순차적으로 투여될 수 있다. 투여를 위한 제형에는 현탁액, 시럽 또는 엘릭시르, 및 비경구, 피하, 피부내, 근내 또는 정맥내 투여 (예: 주사가능한 투여용 제제), 예컨대 무균 현탁액 또는 에멀젼이 포함될 수 있다. 백신 또는 조성물은 적합한 담체, 희석제 또는 부형제, 예컨대 멸균수, 생리 식염수, 글루코오스 등과 혼화되어 전달되거나 식품 및/또는 물 중에서 혼합되거나 분무로서 투여될 수 있다. 조성물은 원하는 제제 및 투여 경로에 따라 보조 물질,예컨대 습윤제 또는 에멀젼화제, pH 완충제, 애쥬반트, 겔화 또는 점도 증강 첨가제, 보존제, 향미제, 착색제 등을 함유할 수 있다. 실험을 행하지 않고 적합한 제형을 제조하기 위해 표준 약학 문헌, 예컨대 ["Remington's Pharmaceutical Sciences," 1990] 를 찾아볼 수 있다.
본원에 개시된 주제는 하기 단계를 포함하는 무약물 플라스미드의 제조 방법에 관한 것이다: 1) 숙주 염색체의 비필수 영역 하나 이상에서 대립형질 대체에 의해 삽입되는 비상동 폴리뉴클레오티드를 포함하는 그람 음석 박테리아 숙주 균주를 조작하는 단계; 2) cI 억제인자 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 플라스미드를 구축하는 단계; 3) 박테리아 숙주 균주를 cI 억제인자 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 플라스미드로 형질전환하는 단계; 4) 30℃ 내지 42℃ 범위의 온도에서 수크로오스의 존재 하에 형질전환된 박테리아 숙주 균주를 성장시키는 단계; 및 5) DNA 플라스미드를 회수하는 단계.
구현예의 하나의 양태에서, DNA 플라스미드는 면역원 또는 단백질을 인코딩하는 비상동 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 이때 비상동 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 조작가능하게 연결된다. 상기 프로모터는 원핵 또는 진핵 세포에서 기능적인 프로모터, 예컨대 CMV 프로모터일 수 있다.
또한, 본원에 개시된 주제는 하기 단계를 포함하는 무약물 플라스미드를 사용하여 단백질 또는 면역원을 제조하는 방법에 관한 것이다: 1) 숙주 염색체의 하나 이상의 비필수 영역에서 대립형질 대체에 의해 삽입되는 비상동 폴리뉴클레오티드를 포함하는 그람 음성 박테리아 숙주 균주를 조작하는 단계; 2) cI 억제인자 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 면역원 또는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 플라스미드를 구축하는 단계; 3) cI 억제인자 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 면역원 또는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 플라스미드로 박테리아 숙주 균주를 형질전환하는 단계; 4) 30℃ 내지 42℃ 범위의 온도에서 수크로오스의 존재 하에 형질전환된 박테리아 숙주 균주를 성장시키는 단계; 및 5) 면역원 또는 단백질을 회수하는 단계.
구현예의 하나의 양태에서, 면역원 또는 단백질을 인코딩하는 유전자는 원핵 세포에서 기능적인 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 하기를 포함하나 이로써 한정되지 않는 그람-음성 박테리아로부터의 프로모터일 수 있다: 아비박테리움 (Avibacterium), 브루셀라 (Brucella), 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli), 헤모필러스 (Haemophilus)(예: 헤모필러스 수이스 (Haemophilus suis)), 살모넬라 (Salmonella) (예: 살모넬라 엔테리디스 (Salmonella enteridis), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 인판티스 (Salmonella infantis)), 쉬겔라 (Shigella), 파스퇴렐라 (Pasteurella) 및 리메렐라 (Rimeirella) 로부터 단리되는 프로모터.
구현예의 하나의 양태에서, 숙주 염색체 내에 삽입되는 비상동 폴리뉴클레오티드는 sacB 단백질을 인코딩한다. 또다른 양태에서, 수크로오스 농도는 0% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 10% 범위 일 수 있다. 또다른 양태에서, 수크로오스 축소는 contraction may range from 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 3%, 약 3% 내지 약 4%, 약 4% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 6%, 약 6% 내지 약 7%, 약 7% 내지 약 8%, 약 8% 내지 약 9%, 또는 약 9% 내지 약 10% 범위일 수 있다. 또다른 양태에서, 수크로오스 축소는 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 또는 약 10% 일 수 있다.
구현예의 하나의 양태에서, 온도는 약 30℃ 내지 약 42℃ 일 수 있다. 또다른 양태에서, 온도는 약 30℃ 내지 약 41℃, 약 30℃ 내지 약 39℃, 약 30℃ 내지 약 38℃, 약 30℃ 내지 약 37℃ 범위일 수 있다. 또다른 양태에서, 온도는 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 또는 약 41℃ 일 수 있다.
회수하는 것이란 용어는 배양 배지로부터 수집하고, 추출하고, 수확하거나 정제하는 것을 포함하나 이로써 한정되지 않는다.
"단리된" 생물학적 성분 (예컨대 핵산 또는 단백질 또는 소기관) 은 그 성분이 자연적으로 발생하는 유기체의 세포 내 다른 생물학적 성분, 예를 들어, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 단백질, 및 소기관으로부터 실질적으로 분리 또는 정제되어진 성분을 지칭한다. "단리된" 폴리뉴클레오티드 (DNA 플라스미드 포함) 및 단백질에는 표준 정제 방법 (예를 들어, [Russell, David W.; Sambrook, Joseph (2001), Molecular cloning: laboratory manual. Cold Spring Harbor, N. Y: Cold Spring Harbor Laboratory] 참조) 에 의해 정제된 폴리뉴클레오티드 및 단백질이 포함된다. 또한, 상기 용어는 재조합 기술 및 화학적 합성에 의해 제조되는 폴리뉴클레오티드 및 단백질을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "정제된" 은 절대 순도를 요하지 않으며; 오히려, 상대적 용어로서 의도된다. 따라서, 예를 들어, 정제된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 제제는 그안의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 그것의 자연 환경에 있을 때보다 더욱 농축되어 있는 것을 의미한다. 즉, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 세포성 성분으로부터 분리된다. "실질적으로 정제된" 은 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상, 또는 그 이상의 세포성 성분 또는 물질이 제거된 것을 의미한다. 마찬가지로, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 부분적으로 정제될 수 있다. "부분적으로 정제된" 은 60% 미만의 세포성 성분 또는 물질이 제거되는 것을 의미한다.
본 발명은 본 발명에 따른 조성물, 백신 또는 면역성 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 면역 반응 또는 보호성 반응을 유도하기 위한 방법을 추가로 제공한다. 산출된 면역 반응은 특히 항체 및/또는 세포성 면역 반응, 특히 감마-인터페론 반응이다.
특히, 본 발명은, 병원성 유기체 (예를 들어, 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 원생동물 파라자리에 의한 감염) 로 동물이 감염되는 것에 의해 야기되는 증상을 방지하거나 감소시키기 위한 방법, 또는 이에 대한 면역화 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는 척추 동물에서 유용하다: 인간, 개류 (예를 들어, 개), 고양이류 (예를 들어, 고양이); 말류 (예를 들어, 말), 소류 (예를 들어, 소), 돼지류 (예를 들어, 돼지), 및 조류 (예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 꿩, 앵무새, 핀치, 매, 까마귀 및 주금류 (타조, 에뮤 및 화식조 등을 포함하나 이에 한정되지 않음). 본 발명의 방법은 또한 생선 DNA 백신을 제공하는데 유용하다.
본 발명의 특정 양태에서, 이들 방법은 본 발명에 따라 제조된 백신 조성물을 투여함으로써 분만 전의 수태 암컷의 백신화로 이루어진다. 이들 방법은 또한 백신화 프로토콜에 의해 산출된 보호성 항체의 도입을 포함하고 백신화된 수태 암컷으로부터의 이들 보호성 항체가 이들 자손으로 이동되는 것을 포함한다. 그러한 모체 항체의 이동은 후속적으로 질병으로부터 자손을 보호한다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여용량은 백신화될 동물의 종, 번식, 연령, 크기, 백신 히스토리 및 건강 상태에 의존적일 것이다. 항원 농도, 추가 백신 성분 및 투여 경로 (즉, 피하, 피부내, 경구, 근내 또는 정맥내 투여) 와 같은 다른 인자가 효과적인 투여용량에 영향 미칠 것이다. 투여체에 대한 백신의 투여용량은 백신의 항원 농도, 투여 경로 및 백신화될 동물의 연령 및 상태에 기초하여 용이하게 결정될 수 있다. 항원의 각각의 배치 (batch) 는 별도로 눈금매길 수 있다. 대안적으로는, 상이한 용량의 체계적인 면역원성 시도, 및 MPD (Minimum Protective Dose; 최소 보호성 투여량) 연구 및 다른 스크리닝 절차가 실험을 수행하지 않고 본 발명에 따른 백신 조성물에 대해 효과적인 투여용량을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 하기 제시되는 실시예로부터, 대략적인 투여용량이 얼마인지 본원에 기재된 백신 조성물을 사용하는데 적절한 대략적인 부피가 얼마인지가 명백해질 것이다. 중요한 인자는, 투여용량이 자연 감염과 연계된 사망률 및 질병률에서의 감소에 의해 명증되는 바와 같이, 자연 감염에 대항하여 적어도 부분적 보호성 효과를 제공하는 것이다. 마찬가지로, 당업자는 적절한 부피를 용이하게 알아낼 수 있다. 예를 들어, 조류 종에 있어서, 투여용량의 부피는 약 0.1 ㎖ 내지 약 0.5 ㎖, 유리하게는, 약 0.3 ㎖ 내지 약 0.5 ㎖ 일 수 있다. 고양이, 개 및 말 종에 대해선, 투여용량 부피는, 약 0.2 ㎖ 내지 약 3.0 ㎖, 유리하게는 약 0.3 ㎖ 내지 약 2.0 ㎖, 보다 유리하게는, 약 0.5 ㎖ 내지 약 1.0 ㎖ 일 수 있다. 소 및 돼지 종에 대해선, 투여용량 부피는 약 0.2 ㎖ 내지 약 5.0 ㎖, 유리하게는 약 0.3 ㎖ 내지 약 3.0 ㎖, 보다 유리하게는 0.5 ㎖ 내지 약 2.0 ㎖ 일 수 있다.
마지막 투여 이래로 장기간의 시간이 지났을 때 또는 초기 면역 반응을 증강시키기 위해 주기적 시간 간격으로 반복하는 백신화가 바람직하다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 백신 조성물은 비경구 주입 (즉, 피하, 피부내, 또는 근내) 으로서 투여된다. 조성물은 하나의 투여량으로서 투여될 수 있거나, 대안적인 구현예에서는, 약 2 내지 약 6 주, 바람직하게는 약 2 내지 약 5 주의 간격에서 약 2 내지 약 5 회 투여량으로 반복적으로 투여된다. 그러나, 당업자는 투여량 횟수 및 백신화 사이의 간격이 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는 수많은 인자에 의존적임을 인지할 것이다: 백신화 동물의 연령; 동물의 상태; 면역화 경로; 투여량 당 이용가능한 항원의 양; 등. 초기 백신에 대해, 간격은 일반적으로 1 주 초과, 바람직하게는 약 2 내지 약 5 주일 것이다. 이미 백신화된 동물에 대해서, 수태 전 또는 수태 동안 부스터 백신화를 대략 1 년 간격으로 수행할 수 있다.
또한, 본 발명에는 하기와 같은 바늘이 없는 주입기를 사용하여 백신 조성물을 투여하는 것이 고려된다: Pigjet？, Avijet？, Dermojet？ 또는 Biojector？ (Bioject, Oregon, USA). 당업자는 백신화될 동물의 종; 동물의 연령 및 체중 등과 같은 인자에 관해 요구되는 바와 같은 주입기의 세부사항을 실험 없이도 조정할 수 있다.
또한, 본 발명은 면역원 또는 약학 조성물과 같은 활성 성분을 함유하는 제 1 바이알, 및 제 2 바이알에서 본 발명에 따라 제조된 희석제를 포함하는 키트에 관한 것이다. 면역원은 본원에 기재된 바와 같이 동결건조 형태, 건조 형태 또는 수용액 형태일 수 있다.
하기 비제한적 실시예로 본 발명을 추가로 기술할 것이다.
실시예
실시예 1: 항생제-미함유 플라스미드 유지 개념
하기 실시예는 3가지 성분에 기초한 그람-음성 숙주 세포 내에 다수의 플라스미드 복제본을 유지시키기 위한 신규한 개념을 입증한다:
1. 규정된 배양 조건 하에서 그람-음성 박테리아에 대한 독성 산물을 발현하는 그람-음성 박테리아 (이때, 독성 유전자는 박테리아 숙주 염색체의 비필수 영역 하나 이상으로 삽입됨).
2. 엄격히 조절될 수 있는 구성요소적 프로모터의 제어 하에서 독성 산물을 인코딩하는 유전자의 박테리아 염색체 상에서의 존재; 및
3. 숙주 염색체 상의 독성 유전자에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 조절하는 플라스미드로부터 특정 억제인자의 발현.
이러한 설계에서, 플라스미드의 존재는 규정된 배양 조건 하에 (예: 수크로오스의 존재 하에) 있을 때, 그람-음성 박테리아 숙주의 다중을 제어한다.
제 1 성분에서, 그람 음성 박테리아는 레반수크라제를 코딩하는 sacB 유전자를 발현하기 위해 형질전환된다 (도 1). 제 2 및 제 3 성분은 cI 억제인자 유전자 산물 및 우측 λ 프로모터에 관한 것이다. λ 박테리오파지의 cI 유전자는 λ 억제인자를 코딩한다.
cI 억제인자 단백질을 코딩하는 게놈 영역은 면역성 영역으로서 공지되어 있다. 면역성 영역은 도 2 에 도시되어 있다. cI 유전자 산물을 발현하는 플라스미드계는 λ 프로모터의 제어 하에 놓인 sacB 유전자의 전사를 저해해야만 한다. 그러한 억제는 수크로오스에 대한 내성을 부여해야만 하고 숙주 세포에서 플라스미드 유지 및 번식 둘 다를 허용해야만 한다 (도 1 참조).
도 3 은 플라스미드로부터 발현되는 cI 억제인자 활성이 숙주 세포 염색체 상에 위치한 λ Pr 프로모터 하에 위치한 독성 sacB 유전자 산물의 전사를 저해하고, 숙주 E. coli 세포의 수크로오스의 존재하에서의 생존력은 플라스미드로부터 λ cI 억제인자 단백질의 충분한 발현 수준에 의해 보장된다는 "무약물" 개념의 개요도이다. 이의 특정 프로모터에 결합하는 cI 억제인자는 30℃ 내지 37℃ 의 온도에서 최적이다 (도 3 참조).
특정 경우 (예컨대 온도 민감성 cI857 억제인자를 사용하는 경우) 에서, cI 억제인자는 40℃ 초과의 온도에서 프로모터에 결합하지 않을 것이다. 따라서, 42℃ 로의 전환은 λ Pr 프로모터에 대한 cI 억제인자의 결합 활성을 저해하고 결과적으로 숙주 세포가 수크로오스 (보다 특히 레반 하위생성물) 에 대해 민감하게 되어야만 한다. 수크로오스의 존재 하의 42℃ 온도 인큐베이션은 전체 시스템의 기능성을 유효하게 하기 위한 특별한 목적을 위한 조건이고 시스템의 전체 기능성의 지지에서 “음성적 증거”를 구성한다 (도 4 및 도 6C 참조). 실제로, Cat 또는 수크로오스의 존재하에 성장시킨 pPB829 또는 pPB838 플라스미드로 형질전환된 부모 세포 λPr::sacB purNΩKan 은 42℃ 에서 인큐베이션시 LB 수크로오스 아가 상에 플레이팅될 때 생존할 수 없었다. 이는 부포 세포의 생존력이 cI 유전자를 포함하는 플라스미드의 유지에 의존적임을 입증한다.
실시예 2: λ 프로모터 / 레반수크라제 유전자를 가지고 있는 E. coli 숙주 균주의 생성
λPr::sacBΩKan 카세트를 함유하는 2 개의 조작된 숙주 균주를 제조하고, 이때 람다 프로모터 (λPr) 의 제어 하의 sacB 유전자를 함유하는 카세트를 카나마이신으로 마킹한 후 edA 또는 purN 유전자의 대립형질 대체에 의해 E. coli 염색체로 도입하였다. 이들 유전자는 비필수적이고 이들의 결실은 성장 속도에 영향 미치지 않는다. 형질전환된 세포는 수크로오스에 매우 민감하게 되었다.
도 8A-B 는 edA 또는 purN 유전자 각각의 대립형질 대체 의해 E. coli 염색체로 삽입되는 λPr::sacBΩKan 카세트가 PCR 결합에 의해 융합되기 전 PCR 증폭된 6 개의 독립적 성분으로 구성되는 것을 보여준다.
도 8 D 는 λPr::sacBΩKan 카세트가 edA 또는 purN 유전자의 대립형질 대체에 의해 E. coli 의 염색체로 삽입되는 것을 보여준다. 이러한 카세트 삽입은 선형 DNA 주형으로 E. coli 를 형질전환함으로써 수행되고, 이는 염색체 유전자자리의 업스트림 및 다운스트림 상동 영역에 의한 측면화된 결실된 유전자를 함유하고, 재조합이 능숙한 E. coli 균주, 예컨대 recD, recB recC sbcA 돌연변이체로 형질전환된다. 부모 균주의 조작을 위한 E. coli 균주는 Stratagene (ref# 200154) 으로부터의 BJ5183 였고, 이때 유전자형은 endA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (Strr) 였다. 나타낸 바와 같이, E. coli의 초기 표현형은 KanS, CatS 및 수크로오스R 였다. 균주의 형질전환에 따라, 표현형은 KanR, CatS 및 수크로오스S 로 판명되었다. 이러한 나중 표현형은 항생제-미함유 플라스미드의 기능성의 입증을 다룬 추가 실험을 위해 사용되는 부모 균주 중 하나였다.
도 8C 는 Prλ::sacBΩKan E. coli 염색체로의 edA 유전자의 대립형질 대체에 의해 삽입되는 λPr::sacBΩcat 카세트가 결합 PCR 에 의해 융합되기 전에 PCR 증폭된 6 개의 독립적 성분으로 이루어졌다는 것을 보여준다. 대립형질 교환에 의해 edA 유전자의 결실을 표적으로 하는 새로운 λPr::sacBΩcat 카세트의 목표는 2 개의 sacB 카세트를 발현하는 이중 결실 돌연변이체 ΔedA ΔpurN을 조작하기 위한 것이었다.
도 8 E 는 부모 균주가 cI 플라스미드 (pPB829 또는 pPB838) 로 형질전환될 때, 세포 (부모 균주 + cI 플라스미드 [pPB829 또는 pPB838]) 가 카나마이신 (KanR), 클로람페니콜 (CatR) 및 수크로오스 (수크로오스R) 에 내성이 생겼다는 것을 보여준다. 도면은 조작된 숙주 균주 (ΔpurN λPr::sacB+ Ωkan) 또는 (ΔedA λPr::sacB+ Ωkan) 의 공동 발현 및 sacB 유전자가 람다 프로모터의 제어 하에 놓일 때의 개념의 증거를 입증하기 위한 약물 플라스미드 및 edA 또는 purN 유전자의 대립형질 대체에 의해 E. coli의 염색체로 도입되는 구축물을 도시한다. 형질전환된 세포는 수크로스에 대해 매우 민감하게 되었다. cI 억제인자를 포함하는 클로람페니콜 마킹된 플라스미드 (pPB829 또는 pPB838) 가 ΔpurN λPr::sacB+ Ωkan 또는 ΔedA λPr::sacB+ΩKan 균주로 도입될 때, 형질전환된 세포는 카나마이신, 클로람페니콜 및 수크로오스에 대해 내성이 생기게 되었다.
λ프로모터 (λPr)를 purN 결실을 위해 PB 1232 및 PB 1233 프라이머로 증폭시켰다.
PB1232 프라이머 (SEQ ID NO:6):
(CCGAACAACGCGTGGTTATCGACACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCG) 및
PB1233 프라이머 (SEQ ID NO:7):
(CAAACTTTTTGATGTTCATATCCATCTGATCCTCTTCAAAAGGCCACCTG)
λ프로모터 (λPr) 를 edA 결실을 위해 PB 1234 및 PB 1233 프라이머로 증폭시켰다.
PB1234 (SEQ ID NO:8):
(GACGACAAATTTGTAATCAGGCGAGAGCACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCG)
λ프로모터 (λPr) (SEQ ID NO:5) 의 증폭을 DNA 주형으로서 pLDR8 플라스미드 (ATCC# 77357) 를 사용하여 수행하였다. λPr::sacBΩkan 카세트의 조작을 위해 결합 PCR 을 사용할 때, sacB 유전자 (SEQ ID NO:3) 를 DNA 주형으로서 pNB350 (Merial 이 지적 재산권 소유) 를 사용하여 PB 1192 (SEQ ID NO:9) (ATGGATATGAACATCAAAAAGTTTGC) 및 PB1193 (SEQ ID NO:10) (AAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCTTG) 프라이머로 증폭시켰다 (도 8A-B 참조). λPr::sacBΩcat 카세트의 조작을 위해, 역 프라이머 PB1320 (SEQ ID NO:80) (GCCGATCAACGTCTCATTTTCGCCGTTAACAGATCTTTATTTGTTAACTGTTAATT GTCCTTG) 를 PB1193 위치에서 사용하였다. bla 프로모터를 DNA 주형으로서 pCMVβ 를 사용하여 PB1194 (SEQ ID NO:11) (ATGTGCGCGGAACCCCTATTTG) 및 PB1195 (SEQ ID NO:12) (GACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGC) 프라이머로 증폭시켰다. 카나마이신 내성 유전자를 DNA 주형으로서 플라스미드 pLL14 (카나마이신 유전자에 대한 약학 프로모터 함유, Merial 이 지적 재산권 소유) 를 사용하여 PB1196 (SEQ ID NO:13) (ATGAGCCATATTCAACGGGAAACG) 및 PB1197 (SEQ ID NO:14)(GAAAAACGCCAGCGGCAGAGCTGGCGCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG) 프라이머로 증폭시켰다. 천연 cat 프로모터의 제어 하에 놓인 클로람페니콜 (cat) 내성 유전자를 DNA 주형으로서 pPB829 를 사용하여 PB 1321 (SEQ ID NO:81) (AGATCTGTTAACGGCGAAAATGAG) 및 PB1322 (SEQ ID NO:82) (AAAACGCTACAAAAATGCCCGATCCTTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGC) 프라이머로 증폭시켰다. purN 유전자의 5'측 영역을 DNA 주형으로서 E. coli SCS1 균주의 게놈 DNA 를 사용하여 PB1237 (SEQ ID NO:15) (TTTGCGGCCGCTGGTGGTGGTCGCCATGTGCGTTAATGACC) 및 PB1199 (SEQ ID NO:16) (TATTCGATAACCACGCGTTGTTCGG) 로 증폭시켰다. purN 유전자의 3'측 영역을 DNA 주형으로서 E. coli SCS1 균주의 게놈 DNA 를 사용하여 PB1200 (SEQ ID NO: 17) (GCGCCAGCTCTGCCGCTGGCGTTTTTC) 및 PB 1238 (SEQ ID NO: 18) (TTTGGATCCGCTGGTGGATATCATCAAGGCAGTAACGCAGAATG) 프라이머로 증폭시켰다. edA 유전자의 5'측 영역을 DNA 주형으로서 SCS1 의 게놈 DNA 를 사용하여 PB1235 (SEQ ID NO:19) (TTTGCGGCCGCTGGTGGTTGAGAACCAGGTGATTGAAGCGCC) 및 PB1209 (SEQ ID NO:20) (CTCTCGCCTGATTACAAATTTGTCGTC) 프라이머로 증폭시켰다. edA 유전자의 3'측 영역을 주형 DNA 으로서 플라스미드 pLDR8 를 사용하여 다음 프라이머 PB1210 (SEQ ID NO:21) (AGGATCGGGCATTTTTGTAGCGT) 및 PB1236 (SEQ ID NO:22)(TTTCTAGAGCTGGTGGCGACTACCGTGAATCCTGGCAACC) 프라이머로 증폭시켰다.
E. coli 염색체로 이동되는 이들 λPr::sacB Ωkan 카세트 또는 λPr::sacB Ωcat 의 6 개의 개별 PCR 산물을 결합 PCR 에 따라 함께 융합하였다 (도 8A-B-C). 이들 6 개의 별도 증폭 단편을 PCR 클린-업 키트 (Geneclean turbo kit; MP Biomedicals, CA, USA) 로 정제하고, 제 2 회전 PCR 을 모든 6 개의 단편의 존재 및 프라이머의 부재로 세팅하였다. PCR 조건은 하기와 같았다: PCR 혼합물 (최종 25 ㎕), 1 ㎕ 의 각각의 PCR 단편, 2 ㎕ 의 dNTP (2.5 mM 각각, 5 ㎕ 의 5xPCR 완충제, 11.5 ㎕ 의 멸균 증류수, 0.5 ㎕ 의 Phusion DNA 폴리머라제 (Finenzymes, Finland); PCR 사이클: 98℃ 30s, (98℃ 10 s, 6O℃ 30 s, 72℃ 5 분)* 15 사이클 및 72℃ 10 분. 제 3 회전 PCR 증폭을 purN (대립형질 대체) 에 대해 PB 1235 및 PB 1236 프라이머 및 edA (대립형질 대체) 에 대해 PB 1237 및 PB 1238 프라이머를 사용하여 1 ㎕ 의 정제된 제 2 회전 산물로 수행하였다. PCR 조건은 하기와 같았다: PCR 혼합물 (최종 50 ㎕), 1 ㎕ 의 제 2 PCR 단편, 1 ㎕ 의 dNTP (2.5 mM 각각, 10 ㎕ 의 5xPCR 완충제, 37 ㎕ 의 멸균 증류수, 0.25 ㎕ 의 전진 프라이머, 0.25 ㎕ 역 프라이머, 0.5 ㎕ Phusion DNA 폴리머라제 (Finenzymes, Finland); PCR 사이클: 98℃ 30s, (98℃ 15 s, 6O℃ 30 s, 72℃ 4 분)* 35 사이클 및 72℃ 10 분. 최종 PCR-결합 증폭절 (purN 대립형질 대체에 대해 4007 bp 및 edA 대립형질 대체에 대해 3407 bp) 을 아가로스 겔 상에서 확인하고 E.coli 로의 형질전환 전에 정제하였다. 각각의 결합된-PCR 증폭절을 제한 분석법에 의해 확인하였다.
표적 유전자자리 (edA 또는 purN) 의 경계선을 치는 DNA 서열에 대한 2 개의 긴 상동 영역에 의해 측면에 배치된 bla 프로모터의 제어 하에 놓인 Kan 내성 유전자 및 λPr 프로모터의 제어 하에 놓인 sacB 유전자 (SEQ ID NO:75) 를 인코딩하는 선형 DNA 단편 (λPr::sacBΩKan) 을 전기천공법에 의해 E. coli 의 염색체로 통합시켰다. 대략 300 개의 형질전환체 후보 (ΔpurN λPr::sacBΩKan 또는 ΔedA λPr::sacBΩKan 단일 돌연변이체) 를 선별 압박으로서 카나마이신을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 수득하였다. 20 개의 콜로니를 무작위로 고르고, 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 분해함으로써 정제하고, edA 또는 purN 유전자자리에서의 λPr::sacBΩKan 카세트 삽입을 PCR 로 검증하였다 (도 9B 참조). PB1196 및 PB1197 을 사용하는 PCR 을 염색체 내의 카나마이신 삽입을 확인하기 위해 수행하였다. PB1192 및 PB1193 을 사용하는 PCR 을 염색체에서 sacB 유전자의 존재를 증명하기 위해 수행하였다. PB1204 (SEQ ID NO:23) (GTGGTGCTTATTTCCGGCAACGG) 및 PB1205 (SEQ ID NO:24) (CCAGCCACGCGGCGTTTTCGTGC) 프라이머를 사용하는 PCR 을 염색체에서 purN 유전자의 부재를 검증하기 위해 수행하였다. PB 1214 (SEQ ID NO:25) (GACCACCGGCCCGGTTGTACCGG) 및 PB1215 (SEQ ID NO:26)(CGGACCCGCGATCGCCTGCAGG) 을 사용하는 PCR 을 edA 유전자의 부재를 검증하기 위해 수행하였다 (도 9B 참조). PB1213 (SEQ ID NO:27) (GGTGGATGGCGTCCATTTCTGTGC) 및 PB1196 프라이머를 사용하는 PCR 을 edA 유전자자리에서 카세트의 우측 및 올바른 삽입을 검증하기 위해 수행하였다. PB1212 (SEQ ID NO:28) (CAAAAGTGTTAAGCGGTAACCTG) 및 PB1233 프라이머를 사용하는 PCR 을 edA 유전자자리에서 카세트의 좌측 및 올바른 삽입을 검증하기 위해 수행하였다. PB1203 및 PB1196 프라이머를 사용하는 PCR 을 purN 유전자자리에서 카세트의 우측 및 올바른 삽입을 검증하기 위해 수행하였다. PB 1202 및 PB 1233 프라이머를 사용하는 PCR 을 purN 유전자자리에서 카세트의 좌측 및 올바른 삽입을 검증하기 위해 수행하였다 (도 9C 참조). 올바른 유전자자리에서 통합을 확인하기 위해 모든 PCR 을 확인하였다. 더욱이, 도 10 에서 나타낸 바와 같이, sacB 유전자의 기능성 또한 확인하였다. 조작된 부모 균주 ΔpurNλPr::sacBΩKan 을 수크로오스를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장시킬 수 없었다 (도 10).
sacB 유전자 (λPr 프로모터의 제어 하에 놓임) 및 Cat 내성 유전자 (이의 천연 cat 프로모터의 제어 하에 놓임) 를 인코딩하는 선형 DNA 단편 (λPr::sacB Ωcat) (표적 유전자자리 (edA) 의 경계를 짓는 DNA 서열과 상동하는 2 개의 긴 영역에 의해 측면에 배치됨) 을 전기천공법에 의해 ΔpurN λPr::sacBΩKan E. coli 균주의 염색체로 통합시켰다. 대략 200 개의 형질전환체 후보 (ΔpurN λPr::sacBΩKan ΔedA λPr::sacB Ωcat 이중 돌연변이체) 를 선별 압박으로서 클로람페니콜을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 수득하였다. 20 개의 콜로니를 무작위로 고르고 클로람페니콜 상에서 분해에 의해 정제하고 edA 유전자자리에서의λPr::sacB Ωcat 카세트 삽입을 프라이머 세트 PB1212 및 PB1213 을 사용하여 PCR 에 의해 검증하였다 (도 9C 참조). PCR 산물을 λPr::sacB Ωcat 의 동정을 유효하게 하기 위한 서열분석에 의해 확인하였다.
숙주 균주 조작을 도 8D 에서 도시한다. 도 8E 는 숙주 균주 (하나의 sacB 카세트 [λPr::sacBΩKan]) 및 무약물 플라스미드의 공동존재를 도시하고 있다. 초기 E. coli 유전자형은 KanS, CatS, 수크로오스R 였다. E. coli ΔpurN Prλ::sacBΩKan 의 염색체로의 카세트 통합은 새로운 유전자형, KanR, CatS, 수크로오스S 을 생성하였다. cI 억제인자를 가지고 있는 플라스미드의 도입은 최종 유전자형, KanR, CatR, 수크로오스R 을 생성시켰다.
실시예 3: cI 억제인자 발현 카세트를 가지고 있는 플라스미드의 생성 (플라스미드 pPB838 - pPB844 내지 pPB847 - pPB885 - pPB896 )
플라스미드 구축의 요약
pPB828-유래된 플라스미드, 예컨대 pPB829 및 pPB844-pPB847 을 카나마이신 유전자 (P1) 의 약한 프로모터 또는 그 자신의 프로모터의 제어 하에서, λ 파지의 cI ORF를 함유하여 생성시켰다.
카나마이신 유전자 (P1) 의 약한 프로모터의 제어 하에 놓인 cI 유전자를 함유하는 pPB838 플라스미드를 중간 플라스미드 시판 벡터 pMCS5를 사용하여 생성시켰고, 이때 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자 (cat) 는 암피실린 내성 유전자를 대체하였다 (도 19).
pPB844 및 pPB845 플라스미드는 pPB828 벡터로 클로닝된 cI 유전자 (P1 프로모터의 제어 하에 놓임)를 함유하고, 이는 cat 유전자를 함유하는 pVR1012 유도체이다 (pVR1020 또는 1012 플라스미드, VICAL Inc.; Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, 참조, 예: U.S. Patent Nos. 5,846,946 and 6,451,769). 상기 플라스미드는 플라스미드로의 cI 유전자의 기원에 있어서 상이하다 (도 20-21).
pPB846 및 pPB847 플라스미드는, cat 유전자를 함유하는 pVR1012 유도체인 pPB828 벡터로 클로닝되는 cI 유전자 (그 자신의 (천연) 프로모터 SEQ ID NO:30 의 제어 하에 놓임) 를 함유한다. 상기 플라스미드는 플라스미드에서 cI 유전자의 기원에 있어서 상이하다 (도22-23).
pPB885 는 pPB838 플라스미드로부터 제조하였고 [카나마이신 유전자 (P1) 의 약한 프로모터의 제어 하에 놓인 cI 유전자] 이때 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자 (cat) 를 AvrII 제한 소화에 의해 제거하였다 (도 24).
pPB829-유래된 플라스미드, 예컨대 pPB896 은 카나마이신 유전자 (P1) 의 약한 프로모터의 제어 하에 놓인 cI 유전자를 함유한다. pPB896 플라스미드는 진핵 CMV 프로모터의 제어 하에 놓인 GFP 마커 유전자를 함유한다 (도 25).
이들 플라스미드를 무약물 시스템에서 관심 유전자 (트랜스진)인 비상동 폴리뉴클레오티드를 클로닝하기 위한 벡터로서 사용하였다. 각각의 플라스미드는 항생제 내성 유전자 (Cat) 를 인양하고 이는 항생제 (예컨대 클로람페니콜) 선별 압박 없이 수크로오스의 존재 하에 적절한 E. coli sacB+ 균주에서 플라스미드 번식을 허용하는 독특한 제한 효소에 의해 제거되고 잘라내질 수 있다.
이들 플라스미드 상의 항생제 내성 유전자 (Cat) 는 오직 개념의 증거를 위해서만 사용하였다. Cat 유전자를 최종 무약물 플라스미드에서 최종적으로 제거하였다 (도 13 내지 15 및 실시예 4).
플라스미드 pLDR8 (ATCC 번호 # 77357) 로부터의 cI 유전자 서열은 억제인자 단백질 cI857 돌연변이체를 생산한다 (NCBI: AB248924, 클로닝 벡터 pND707,Love, CA. et al., Gene. 17; 176(l-2):49-53; 1996).
A. 약한 프로모터 P1 의 제어 하에 놓인 cI 억제인자 ORF 를 함유하는 플라스미드 pPB829 의 구축
pPB828 플라스미드: ( pVR1012 -계 플라스미드 + Cat 유전자) (도 17)
pPB828-유래 플라스미드, 예컨대 pPB829 를 독특한 EcoRI 소화 자리에 의해 잘라내질 수 있는 Cat 유전자 및 카나마이신 유전자 (P1) 의 약한 프로모터 하에서 λ 파지의 cI ORF를 함유하여 생성시켰다. pVR1012-계 발현 벡터를 pPB828 플라스미드를 생성시키는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (Cat) 유전자를 함유하여 생성시켰다. pPB627 (Merial 사 재료) 로부터의 Cat 유전자는 pNB335 으로부터의 유도체였고 이는 초기 플라스미드 pSW23T 로부터의 유도체 그 자체이다 (GenBank Accession No. AY733066 에 대한 클로닝 플라스미드). Cat 유전자 (798 bp) (SEQ ID NO:31 (DNA), SEQ ID NO:32 (단백질)) 에 해당하는 DNA 단편을 프라이머 PB 1184 (SEQ ID NO:33) (GAATTCCGGTCCGGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGC3) [EcorI 자리 (밑줄) 함유] 및 PB 1185 (SEQ ID NO:34) (CCTAGGCTGTGTTAATTAAGGCGCGCCGAATTCCGGTCCGTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGC) [EcoRI 자리 (밑줄) 함유] 를 사용하여 PCR 에 의해 수득하였고, pNB350 을 주형으로서 사용하고 Phusion™ High-Fidelity DNA 폴리머라제 (Finnzymes, 02150 Espoo, Finland) 를 사용하였다. 생성된 PCR 생성물 (832 bp) 을 pCR blunt Topo 벡터 (Invitrogen, CA, USA) 로 라이게이션하여 플라스미드 pCRblunt/PB1184-1185 (4351 bp) 을 수득하였다 (도 16). pCRblunt/PB1184-1185 의 일치성을 제한 분석에 의해 확인하였다 (PvuII 소화). Cat 유전자에 해당하는 DNA 단편을 Ecl136II 및 EcoRV 로 pCRblunt/PB1184-1185 플라스미드의 효소 소화에 의해 수득하였다. 897 bp 단편을 pVR1012-계 플라스미드로 라이게이션하고 (MscI 및 stuI (3303 pb) 로 이미 소화됨) 플라스미드 pPB828을 생성시켰다 (도 17). pPB828 의 일치성을 제한 분석에 의해 확인하였다 (삽입 크기를 결정하기 위한 PvuII 및 NcoI 소화 및 Cat 유전자가 잘 제거되는지를 검증하기 위한 EcoRI).
pPB829 플라스미드: ( pPB828 플라스미드 + P1 :: cI 유전자) (도 18)
P1 프로모터 (카나마이신 내성 유전자의 약한 프로모터) 하의 cI 유전자를 함유하는 구축물을 융합 PCR 로 수득하였다. 주형으로서 pLL14 (Merial 특허 출원 US2005/0164946 호 참조) 및 Phusion DNA 폴리머라제를 사용하여, P1 약한 프로모터에 해당하는 DNA 단편을 프라이머 PB1186 (SEQ ID NO:35) (TCATACCAGGCCTAGGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATG) 및 PB1187 (SEQ ID NO:36) (AACACCCCTTGTATTACTGTTTATG) 를 사용하는 PCR 로 수득하였다. 주형으로서 pLDR8 (ATCC # 77357) 및 Phusion DNA 폴리머라제를 사용하여 cI 유전자 (SEQ ID NO:1) 에 해당하는 DNA 단편을 프라이머 PB1188 (SEQ ID NO:37) (AATACAAGGGGTGTTATGAGCACAAAAAAGAAACCATTAACAC) [5' 말단에서 P1 서열의 상보적 영역 (밑줄) 함유] 및 PB1189 (SEQ ID NO:38) (CCGGAATTCGGCGCGTCAGCCAAACGTCTCTTCAGGCCACTG) 를 사용하는 PCR 로 수득하였다. 2 개의 PCR 산물 (각각 151 및 729 bp) 을 정제하였고 PB1186 및 PB1189 프라이머 및 Phusion DNA 폴리머라제 (Finnzymes, Finland) 를 갖는 제 2 PCR 단계에서 주형으로서 사용하였다 (도 24 참조). 2 개의 PCR 산물 (각각 151 및 729 bp) 을 정제하고 AscI 및 AvrII 로 소화된 플라스미드 pPB828 로 라이게이션하여 플라스미드 pPB829 (4970 bp) 를 생성시켰다 (도 9A). Clontech (Takara Bio Europe, St-Germain-en-Laye,France) 로부터 "In-Fusion PCR 클로닝 키트" (cat. No. 740590.250) 로 라이게이션을 설정하였다. 클론 pPB829 를 HindII 소화 분석법에 따라 선별하였다. cI 유전자 및 P1 프로모터의 서열 통합성을 플라스미드 pPB829 를 서열분석함으로써 확인하였다.
pPB896 플라스미드: ( pPB829 플라스미드 + P1 :: cI 유전자 + GFP ) (도 25)
둘 모두의 NotI/BglII 로 pCG105 플라스미드 (진핵 CMV 프로모터의 제어 하에 놓인 GFP 유전자를 갖는 pPB828-유래된 플라스미드, Merial 이 지적 재산권 소유) 를 제한 소화한 것으로부터 GFP 유전자를 제조하였다. 이러한 소화된 GFP 유전자 를 NotI/BglII 에 의해 미리 잘린 pPB829 플라스미드로 클로닝하여 pPB896 플라스미드를 생성시켰다.
B. P1 프로모터 ( 카나마이신 유전자의 약한 프로모터) 하의 cI 유전자를 함유하는, 중간 플라스미드, pPB838 , 및 플라스미드 pPB844 - pPB845 의 구축,
pPB837 .1 플라스미드: ( pMCS5 플라스미드 + Cat 유전자)
Cat 유전자에 해당하는 DNA 단편을 pPB791 [pNB350 의 플라스미드의 유도체] (주형으로서) 및 Phusion DNA 폴리머라제를 사용하여, 프라이머 PB1182 (SEQ ID NO:39) (AGATCTGTTAACGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGC) [5' 말단에서 BglII 자리 (밑줄) 함유] 및 PB1183 (SEQ ID NO:40) (GTCGACGTTAACTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGC) [5' 말단에서 SalI 자리 (밑줄) 함유]를 사용하는 PCR 로 수득하였다.
PCR 프라이머를 pNB350 의 cat 서열을 기초로 하여 설계하였다. 3 개의 독립적인 PCR 산물 (779 bp) 을 풀링하고 pCRII 벡터로 라이게이션하여 플라스미드 pCRII + PB1182-1183 (4734 bp) 를 수득하였다. pCRII + PB1182-1183 의 클론을 SalI/BglII 소화에 따라 선별하였다. pMCS5 플라스미드 (MoBiTec, Germany) 를 SaiI 및 BglII 로 소화시켜 DNA 단편 (2950 bp) 을 수득하였다. pCRII + PB1182-1183 을 SalI 및 BglII 에 의해 소화하고 단편 SalI-BglII 을 아가로스 겔 (797 pb: 단편 B) 로부터 단리하였다. 단편 A 및 B 를 라이게이션하여 플라스미드 pPB837.1 (3747 bp) 를 생성시켰다.
pPB837 .2: bla 프로모터를 갖지 않는 ( pMCS5 + Cat )
bla 프로모터 영역을 함유하지 않는 플라스미드 pPB837.2 를 생성시켰다. 플라스미드 pPB837.1 를 NaeI 및 XmnI 로 소화시키고 3300 bp 의 단편 NaeI-XmnI 을 단리하고 아가로스 겔 (단편 A) 로부터 정제하였다. 단편 A 를 라이게이션하여 pPB837.2 플라스미드 (3300bp) 를 수득하였다. 클론 pPB837.2 를 BglI 소화에 따라 선별하였다.
pPB838 플라스미드 ( pMCS5 + Cat ( bla 프로모터를 갖지 않음)) + P1 :: cI (도 22)
P1 프로모터 (카나마이신 내성 유전자의 약한 프로모터) 하의 cI 유전자를 함유하는 구축물을 융합 PCR 로 수득하였다. P1 약한 프로모터에 해당하는 DNA 단편을 프라이머 PB1186 및 PB1187 및 주형으로서 pLL14 및 Phusion DNA 폴리머라제를 사용하여 PCR 에 의해 수득하였다. cI 유전자에 해당하는 DNA 단편을 프라이머 PB1188 및 PB 1189, 주형으로서 pLDR8 (ATCC # 77357) 및 Phusion DNA 폴리머라제 (Finnzymes, Finland) 를 사용하여 PCR 에 의해 수득하였다. 2 개의 PCR 산물 (각각 151 및 729 bp) 를 정제하고 제 2 PCR 단계에서 주형으로서 PB 1186 및 PB 1189 프라이머 및 Phusion DNA 폴리머라제를 사용하였다. 2 개의 독립적인 PCR 산물 (880 bp) 을 풀링하고 pCRIIblunt 벡터로 라이게이션하여 플라스미드 pCRblunt + PB1186-1189 (4400 bp) 를 수득하였다. pCRIIblunt + PB1186-1189 의 클론을 EcoRV/SpeI 소화에 따라 선별하였다.
pCRIIblunt + PB1186-1189 를 EcoRV 및 SpeI 로 소화시켜 EcoRV-SpeI 단편 A (936 bp) 를 수득하였다. pPB837.2 를 EcoRV 및 SpeI 로 소화시키고 단편 EcoRV-SpeI 를 아가로스 겔 (3464 pb: 단편 B) 로부터 단리하였다. 단편 A 및 B 를 라이게이션하여 플라스미드 pPB838 (4216 bp) 를 생성하였다. 클론 pPB838 를 HindIII 소화에 따라 선별하였다. cI 유전자 및 P1 프로모터의 서열의 통합성을 서열분석에 의해 확인하였다.
pPB885 플라스미드 ( pMCS5 + Cat ( bla 프로모터를 갖지 않음)) + P1 :: cI (도 24)
이러한 플라스미드를 pPB838 플라스미드로부터 강탈하였고 여기서 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자 (cat) 를 AvrII 제한 소화 (도 24) 에 의해 제거하였다. pPB885 플라스미드는 카나마이신 유전자의 약한 프로모터 (P1) 의 제어 하의 cI 유전자를 함유한다. pPB885 플라스미드를 10% 수크로오스로 보충된 LB 아가 플레이트 상에서 직접적인 선별에 의해 ΔpurN λPr::sacB Ωkan E. coli 숙주 균주의 형질전환에 따른 실시예 4 (하기 참조) 에 기재된 바와 같이 단리하였다.
플라스미드 pPB844 - pPB845 (도 23-24)
P1 프로모터 하의 cI 유전자에 해당하는 DNA 단편을 프라이머 PB1186 및 PB1263 (SEQ ID NO:41) (TCAGCCAAACGTCTCTTCAGGCCAC), 주형으로서 pPB838 플라스미드 및 Phusion DNA 폴리머라제를 사용하여 PCR 에 의해 수득하였다. 4 개의 독립적인 PCR 산물 PB 1186-PB 1263 (864 bp) 을 풀링하고 pCRblunt 벡터로 라이게이션하여 플라스미드 pCRblunt + PB1186-1263 (4383 bp) 을 수득하였다. pCRblunt + PB1186-1263 의 클론을 HindIII 소화에 따라 선별하였다.
pCRblunt + PB1186-1263 플라스미드를 EcoRI 로 소화하였고 극단을 Klenow 폴리머라제로 채워 blunt 단편 (929 bp : 단편 A) 을 생성시켰다. pPB828 플라스미드를 XmnI 으로 소화시키고 생성된 XmnI-XmnI 단편을 정제하였다 (단편 B: 4135 bp). 단편 A 및 B 를 라이게이션하여 플라스미드 pPB844 또는 pPB845 를 생성시켰다. 후보를 BamHI/HindlII 소화로 스크리닝하였다. pPB844 플라스미드 (도 20 참조) 에서, cI 유전자는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO:43) 의 제어 하의 벡터의 MCS (다중 클로닝 자리) 로 클로닝되는 관심 트랜스진과 동일한 방향에서 존재한다. pPB845 플라스미드 (도 21 참조) 에서, cI 는 반대 방향에서 기원하였다.
C. 이의 천연 프로모터 플라스미드 pPB846 - pPB847 을 갖는 cI 유전자의 수득
이의 자신 프로모터 (cI 천연 프로모터: SEQ ID NO:30) 하의 cI 유전자에 해당하는 DNA 단편을 주형으로서 pLDR8 플라스미드 및 Phusion DNA 폴리머라제를 사용하여, 프라이머 PB1266 (SEQ ID NO:42) (GCTGACTCATACCAGGCACGCACGGTGTTAGATATTTATCCC) 및 PB1263 를 사용하는 PCR 에 의해 수득하였다.
pPB846 - pPB847 플라스미드
4 개의 독립적인 PCR 산물 PB1266-PB1263 (777 bp) 을 풀링하고 pCRblunt 벡터로 라이게이션하여 플라스미드 pCRblunt + PB1266-1263 (4296 bp) 를 수득하였다. pCRblunt + PB1266-1263 의 클론을 HindIII 소화에 따라 선별하였다.
pCRblunt + PB 1266- 1263 플라스미드를 EcoRI 으로 소화시키고 극단을 Klenow 폴리머라제로 채워 blunt 단편 (842 bp : 단편 A) 을 생성시켰다. pPB828 플라스미드를 XmnI 로 소화시키고 단편 XmnI-XmnI 를 정제하였다 (단편 B: 4135 bp). 단편 A 및 B 를 라이게이션하여 플라스미드 pPB846 (4999 bp) 또는 pPB847 를 생성시켰다. 후보를 BamHI/HindIII 소화에 의해 스크리닝하였다. pPB846 플라스미드 (도 22 참조) 에서, cI 유전자는 CMV 프로모터의 제어 하의 벡터의 MCS 자리로 클로닝되는 관심 유전자와 동일한 방향에서 존재한다. pPB847 플라스미드 (도 23 참조) 에서, cI 유전자는 반대 방향에서 기원한다.
D. 구축 결과
도 7 은 무약물 플라스미드를 제조하기 위해 사용되는 cI 억제인자를 가지고 있는 pPB838 및 pPB829 의 구축을 나타낸다. 둘 모두의 플라스미드를 클로람페니콜 (CatR) 유전자로 마킹하였다. 이들 플라스미드 상의 Cat 유전자는 개념의 증거를 결정하기 위해서만 요구되었으나 최종적으로는 제거될 수 있다 (도 13-15 및 실시예 4 참조).
실시예 4: cI 플라스미드(들)로 E. coli 숙주 균주의 형질전환 및 수크로오스 아가 플레이트 상의 직접적 선별
아가 플레이트(들) 상의 선별 압박으로서 항생제의 사용 없이 클로람페니콜 (Cat) 마킹된 cI 플라스미드(들)에 의해 형질전환된 세포의 스크리닝을 가능하게 하는 실험 절차를 효율적으로 입증하였다 (도 13-15 참조). E. coli λPr::sacB+ ΔpurNΩKan 의 감응 세포를 1 ㎍ 의 pPB838 또는 pPB829 플라스미드로 형질전환시키고 3 시간 동안 3O℃ 에서 LB 액체 브로쓰 배지에서 인큐베이션하였다. 희석된 (10-3 및 10-4) 형질전환된 세포 (pPB838 및 pPB829 플라스미드를 가짐) 100 ㎕ 분취액을 10% 수크로오스를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 도포하였다. 수크로오스를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장시킨 98-100 % 의 수크로오스 내성 세포는 CatR 였기 때문에, 10-3 내지 10-4 범위의 이들 희석은 진짜 형질전환체 세포 (예: cI 플라스미드를 갖는 것) 를 선별하기에 적당한 것으로 나타났다. 이는 이들 형질전환된 세포가 cI 플라스미드 (pPB829 또는 pPB838) 를 갖는다는 것을 시사한다.
도 13A 는 E. coli λPr::sacB+ ΔpurNΩKan 감응 세포를 1 ㎍ 의 pPB838 또는 pPB829 플라스미드로 형질전환하고 도트-스팟팅 (각각 도트에 대해 4 ㎕) 전에 LB 액체 브로쓰 배지에서 3O℃ 에서 3 시간 동안 인큐베이션하였음을 나타낸다. 도면은 클로람페니콜 (15 ㎍/㎖) 또는 수크로오스 (10%) 를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 Log 희석 (희석되지 않은 것에서 6 Log 희석까지) 을 나타낸다. E. coli λPr::sacB+ 의 비형질전환된 감응 부모 균주 세포를 유사한 조건 하에서 표준 세포로서 사용하였다. 예상되는 바와 같이, 표준 세포는 선별적 플레이트, 예컨대 cat 및 수크로오스 상에서 성장하지 못했다. 그럼에도 불구하고, 장기간의 인큐베이션 (3 일) 으로 인해, 수크로오스에 대해 내성이 있는 몇몇 자연발생 돌연변이체가 이러한 조건 하에서 나타났다. 자연발생 돌연변이체의 이러한 수준은 진짜 형질전환체 세포의 스크리닝에 고려되는 기준선을 규정한다. 이러한 실험 조건 하에서 cat 및 수크로오스 상에서 성장시킨 형질전환된 세포들로 2 개의 Log 차이가 관찰되었다. 규정에 따라 감응 세포는 세포벽 취약점을 일시적으로 나타낸다. LB 액체 배지에서 형질전환된 세포의 후-전기천공법 인큐베이션은 상기 언급된 세포 취약점 및 세포벽의 유도 기공 및 전기천공법에 따른 세포막 둘 모두의 생성을 가능하게 한다. 감응 세포가 λPr::sacB+ ΔpurNΩKan 카세트 삽입으로 인해 수크로오스에 유전적으로 민감하기 때문에, 수크로오스의 존재 하에 형질전환된 세포 회수는 Cat 상에서 세포 회수에 비해 2 Log 감소하였다. 이들 관측치를 선별적 플레이트 상에서 형질전환된 세포의 100 ul 을 도포함으로써 확인하였다 (도 13B 참조).
도 13B 는 LB 수크로오스 아가 플레이트 상에서 성장할 수 있는 진짜 형질전환체 세포의 성공적인 스크리닝을 위해 고려되는 자연발생 돌연변이률의 기준선을 보다 양호하게 규정하기 위해, 수크로오스 상의 표준 분포 및 수크로오스 및 cat 상의 형질전환 효능률을 결정하기 위해 적절한 Log 희석을 사용하여 cat 또는 수크로오스를 함유하는 선별 LB 아가 플레이트 상에 100 ㎕ 의 형질전환된 (pPB838 및 pPB829 플라스미드 가짐) 및 비형질전환된 표준 세포를 도포함을 나타낸다. 이전 도트-스파팅 세포 실험 (도 13A 참조) 과 일치하여, 수크로오스에 내성인 자연발생 돌연변이체는 10-3 희석의 형질전환체 세포가 수크로오스를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 도포될 때 검출되지 않았다. 상기 나타낸 바와 같이 (도 13A 참조), 이러한 조건 하에서 cat 과 수크로오스 상의 선별 사이의 형질전환 효능에서 2 Log 차이가 있었다. 수크로오스를 함유하는 LB 아가 상에 도포될 때 10-3 내지 10- 4 의 희석 범위는 형질전환체 세포 (예: cI 플라스미드를 갖는 것) 를 선별하기에 적당한 것으로 나타났다.
도 14A-C 는 선별 압박으로서 항생제의 사용이 없는 cI 플라스미드만 (pPB829 및 pPB838) 갖는 형질전환된 세포를 선별하기 위한 실험적 절차의 효능을 도시하고 있다.
도 14A 는 cI 플라스미드를 갖는 진짜 형질전환체 세포의 스크리닝을 유효하게 하기 위해 복제품 플레이트 검정을 사용하는 실험적 개요도를 나타낸다. 도 13 B 에 나타낸 것과 유사하게, 부모 감응 세포 λPr::sacB+ ΔpurNΩKan 를 cI 플라스미드 (pPB829 및 pPB838) 로 형질전환하였고 적당한 Log 희석액을 3 일 동안 3O℃ 에서 인큐베이션하기 전에 선별적 (cat 또는 수크로오스) LB 아가 플레이트 상에 도포하였다. 그 후, 20 내지 150 범위의 CFU (colony forming unit; 콜로니 형성 단위) 역가를 나타내는 플레이트를 3일 더 동안 30℃ 에서 인규베이션 전에 Cat 또는 수크로오스 또는 둘 다의 조합을 함유하는 새로운 신선한 LB 아가 플레이트 상에서 복제하였다. 이론적으로, Cat 내성 콜로니는 cI 플라스미(들)을 전파시키는 세포에 해당해야만 한다.
도 14B 는 CatR CFU 가 복제 플레이트 검정 후 Cat/수크로오스 LB 아가 플레이트 상에서 및 수크로오스 LB 아가 플레이트 상에서 수득되는 수 사이에서 동일하였음을 확인하는 실험적 결과를 나타낸다. 도 14B (패널 B) 에서 입증하는 바와 같이, CatR CFU 는 하기이다: i) 모든 수크로오스 내성체 및 ii) Cat 및 수크로오스의 조합에 대한 모든 내성체 (cI 플라스미드를 가지고 있는 형질전환에 따른 모든 부모 세포를 나타냄). 패널 C 는 수크로오스 상에서 직접 선별된 10-3 및 10-4 희석의 형질전환체 세포가 또한 수크로오스에 대한 내성이 있고 수크로오스 및 Cat 둘 모두의 조합에 대한 내성이 있었다는 것을 나타내고, 또한 이들 수크로오스 내성 CFU 가 cI 플라스미드를 함유하는 진짜 형질전환된 세포에 해당함을 나타낸다. 실제로, 비형질전환된 부모 세포가 수크로오스를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 도포되는 경우, 수크로오스 내성체 CFU (수크로오스 및 Cat 의 조합 상에서 복제될 때) 는 클로람페니콜 내성체가 pPB829 또는 pPB838 플라스미드에 의한 표현형적 특성을 가져오기 때문에 예상되는 바와 같이 성장하지 못했다.
도 14C 는 복제 플레이트 검정 (도 14B 참조), 보다 특히 항생제의 사용이 없이 선별되는 cI 플라스미드를 갖는 콜로니의 백분율로부터 수득되는 통계학적 자료를 나타낸다. 이러한 실험 조건 하에서, cI 플라스미드를 갖는 콜로니의 백분율은 98% 내지 100% 범위였다.
실시예 5: cI 플라스미드가 유지될 수 있음을 나타내는 수크로오스의 존재 하의 배양 조건 및 이의 부재 하의 배양 조건의 차이
sacB, ΔpurN λPr::sacB+ΩKan 을 발현하는 E. coli 세포를 수크로오스의 존재 또는 부재 하에서 성장시켜 E. coli 염색체로 삽입되는 λPr::sacB+ 카세트의 기능성을 확인하였다.
도 4 는 불활성화된 시스템의 "수크로오스 민감성" 을 기재하고 있고, 이때 온도에서 42℃ 로의 전환은 λ Pr 프로모터에 대한 cI 억제인자의 결합 활성을 저해하고 숙주 세포가 수크로오스에 대한 민감하게 되게 한다. 플라스미드로부터 발현되는 cI 억제인자 단백질은, 숙주 세포 염색체 상에 위치한 λ Pr 프로모터 하에 놓인 독성 sacB 유전자 산물의 전사를 저해한다. 숙주 E. coli 세포의 생존력은 수크로오스의 존재 하에서 λ cI 억제인자 단백질의 플라스미드로부터의 충분한 발현 수준에 의해 보장된다. 도 5 는 무약물 플라스미드 (pDL: DrugLess Plasmid) 를 수득하기 위한, 수크로오스의 존재 하에서 항생제-미함유 pDLl 플라스미드와 숙주 균주의 조합을 기재하고 있다. 상기 개념의 증거를 위한 실험 계획은 도 6A, 6B, 및 6C 에 추가로 도시된다.
수크로오스의 존재 또는 부재하에서 성장될 때 sacB, ΔpurN Ω λPr::sacB+ΩKan 를 발현하는 숙주 세포의 생리학적 특징을 표 1 에 기재한다.
표 1. 수크로오스의 존재 및 수크로오스의 부재 하에서 성장시킬 때, sacB+ 숙주 세포, ΔpurN Ω λPr::sacB+ 의 생리학적 특징
Figure pct00002
수크로오스의 존재 또는 부재 하에서 성장시킬 때, pDLl 플라스미드의 존재 및 부재 하에서, sacB (λPr::sacB+) 를 발현하는 숙주 세포의 생리학적 특징을 표 2 에 기재한다.
표 2. 수크로오스의 존재 또는 부재 하에서 성장시킬 때, pDL1 플라스미드의 존재 및 부재 하에서 λPr::sacB+ 숙주 세포의 생리학적 특징
Figure pct00003
도 10-11 은 유전적으로 조작된 숙주 균주가 30-37℃ 에서 수크로오스에 대해 매우 내성이 있었던 반면, 42℃ 에서는 성장이 관찰되지 않았음을 확인하는 결과를 나타낸다. 도 10 은 pPB829 플라스미드 또는 pPB838 플라스미드를 가지고 있는, E. coli 숙주 균주, ΔpurN λPr::sacB+ Ωkan 이 (제 2 계대) 수크로오스의 존재 하에 32℃ 에서 잘 성장함을 보여준다. sacB 유전자 발현은 둘 모두의 cI 플라스미드로부터 합성되는 cI 유전자 산물에 의해 완벽하게 억제되었다. 플라스미드 유지는 100% 효율이었고 (CatR 상의 대조군 대비) 세포는 수크로오스의 존재 하에서 생존할 수 있었다. 42℃ 에서, cI 유전자 산물은 불활성화되었다. 플라스미드는 유지될 수 없었고, 세포는 수크로오스의 존재하에서 사멸하였다. 이는, 수크로오스의 존재 하에서 세포 생존력이 기능적 cI 플라스미드의 존재로 인한 것이었음을 입증한다.
실시예 6: cI 플라스미드가 5 계대에 걸쳐 안정적임을 나타내는 배양 조건, 항생제 선별 압박 부재, 및 수크로오스에 대한 내성이 있는 자연발생 돌연변이체 결핍
일단 무약물 플라스미드가 제조되면, 이들을 수크로오스 또는 Cat 을 함유하는 신선한 브로쓰 배지에서 수 회의 계대에 걸쳐 이의 안정성 및 이의 강건성에 대해 시험하였다.
도 11 은 클로람페니콜 또는 수크로오스 상에서 선별 동안 명백한 유전적 재배열의 결핍을 포함하는, 세포를 성장시키는데 있어서 pPB829 및 pPB838 플라스미드의 안정성을 도시하고 있다. 수크로오스 및 클로람페니콜의 존재하에서 성장시키는 배양에서 상당한 플라스미드 수율 및 유지가 심지어 연속적인 5 계대 후에도 관찰되었다. 항생제 및 비항생제 시스템은 세포를 성장시키는 것으로부터 플라스미드 유지 및 선별 면에서 적어도 동등했다.
도 12 는 세포가 3O℃ 에서 성장될 때, 부모 E. coli 균주에서 삽입된 λPr::sacB 카세트에서 자연발생 돌연변이의 결핍을 도시하고 있다. 이러한 관찰은 세포가 수크로오스의 존재 하에서 성장될 때, 그러한 E. coli 유전적 배경에서 cI 플라스미드 안정성을 명백하게 입증하는 것이다 (도 10 참조). 이러한 돌연변이률 실험을 부모 균주 (sacB 유전자를 발현하는 purN 결실) 로 수행하였다. 18h 인큐베이션 후 3O℃ 에서 돌연변이가 발생하지 않음을 나타냈다. 이들의 염색체에서 sacB+ 카세트를 가지고 있는 부모 세포의 클론 배양액을 수크로오스를 함유하는 LB 에서 성장시켰다. 세포를 1.0 의 OD 에서 수확하고 분취액 100 ㎕ 에서 수크로오스를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 도포하였다. sacB 유전자의 존재가 세포사를 야기하기 때문에, 자연발생 돌연변이률 3O℃ 에서 밤새 인큐베이션한 후 수크로오스 내성 콜로니의 득점에 의해 자연발생 돌연변이률을 평가하였다. sacB+ 카세트를 인양하나 cI 플라스미드 (pPB829 또는 pPB838) 로 형질전환된 표준 세포는 수크로오스에 내한 내성이 생겼고 DO 1.0 의 배양액이 득점을 위해 수크로오스로 보충된 LB 아가 플레이트 상에 분포 (100 uL) 되기 전 5 Log 로 희석될 필요가 있었다. 밤to 배양함에 따라 (18 시간 인큐베이션), 수크로오스 내성 콜로니가 부모 세포 배양액으로 검출되지 않은 반면(ΔpurNλPr::sacBΩKan), 5 Log 희석 배양액의 pPB829 또는 pPB838 플라스미드(들)로 형질전환된 ΔpurNλPr::sacBΩKan 은 성장하였다. 세포가 37℃ 에서 인큐베이션되었을 때, 몇몇 수크로오스 내성 콜로니 (ΔpurNλPr::sacBΩKan) 를 검출하기 위해 36 시간이 필요했다.
37℃ 에서 인큐베이션되었을 때 36 시간 후의 1 돌연변이/1.3 X 105 세포의 속도로 자연발생 돌연변이가 발생했다. 수크로오스의 존재 하에서 세포를 성장시키는데 있어서, cI 플라스미드 유지는 30℃ 에서 밤새 인큐베이션한 후 효과적이였으나, 모체 균주의 성장은 검출되지 않았다.
실시예 7: 제 2 sacB 카세트 (Δ edA λ Pr :: sacB Ω cat ) 를 상기 언급된 하나의 sacB 카세트 E. coli 숙주 균주 (Δ purN λ Pr :: sacB Ω kan ) 로 첨가함으로써 수크로 오스에 대한 자연발생 돌연변이률을 감소시키기 위한 부모 E. coli 숙주 균주의 개선
둘 모두의 도 8C 및 도 9D 는 2 개의 sacB 카세트 (ΔpurN λPr::sacBΩkan ΔedA λPr::sacBΩcat) 를 가지고 있는 E. coli 의 새로운 부모 숙주 균주가 어떻게 조작되는지를 도시하고 있다.
도 lOB-C 는 이중 sacB 카세트 E. coli 균주 (ΔpurN λPr::sacB+ Ωkan ΔedA λPr::sacB+ ΩCat) 가 3O℃ 및 42℃ 에서 인큐베이션될 때 수크로오스의 존재 하에서 매우 민감한 (성장 없음) 반면, 심지어 10% 수크로오스 상에 플레이팅된 하나의 sacB 카세트 E. coli 균주 (ΔpurN λPr::sacBΩKan) 를 갖는 몇몇 자연발생 돌연변이체가 나타남을 입증한다.
또한, 도 1OC 는 하나의 sacB 카세트 E. coli 균주 (10% 최종) 에 비해 이중 sacB 카세트 E. coli 균주에 대해 가장 낮은 수크로오스 농도 (2% 최종) 가 요구됨을 도시하고 있다. 더욱이, 가장 높은 온도, 예컨대 42℃ 에서 및 낮은 수크로오스 % 에서 나타낸 바와 같이, 2 개의 sacB 카세트 E. coli 균주가 수크로오스에 대해 훨씬 더 민감한 것으로 나타났다. 이는 약 37℃ 에서의 온도 및 약 2% (또는 약간 미만) 에서의 수크로오스의 농도가 세포를 성장시키는데 있어서 cI 유전자 억제인자를 가지고 있는 플라스미드(들)을 유지하기 위한 최적 조건에 해당할 수 있음을 시사하는 것이다.
도 12B-C 는 (1 개 보다는) 2 개의 sacB 카세트의 존재가 3O℃ 내지 37℃ 의 온도 범위에서 수크로오스 민감성 (여전히 2% 수크로오스에서 최적) 에 대한 보다 양호한 강건성을 부여하는 것을 입증한다. 2 개의 sacB 카세트 BJ5183 ΔpurNΩ λPr::sacB Km AedaΩ λPr::sacB Cat 클론 #1 및 BJ5183 ΔpurNΩ λPr::sacB Km AedaΩ λPr::sacB Cat 클론 #2 를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 E.coli 세포, 및 하나의 sacB 카세트 BJ5183 ΔpurNΩ λPr::sacB Km 클론 #16 및 BJ5183 ΔedAΩ λPr::sacB Km 클론 #11 을 함유하는 플라스미드로 형질전환된 E.coli 세포를 OD600 약 1.0 으로 성장시켰다. 각 배양액의 약 100 ul 을 CFU 득점을 위한 0%, 2% 및 4% 수크로오스 (희석 10-5) 를 함유하는 LB/아가 플레이트 상에 도포하였다. 플레이트를 3O℃ 내지 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 37℃ 에서의 인큐베이션을 사용하여 2% 및 4% 수크로오스의 존재 하에 이중 sacB 카세트를 발현하는 부모 균주의 강건성을 평가하기 위해 사용하였다. 도 12B 내지 C 및 하기 표 3 내지 7 은, E. coli 염색체에서 하나의 sacB 카세트의 존재가 유사한 온도, 예컨대 3O℃ 및 37℃ 에서 2 내지 4% 범위의 수크로오스 농도에서 보다 덜 강건했음을 나타낸다. 이러한 플레이팅 검정에서 확인되는 바와 같이, 2 개의 sacB 카세트 E. coli 균주를 갖는 수크로오스에 대한 돌연변이률이 37℃ 에서 인큐베이션될 때 가장 낮은 수크로오스 농도 (2%) 에서 검출 불가능한 반면, 하나의 sacB 카세트 E. coli 균주를 갖는 돌연변이률은 3.8 10-6 내지 5 10-5 범위였다. 독립적인 세트의 실험은, 2 개의 sacB 카세트 E. coli 균주에서 돌연변이률이 2% 수크로오스의 존재 하에서 37℃ 에서 인큐베이션될 때 5.10-10 에 근접했음을 나타냈다.
표 3
Figure pct00004
표 4
Figure pct00005
표 5
Figure pct00006
표 6
Figure pct00007
표 7
Figure pct00008
실시예 8: 항생제 선별 압박 의 부재 하에 수득되는 플라스미드 유지 및 수율 (cI 플라스미드는 숙주 균주에서 다수의 복제본 수에서 유지됨)
cI 플라스미드 (pPB829 또는 pPB838) 를 인양하고 sacB 를 발현하는 E. coli 숙주 세포를 항생제 선별 압박의 부재 하에 (예: 수크로오스의 존재 하에) 또는 대조군으로서 Cat 의 존재하에에서 성장시켰다.
도 11 에서, 플라스미드 수율을 2 및 5 계대에서 측정하였다. 플라스미드를 배양액으로부터 추출하고 3O℃ 에서 유지하고 겔 전기영동 처리하였다. HindII 제한 소화는 Cat 또는 수크로오스로 선별하고 번식하는 동안 pPB829 또는 pPB838 중에서 명백한 유전적 재배열이 발생하지 않았음을 나타낸다. 더욱이, 유사한 cI 플라스미드 유지가 Cat 또는 수크로오스 선별 압박 하에서 cI 플라스미드의 선별 동안 관찰되었다.
도 15A-B 는 클로람페니콜 또는 수크로오스 상에서 선별 후 유전적 재배열의 결핍을 포함하는, 배양액에서 cI 플라스미드 (pPB829 및 pPB838, sacB 카세트의 하나의 본제본 함유) 유지의 안정성 및 효능을 도시하고 있다. cI 플라스미드의 효율적인 플라스미드 유지 및 안정성을 수크로오스 또는 클로람페니콜의 존재 하에서 관찰하였다. 더욱이, 플라스미드 수율 (복제본 수) 은 pPB838 또는 pPB829 로 형질전환된 부모 숙주 균주를 3O℃ 에서 선별 압박으로서 수크로오스의 존재 하에 성장시킬 때, 선별 압박으로서 Cat 의 존재하에서 배양시 보다 훨씬 더 많았다 (셀 당 대략 700). 플라스미드 유지 및 수율은 매우 효율적이였고 복제본 수는 Cat 의 존재하에 배양되는 세포에 비해 2 배 더 높았다. 숙주 세포가 수크로오스의 존재 하에서 배양될 때 이러한 양호한 cI 플라스미드 수율은 cI 발현을 제어하는 약한 프로모터 (P1) 로 인한 것이었다. 실제로, 카나마이신 유전자의 약한 프로모터 (P1) 의 제어 하의 cI 억제인자의 발현은 플라스미드 수율 상에 양성 효과를 내어 λPr 프로모터의 제어 하에 놓인 sacB 유전자의 독성을 보다 양호하게 중화시켰다.
상기 입증된 바와 같이 (도 11A 참조), 항생제 및 비항생제 시스템은 cI 플라스미드를 가지고 있는 세포를 성장시키는 것의 선별 및 플라스미드 유지 면에서 동등하다. 도 15B 는 선별 압박으로서 Cat 의 존재하에서 배양시 보다 오히려 pPB838 또는 pPB829 로 형질전환된 부모 숙주 균주를 선별 압박으로서 수크로오스의 존재 하에서 성장시킬 때, 플라스미드 수율 (복제본 수) 이 훨씬 높았음 (셀 당 대략 700)을 입증한다. 플라스미드 유지 및 수율은 매우 효율적이고 복제본 수는 항생제 선별, 예컨대 Cat 의 존재 하에 배양되는 세포와 비교하여 2 배 높았다.
실시예 9: cI 플라스미드에서 항생제 유전자의 부재 하에서 플라스미드 유지 및 수율: 1 개 및 2 개의 sacB 카세트 E. coli 균주 두 경우 사이의 비교 분석
도 15C-E 는 1 개 및 2 개의 sacB 카세트 E. coli 균주 (ΔpurN λPr::sacB+Ωkan 및 ΔpurN λPr::sacB+ Ωkan ΔedA λPr::sacB+Ωcat, 각각) 둘 모두에서 cat-미함유 pPB885 플라스미드의 안정성 및 수율을 도시한다. 둘 모두의 ΔpurNΩλPr::sacB km (1 개의 sacB 카세트) 및 ΔpurNΩλPr::sacB km ΔedaΩλPr::sacB cat (2 개의 sacB 카세트) 부모 균주를 cI cat-미함유 pPB885 플라스미드로 형질전환하였고 수크로오스 플레이트 상에 플레이팅 전 LB 배지에서 3 시간 인큐베이션하고 수크로오스로 보충된 LB 액체 성장 배지에서 후속적인 배양 (3 계대) 을 하였다. 플라스미드 수율은 2 개 및 1 개 sacB 카세트 E. coli 균주, 각각에 대해 5% 및 10% 수크로오스로 보충된 LB 에서 3 계대에서 측정하였다. pPB885 플라스미드를 37℃ 에서 유지한 배양액으로부터 추출하고 겔 전기영동 처리하였다. PvuII 제한 소화는 수크로오스로 선별 및 번식 동안 pPB885 에서 명백한 유전적 재배열이 발생하지 않았음을 나타낸다 (도 15D 참조). 이러한 겔에서 입증된 바와 같이, 둘 모두의 E. coli 숙주 균주 (1 개 및 2 개의 sacB 카세트, 각각) 에서 10% 및 5% 에서 수크로오스로 선별 후 명백한 유전적 재배열이 발생하지 않았다.
도 15E 는 1 개 및 2 개의 sacB 카세트 E. coli 균주 (ΔpurN λPr::sacB+Ωkan 및 ΔpurN λPr::sacB+Ωkan ΔedA λPr::sacB+ Ωcat, 각각) 둘 모두에서 cat-미함유 pPB885 플라스미드의 수율을 도시한다. 흥미롭게도, 2 개의 sacB 카세트에서의 플라스미드 수율 (복제본 수) (셀 당 대략 278) 이 하나의 sacB 카세트 E. coli 균주로부터 수득되는 플라스미드 수율 (셀 당 대략 142) 에 비해 훨씬 높았다. 이러한 실험에서 수득되는 플라스미드 수율은 이전의 비교 연구에서 수득되는 플라스미드 수율 보다 낮은 것으로 나타났다 (도 15B 참조). 이는 주로 하기 사실로 인한 것이다: i) 최고인 것을 동정하기 위해 보다 많은 클론이 pPB885 형질전환에 따라 평가될 필요가 있음, 및 ii) 더욱이, cat-미함유 pPB885 플라스미드로 형질전환된 2 개의 sacB 카세트 E. coli 균주의 성장 조건이 최적으로 배양되지 않았음. 실제로, 본 발명자들은 이러한 가장 나중의 균주에 대한 최적 성장 조건은 약 37℃ 및 약 2% 수크로오스 (또는 약간 미만) 였음을 입증하였다. 그러나, 이러한 결과는, 최적 강건성 조건 하에서, 플라스미드 수율이 하나의 sacB 카세트를 갖는 E. coli 균주에 비해 2 개의 sacB 카세트 E. coli 균주에서 더욱 양호할 수 있음을 시사한다.
실시예 10: CHO 세포에서 항생제-미함유 cI 플라스미드 트랜스펙션
도 15F 및 하기 표 8 은 항생제-미함유 플라스미드 (선별 압박으로서 pPB896 /수크로오스) 및 항생제 플라스미드 (선별 압박으로서 pCG105 / Cat) 의 CHO 세포에서 플라스미드 트랜스펙션 효능 (GFP 발현) 을 도시한다. 이들 2 개의 선별 압박 (수크로오스 대 Cat (항생제로서)) 사이의 GFP 단백질 발현 면에서 명백한 차이가 관찰되지 않았다. pCG105 플라스미드 (CMV 프로모터 [Merial 소유] 의 제어 하에 놓인 GFP 유전자를 갖는 pPB828-유래된 플라스미드) 및 pPB896 (pPB829 플라스미드 + P1::cI 유전자 + GFP) 플라스미드를 CHO 세포의 트랜스펙션에 사용하여 항생제-미함유 플라스미드 개념 대 기존 항생제 플라스미드의 기능성을 평가하였다. 이러한 실험을 하나의 sacB 카세트를 갖는 E. coli 숙주 균주의 배양액으로부터 단리한 플라스미드를 사용하여 수행하였다. pCG105 를 선별 압박으로서 카나마이신을 이용한 E. coli 에서 번식시키는 반면, pPB896 를 선별 압박으로서 10% 수크로오스를 이용하는 E. coli 에서 번식시켰다. DNA 플라스미드를 추출하고 동일한 농도로 투여하였다.
도 15F 는 리포펙타민 (Lipofectamine) 2000 을 이용하는 CHO-K1 세포의 일시적인 트랜스펙션 후 pCG105 및 pPB896 에 의해 인코딩되는 GFP 단백질의 시험관내 발현을 도시한다. 제조자의 지시사항에 따라 6 cm 직경 플레이트에서 90% 합류 CHO-K1 세포를 5 ㎍ 의 플라스미드 및 10 uL 의 리포펙타민 각각으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후, 세포를 1% SVF 를 함유하는 MEM-글루타맥스 배지에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양액을 수확하고 형광성 마이크로복제본을 사용하여 분석하고 (도 15G) 유세포 분석법 (FACS Calibur [Becton Dickinson]) 으로 분석하였다 (표 8).
도 15F 는, 유사한 GFP 에피형광성이 둘 모두의 트랜스펙션된 CHO-K1 세포에서 가시화됐음을 보여준다. 클로람페니콜 및 수크로오스의 선별 압박 하에서 pCG105 및 pPB96 플라스미드는 상당한 효능을 갖는 CHO-K1 세포를 트랜스펙션할 수 있었다.
표 8 은 pCG105 및 pPB896 플라스미드로 CHO 트랜스펙션한 효능을 나타낸다. 이러한 표에서 나타낸 바와 같이, GFP 단백질을 발현하는 CHO 세포의 상당한 % 를 CHO 를 pCG105 (59% GFP 발현됨) 및 pPB896 (48% GFP 발현됨) 로 트랜스펙션할 때 측정하였다. 이들 결과는 궁극적으로 CHO 트랜스펙션 및 DNA 백신 목적에서 적용을 위한 수크로오스-계 항생제-미함유 플라스미드 시스템의 사용을 유효하게 만드는 것이다.
표 8
Figure pct00009
이들 실시예는 염색체상에 위치한 독성 유전자의 제어가 플라스미드 상에 위치한 억제인자로 달성될 수 있음을 입증한다. 시스템은 항생제 선별 압박의 부재 하에서 완전히 기능한다. 시스템은 숙주 세포의 5 계대에 걸쳐 안정적이다. 시스템은 숙주 세포가 셀 당 다수의 플라스미드 복제본 수를 달성하도록 한다. 시스템은 최소 합성 배양 배지의 사용과 완전히 양립가능하다.
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따라서, 본 발명의 상세한 바람직한 구현예에서 기재한 것은, 상기 기술에서 제시된 바와 같은 특정 세부사항이 상기 단락에서 규정되는 본 발명은 을 한정하지 않으며, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않는 한 이의 많은 명백한 변형이 가능하다는 점이 이해되어야 한다.
본원에 참조되거나 인용된 모든 문헌 ("본원에 인용된 문헌"), 및 본원에 인용된 문헌에서 참조되거나 인용된 모든 문헌은, 본원 및 본원에 참조로서 혼입되어 있는 임의의 문헌에 언급된 임의의 생성물에 대해 제조자의 임의의 지시사항, 기술, 생성물 세부사항 및 생성물 시트와 함께, 본원에 참조로서 포함되어 있고, 본 발명의 실시에 사용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Merial Limited Audonnet, Jean-Christophe Jolivet, Edmond <120> ANTIBIOTIC-FREE PLASMID <130> MER 09-132 <150> 61/180,755 <151> 2009-05-22 <160> 83 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 711 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> cI857 repressor gene <400> 1 atgagcacaa aaaagaaacc attaacacaa gagcagcttg aggacgcacg tcgccttaaa 60 gcaatttatg aaaaaaagaa aaatgaactt ggcttatccc aggaatctgt cgcagacaag 120 atggggatgg ggcagtcagg cgttggtgct ttatttaatg gcatcaatgc attaaatgct 180 tataacgccg cattgcttac aaaaattctc aaagttagcg ttgaagaatt tagcccttca 240 atcgccagag aaatctacga gatgtatgaa gcggttagta tgcagccgtc acttagaagt 300 gagtatgagt accctgtttt ttctcatgtt caggcaggga tgttctcacc taagcttaga 360 acctttacca aaggtgatgc ggagagatgg gtaagcacaa ccaaaaaagc cagtgattct 420 gcattctggc ttgaggttga aggtaattcc atgaccgcac caacaggctc caagccaagc 480 tttcctgacg gaatgttaat tctcgttgac cctgagcagg ctgttgagcc aggtgatttc 540 tgcatagcca gacttggggg tgatgagttt accttcaaga aactgatcag ggatagcggt 600 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Arg 165 170 175 Leu Phe Tyr Thr Asp Phe Ser Gly Lys His Tyr Gly Lys Gln Thr Leu 180 185 190 Thr Thr Ala Gln Val Asn Val Ser Ala Ser Asp Ser Ser Leu Asn Ile 195 200 205 Asn Gly Val Glu Asp Tyr Lys Ser Ile Phe Asp Gly Asp Gly Lys Thr 210 215 220 Tyr Gln Asn Val Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Asn Tyr Ser Ser Gly 225 230 235 240 Asp Asn His Thr Leu Arg Asp Pro His Tyr Val Glu Asp Lys Gly His 245 250 255 Lys Tyr Leu Val Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Glu Asp Gly Tyr Gln 260 265 270 Gly Glu Glu Ser Leu Phe Asn Lys Ala Tyr Tyr Gly Lys Ser Thr Ser 275 280 285 Phe Phe Arg Gln Glu Ser Gln Lys Leu Leu Gln Ser Asp Lys Lys Arg 290 295 300 Thr Ala Glu Leu Ala Asn Gly Ala Leu Gly Met Ile Glu Leu Asn Asp 305 310 315 320 Asp Tyr Thr Leu Lys Lys Val Met Lys Pro Leu Ile Ala Ser Asn Thr 325 330 335 Val Thr Asp Glu Ile Glu Arg Ala Asn Val Phe Lys Met Asn Gly Lys 340 345 350 Trp Tyr Leu Phe Thr Asp Ser Arg Gly Ser Lys Met Thr Ile Asp Gly 355 360 365 Ile Thr Ser Asn Asp Ile Tyr Met Leu Gly Tyr Val Ser Asn Ser Leu 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atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60 cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 120 attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 180 cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaatttc gtatggcaat gaaagacggt 240 gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 300 acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 360 tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 420 aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 480 gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc 540 gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg ccgtttgtga tggcttccat 600 gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa 660 <210> 32 <211> 219 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Cat protein <400> 32 Met Glu Lys Lys Ile Thr Gly Tyr Thr Thr Val Asp Ile Ser Gln Trp 1 5 10 15 His Arg Lys Glu His Phe Glu Ala Phe Gln Ser Val Ala Gln Cys Thr 20 25 30 Tyr Asn Gln Thr 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ccatccacgc tgttttgacc 720 tccatagaag acaccgggac cgatccagcc tccgcggccg ggaacggtgc attggaacgc 780 ggattccccg tgccaagagt gacgtaagta ccgcctatag actctatagg cacacccctt 840 tggctcttat gcatgctata ctgtttttgg cttggggcct atacaccccc gcttccttat 900 gctataggtg atggtatagc ttagcctata ggtgtgggtt attgaccatt attgaccact 960 cccctattgg tgacgatact ttccattact aatccataac atggctcttt gccacaacta 1020 tctctattgg ctatatgcca atactctgtc cttcagagac tgacacggac tctgtatttt 1080 tacaggatgg ggtcccattt attatttaca aattcacata tacaacaacg ccgtcccccg 1140 tgcccgcagt ttttattaaa catagcgtgg gatctccacg cgaatctcgg gtacgtgttc 1200 cggacatggg ctcttctccg gtagcggcgg agcttccaca tccgagccct ggtcccatgc 1260 ctccagcggc tcatggtcgc tcggcagctc cttgctccta acagtggagg ccagacttag 1320 gcacagcaca atgcccacca ccaccagtgt gccgcacaag gccgtggcgg tagggtatgt 1380 gtctgaaaat gagcgtggag attgggctcg cacggctgac gcagatggaa gacttaaggc 1440 agcggcagaa gaagatgcag gcagctgagt tgttgtattc tgataagagt cagaggtaac 1500 tcccgttgcg gtgctgttaa cggtggaggg cagtgtagtc tgagcagtac tcgttgctgc 1560 cgcgcgcgcc accagacata atagctgaca gactaacaga ctgttccttt ccatgggtct 1620 tttctgcagt caccgtcgtc gacacgtgtg atcagatatc gcggccgctc tagaccaggc 1680 cctggatcca gatctgctgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 1740 gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 1800 attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 1860 agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg 1920 ggtacccagg tgctgaagaa ttgacccggt tcctcctggg ccagaaagaa gcaggcacat 1980 ccccttctct gtgacacacc ctgtccacgc ccctggttct tagttccagc cccactcata 2040 ggacactcat agctcaggag ggctccgcct tcaatcccac ccgctaaagt acttggagcg 2100 gtctctccct ccctcatcag cccaccaaac caaacctagc ctccaagagt gggaagaaat 2160 taaagcaaga taggctatta agtgcagagg gagagaaaat gcctccaaca tgtgaggaag 2220 taatgagaga aatcatagaa tttcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 2280 cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 2340 atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 2400 taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 2460 aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 2520 tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 2580 gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 2640 cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 2700 cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 2760 atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 2820 tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 2880 ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 2940 acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 3000 aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 3060 aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 3120 tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 3180 cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 3240 catagttgcc tgactcgggg ggggggggcg ctgaggtctg cctcgtgaag aaggtgttgc 3300 tgactcatac caggcctagg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 3360 ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc catttaaatt 3420 gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgttatgagc acaaaaaaga aaccattaac 3480 acaagagcag cttgaggacg cacgtcgcct taaagcaatt tatgaaaaaa agaaaaatga 3540 acttggctta tcccaggaat ctgtcgcaga caagatgggg atggggcagt caggcgttgg 3600 tgctttattt aatggcatca atgcattaaa tgcttataac gccgcattgc ttacaaaaat 3660 tctcaaagtt agcgttgaag aatttagccc ttcaatcgcc agagaaatct acgagatgta 3720 tgaagcggtt agtatgcagc cgtcacttag aagtgagtat gagtaccctg ttttttctca 3780 tgttcaggca gggatgttct cacctaagct tagaaccttt accaaaggtg atgcggagag 3840 atgggtaagc acaaccaaaa aagccagtga ttctgcattc tggcttgagg ttgaaggtaa 3900 ttccatgacc gcaccaacag gctccaagcc aagctttcct gacggaatgt taattctcgt 3960 tgaccctgag caggctgttg agccaggtga tttctgcata gccagacttg ggggtgatga 4020 gtttaccttc aagaaactga tcagggatag cggtcaggtg tttttacaac cactaaaccc 4080 acagtaccca atgatcccat gcaatgagag ttgttccgtt gtggggaaag ttatcgctag 4140 tcagtggcct gaagagacgt ttggctgagg cgcgccgaat tccggtccgt tacgccccgc 4200 cctgccactc atcgcagtac tgttgtaatt cattaagcat tctgccgaca tggaagccat 4260 cacaaacggc atgatgaacc tgaatcgcca gcggcatcag caccttgtcg ccttgcgtat 4320 aatatttgcc catggtgaaa acgggggcga agaagttgtc catattggcc acgtttaaat 4380 caaaactggt gaaactcacc cagggattgg ctgagacgaa aaacatattc tcaataaacc 4440 ctttagggaa ataggccagg ttttcaccgt aacacgccac atcttgcgaa tatatgtgta 4500 gaaactgccg gaaatcgtcg tggtattcac tccagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct 4560 catggaaaac ggtgtaacaa gggtgaacac tatcccatat caccagctca ccgtctttca 4620 ttgccatacg aaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg 4680 gataaaactt gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa 4740 cggtctggtt ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat 4800 gccattggga tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct 4860 tagctcctga aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat 4920 ggtgaaagtt ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca ttttcgcccg 4970 <210> 80 <211> 63 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PB1320 primer <400> 80 gccgatcaac gtctcatttt cgccgttaac agatctttat ttgttaactg ttaattgtcc 60 ttg 63 <210> 81 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PB1321 primer <400> 81 agatctgtta acggcgaaaa tgag 24 <210> 82 <211> 52 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PB1322 primer <400> 82 aaaacgctac aaaaatgccc gatcctttac gccccgccct gccactcatc gc 52 <210> 83 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> P1 promoter (2) <400> 83 atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcac 35

Claims (24)

  1. cI 억제인자 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 무약물 플라스미드.
  2. 제 1 항에 있어서, cI 억제인자 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:2, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 또는 58 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 90 % 이상의 서열 일치성을 갖는 무약물 플라스미드.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결되는 무약물 플라스미드.
  4. 제 3 항에 있어서, 프로모터가 P1 프로모터 또는 천연 cI 프로모터인 무약물 플라스미드.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:1, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 90 % 이상의 서열 일치성을 갖는 무약물 플라스미드.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원 또는 단백질을 인코딩하는 비상동 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 무약물 플라스미드.
  7. 제 6 항에 있어서, 비상동 폴리뉴클레오티드가 원핵 또는 진핵 세포에서 프로모터 기능기에 작동가능하게 연결되는 무약물 플라스미드.
  8. 제 7 항에 있어서, 프로모터가 CMV 프로모터 또는 그람-음성 박테리아로부터 단리되는 프로모터인 무약물 플라스미드.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 무약물 플라스미드를 포함하는 조작된 그람-음성 박테리아 숙주 균주.
  10. 제 9 항에 있어서, 박테리아 숙주가 박테리아 염색체의 비필수 영역에 숙주에게 독성인 산물을 인코딩하는 비상동 폴리뉴클레오티드 하나 이상을 포함하는 박테리아 숙주 균주.
  11. 제 10 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 sacB 유전자를 포함하는 박테리아 균주.
  12. 제 11 항에 있어서, sacB 유전자가 SEQ ID NO:4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 또는 74 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 90 % 이상의 서열 일치성을 갖는 sacB 단백질을 인코딩하는 박테리아 균주.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 비상동 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결되는 박테리아 균주.
  14. 제 13 항에 있어서, 프로모터가 λ 파지로부터의 프로모터인 박테리아 균주.
  15. 제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 비필수 영역이 deA 유전자 또는 purN 유전자를 포함하는 박테리아 균주.
  16. 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, sacB 유전자가 SEQ ID NO:4 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 90 % 이상의 서열 일치성을 갖는 sacB 단백질을 인코딩하고, sacB 유전자가 SEQ ID NO:5 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 프로모터에 작동가능하게 연결되는 박테리아 균주.
  17. 제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:75 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 복제본 하나 이상을 포함하는 박테리아 균주.
  18. 제 17 항에 있어서, 숙주 염색체의 deA 유전자 및 purN 유전자에 삽입된 SEQ ID NO:75 의 폴리뉴클레오티드의 2 개의 복제본을 포함하는 박테리아 균주.
  19. 제 10 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 아비박테리움 (Avibacterium), 부르셀라 (Brucella), 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli), 헤모필루스 (Haemophilus) (예: 헤모필루스 수이스 (Haemophilus suis)), 살모넬라 (Salmonella) (예: 살모넬라 엔터리디스 (Salmonella enteridis), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 인판티스 (Salmonella infantis)), 쉬겔라 (Shigella), 파스퇴렐라 (Pasteurella), 및 리메렐라 (Rimeirella) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 균주.
  20. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 무약물 플라스미드를 포함하는 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  22. 하기 단계를 포함하는 무약물 플라스미드의 제조 방법:
    1) 숙주 염색체의 비필수 영역 하나 이상에 대립형질 대체에 의해 삽입되는 비상동 폴리뉴클레오티드를 포함하는 그람 음성 박테리아 숙주 균주를 조작하는 단계;
    2) cI 억제인자 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 플라스미드를 구축하는 단계;
    3) cI 억제인자 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 플라스미드로 박테리아 숙주 균주를 형질전환하는 단계;
    4) 30℃ 내지 42℃ 범위의 온도에서 수크로오스의 존재 하에 형질전환된 박테리아 숙주 균주를 성장시키는 단계; 및
    5) DNA 를 회수하는 단계.
  23. 하기 단계를 포함하는 단백질 또는 면역원의 제조 방법:
    1) 숙주 염색체의 비필수 영역 하나 이상에 대립형질 대체에 의해 삽입되는 비상동 폴리뉴클레오티드를 포함하는 그람 음성 박테리아 숙주 균주를 조작하는 단계;
    2) cI 억제인자 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 면역원 또는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 DNA를 구축하는 단계;
    3) cI 억제인자 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 면역원 또는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 플라스미드로 박테리아 숙주 균주를 형질전환하는 단계;
    4) 30℃ 내지 42℃ 범위의 온도에서 수크로오스의 존재 하에 형질전환된 박테리아 숙주 균주를 성장시키는 단계; 및
    5) 면역원 또는 단백질을 회수하는 단계.
  24. 제 23 항에 따른 방법에 의해 제조되는 단백질 또는 면역원을 포함하는 조성물.





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