KR100391752B1 - 재조합단백질, 플라즈미드 및 변형된 세포의 생성방법 - Google Patents
재조합단백질, 플라즈미드 및 변형된 세포의 생성방법 Download PDFInfo
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Abstract
T7 박테리오파지 프로모터에 의해 조절된 관심 핵산 서열 및 RP4 플라즈미드의 par 영역 또는 이들의 유도체의 전부 또는 일부를 포함하는 안정화 영역을 포함하는 발현 플라즈미드, 또한 본 발명은 재조합 생성물 생성에서의 플라즈미드의 용도에 관한 것이다.
Description
세균, 특히 이. 콜라이를 원핵 및 진핵 모두로부터 다양한 기원의 단백질을 생성하기 위해서 사용할 수 있다. 특히, 사람 단백질이 이. 콜라이에서 생성될 수 있다. 이를 행하기 위해서, 구조 유전자, 또는 당해 단백질을 암호화하는 유전자의 cDNA는 이. 콜라이 발현 장치에 의해 확인되는 적절한 발현 시그널의 다운스트림(프로모터 및 리보좀 부착 부위)에 놓여야 한다. 이. 콜라이에 사용된 가장 효율적인 시스템은 Studier에 의해 기재된 것이다 [참조: Studier et al., 1990]. 이 시스템은 특히 이러한 동일한 박테리오파지의 RNA 중합효소에 의해 확인되는 파지 T7 프로모터의 이용을 포함한다(이. 콜라이는 이러한 특별한 중합효소에 의해 확인되는 임의의 프로모터를 소유하지 않는다). 이러한 발현 시스템은 예를 들면 파지 T7 RNA 중합효소 유전자 발현의 IPTG로의 유도를 포함한다(이. 콜라이의 PlacUV5 같은유도가능한 프로모터 조절하의 후반부). 이러한 유도는 박테리오파지 T7 프로모터의 조절하에 놓이는 유전자의 발현을 초래하며, 중합효소에 의해 확인된다. 중합효소만이 발현되는 유전자의 업스트림 프로모터를 확인하기 때문에, 후자의 유전자는 일반적으로 아주 높은 수준에서 발현된다(총 세균 단백질의 일부 % 이상). 현재 아주 많은 출원이 Studier에 의해 초기에 기재된 [참조: Studier et al., 1990] 이러한 시스템의 사용예를 제공한다.
상기에 지시된 바와 같이, 세균, 특히 이. 콜라이가 약학적으로 관심있는 사람 단백질을 생성하기 위해 사용된다. 이어서, 상기 단백질이 다양한 치료법에 사용된다면, 이들은 식품 생성 시행령(Good Production Practice; GPP)의 규칙에 따라 제조하는 것이 좋다. 이를 행하기 위해서, 생성물이 재생성가능하고 높게 규정된 질 및 매우 높은 순도인 생성물이 수득되는 것을 보장하는 생성 시스템 사용이 필수적이다. 약학적 관심의 단백질을 생성하기 위한 방법의 중요한 특징중의 하나는 단백질을 생성하기 위해 사용된 균주이다. 따라서, 생성 모드가 정성적으로 및 정량적으로 모두 재생성가능함을 보장하기 위한 이러한 균주가 필요하다.
정성적인 수준에서, 예를 들면 총체적으로 동종인, 즉 천연 단백질의 서열과 동일한 일차 서열을 갖는 단백질을 생성하는 것이 적당하다. 따라서, 핵심 돌연변이가 발현된 단백질의 암호화된 서열을 변형시키며, 발효 과정중에 박테리아 세포로 생성될 수 있다면, 이는 천연적인 서열을 갖는 단백질과 함께 혼합된 변형 단백질의 생성을 일으킨다. 사람에게 투여하는 중에, 이러한 변형된 단백질은 처치에 매우 해로울 수 있는 면역 반응을 초래하거나 뒤이은 처치에서, 이러한 경우에 격렬한 면역 반응을 일으킬 수 있다.
정량적인 수준에서는, 방법이 재생성가능해야만 한다는 사실을 수용한다. 이는 수득된 생성물의 질적 증거를 구성한다. 따라서, 다른 생성 배치에서, 생물량의 단위당 합성되는 적당한 단백질의 양은 시간의 동일한 단위 및 동일한 배양액 및 성장 조건을 이용하기 때문에 동일하다. 단백질 생성의 이러한 재생성율의 매우 중요한 특징은 박테리아 세포에서 발현 카세트를 수행하는 플라즈미드의 존재이다. 발효 방법은 모든 세포가 배양액의 말단에 플라즈미드를 계속 포함할 때(단백질 생성 전 및 후), 훨씬 더 조절하에 놓인다. 플라즈미드의 존재에 대해 선택한 항생물질은 세균의 플라즈미드를 유지하기 위해서 일반적으로 배양 배지에 첨가된다. 이는 다양한 문제를 일으킬 수 있다: 발효 배지 제조용 항생물질의 가격; 항생물질은 오토클레이빙에 의해 멸균될 수 없기 때문에, 사용전에 배양액 배지에 첨가하는 것이 좋다; 항생물질은 안정하지 않을 수도 있고 사람에게 유독하거나 적어도 일부 환자에게서 원하지 않는 부작용을 일으킬 수 있는 형질전환된 생성물을 유발할 수 있다; 또한 항생물질은 단독으로 사람에게 유독하거나 적어도 일부 환자에게서 원하지 않는 부작용을 일으킬 수 있다. 후자의 두 경우에서, 유독 생성물로부터 유도된 항생물질 또는 생성물에 상응하는, 미량의 유독 생성물은 정제된 생성물에 존재하며, 투여된 용량을 기준으로 부작용 또는 유독 작용을 초래할 수 있는 수준보다 더 낮다. 이는 정밀하고 비싼 연구를 수반한다.
본 발명은 세균내 재조합 단백질의 생성에 관한 것이다. 보다 특별하게, 세균내 재조합 단백질의 가속 생성을 허용하고 특히 안정되고 효과적이며 박테리오파지 T7 프로모터 및 안정화 영역을 포함하는 발현 시스템을 사용하는 신규한 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 방법에 사용될 수 있는 플라즈미드 및 본 방식으로 생성된 재조합 단백질에 관한 것이다.
도 1: 플라즈미드 pXL2435의 작제
A-작제도: pETlla로부터 3.2 kb 및 pXL2283으로부터 2.8 kb의 AccI-NdeI 단편은 플라즈미드 pXL2434를 생성하기 위해 결찰된다; 플라즈미드 pXL2434는 BglII로 분해되며 pXL2435를 생성하기 위해 pXL2434로부터 2.4 kb의 BamHI 단편을 결찰시킨다.
B-플라즈미드 pXL2435의 지도: aFGF: aFGF을 암호화하는 유전자, Ampr: 암피실린에 대해 내성인 유전자, Kmr: 카나마이신에 대해 내성인 유전자; lacq: Lac 억제자의 가속된 합성을 암호화하는 유전자; ori: 복제의 ColE1 기원; parDE' parCBA: RP4 par locus의 유전자; pT7: T7 Φ10 프로모터 및 lacO 오퍼레이터; TΦ: T7 TΦ 종결기. 화살표는 유전자가 전사되는 방향을 지시한다. 도시된 제한 효소 부위는 클로닝에 사용되는 것들이다. 브래킷에서 숫자는 염기쌍으로 서열 번호: 1상의 위치에 상응한다.
도 2: 항생물질의 부재하에 및 플라즈미드 pXL2283, pXL2434또는 pXL2435의 존재하에 이. 콜라이 BL21, DE3에 의해 유도되고 이어 IPTG로 유도된 aFCF 단백질의 도시 총 세포 추출물은 겔상에서 적하된다. M: kDa로 지시된 분자량을 갖는 분자량 마커; 화살표는 aFGF의 분자량을 지시한다.
서열 번호: 1: 8501 bp 플라즈미드 pXL2435의 뉴클레오티드 서열. 서열상의 위치 1은 pETlla의 Bq;II 절단 부위에 상응한다. aFGF 유전자는 위치 108 및 575 사이에 위치하고, par locus는 위치 6038 및 8499 사이, 예를 들면 parE' 8248 내지 8499, parD 8001 내지 8252, parC 7850 내지 7557, parB 7560 내지 7027 및 parA 7066 내지 6407 사이에 위치한다. T7 Φ10 프로모터는 위치 20 및 36사이에,lacO는 위치 39 및 63 사이에, T7 TΦ 종결기는 위치 586 및 708 사이에 위치하고, lacq유전자는 위치 5636 및 4554 사이에 위치한다.
본 발명은 이러한 문제점을 해결한다. 따라서, 본 발명은 박테리아 유발이발효제에서 서로 계속될 때 플라즈미드를 유지하기 위해 존재하는 항생물질이 필요없는 특히 효과적인 발현 시스템을 제공한다. 본 발명은 특히 발현이 박테리오파지 T7 프로모터에 의해 이루어지고 안정화 영역을 추가로 포함하는 플라즈미드 발현 시스템의 작제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 시스템은 Studier 일동의 시스템의 경우에서 관찰된 것과는 반대로, 플라즈미드를 발현된 단백질의 발현을 포함시킨 후에 그리고 항생물질이 없는 배양 조건에서, 임의의 선택 압력 없이 모든 세균성 세포에서 유지할 수 있기 때문에 유리하다. 발현의 유도에 이어, Studier [참조: Studier et al., 1990] 플라즈미드는 세포의 극소량 분획에서 존재할 뿐이다. 이는 본 발명의 시스템이 플라즈미드상에서 강한 안정화 효과를 가지며, 그로인해 재조합 단백질이 생성되는 수준을 증가시키고 방법의 재생성율을 증가시킨다는 증거이다. 특히, 본 발명에 따른 플라즈미드 작제에 사용된 안정화 영역은 플라즈미드 RP4의 par 단편으로부터 유도된다.
본 발명은 일차적으로 박테리오파지 T7 프로모터의 조절하에 관심 핵산 서열을 포함하는 발현 플라즈미드 및 플라즈미드 RP4의 par 영역 또는 이러한 영역의 유도체의 전부 또는 일부를 포함하는 안정화 영역에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명의 플라즈미드에 사용된 박테리오 파지 T7 프로모터는 10개의 유전자에 대한 프로모터이다.
상기에서 지시한 바와 같이, 본 발명의 플라즈미드에 사용된 안정화 영역은 플라즈미드 RP4의 par 단편으로부터 유도된 것이다 [참조: Gerlitz et al., 1990]. 이러한 단편은 다양한 작용(특히, parA, parB, psrC, parD 및 parE로 명명된 5개의유전자) 및 특히, 아마도 플라즈미드 이량체를 분해할 수 있는 부위-특이성 재조합 효소 활성을 명백하게 갖는 단백질을 운반한다 [참조: Eberl et al., 1994]. 이러한 par 단편은 실시예에서 서술한 바와 같이, 플라즈미드 RP4로부터 분리되고 본 발명의 발현 플라즈미드내에서 클로닝될 수 있다. 더구나, 이러한 단편은 본 발명의 플라즈미드내에서 유도전에 또는 뒤이어 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명의 플라즈미드의 안정화 영역은 플라즈미드 RP4의 par 영역 또는 이러한 영역의 유도체의 전부 또는 일부로 구성된다.
특히, 플라즈미드의 안정화 영역은 Gerlitz 일동(1990)에 의해 기술된, 플라즈미드 pTUG3 으로부터의 PstI 삽입부 또는 pOH23으로부터의 아단편 SphI-SphI-SphI 또는 pOH41로부터의 SphI-SphI-ClaI 또는 pGMA28로부터의 SphI-SphI-BamHI 또는 pGMA27로부터의 SphI-SphI-BamHI 또는 pGMA27로부터의 적어도 하나의 SphI-SphI-BamHI 삽입부를 포함하는 pTUG3로부터의 PstI 삽입부의 임의의 아단편으로 구성될 수 있다. pTUG3의 PstI 삽입부는 parCBA-parDE 유전자 및 플랭킹 영역을 포함하지만, pGMA27 또는 pGMA28의 삽입부만이 parCBA-parDE' 유전자 및 5' 플랭킹 영역을 포함한다. 또한 안정화 영역은 parDE 유전자 또는 parD 유전자 및 이의 프로모터 영역 또는 Roberts 일동.(1994)에 의해 이미 기술된 다른 프로모터로 구성된다. 이러한 영역은 플라즈미드 pTUG3에 포함된 StyI-ClaI 단편으로부터 수득될 수 있다. 안정화 영역은 또한 플라즈미드 pTUG3에 포함된 둘, 셋 또는 네개의 par 유전자, 예를 들면 이들 자신의 프로모터 영역 또는 다른 프로모터 영역과 함께 patA-parD 또는 parB-parD 또는 parAC-parD 또는 parBA-parDE의 임의의 배합물로구성된다.
par 영역의 유도체는 par 영역의 유전적 및/또는 화학적 변형에 의해 수득되고 본 발명에 따른 안정한 플라즈미드를 성취할 수 있는 임의의 단편을 포함한다. 특히, 이러한 유도체는 당해분야의 기술자에게 공지된 기술에 따라 수행된 결손, 돌연변이, 첨가, 절단, 결찰 등에 의해 플라즈미드 RP4의 par 영역내에서 수득될 수 있다. 연속적으로, 유도체의 작용 효율은 실시예에 기술된 바와 같이 시험될 수 있다(특히, 실시예 2 참조).
유리하게, 본 발명에 따른 플라즈미드내 안정화 영역은 플라즈미드 RP4의 par 영역의 일부를 포함한다. 하나의 특별한 양태에서, 안정화 영역은 서열 번호: 1의 잔기 6038및 8499사이에 포함된 단편으로 구성된다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 플라즈미드는 lacO 오퍼레이터 및 lacIq유전자를 추가로 포함한다. 따라서, 이. 콜라이에 존재하지 않는 중합효소에 대해 특이적인 박테리오파지 T7 프로모터의 존재에도 불구하고, 관심 핵산 서열의 기초적 발현이 유도 효소없이 일어남이 관찰된다. 이러한 잔여 발현은 플라즈미드의 안정성에서 일부 약화를 유도할 수 있다. 본 발명의 플라즈미드내 lacO 오퍼레이터 및 lacIq유전자의 존재는 더 조절되는 핵산 서열의 발현을 얻고, 특히 유리하게 유도 효소의 부재하에 임의의 발현을 억제하는 것이 가능하다. 따라서 이러한 요소와 병합되는 플라즈미드는 더 큰 안정성 및 발현의 더 큰 조절을 나타낸다. 원하는 효과를 성취하기 위하여, lacO 오퍼레이터는 실시예 1에서 지시한 바와 같이, 박테리오파지 T7 프로모터의 다운스트림 및 관심 핵산 서열의 업스트림에 유리하게 위치한다. lacIq유전자는 플라즈미드의 원하는 성질에 대해 필수적이지 않은 영역에서 플라즈미드내로, 바람직하게는 자신의 프로모터와 함께 삽입된다. 따라서, 유전자는 바람직하게는 par 영역 및 관심 핵산 서열의 발현 카세트 외면에 삽입된다. 이러한 오퍼레이터 및 lacIq유전자의 서열은 서열 번호: 1 서열로 주어진다. 이러한 요소는 동종이거나 대등한 작용을 가지는 서열에 의해 대치될 수 있다.
특히 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 플라즈미드는 또한 관심 핵산 서열의 다운스트림에 위치한 전사 종결기를 포함한다. 유리하게, 사용된 전사 종결기는 그의 프로모터가 사용된 박테리오파지 T7 유전자의 것이다. 바람직하게, 전사 종결기는 박테리오파지 T7의 TΦ 종결기이다.
본 발명에 따른 플라즈미드에 존재하는 관심 핵산 서열은 약학 또는 농식품에서 관심이 있거나 생촉매에 대해 사용될 수 있는 단백질을 암호화하는 임의의 서열일 수 있다. 서열은 구조 유전자, 보상 DNA 서열, 합성 또는 반-합성 서열 등일 수 있다.
바람직하게는, 핵산 서열이 예를 들면, 효소, 혈액 생성물, 호르몬, 림포카인(인터루킨, 인터페론, TNF 등), 성장 인자, 신경 전달과 또는 이들을 합성하기 위한 이들의 전구체 또는 효소, 영양 인자: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/플레이오트로핀등; 아포리포프로틴: ApoAI, ApoAIV, ApoE 등, 디스트로핀 또는 미니디스트로핀, CFTR 단백질중에서 선택되는 약학적 관심 단백질을 암호화하며, 낭포성 섬유증, 종양 억제 유전자 유전자: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev등, 응고에 관여된 인자를 암호화하는 유전자: 인자 VII, VIII 및 IX, DNA 수복에 관여된 유전자와 결합한다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 관심 핵산 서열은 산성 섬유아세포 성장인자(aFGF)를 암호화한다. 사람 aFGF 유전자의 천연 형태 cDNA를 동정하고, 서열분석하며, 클로닝시킨다 [참조: Jaye et al., 1986 and 1987]. 이러한 cDNA는 N-말단부에서 결손의 존재에 의존하는 aFGF의 다른 형태, 특히 154, 140 또는 134 아미노산을 둘러싼 형태을 암호화할 수 있다. 더구나, 천연 또는 인위적 변형이 또한 생성될 수 있으며, 이러한 변형은 천연 유전자 서열(예를 들면, N-말단 메티오닌)내 한쌍 이상 염기의 결손, 돌연변이 및/또는 첨가에 의한 변형으로부터 일어난다. 본 발명의 하나의 완전히 특정한 양태에서, 관심 핵산 서열은 aFGF(154)를 암호화한다. 플라즈미드 pXL2435는 서열 번호: 1를 나타내며, 특정 실시예로서 인용될 수 있다.
또한 본 발명은 재조합 단백질을 생성하기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 특별하게, 본 발명에 따른 생성 방법은 핵산 서열의 발현이 일어나는 조건하에 다음을 포함하는 세균 배양액으로 구성된다:
- 상기 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 운반하는 상술된 바와 같은 플라즈미드, 및
-박테리오파지 T7 RNA 중합효소의 유전자.
상기에서 지시한 바와 같은, 특히 특별하게 박테리오파지 T7 프로모터에 사용되는 시스템 잔기의 관심은 동일한 T7 박테리오파지의 RNA 중합효소에 의해 확인된다. 따라서, 사용된 세균은 본 발명에 따른 플라즈미드에 더하여, 박테리오파지 T7 RNA 중합효소의 발현이 일어나는 카세트를 포함해야만 한다. 이러한 카세트는 사용되거나(이. 콜라이 균주 BL21, DE3), 제 2의 플라즈미드 또는 파지에 의해 운반되는 세균의 게놈중으로 통합되거나 그밖에 본 발명의 플라즈미드상에 존재할 수 있다. 유리하게, 박테리오파지 T7 RNA 중합효소를 암호화하는 유전자를 lac, trp 또는 recA 프로모터같은 유도 프로모터의 조절하에 발현 카세트에 둔다. 이어서, 이는 조절된 방식으로 세포에서 RNA 중합효소 생성을 유도하여, 결과적으로 관심 핵산 서열의 발현을 조절하는 것이 가능하며, 서열을 상기 RNA 중합효소에 대해 특이적인 프로모터의 조절하에 둔다. 바람직하게, 박테리오파지 T7 RNA 중합효소의 발현을 조절하는 유도 프로모터는 이. 콜라이 PlacUV5 프로모터이며, 특히 IPTG의 존재하에 유도된다.
실시예에서 보다 상세하게 지시된 바와 같이, 본 발명의 방법은 높은 수준에서 재생성 방식으로 비변형된 단백질을 생성하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 이러한 방법은 산업적 규모에서 약학적 성질의 재조합 단백질을 생성하는 것을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 방법은 재조합 섬유아세포 성장 인자(특히, aFGF 및 bFGF)를 생성하기에 특히 적합하다. 따라서, 본 발명은 특히 재조합 aFGF 제조 방법에 관한 것이며, 방법에 따라 플라즈미드 pXL2435 및 박테리오파지 T7 RNA 중합효소의 유전자를 포함하는 세균을 핵산 서열의 발현을 허용하는 조건하에 배양시켜 생성된aFGF를 회수한다.
본 발명은 설명을 위한 것이지 제한되지는 않는 실시예를 이용하여 보다 상세하게 기술될 것이다.
사용된 약자:
aFGF: 산성 섬유아세포 성장 인자.
bp: 염기쌍
OD: 광학 밀도
이. 콜라이(E. coli): Escherichia coli
IPTG: 이소프로필티오-β-D-갈락토시다제
kb: 킬로베이스
kDa: 킬로달톤
Km: 카나마이신(kanamycin)
LB: Luria-Bertani 배지
PAGE-SDS: 아크릴아미드, N,N'-메틸렌비사크릴아미드 및 나트륨 도데실 설페이트
를 포함하는 겔을 이응한 전기영동
T7: 박테리오파지 T7
일반적 클로닝, 분자 생물학적 및 생화학적 기술.
세슘 클로라이드/에티듐 브로마이드 농도 구배내 플라즈미드 DNA의 원심분리, 제한 효소 분해, 겔 전기 영동, 아가로즈 겔로부터의 DNA 단편의 전기 용출, 이. 콜라이내 형질전환, 핵산 침전 등과 같은 표준 분자 생물학적 방법이 문헌에 기술되어 있다[참조: Sambrook et al., 1989] 제한 효소는 New-England Biolabs(Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) 또는 Amersham Ltd(Amersham)에 의해 제공된다.
결찰에 있어서, DNA 단편은 0.7% 아가로즈 겔상에서 그들의 크기에 따라서 분리되고, 전기용출에 의해 정제되며, 페놀로 추출되어 에탄올로 침전시킨 다음, 파지 T4 리가제의 존재하에 50mM 트리스-HCl, pH 7.4. 10mM MgCl2, 10mM DTT, 2mM ATP 완충액에서 배양시킨다(Biolabs). 결찰된 DNA 또는 순수한 플라즈미드 DNA가 균주를 형질전환시키기 위해 사용된다: 완전하게 정제된 이.콜라이 BL21, DE3 [F-ompT hsdSB(rB - MB -) gal dcm (DE3)] [참조: Studier et al., 1990] 및 이. 콜라이 TGI [△(lac proA,B), supE, thi, hsdD5/F' traD36, proA+, B+, lacIq, lacZ△M15] [참조: Gibson, 1994]. 플러즈미드 DNA 샘플은 Sambrook 일동(1989)에 의해 기술된알칼린 용해 기술에 의해 정제된다.
LB 배양 배지는 세균학적 분야에 사용된다[참조: Sambrook et al., 1989]. 이어서, 세균 상등액의 희석은 필요하다면, 50mg/l 카나마이신으로 보완된 LB 배지 평판상에서 펼쳐진다.
Studier 일동(1990)에 의해 기술된 프로토콜이 균주 BL21, DE3의 도움으로 aFGF를 생성하기 위해 사용되며, aFGF를 발현시키기 위한 플라즈미드를 포함한다(실시예 1에서 기술한 것과 같은, pXL2283 또는 pXL2434 또는 pXL2435).
aFGF의 생성율은 총 세포 추출물상에서 측정된다. 세균이 용해된 후에, 샘플은 전기영동후에 Coomassie 블루로 염색된 15% SDS-PAGE상에서 적하된다[참조: Denefle et al., 1987]. aFGF를 생성하는 균주로부터 유도된 샘플은 16kDa의 분명한 분자량을 갖는 밴드를 나타낸다. 니트로셀룰로즈 막상에서 반-건조 이동이 수행되고[참조: Sambrook et al., 1989] 막은 아비딘/바이오틴화된 과산화제 복합체를 이용하여 aFGF의 비색 면역학적(래빗으로부터 수득되고 프랑스의 시그마에 의해 시판되는 항-소 aFGF 항체; 및 항-래빗 IgG) 검출을 허용하기 위해 벡타스테인키트(Biosys SA, France)를 동반하는 프로토콜에 따라 처리된다. 프로-블로트 막 상에서의 다른 반-건조 이동이 수행되고(Matsudaira, 1987), 막은 Coomassie 블루로 염색되고 16kDa의 분명한 분자량 밴드가 삭제된다. 이러한 막 피스는 Edman(1956), 온-라인 120/7 분석자가 소유하고 제조자의 지시에 따라 사용된 생시스템 미세연속기가 사용된 모델 477A를 이용한 퇴화를 겪는다.
실시예 1-사람 aFGF의 cDNA를 발현시키기 위한 안정하고 조절된 플라즈미드의 작제.
본 실시예는 이. 콜라이에서 aFGF를 생성하기 위한 안정하고 높게 조절된 플라즈미드를 수득하기 위해 수행된 작제를 기술한다.
사람 aFGF 유전자의 천연 형태의 cDNA(470 bp)[참조: Jaye et al., 1986 and 1987]는 발현 플라즈미드 pMJ42를 생성하기 위해서 NdeI 및 BamHI 부위에서 발현 벡터 pET9[참조: Studier et al., 1990]내에서 동정되고, 서열분석되어 클로닝되며, 이어서 pXL2283으로 명명된다(도 1 참조). 플라즈미드 pXL2283으로부터의 2.8kb NdeI-AccI 삽입부는 발현 플라즈미드 pXL2434를 생성하기 위해서 플라즈미드 pETlla로부터 3.2kb NdeI-AccI 단편으로 결찰된다[참조: Studier et al., 1990]. 이러한 플라즈미드는 lacIq유전자 및 lacO 오퍼레이터를 소유한다는 점에서 pXL2283과 다르며, 훨씬 더 조절된 방식으로 aFGF를 발현시킬 수 있다. 이어서, BamHI 부위는 플라즈미드 pGMA28로부터 유도된 2.46kb parCBA-pzrDE'의 말단부에서 유도된다[참조: Gerlitz et al., 1990]. 이를 행하기 위해서, pGMA28로부터의 2.46kb SphI-SphI-BamHI 단편을 플라즈미드 pUC18내에서 클로닝시키고[참조: Yanish-Perron et al., 1985], 플라즈미드 pGMA60을 생성하기 위해서 SphI-BamHI로 분해시킨다[참조: H. Schwab et al., personal communication]. 이어서, 플라즈미드 pGMA60으로부터의 2.46kb HindIII-EcoRI 단편을 플라즈미드 pMTL22내에서 클로닝시키며[참조: Chambers et al., 1988], pXL2433을 생성하기 위해서 HindIII EcoRI로 분해시킨다. 플라즈미드 pXL2433으로부터 BamHI (parCBA-parDE') 삽입부는플라즈미드 pXL2435를 생성하기 위해서 플라즈미드 pXL2434의 BqlII 부위내에서 유도된다. 플라즈미드 pXL2435의 작제도 및 지도를 도 1에 나타내었고, 플라즈미드 pXL2435의 8501 bp 서열이 기술된다{기술번호: 1). Gerlitz 일동(1990)에 의해 논문에 기술된 서열은 단지 부분적이지만(125 염기쌍이 3' 말단에 첨가된다), 서열의 이러한 3' 부분은 플라즈미드 pXL2433과 pXL2435 및 서열 번호: 1상에서 확인된다. 세개의 발현 플라즈미드의 특징의 요약을 표 1에 나타내었다.
[표 1]
발현 플라즈미드의 특징
실시예 2-aFGF를 생성하는 동안의 발현 플라즈미드의 안정성
본 실시예는 액체 배지에서 T7 중합효소-의존성이고 균주가 플라즈미드에 대한 선택없이 배양되는 aFGF의 발현에 대해 플라즈미드를 포함하는 재조합 이. 콜라이 균주로부터 aFGF의 생성을 기술한다. aFGF 생성에 이어, 플라즈미드의 존재는도 1에 기술된 플라즈미드에 의해 운반된 내성 유전자, 카나마이신에 대한 세균의 내성에 의해 모니터링된다. 마지막으로, 생성된 aFGF 단백질은 표준 생화학 방법에 의해 특징지워진다.
실시예 2.1-aFGF 생성을 유도하기 위한 조건의 부제하의 발현 플라즈미드의 안정성.
플라즈미드 pXL2283, pXL2434 및 pXL2435는 BL21, DE3 균주내에서 형질전환에 의해 유도된다 [참조: Studier et al., 1990]. 두개의 형질전환제는 카나마이신을 포함하는 LB 아가 배지상에서 선택되고 카나마이신의 존재하에 액체 LB 배지상에서 16시간 동안 배양된 형질전환제 사이에서 임의로 선택된다. 배양액을 600 nm에서 광학 밀도가 0.2 내지 0.6이 될때까지, 1/100으로 희석시키고 카나마이신의 존재하에 LB배지에서 배양시킨다. 배양액을 10㎖ LB 배지에서 1/100으로 희석시키고 균주를 0.17 내지 0.6의 OD까지 배양시킨다. 37℃에서, 항생물질을 포함하지 않는 배지에서 이러한 희석 및 세균의 성장이 6회 반복되고 2일의 기간후에, 총 30회 발생 이상에 상응한다. 세균은 LB 아가상에 분포된다. 이들이 성장한후에, 100개의 클론이 LB 아가 및 Km을 포함하는 LB 아가상에서 계속된다. 표 2는 플라즈미드에 대한 선택 압력없이 적어도 30 발생후에, Km에 내성인 클론의 발생율을 도시한다.
본 실시예는 RP4 par 단편이 안정도 효과가 단지 온화함에도 불구하고 선택 압력의 부재하에 플라즈미드를 안정하게 함을 나타낸다.
실시예 2.2-aFGF 생성을 유도하기 위한 조건하의 발현 플라즈미드의 안정도.
항생물질의 부재하에 적어도 30회 발생에서 배양된 세균(실시예 2.1에서 기술)을 LB 배지에서 1/100으로 희석시키고 12시간 동안 배양한 다음, LB 배지에서 다시 한번 1/100으로 희석시킨다. 세균이 0.5 내지 0.8의 OD로 성장했을 때, 1mM의 IPTG가 첨가되고 세균이 aFGF를 생성하기 위해서 4시간 동안 배양되며, Coomassie 블루로 염색된 15% SDS-PAGE 겔상에서 적하된 총 세포 추출물상에서 측정된다(도 2 참조). 세균이 LB 아가상에 분포된다. 이들이 성장한 후에, 100개의 클론이 LB 아가 및 카나마이신을 포함하는 LB 아가상에서 계속된다. 표 2는 플라즈미드에 대한 선택 압력의 부재하에 생성된 aFGF를 가진 후에 카나마이신에 내성인 클론의 생성율을 도시한다.
본 실시예는 par 단편이 실질적인 분리된 안정도에 뒤이어 파지 T7 중합효소-의존 발현 시스템을 적용하는 aFGF 발현을 유도함을 분명하게 나타낸다.
[표 2]
플라즈미드에 대한 임의의 선택 압력없이, 단독 성장, 또는 성장(적어도 30발생)에 이은 발현을 따르는 카나마이신에 대해 내성인 클론의 %
실시예 2.3-aFGF를 발현시키기 위한 플라즈미드의 존재하에 생성된 aFGF 단백질의 특징.
aFGF 단백질이 실시예 2.2에서 서술한 유도 조건하에 생성될 때, 수득된 aFGF 단백질은 Coomassie 블루로 염색된 15% PAGE-SDS 겔상에서 가시화되며, 도 2를 참조하고, 보고된 생화학 수득물 및 공표된 서열을 따라, 16 kDa의 분명한 분자량으로 이동한다[참조: Jaye et al., 1986 and 1987]. 추가로, 이러한 단백질은 항-소 aFGF 항체를 이용한 비색 면역학적 검출에 의해 나타난다. 이어서, 균주 BL21, DE3 pXL2435에 의해 생성된 단백질의 N-말단 서열은 총 추출물을 이용하여 결정되며, 일반적 생화학 기술에서 서술한 바와 같이, PAGE-SDS 전기영동에 의해 정제된다. 수득된 서열은 A-E-G-E-I-T-T-F-T-A-L-T (서열 번호: 2)이며; 천연 단백질의 N-말단 서열과 동일하고 [참조: Jaye et al., 1986], 말단 메티오닌은 Hirel일동(1989)에 의해 논의된 바와 같이, 이. 콜라이 메티오닐아미노펩티다제에 의해 절단된다.
따라서, 본 실시예는 실시예 2.2에서 서술한 바와 같이, 이. 콜라이에서 안정한 발현 플라즈미드를 이용하여 생성된 단백질이 aFGF 단백질이고, 이의 N-말단서열이 절단되지 않음을 나타낸다.
Claims (17)
- 박테리오파지 T7 프로모터 조절하의 관심 핵산 서열 및 플라즈미드 RP4의 par 영역을 포함하는 안정화 영역을 포함하는 발현 플라즈미드.
- 제 1 항에 있어서, 박테리오파지 T7 프로모터가 유전자 10의 프로모터인 플라즈미드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, lacO 오퍼레이터 및 lacIq유전자를 추가로 포함하는 플라즈미드.
- 제 3 항에 있어서, lacO 오퍼레이터가 박테리오파지 T7 프로모터의 다운스트림 및 관심 핵산 서열의 업스트림에 위치하는 것을 특징으로 하는 플라즈미드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 관심 핵산 서열이 약학적 또는 농식품적 관심의 단백질 또는 생체촉매에 사용될 수 있는 단백질을 암호화하는 플라즈미드.
- 제 5 항에 있어서, 관심 핵산 서열이 효소, 혈액 생성물, 호르몬, 림포카인, 성장 인자, 신경전달물질, 또는 이들의 전구체 또는 이들에 대한 합성 효소, 영양인자, 아포리포프로테인, 디스프로핀 또는 미니디스트로핀 CFTR 단백질, 종양 억제 폴리펩티드, 응고에 관여하는 폴리펩티드 인자, 또느 DNA 수복에 관여하는 폴리펩티드를 암호화하는 플라즈미드.
- 제 6 항에 있어서, 관심 핵산 서열이 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF)를 암호화하는 플라즈미드.
- 제 7 항에 있어서, 관심 핵산 서열이 aFGF(154)를 암호화하는 플라즈미드.
- 서열 번호: 1을 나타내는 플라즈미드 pXL2435.
- 핵산 서열의 발현을 허용하는 조건하에-재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 플라즈미드, 및-박테리오파지 T7 RNA 중합효소의 유전자를 포함하는 세균을 배양하는 것으로 이루어진 재조합 단백질 생성 방법.
- 제 10 항에 있어서, 박테리오파지 T7 RNA 중합효소의 유전자가 유도 프로모터의 조절하에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 박테리오파지 T7 RNA 중합효소의 유전자가 세균의 게놈내에 통합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 세균이 이. 콜라이 균주인 방법.
- 제 13 항에 있어서, 세균이 이. 콜라이 균주 BT21, DE3인 방법.
- 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 재조합 단백질이 재조합 aFGF인 방법.
- 플라즈미드 pXL2435 및 박테리오파지 T7 RNA 중합효소의 유전자를 포함하는 세균을 핵산 서열의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고, 생성된 aFGF를 회수하는 재조합 aFGF의 제조 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 플라즈미드로 형질전환된 세균.
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