JP5966018B2 - 改変ボルデテラ・パータシス株 - Google Patents
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Description
上述の遺伝子改変B.パータシス株を培地内で培養し、該株内に存在する遺伝子によってコードされた無毒化百日咳毒素(rPT)、パータクチン及び繊維状ヘマグルチニン(FHA)を含む抗原を発現させる段階と、培地若しくは細胞抽出物から該抗原を回収する段階とを含む方法を提供する。
B.パータシス染色体におけるS1遺伝子の変異
2種の変異R9K及びE129GをサブユニットS1に導入するため、2段階アプローチを利用し、これらの変異の1種の損失を引き起こし得る、2種の変異間領域における組換えの可能性を回避した。このアプローチにより、選択培地での簡易レプリカ平板法によって所望のコロニーを選択することができる。先ず、野生型S1遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子(CmR)(図2A)又は所望の変異を含む改変S1遺伝子(図2B)(いずれもS1上流域及び下流域の1.2〜1.5kBに隣接)で置換されたpBluescript II SK+中で2種の大腸菌ベクターを構築した。次に、これらのベクターを処理し、そのインサートをpSS4245に導入した。これらの誘導体を大腸菌SM10に導入し、B.パータシス株トハマへの接合伝達及び対立遺伝子交換を行った。プラスミドpSS5Cm3によって、S1遺伝子がCmRマーカーで置換された(図3A)。プラスミドpSS5S13−9K−129Gによって、S1遺伝子がその元の位置(この段階では2種の所望の変異を有する)に回復された(図3B)。選択培地で分離菌を選択した後、予想される位置でのCmR遺伝子と改変S1遺伝子の統合をPCR増幅によって確認した(データは示さず)。予想される位置での変異S1遺伝子の組み込みは、S1遺伝子内部で上流5’及び3’下流フランキング領域に結合することが可能な所定のプライマーを用いたPCRで確認されたように明らかであった(データは示さず)。更なる同化のために選択されたクローンのS1遺伝子における変異は、DNA配列決定によって確認した。新しい株をBp−WWCと命名した。
B.パータシスに適合し得るマルチコピープラスミドに全ptx−ptlオペロンを挿入してPT発現を増加させる最初の試みにおいては、有用な株を送達することができなかったが、これは、PTの過剰発現が潜在的に有毒であり、生存可能な株を得るにはPT発現をある限界内にとどめる必要があることを示唆している。PT毒素の収率を高めるため、PT構造遺伝子の第2のセットをBp−WWC染色体に導入した。挿入標的部位を特定するため、B.パータシス・トハマゲノムの配列をスキャンし、多くの偽遺伝子を同定した。推定アンモニウムトランスポーター遺伝子と推定自己トランスポーター遺伝子との間のDNA配列を挿入用に選択した(posn.2,903,988〜2,905,228及び2,905,291〜2,908,277)。これらの遺伝子は各々、その機能性を損ねるフレームシフト変異を有する(図4A)。先のセクションで概説した一般的な戦略に従った。先ず、選択組み込み部位に隣接する領域内にCmR遺伝子を挿入して大腸菌ベクターpSKPD5Cm3を構築した(図4B)。対象となる配列をpSS4245に挿入した後、CmRマーカーによって対立遺伝子交換を選択した。設計位置でのCmR遺伝子の組み込みをPCRによって確認した(データは示さず)。第2のベクターにおいては、S3遺伝子を同一のフランキング領域内に挿入した後、5種のPT構造遺伝子S1〜S3をptxプロモーター及びptlターミネーターと共に挿入し、S1内に2種の変異を含むベクターpSKptxterを得た(図4C)。標的組み込み部位への対立遺伝子交換によって、PT構造遺伝子の機能性クラスターの第2のコピーがBp−WWC株に挿入された。新しい株をBp−WWDと命名した。組み込みの結果は、ptxオペロン内部で上流域又は下流域に結合しているプライマーを用いた増幅によって確認したが、これによって、組換えが生じた領域は破壊されずに、予想された組み込みが行われたことが分かった。
自動化配列決定を用いて所望の変異の存在を確認した。S1遺伝子の2種のコピーが組み込まれた株Bp−WWDの場合、PCR増幅によって、原理的には2種の遺伝子のコピーの混合物が得られる。インサートの内の1種における予期しない点変異が、対応する位置における二重ヌクレオチド割り当てとして出現し得る。R9K及びE129G位置における蛍光シグナルの単一ピークはBp−WWC上の正しい配列を示しており、該ピークから、Bp−WWD内のS1の2種のコピーが同一の変異を有していることが分かった。2種の所望な変異付近の配列を図5に示す。図5には、株Bp−WWDの配列決定記録と野生型トハマ、Bp−WWC及びBp−WWDの配列アラインメントが示されている。
PRN産生が制限されているため、fhaプロモーターと自身のターミネーターの制御下にあるprn構造遺伝子の第2のコピーをBp−WWD染色体内の2種の偽遺伝子間、即ち、推定グルタチオンS−トランスフェラーゼ偽遺伝子と推定アスパラギン酸ラセマーゼ偽遺伝子との間に挿入した(図6A)。CmR遺伝子が選択挿入部位に隣接する上流域と下流域との間に挿入されたpSKPD2Cm3大腸菌ベクターを構築した。FHAプロモーターの制御下で同様のフランキング領域とprn遺伝子を用いて他のベクターを構築した(図6B)。所望の位置にCmRマーカーを挿入した後、通常の対立遺伝子交換選択及びスクリーニング手続きを用いてCmR遺伝子をprn機能性ブロックで置換した。
株Bp−WWEを培養し、MSS培地で連続的に継代培養して計50世代程度とした。最終培養物を希釈し、MSS−寒天に播種した。30個の単離コロニーをランダムに採取した。PCRによって30個のコロニーのS1遺伝子及びprn遺伝子について解析した(データは示さず)。その結果、全てのコロニーは、予想された位置にS1遺伝子とprn遺伝子の2種のコピーを含んでいることが分かった。
振盪フラスコ培養におけるPT及びFHAの産生をELISAによって解析した。振盪フラスコ培養は全て、ヘプタキス(2,6−O−ジメチル)−β−シクロデキストリンを含む変法スタイナー−ショルテ培地(MSS)で行った[23、24]。株Bp−WWC及びBp−WWDの結果を表1及び表2に示す。Bp−WWCや野生株トハマと比べて株Bp−WWDにおけるPTの産生は約2倍であったが、これは、構造遺伝子クラスターのコピー数と発現レベルとの予想された相関性を示している。
MSS培地中で増殖したBp−WWC、Bp−WWD及びBp−WWEの振盪フラスコ培養におけるPRNの産生。PRNのその膜結合型前駆体からの遊離は、未確認プロテアーゼによる不正確な切断の結果である[25]ため、PRN発現をウェスタンブロット濃度測定解析によって確認し、抗原の完全性についても評価した。高密度発酵槽培養においては、PRNの大部分が膜結合型前駆体から培養上清に自発的に遊離される(未発表の所見)ことも分かった。従って、導入された遺伝子改変によってこの特性が改変されるかどうか調べた。PRNのアッセイは、清澄化した培養上清及び分離細胞の60℃抽出物に対して行った。結果を表3に示す。Bp−WWC及びBp−WWDにおけるPRN毒素の量は同等であった。Bp−WWEにおいては2倍に増加したことが分かったが、これも、遺伝子コピー数と発現レベルとの良好な相関性を示している。これらのフラスコ培養においては、培養上清中に存在するPRNの割合は小さいままか又は無視できるレベルであったが、Bp−WWEの場合には上清中のPRNの割合も増加した。
培養上清からのPTの精製は、オッセンギス(Ozcengiz)のプロセス[26]の変法、即ち、最初の硫酸アンモニウム沈殿をリガンド交換クロマトグラフィーで代用する[27、28]方法で行った。野生型B.パータシス及びBp−WWC(遺伝的に不活性化したPT)由来のPT毒素の毒性を解析し、CHO細胞クラスタリング試験[29]によって比較した。この試験は、PTに関して報告された他の機能的アッセイに比べて感度が遥かに高い。B.パータシス・トハマ株から精製された天然毒素は、クラスタリング終点が2.6pg/ウェルであることが示された。遺伝的に不活性化されたPTは、この試験で得られた最高濃度(即ち、0.8〜1.6μg/サンプル)でもクラスタリングを促進しなかった(図7)。従って、PTの低溶解度による制限を考慮すると、この試験から、毒性が5×105〜106倍低下することが分かる。この結果から、PTサブユニットS1における2種のアミノ酸置換をもたらす5種のヌクレオチド置換によって、Bp−WWC由来のPT毒素がうまく不活性化されたことが分かる。
これらの実験における無標識遺伝子挿入及び置換は、B.パータシスにおいてベクターとしてpSS4245を用いることによって成功した。プラスミドの切除を引き起こす第2の相同組換えを行った後、cre−loxシステム[30]やボルデテラで用いる初期の対立遺伝子交換手続き[22]に対し、染色体内には抗菌性遺伝子マーカーや瘢痕は残されていなかった。遺伝的に不活性化されたPT毒素の過剰産生は、ptx遺伝子のタンデム反復又はfha遺伝子へ挿入された他のコピーを用いて1992年に報告された[20]。得られた株によってPTが最大80mg/Lまで過剰産生した。タンデム反復遺伝子は、遺伝的不安定性の原因となり得ることが知られている。こうした理由で、B.パータシスのゲノム配列をスキャンして適切な組み込み部位を見出した。2種の偽遺伝子のターミネーター間のDNA位置をptxクラスターの組み込み部位として選択した。事前の試みによって示唆されているように、このような病原性因子の過剰産生は細胞代謝に負荷をかけ、その結果、増殖速度が低下し、最終的には遺伝的不安定性を招く場合があるため、PT構造クラスターのコピー数を2に制限した。
遺伝的に不活性化されたPTのS1::R9K−E129Gサブユニットを含むB.パータシス株を、如何なるマーカーや瘢痕も染色体内に残さずに構築した。染色体上の2種の偽遺伝子間にptx−ptlオペロンプロモーター及びptlターミネーターの制御下で5種の構造遺伝子(S1変異のptx)を組み込むことによって、振盪フラスコ内でPT毒素が2倍に増加したことが分かった。PTの不活性化はCHO細胞クラスタリングアッセイによって確認した。更に、染色体上の別の位置で他の偽遺伝子間にprn遺伝子の第2のコピーを組み込むことによってPRN産生が増加した。この株は振盪フラスコ継代培養において遺伝的に安定であることが見出され、大規模な(>1000L)発酵に必要とされるよりも多い世代数が再現された。これらの株(特に、PT及びPRN抗原の相対量がワクチンの組成にマッチするBp−WWE)は、手頃な価格の無細胞百日咳ワクチンの製造を可能にする上で有用であることが示されたが、これは、十分な免疫原性のために天然抗原が必要とする用量が低下し、2種の制限抗原PT及びPRNに対する株の生産性が向上することによるコスト削減に寄与する。
細菌株、プラスミド及び培養条件
本研究に用いた化学物質及び試薬は全て、分子生物学グレード又は分析グレードであった。化学物質はメルク及びシグマから購入した。細菌培養培地はディフコ(米国)及びメルク(ドイツ)から入手した。制限酵素及び修飾酵素はニュー・イングランド・バイオラボ(米国)から購入した。
B.パータシス株トハマの染色体DNAを原料として用いた。5’F−PT−SalI及び5’R−PT−MCSプライマーを用いたPCRによってS1遺伝子の上流域を増幅した。後者のプライマーは、KpnI、XbaI、BglII及びNotI部位を含む。増幅産物をアガロースゲルから回収し、QIAEX II抽出キット(キアゲン)によって精製した。1287bpの増幅産物をSalI及びNotIで消化し、同じ酵素で消化した大腸菌ベクターpSKΔKpnIにクローン化した。pSKΔKpnIは、KpnI部位が消化によって除去され、クレノウ酵素で埋められ、再環状化されたpBluescript II SK+の誘導体である。得られた構築物を熱ショックによって大腸菌DH5αのコンピテント細胞に形質転換し、pSK5’と命名した。同様に、3’F−PTXbaI及び3’R−PT−BglIIプライマーを用いた増幅によって下流域を得た。1531bpの産物をXbaI及びBglIIで消化し、回収した断片を同じ酵素で消化したpSK5’に挿入し、pSK53を得た。
B.パータシスへの対立遺伝子交換を行うため、新しく開発したベクターpSS4245(図1)を用いた。このベクターに関する完全な記載はまだ公表されていないため、その構造の概略を本明細書にて報告する。このベクターは、ボルデテラ種における対立遺伝子交換のために特異的に設計された。対象となる遺伝子やその染色体上のフランキング配列を挿入することができるマルチリンカークローニング部位を含み、大腸菌内でベクターやその誘導体を選択するのに用いる数種の抗生物質(アンピシリン等)耐性遺伝子を含む。複製開始点はpBR322に由来するが、これは、該ベクターが大腸菌内では複製可能であるが、B.パータシス内では自殺することを意味する。Tn5に由来するストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子も存在し、この遺伝子は、B.パータシスに対してはストレプトマイシン耐性をもたらすが、大腸菌にはもたらさない[33]。大腸菌ドナーとB.パータシスレシピエントとの間の接合伝達は、プラスミドRP4由来の伝達起点の存在によって生じ得る。これには、ドナー株として大腸菌SM10を用いることが必要であり、RP4由来の必要な接合機能をトランスに(in trans)もたらす[22]。接合は、レシピエントであるB.パータシスとドナーである大腸菌を、これら2種の細菌の増殖をサポートする寒天プレート上で一緒に画線することによってのみ生じる。ベクターはB.パータシス内では自殺するため、対象となる遺伝子に隣接する一領域における相同組換えによって全ベクターとそのStrRマーカーを組み込んだB.パータシス細胞に対してストレプトマイシンを選択し、それと同時に大腸菌ドナーを排除する。この共組み込みと排除を解決するため、ベクターの大部分は対象となる遺伝子を保存し、pSS4245はI−SceIメガヌクレアーゼ遺伝子と共に対応する切断部位を取り込む(図1)[34]。ヌクレアーゼをptx−ptlオペロンプロモーターの制御下に置く。B.パータシス染色体上には対応する切断部位が存在しない。融合体の選択は調節条件下で行う必要があるが、この場合、PTを含むB.パータシスの全ての病原性因子が抑制される。この条件は、接合プロセスで用いるMSS−寒天プレートに20mMのニコチン酸を添加することによって得られた。ニコチン酸を添加せずにMSS−寒天に接合完了体混合物を移すとptxプロモーター抑制が緩和されるため、I−SceIヌクレアーゼが発現する。これによって、組み込まれたベクターのヌクレアーゼ部位のレベルで細菌染色体内で二重鎖切断が生じる。この事象は修復されなければ致死的である。DNA損傷も修復に向けたSOS応答を活性化し、組換え頻度は2〜3ログで増加し、損傷は第2の相同組換えによって最終的には排除される[34]。いずれの場合においても、ベクターの大部分を損失する。第2の組換えが同じフランキング領域内で生じた場合には元の株が再生し、他のフランキング領域内で生じた場合には所望の株が得られる。略同じサイズのフランキング領域と同様に、クロラムフェニコール耐性状態についてスクリーニングする必要のあるコロニーは少数であり、得られる2種類の株、即ち、親株と組換え株は略同等に分布する。
S1遺伝子をPCR増幅によってクローン化し、部位特異的PCR変異誘発によって変異させた。プライマーS1F−PT−KpnI及びS1R−PTXbaIを用いて染色体DNA由来の遺伝子を増幅した。精製したPCR産物をXbaI及びKpnIで消化し、回収した908bpの断片を同じ酵素で切断したpSK53に連結させた。形質転換及びコロニー選択後、得られたプラスミドをpSK5S13と命名した。
先ず、標的挿入部位に隣接する配列(図4A)をクローン化してpSKPD5Cm3を得た。上流の1688bpの断片をプライマー5’F−PD−ApaI及び5’R−PD−MCSで増幅し、ApaI及びKpnIで消化し、同じ酵素で切断したpSK5Cm3に連結させてpSKPD5’−Cmを得た。下流の2980bpの断片をプライマー3’F−PD−MCS及び3’R−PD−BglIIで増幅し、XbaI及びBglIIで消化し、同じ酵素で切断したpSKPD5’−Cmに連結させた。得られたプラスミドをpSKPD5Cm3と命名した(図4B)。
PRN構造遺伝子の第2のコピーを組み込むために選択した標的部位へのクロラムフェニコール耐性遺伝子の組み込み。
BamHI部位が欠如したpBluescript SK+の誘導体の構築を、酵素による消化、クレノウ酵素による埋め込み及び連結によって行った。得られたプラスミドを大腸菌に形質転換し、pSKΔH1と命名した。
ATG開始コドン(F)で開始するプライマーとXbaI(R)制限部位を有するプライマーを用いてB.パータシスDNAからPRNの構造遺伝子を増幅した。コード領域及びターミネーターのみを含む2808bpの増幅産物を「A」テーリングプロトコル(プロメガ)によって処理した。得られた断片をpGEM−Tイージーベクターにクローン化した。得られたpGEM−TPRNと命名されたプラスミドを制限酵素解析によって確認した。強いFHAプロモーターによって駆動されるPRN遺伝子の第2のコピーを得るための最初の検査において、FHAプロモーターをPCR増幅によってB.パータシスDNAから単離し、PRN遺伝子の前方に挿入した。BamHIを有するプライマー(FHAproF−BamHI)とNdeI−XbaIを含むポリリンカーを有するプライマー(FHAR−MCS)によってFHAプロモーターを増幅した。精製産物をBamHI及びXbaIで切断した後、回収したDNA断片を同じ酵素で切断したpSKPD253に連結させた。得られたpSKPD253Fpと命名されたプラスミドを制限酵素解析によって確認した。このプラスミドをNdeI及びXbaIで切断した後、PRNF−NdeI及びPRNR−XbaIプライマーによってpGEMTPRNから増幅し、同じ酵素で切断したprn遺伝子のPCR産物と連結させた。得られたプラスミドをpSKPD25FpPRN3と命名した(図6B)。このプラスミドをNotI及びSpeIで消化し、同じ酵素で消化したpSS4245に連結させることによって接合構築物を得た。得られたプラスミドをpSSPD2FpPRNと命名した。この構築物をBp−WWD染色体の選択位置で挿入し、上述の通常の対立遺伝子交換手続きとスクリーニングを用いて導入したクロラムフェニコール耐性マーカーを置換した。
制限部位BamHIを有するプライマー(PrnProF−BamHI)及び制限部位NdeIを有するプライマー(PRNProR−NdeI)を用いたB.パータシスDNAのPCR増幅によってPRNプロモーターをクローン化した。プラスミドpSKPD25FpPRN3をBamHI及びNdeIで切断し、FHAプロモーターを損失した断片を得た。PRNプロモーターをその場所に連結させた。大腸菌に形質転換し、制限酵素解析によって確認した後、得られたプラスミドをpSKPD25PRN3と命名した(図6C)。該プラスミドをNotIで切断し、同じ酵素で切断したpSS4245に挿入した。得られた構築物のpSSPD2prnを大腸菌SM10に導入し、対立遺伝子交換を行った。得られたB.パータシス株をBp−WWEと命名した。設計位置でのprn遺伝子の組み込みの確認は、prn遺伝子内部で上流5’フランキング領域のみに特異的に結合するプライマー(5’FPD2−int及びPRNProR−NdeIプライマー)及び3’下流フランキング領域のみに特異的に結合するプライマー(PRNF−int及び3’RPD2−intプライマー)を用いたPCRによって行った。
振盪フラスコ中、メチル化β−シクロデキストリンを添加したMSS培地(100mL)を用い、35℃、200rpmでBp−WWC、Bp−WWD及びBp−WWEを増殖した。増殖を32〜48時間行った後、培養上清を採取し、ELISAによってアッセイしてPT及びFHAの発現レベルを定量化した。PRN発現をウェスタンブロット濃度測定解析によって確認し、抗原の完全性についても評価した。このアッセイは、清澄化した培養上清と等張バッファー中60℃で加熱して得た細胞抽出物との両方について行った。
PT又はFHAに対する精製ウサギポリクローナル抗体(1:1000、NLAC、タイ)を96ウェルプレート(NUNCマキシソープ)中、炭酸/重炭酸バッファー(pH9.6)(100μL/ウェル)でコートし、4℃で一晩インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水(pH7.4、0.1%ツイーン20含有)(PBST)で3回洗浄した後、3%ウシ血清アルブミン(BSA)含有PBST(100μL/ウェル)を用いてブロッキングを行い、その後、37℃で1時間インキュベートした。ブロッキングバッファーを廃棄して洗浄を行った後、標準PT、FHA又はサンプルの希釈物を添加し、37℃で1時間インキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、ブロッキングバッファーに溶解した抗PTサブユニットS2マウスモノクローナル抗体(1:30,000、アブカム、米国)又は抗FHAマウスモノクローナル抗体(1:10,000、NIBSC、英国)(100μL)を添加し、同様の条件下でインキュベートした。PBSTでウェルを3回洗浄した後、ウサギ抗マウス(H+L)IgG−HRP接合体(アブカム、米国)のブロッキングバッファー希釈物(1:10,000)(100μL)を二次抗体として用い、再度37℃で1時間インキュベートした。PSTで洗浄した後、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(KPL、米国)(100μL)を酵素基質として添加した。1N HCl(100μL/ウェル)によって呈色反応を終了させた。マイクロタイタープレートリーダーを用い、光学濃度を450nmで測定した。
標準PRN及びサンプルの希釈物を10%SDS−PAGEゲルに溶解した後、半乾燥ブロッティングシステムを用いてPVDF膜に移した。PBSTに溶解した5%スキムミルクで膜を1時間ブロックした。このブロッキング溶液を廃棄した後、膜をブロッキングバッファーに溶解した抗PRNヒツジ血清(1:10,000、NIBSC、英国)(20mL)と共に1時間インキュベートし、その後、PBSTで3回洗浄した。次に、膜を同様の条件下でウサギ抗ヒツジIgG−HRP接合体(サンタクルーズ・バイオテクノロジー、米国)(20mL)と共にインキュベートし、再度洗浄した。次に、膜を3,3’−ジアミノベンズアミジンに茶色くなるまで浸漬した。脱イオン水で2〜3回すすいで反応を終了させた後、室温で乾燥させた。膜をスキャンし、画像ファイルに変換した。専用のソフトウェアを用いたサンプル及び基準バンドのデンシトメトリー解析によってPRN濃度を求めた。
株の培養をMSS培地(100mL)中、35℃、200rpmで48時間行った後、培養物(0.1mL)をMSS(100mL)に導入し、同様の条件下でインキュベートした。この工程を更に4回繰り返した。各導入は10世代に相当する。培養物を希釈し、MSS寒天上に播種した。30個の単離コロニーをランダムに選択した。選択した30個のコロニーの内の2個をPCRによって解析し、予想されるPT及びPRNインサートの存在を検出した。
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞クラスタリング活性をヒューレット(Hewlett)らの方法[28]によって確認した。即ち、10%ウシ胎仔血清を添加したcRPMI1640培地中でCHO細胞を培養した。5%CO2雰囲気下、37℃で細胞をインキュベートした。培養した細胞をトリプシン処理し、cRPMI1640培地で2×104個/mLに調整し、96ウェルマイクロ培養プレートのウェルに供給した(200μL/ウェル)。試験サンプル及び基準PT毒素をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.4)にて10倍間隔で連続的に希釈し、希釈物(25μL)をウェルに添加した。同様の条件下で48時間インキュベートしてクラスタリングを最大限にした後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、写真撮影した。
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Claims (15)
- 遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株であって、百日咳毒素S1遺伝子はArg9→Lys9及びGlu129→Gly129変異を有するが、抗生物質耐性遺伝子は組み込まれておらず、無毒化百日咳毒素(rPT)を発現することができる遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株。
- トハマ株に由来する、請求項1に記載の遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株。
- (a)遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株の染色体の非機能性領域にptxオペロンのコピーを少なくとも一つ組み込むことによって更に改変されており、組み込まれたptxオペロンは、変異Arg9→Lys9及びGlu129→Gly129を含むように改変されたS1遺伝子とS2〜S5遺伝子のセットを含んでおり、こうして改変された株は、染色体内に離れて位置する少なくとも2種のptxオペロンを有し、1種のptxオペロンのみを有する株と比較して高いレベルの無毒化百日咳毒素を発現することができ、及び/又は
(b)遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株の染色体の非機能性領域にパータクチンをコードするprn遺伝子のコピーを少なくとも一つ組み込むことによって更に改変されており、こうして改変された株は、染色体内に離れて位置する少なくとも2種のprn遺伝子を有し、1種のprn遺伝子のみを有する株と比較して高いレベルのパータクチンを発現することができる、
請求項1に記載の遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株。 - ptxオペロン及び/又はprn遺伝子のコピーは、非機能性偽遺伝子内又は非機能性偽遺伝子間に組み込まれている、請求項3に記載の遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株。
- ptxオペロンの一を超えるコピー及び/又はprn遺伝子の一を超えるコピーが挿入された、請求項3に記載の遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株。
- 少なくとも二種のptxオペロン及び/又は少なくともの二種のprn遺伝子を含む、請求項3に記載の遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株。
- 請求項1に記載の遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株を製造する方法であって、ボルデテラ・パータシス株内のS1遺伝子に変異Arg9→Lys9及びGlu129→Gly129を導入する段階を含み、抗生物質耐性遺伝子を組み込んでいない、無毒化百日咳毒素(rPT)を発現することができる遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株を得る方法。
- ボルデテラ・パータシス株がトハマ株である、請求項7に記載の方法。
- (a)遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株の染色体の非機能性領域にptxオペロンのコピーを少なくとも一つ組み込む段階を更に含み、組み込まれたptxオペロンは、変異Arg9→Lys9及びGlu129→Gly129を含むように改変されたS1遺伝子とS2〜S5遺伝子のセットを含んでおり、これによって、染色体内に離れて位置する少なくとも2種のptxオペロンを有し、1種のptxオペロンのみを有する株と比較して高いレベルの無毒化百日咳毒素を発現することができ、及び/又は
(b)遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株の染色体の非機能性領域にパータクチンをコードするprn遺伝子のコピーを少なくとも一つ組み込む段階を更に含み、これによって、染色体内に離れて位置する少なくとも2種のprn遺伝子を有し、1種のprn遺伝子のみを有する株と比較して高いレベルのパータクチンを発現することができる
抗生物質耐性遺伝子を組み込まずに、前記ptxオペロン及び/又はprn遺伝子を組み込む、
請求項7に記載の方法。 - ptxオペロン及び/又はprn遺伝子を非機能性偽遺伝子内又は非機能性偽遺伝子間に組み込む、請求項10に記載の方法。
- ptxオペロンのコピーとprn遺伝子のコピーを遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株の染色体に挿入する、請求項10に記載の方法。
- ptxオペロンの一を超えるコピーを遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株の染色体に挿入し、及び/又はprn遺伝子の一を超えるコピーを遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株の染色体に挿入する、請求項10に記載の方法。
- ボルデテラ・パータシス抗原を製造する方法であって、
(i)請求項1に記載の遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株を培地内で培養し、該株内に存在する遺伝子によってコードされた無毒化百日咳毒素(rPT)、パータクチン及び繊維状ヘマグルチニン(FHA)を含む抗原を発現させる段階と、
(ii)培地若しくは細胞抽出物から該抗原を回収する段階とを含む方法。
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