FI120238B - Menetelmä yhdistelmä-DNA-proteiinien, plasmidien ja modifioitujen solujen tuottamiseksi - Google Patents
Menetelmä yhdistelmä-DNA-proteiinien, plasmidien ja modifioitujen solujen tuottamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI120238B FI120238B FI971100A FI971100A FI120238B FI 120238 B FI120238 B FI 120238B FI 971100 A FI971100 A FI 971100A FI 971100 A FI971100 A FI 971100A FI 120238 B FI120238 B FI 120238B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- plasmid
- nucleic acid
- acid sequence
- afgf
- protein
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 92
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 26
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 claims abstract description 23
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 63
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 claims description 42
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 claims description 41
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 13
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 5
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 3
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 claims description 2
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 claims description 2
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 claims description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 claims description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 10
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 10
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 10
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 10
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000846416 Homo sapiens Fibroblast growth factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 101150068959 parD gene Proteins 0.000 description 2
- 102000005162 pleiotrophin Human genes 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAIHPOGPJVUFJY-WDSKDSINSA-N Ala-Glu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O PAIHPOGPJVUFJY-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 102100037320 Apolipoprotein A-IV Human genes 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 101100489581 Caenorhabditis elegans par-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 102000012605 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Human genes 0.000 description 1
- 108010079245 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010041052 DNA Topoisomerase IV Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101100278012 Escherichia coli (strain K12) dnaG gene Proteins 0.000 description 1
- 101100284207 Escherichia coli (strain K12) gyrA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100040004 Gamma-glutamylcyclotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000004038 Glia Maturation Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 description 1
- ZSWGJYOZWBHROQ-RWRJDSDZSA-N Glu-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZSWGJYOZWBHROQ-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 1
- 240000000950 Hippophae rhamnoides Species 0.000 description 1
- 235000003145 Hippophae rhamnoides Nutrition 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000886680 Homo sapiens Gamma-glutamylcyclotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 102000034452 Methionyl aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000192 Methionyl aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 101100385662 Mus musculus Cul9 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 235000010678 Paulownia tomentosa Nutrition 0.000 description 1
- 240000002834 Paulownia tomentosa Species 0.000 description 1
- GMWNQSGWWGKTSF-LFSVMHDDSA-N Phe-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GMWNQSGWWGKTSF-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100165173 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) basS gene Proteins 0.000 description 1
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 description 1
- 102100032889 Sortilin Human genes 0.000 description 1
- 101100421924 Thermus thermophilus (strain ATCC BAA-163 / DSM 7039 / HB27) spo0C gene Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 108010025592 aminoadipoyl-cysteinyl-allylglycine Proteins 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010073614 apolipoprotein A-IV Proteins 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000704 bioconcentration Toxicity 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- -1 etc. Proteins 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 101150004979 flmA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 1
- 101150048892 parB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
- C07K14/501—Fibroblast growth factor [FGF] acidic FGF [aFGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Menetelmä yhdistelmä-DNA-proteiinien, plasmidien ja modifioitujen solujen tuottamiseksi
Esillä oleva keksintö koskee yhdistelmä-DNA-5 proteiinien tuottamista bakteereissa. Keksintö koskee tarkemmin ottaen uutta menetelmää, joka tekee mahdolliseksi yhdistelmä-DNA-proteiinien aiempaa korkeamman tuotannon bakteereissa ja jossa käytetään erityisen stabiilia ja tehokasta ilmentämissysteemiä, joka käsittää bakteriofagin T7 10 promoottorin ja stabilisaatioalueen. Esillä oleva keksintö koskee myös tässä menetelmässä käyttökelpoisia plasmideja ja näin tuotettuja yhdistelmä-DNA-proteiineja.
Bakteereita, ja erityisesti colia, voidaan käyttää eri alkuperää, yhtä hyvin prokaryoottista kuin euka-15 ryoottista, edustavien proteiinien tuottamiseksi. Erityisesti ihmisproteiineja voidaan tuottaa Eh_ colissa. Tämän suorittamiseksi rakennegeeni tai kyseistä proteiinia koo-dittavan geenin cDNA on sijoitettava sopivien, Ek colin il-mentämiskoneiston tunnistamien ilmentämissignaalien (pro-20 moottori ja ribosomikiinnityskohta) taakse. Tehokkain Ek .···. colissa käytetty systeemi on Studierin kuvaama systeemi • · .............
.···. {Studier et ai. , 1990) . Tässä systeemissä käytetään T7- • · **. fagin promoottoria, jonka tämän saman bakteriofagin RNA- ] polymeraasi spesifisesti tunnistaa (Ek_ coli ei käsitä si- 25 nänsä mitään tämän saman polymeraasin tunnistamaa promoot- • · : ·* toria). Tässä ilmentämissysteemissä indusoidaan esimerkiksi • · · ·.· * IPTGrllä T7-fagin RNA-polymeraasigeenin ilmentyminen (joka geeni on sijoitettu indusoitavan promoottorin kuten Ek_ co-
Iin PlacUV5 kontrolliin) . Tästä indusoinnista seuraa poly- :1. 3 0 meraasin tunnistaman T7-bakteriofagipromoottorin kontrol- • · · .*. liin sijoitetun geenin ilmentyminen. Koska polymeraasi tun- • · · ·*·/ nistaa vain ilmennettävästä geenistä ylävirtaan sijaitsevan • · ’·*·* promoottorin, tämä ilmentyy yleensä hyvin runsaasti (yli : muutaman prosentin kokonaisbakteeriproteiineista) . Hyvin • · · ;*·.· 35 lukuisat julkaisut käsittelevät nykyään tämän alunperin • · 2
Studierin kuvaaman systeemin käyttöä (Studier et ai., 1990).
Kuten edellä mainittiin, bakteereita ja erityisesti E. colia käytetään ihmisproteiinien tuottamiseksi, jotka 5 ovat farmaseuttisesti kiinnostavia. Jos näitä mainittuja proteiineja on määrä sitten käytää erilaisissa terapioissa, on sopivaa valmistaa ne huomioon ottaen hyvän tuotantokäy-tännön (ransk. BPL, Bonne Practique de Production) säännöt. Tämän toteuttamiseksi on välttämätöntä käyttää tuotantosys-10 teemiä, joka on toistettava ja joka takaa pitkälle määritellyn laatuisen tuotteen, joka on hyvin puhdasta. Yksi farmaseuttisesti kiinnostavan proteiinin tuotantomenetelmän tärkeä näkökohta on mainitun proteiinin tuotannon mahdollistava kanta. Itse asiassa tämän kannan on taattava sekä 15 kvalitatiivisesti että kvantitatiivisesti toistettava tuotantotapa .
Esimerkiksi kvalitatiivisella tasolla tulee tuottaa täysin homogeeninen proteiini, eli proteiini, jonka primaa- risekvenssi on identtinen luonnollisen proteiinin primaa- 20 risekvenssiin nähden. Itse asiassa jos bakteerisolussa ta- .·**. pahtuisi fermentoinnin aikana ilmennettävän proteiinin koo- ·«· .···. ditettua sekvenssiä modifioiva pistemutaatio, tuloksena • · olisi tuotanto, jossa on modifioitua proteiinia seoksena • · . villisekvenssin proteiinin kanssa. Ihmiseen päästyään tämä ’ 25 proteiini voisi synnyttää immuunireaktion, joka voisi olla • · • ** hyvin tuhoisa hoidon kannalta, tai myöhemmän hoidon aikana • · · ·.· · synnyttää tällä kertaa vakavan immuunireaktion.
Kvantitatiivisella tasolla todetaan, että menetel-: : : män on oltava toistettava. Tämä takaa saadun tuotteen laa- :***: 30 dun. Täten eri tuotantoerien välillä on oltava sama kysei- . sen proteiinien synteesitaso biomassayksiköinä samassa ai- • · · • · · kayksikössä käytettäessä samoja viljely- ja kasvuolosuhtei- • · ’···* ta. Tämän proteiinin tuotantotason eräs hyvin tärkeä näkö- : kohta on ilmentämiskasetin bakteerisoluissa käsittävän ··· 35 plasmidin läsnäolo. Fermentointimenetelmä on sitä paremmin hallinnassa, mitä paremmin kaikki solut käsittävät plasmi- • · 3 din viljelyn lopussa {proteiinituotantoa ennen ja sen jälkeen) . Plasmidin ylläpitämiseksi bakteereissa kasvualustaan lisätään yleensä plasmidin läsnäololle selektiivistä antibioottia. Tämä voi tuoda mukanaan erilaisia ongelmia: anti-5 biootin hinta fermentorikasvualustan valmistuksen tasolla; koska antibioottia ei voida steriloida autoklavoimalla, se voidaan lisätä kasvualustaan valmistelemattomana; antibiootti saattaa olla olematta stabiili ja muodostaa ihmiselle myrkyllisiä transformaatiotuotteitar tai vähintään johtaa 10 tietyillä potilailla epätoivottaviin sekundaarivaikutuk-siin; antibiootti voi myös sinänsä olla ihmiselle myrkyllinen tai vähintään johtaa tietyillä potilailla epätoivottaviin sivuvaikutuksiin. Kahdessa viimemainitussa tapauksessa on osoitettava, että puhdistetussa tuotteessa joko antibi-15 oottia tai johdannaistuotteita vastaavien myrkyllisten tuotteiden jäämät ovat annettavina annoksina pienempiä kuin tasot, jotka mahdollisesti aiheuttavat sekundaari- tai myrkkyvaikutuksia. Tämä johtaa raskaisiin ja kalliisiin tutkimuksiin.
20 Esillä oleva keksintö tuo parannuksen näihin ongel- ·***. miin. Esillä oleva keksintö antaa itse asiassa käyttöön «»· .···. erityisen tehokkaan ilmentämissysteemin, jossa antibiootti • · ei ole välttämätön plasmidin ylläpitämiseksi fermentorissa • · . esiintyvien bakteeripolvien aikana. Esillä oleva keksintö .. ’ 25 perustuu erityisesti plasmidi-ilmentämissysteemin rakenta- • · : ** miseen, jossa ilmentyminen tapahtuu T7-bakteriofagipromoot- ··♦ • · · ^ *.* * torin ansiosta 3a joka käsittää lisäksi stabiloivan alueen.
Keksinnön mukainen systeemi on erityisen edullinen, koska • · · ί#ί : vastoin kuin havaitaan Studierin et ai. systeemille, sillä 3 0 on mahdollista ylläpitää plasmideja kaikissa bakteeri- • · · . soluissa ilmennettävän proteiinin ilmentymisen indusoinnin » · ♦ “*.* jälkeen viljelyolosuhteissa, jotka eivät käsitä antibioot- • · ’*;·* tia, eli ilman valikointipainetta. Studierin plasmideja : {Studier et ai., 1990) tavataan ilmentymisen indusoinnin ··· .. ..... 1 — 35 jälkeen vain hyvin pienessä osassa soluja. On selvää, että keksinnön mukainen systeemi stabiloi voimakkaasti plasmide- • · 4 ja, mikä lisää yhdistelmä-DNA-proteiinin tuotantotasoja ja menetelmän toistettavuutta. Keksinnön mukaisten plasmidien rakentamiseksi käytetty stabiloiva alue saadaan tarkemmin ottaen plasmidin RP4 par-fragmentista.
5 Keksinnön ensimmäinen kohde on siis iImentämisplas- midi, joka käsittää kiinnostavan nukleiinihapposekvenssin T7-bakteriofagipromoottorin kontrollissa sekä stabiloivan alueen, joka käsittää kokonaisuudessaan tai osittain plasmidin RP4 par-alueen tai tämän johdannaisen ja se lisäksi 10 käsittää IacO-operaattorin ja laclq-geenin.
Edullisesti esillä olevan keksinnön mukaisissa plasmideissa käytetty T7-bakteriofagipromoottori on geenin 10 promoottori.
Kuten edellä mainittiin, keksinnön mukaisissa plas- 15 mädeissä käytetty stabiloiva alue on peräisin plasmidin RP4 par-fragmentista (Gerlitz et ai., 1990}. Tämä fragmentti käsittää eri funktioita (erityisesti viisi geeniä nimeltä par A, parB, parC, parD ja parE), ja etenkin proteiinin, jolla tulee olla kohtaspesifinen rekombinaasiaktiivisuus, 20 joka mahdollisesti tekee mahdolliseksi plasmididimeerien .···. erotuksen (Eberl et ai., 1994). Tämä par-fragmentti voidaan • · . ..................
,···# eristää plasmidista RP4 ja kloonata esillä olevan keksinnön • · ***. mukaisiin ilmentämisplasmideihin kuten esimerkeissä kuva- ♦ · . taan. Lisäksi tätä fragmenttia voidaan modifioida ennen sen " * 25 viemistä keksinnön mukaisiin plasmideihin tai tämän jäi- • · • ** keen. Täten keksinnön mukaisten plasmidien stabiloiva alue ··· *.· · voi koostua kokonaisuudessaan tai osittain plasmidin RP4 par-alueesta tai sen johdannaisesta.
: Erityisesti plasmidien stabiloiva alue voi koostua 30 plasmidin pTUG3 PstI-insertistä tai alafragmenteista Sphl- • · · r'' .Sphl-Sphl pOH23:sta tai Sphl-Sphl-Clal pOH41:stä tai Sphl-• · · ---- - · - " *”.* SphI-BamHI pGMA28:sta tai SphI-SphI-BamHI pGMA27:stä, joita • · *·;·* kuvaavat Gerlitz et ai., 1990, tai kokonaisuudessaan : pTUG3:n Pstl-insertin alafragmentista, joka sisältää vähin- ··· — :*·.:* 35 tään insertin SphI-SphI-BamHI pGMA27:stä. Kun pTUG3:n PstI- • · — insertti sisältää geenit parCBA-parDE ja sivuavat alueet, 5 pGMA27- tai pGMA28-insertit sisältävät vain geenit parCBA-parDE' ja 5'-sivuavan alueen. Stabiloiva alue voi samoin koostua parDE-geeneistä tai parD-geenistä ja sen promoottorialueesta tai muusta promoottorista kuten ovat jo kuvan-5 neet Roberts et ai, , 1994. Tämä alue voidaan saada plasmi-din pTUG3 sisältämästä Styl-Clal-fragmentista. Stabiloiva alue voi myös koostua mistä tahansa plasmidin pTUG3 sisältämästä kahden, kolmen tai neljän par-geenin yhdistelmästä, esimerkiksi parA-parD tai parB-parD tai parAC-parD tai par-10 BA-parDE niiden promoottorialueen tai muun promoottorin kanssa.
Ilmaisu "par-alueen johdannainen" käsittää minkä tahansa fragmentin, joka on saatu par-aluetta geneettisesti ja/tai kemiallisesti modifioimalla ja joka sopii keksinnön 15 mukaisten stabiilien plasmidien toteutukseen. Erityisesti nämä johdannaiset voidaan saada deleetioilla, mutaatioilla, additioilla, pilkkomisilla, ligatoinneilla jne. plasmidin RP4 par-alueella alan ammattilaiselle tuttujen tekniikoiden mukaan. Sitten johdannaisten funktionaalisuutta voidaan 20 testata kuten kuvataan esimerkeissä {katso erityisesti esi- .**·. merkki 2) .
• · ·· · ,···. Edullisesti esillä olevan keksinnön mukaisissa • · plasmideissa stabiloiva alue käsittää RP4-plasmidin par- • · . alueen osan. Erityisessä suoritusmuodossa stabiloiva alue 25 koostuu fragmentista, joka on sekvenssin tunnusnumero 1 : *’ tähteiden 6 038 ja 8 499 välissä.
··· V * On havaittu, että huolimatta E^ colissa esiintymät tömälle polymeraasille spesifisen bakteriofagi-T7-promoot-: torin läsnäolosta kiinnostavan nukleiinihapposekvenssin pe- :***: 30 rus ilmentyminen tapahtuu indusoimatta. Tämä jäämäi Imen tyrni- ··· . *. nen voi aiheuttaa plasmidin stabiilisuuden tietyn laskun.
• · · ***.· Keksinnön mukaisissa plasmideissa operaattorin IacO ja gee- • · *···" nin laclq läsnäolo tekee edullisesti mahdolliseksi saada : nukleiinihapposekvenssin säädellympi ilmentyminen ja eri- :*♦.· 35 tyisesti inhiboida kaikki ilmentyminen indusorin puuttues- • · sa. Nämä elementit sisältävillä plasmideilla on siis kasva- 6 nut stabiilisuus ja ilmentymisen kontrolli. Halutun vaikutuksen saamiseksi IacO-operaattori sijoitetaan edullisesti alavirtaan T7-bakteriofagipromoottorista ja ylävirtaan kiinnostavasta nukleiinihapposekvenssistä kuten esitetään 5 esimerkeissä. laclq-geeni insertoidaan plasmidiin edullisesti oman promoottorinsa kanssa alueelle, joka on epäoleellinen plasmidin haluttujen ominaisuuksien suhteen. Täten geeni insertoidaan edullisesti par-alueen sekä kiinnostavan nukleiinihapposekvenssin ilmentämiskasetin ulkopuo-10 lelle. Tämän operaattorin ja laclq-geenin sekvenssit esitetään sekvenssinä tunnusnumero 1. Huomattakoon, että nämä elementit voidaan korvata sekvensseillä, jotka ovat homologisia tai joilla on ekvivalenttiset funktiot.
Erityisen edullisessa suoritusmuodossa keksinnön 15 mukaiset plasmidit käsittävät myös transkription päättäjän, joka sijaitsee alavirtaan kiinnostavasta nukleiinihapposekvenssistä. Edullisesti käytetty transkription päättäjä on T7-bakteriofagigeenin päättäjä, jonka bakteriofagin promoottoria käytetään. Edullisesti kyseessä on T7-bakterio-20 fagin päättäjä T-Fii.
.···. Keksinnön mukaisissa plasmideissa esiintyvä kiin- .···. nostava nukleiinihapposekvenssi voi olla mikä tahansa sek- • · ***. venssi, joka koodittaa proteiinia, joka on farmaseuttises- • · . ti, maatalousravitsemuksellisesti kiinnostava tai jota voi- ] * 25 daan käyttää biokatälyysiin. Kyseessä voi olla rakennegee- • · ϊ ** ni, komplementaarinen DNA-sekvenssi, synteettinen, puoli- ··· ·.· · synteettinen sekvenssi jne.
Edullisesti nukleiinihapposekvenssi koodittaa far- maseuttisesti kiinnostavaa proteiinia, joka valitaan esi- >*“« 30 merkiksi entsyymeistä, veri johdannaisista, hormoneista, • · · lymfokiineistä (interleukiinit, interferonit, TNF jne.), 1 ♦ · kasvutekijöistä, hermojen välittäjäaineista tai niiden syn-···* teesiprekursoreista tai -entsyymeistä, troofisista teki- jöistä: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, ··· 35 HARP/pleiotrofiini jne.; apolipoproteiineista: ApoAI, Apo- AIV, ApoE jne., dystrofiinista tai minidystrofiinista, • · 7 CFTR-proteiinista mukoviskosidoosiin liittyneenä, kasvaimia suppressoivista geeneistä: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev jne., geeneistä, jotka koodattavat koagulaatioon liittyviä tekijöitä: tekijät VII, VIII, IX, geeneistä, jotka osallistuvat 5 DNA:n korjaamiseen jne.
Esillä olevan keksinnön erityisessä suoritusmuodossa kiinnostava nukleiinihapposekvenssi koodittaa fibroblas-tien hapanta kasvutekijää (aFGF). ihmis-aFGF:n geenin na-tiivin muodon cDNA on identifioitu, sekventoitu ja kloonat-10 tu (Jaye et ai. , 1986 ja 1987} . Tämä cDNA voi koodittaa aFGF:n eri muotoja sen mukaan, miten N-pää käsittää delee-tioita, ja etenkin muotoja, jotka käsittävät 154, 140 tai jopa 134 aminohappoa. Lisäksi luonnollisia tai keinotekoisia variantteja voidaan myös tuottaa niiden ollessa seura-15 usta yhden tai useamman emäsparin deleetiosta, mutaatiosta ja/tai additiosta natiivin geenin sekvenssiin (esimerkiksi N-päämetioniini). Esillä olevan keksinnön aivan erityisen spesifisessä suoritusmuodossa kiinnostava nukleiinihappose-kvenssi koodittaa aFGF(154):ää. Spesifisenä esimerkkinä 20 voidaan mainita plasmidi pXL2435, jonka sekvenssi on sek- .···. venssi tunnusnumero 1.
• · V·'. Esillä olevan keksinnön toinen kohde on menetelmä • · • · ***. yhdistelmä-DNA-proteiinien tuottamiseksi. Tarkemmin ottaen keksinnön mukainen tuotantomenetelmä käsittää bakteerin 25 viljelyn, joka käsittää: ·· : *** - edellä kuvatun kaltaisen plasmidin, joka käsittää ··« V · mainittua proteiinia koodittavan nukleiinihapposekvenssin, ja :*·*: - T7-bakteriofagin RNA-polymeraasigeenin, .***. 30 nukleiinihapposekvenssin ilmentymisen mahdollista- ··· • vissa olosuhteissa.
» · ► · · : Kuten edellä on mainittu, systeemin oleellinen osa ··· on nimenomaan T7-bakteriofagipromoottorin käyttö, jonka j’j tunnistaa spesifisesti saman T7-bakteriofagin RNA-polyme- ··· ·. : 35 raasi. Käytetyn bakteerin on siten käsitettävä keksinnön ·· mukaisen plasmidin ohella kasetti, joka mahdollistaa T7- 8 bakteriofagin RNA-polymeraasin ilmentymisen. Tämä kasetti voi olla joko integroitu käytetyn bakteerin genomiin (kanta E. coli BL21,DE3) tai sen voi käsittää toinen plasmidi tai fagi tai edelleen se voi sisältyä keksinnön mukaiseen plas-5 midiin. Edullisesti ilmentämiskasetissa T7-bakteriofagin RNA-polymeraasia koodittava geeni on sijoitettu indusoitavan promoottorin kontrolliin kuten promoottorit lac, trp tai recA. Tämä tekee itse asiassa mahdolliseksi indusoida kontrolloidulla tavalla RNA-polymeraasin tuotanto solussa, 10 ja siten kontrolloida kiinnostavan nukleiinihapposekvenssin ilmentymistä sen ollessa sijoitettu mainitulle RNA-poly-meraasille spesifisen promoottorin kontrolliin. Edullisesti T7-bakteriofagin RNA-polymeraasin ilmentymistä kontrolloiva indusoitava promoottori on coli-promoottori PlacUV5, jo-15 ka indusoituu spesifisesti IPTGm läsnä ollessa.
Kuten yksityiskohtaisemmin esitetään esimerkeissä, keksinnön mukainen menetelmä mahdollistaa siten ei-modi-fioitujen proteiinien tuotannon korkeina tasoina ja toistettavalla tavalla. Tämä menetelmä tekee siten mahdollisek-20 si farmaseuttista laatua olevien yhdistelmä-DNA-proteiinien ... teollisen tuotannon.
• · • ·
Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä sopii • · *···[ aivan erityisen hyvin fibroblastien yhdistelmä-DNA-kasvu- tekijöiden tuotantoon (aFGF, bFGF etenkin). Täten esillä *·**· 2 5 olevan keksinnön erityinen kohde on menetelmä yhdistelmä- ·· • *·· DNA-aFGF:n valmistamiseksi, jonka menetelmän mukaan viljel- :: : lään bakteeria, joka sisältää plasmidin pXL2435 ja T7- bakteriofagin RNA-polymeraasigeenin, olosuhteissa, jotka mahdollistavat nukleiinihapposekvenssin ilmentymisen, ja ,···, 3 0 otetaan talteen tuotettu aFGF.
• · • Esillä olevaa keksintöä kuvataan täydellisemmin • · · ί·ί ϊ seuraavien esimerkkien avulla, jotka tulee katsoa havain-
• M
:...· nolllistaviksi eikä rajoittaviksi.
. .*. Käytetyt lyhenteet • · · ··· : 35 aFGF: f ibroblastien hapan kasvutekijä • · · ep: emäspari 9 O.D.: optinen tiheys E. coli: Escherichia coli IPTG: isopropyylitio-£-D-galaktosidi ke: kiloemäs 5 kDa: kilodalton
Kiri: kanamys i i n i LB: Luria-Bertani-kasvualusta SDS-PAGE: geelielektroforeesi, joka sisältää akryy-liamidia, N,N1-metyleenibisakryyliamidia ja natriumdodesyy-10 lisulfaattia T7: T7-bakteriofagi Kuvioselitykset
Kuvio 1: Plasmidin pXL2435 rakentaminen A. Rakennekaavio: pETlla:n 3,2 ke:n Accl-Ndel- 15 fragmentti ja pXL2283:n 2,8 ke:n fragmentti ligatoitiin, jolloin saatiin plasmidi pXL2434; Bglll:11a pilkottu plas- midi pXL2434 ligatoitiin pXL2433:n 2,4 ke: n BamHI-frag- menttiin, jolloin saatiin pXL2435.
B. Plasmidin pXL2435 kartta: aFGF: aFGF:ää koodit- 20 tava geeni; Ampr: ampisilliiniresistenssigeeni,· Kmr: kana- ... mysiiniresistenssigeeni,· lacla: geeni, joka koodittaa Lac- • · repressorin kohonnutta synteesiä; ori: ColEl:n replikaatio- • · *···* alkukohta; parDE'parCBA: RP4:n par-paikkageenit; pT7 : T7- * * promoottori Fii-10 ja operaattori IacO; T-Fii: T7-päättäjä *·’*· 25 T-Fii. Nuolet osoittavat geenin transkriptiosuunnan. Merki- ·· • *·· tyt restriktioentsyymikohdat ovat kloonauksissa käytetyt :T: kohdat. Sulkeisiin merkityt luvut vastaavat asemia emäspa- reina sekvenssissä tunnusnumero 1.
Kuvio 2 j • · · .···. 30 E. coli BL21,DE3:n tuottaman aFGF-proteiinin visu- • · --— *·] alisointi antibiootin puuttuessa ja plasmidin pXL2283 tai ϊ·ί ί PXL2434 tai pXL2435 läsnä ollessa indusoinnin lPTG:llä jäi- ··· keen. Solu-uutteet kokonaisuudessaan sijoitetaan geelille.
. M: kDa-yksiköissä ilmaistun molekyylipainon merkki, nuoli ··· : 3 5 osoittaa aFGF:n molekyylipainon.
• ·· • ♦ 10
Sekvenssi tunnusnumero 1:
Plasmidin pXL2435 8 501 ep:n nukleotidisekvenssi.
Sekvenssin asema 1 vastaa pETlla:n BglII-leikkauskohtaa. Geeni aFGF sijaitsee asemien 108 ja 575 välissä, par-kohta 5 asemien 6 038 ja 8 499 välissä eli parE' 8 248 - 8 499, parD 8 001 - 8 252, parC 7 850 - 7 557, parB 7 560 - 7 027 ja parA 7 066 - 6 407; T7-promoottori Fii-10 on asemien 20 ja 36 välissä, IacO asemien 39 ja 63 välissä, T7-päättäjä T-Fii asemien 586 ja 708 välissä ja geeni laclq asemien 10 5 636 ja 4 554 välissä.
Yleiset kloonaukseen liittyvät, molekyylibiologiset ja biokemialliset tekniikat
Molekyylibiologian tavanomaisia menetelmiä kuten plasmidi-DNA:n sentrifugointi seesiumkloridi-etidiumbromi- 15 digradienttia käyttäen, pilkkomiset restriktioentsyymeillä, geelielektroforeesi, DNA-fragmenttien elektroeluutio aga- roosigeelistä, transformointi coliin, nukleiinihappojen saostaminen jne. kuvaaan kirjallisuudessa (Sambrook et ah, 1989). Restriktioentsyymit saatiin tahoilta New-England 20 Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) tai ... Amersham Ltd (Amersham) .
• · • · *** Ligatointeja varten DNA-fragmentit erotetaan kokon- • · *···] sa perusteella 0,7-%: isissä agaroosigeeleissä, niitä puh- * distetaan elektroeluutiolla, uutetaan fenolilla, ne saoste- ***** 25 taan etanolilla, minkä jälkeen inkuboidaan 50 mM Tris-HCl- • *·· puskurissa pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP T4- ::*: fagin DNA-ligaasin (Biolabs) läsnä ollessa. Ligatoituja DNA-sekvenssejä tai puhtaita plasmidi-DNA-sekvenssejä käy-.*:*. tetään transformoitumiskelpoiseksi tehdyn kannan transfor- .···. 30 moimiseksi: E. coli BL21,DE3 [F' ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm • · "" —_____ **j (DE3) ] (Studier et ai., 1990) ja |L_ coli TGl [delta(lac ί.: : proA,B) supE, thi, hsdD5/ F' traD36, proA+, B+, laclq, IacZ- ··· ·...· delta-M15] (Gibson, 1984). Plasmidi-DNA:t puhdistetaan Sam- . .*. brookin et ai. (1989) kuvaaman alkalisen lyysin tekniikal- 35 la. - — • · · • · 11 LB-kasvualustaa käytetään bakteriologisessa osassa (Sambrook et ai. , 1989). Bakteerisuspensiolaimennoksia levitetään sitten LB-kasvualustamaljoihin, joissa kasvualustaa on tarvittaessa täydennetty 50 mg:lla/litra kanamysii-5 niä.
Studierin et ai., 1990, kuvaamaa protokollaa käytetään aFGF:n tuottamiseksi kannan BL21,DE3 avulla, joka käsittää aFGF-ilmentämisplasmidin (pXL2283 tai pXL2434 tai PXL2435 kuten kuvataan esimerkissä 1).
10 aFGF-tuotanto kvantitoidaan kokonaissolu-uutteista.
Bakteerisolujen lyysin jälkeen sijoitetaan näytteet 15-%:iselle SDS-PAGE-geelille, joka elektroforeesin jälkeen värjätään Coomassien sinisellä (Denefle et ai., 1987}.
Näytteillä, jotka ovat peräisin aFGF:ää tuottavista kan-15 noista, havaitaan nauha, joka vastaa 16 kDa:n näennäistä molekyylipainoa. Suoritetaan puolikuiva siirto nitrosellu-loosamembraanille (Sambrook et ai., 1989), membraania käsitellään Vectastain-pakkauksen (Biosys SA, Ranska) protokollan mukaan immunologisen aFGF:n (kaniinista saatua anti-20 aFGF-nautavasta-ainetta myy Sigma, Ranska; ja kaniinin an- ... ti-lgG) toteamisen mahdollistamiseksi kolorimetrisesti bio- • · • · tinyloidun avidiini-peroksidaasikompleksin avulla. Suorite- • · *···[ taan toinen puolikuiva siirto Pro-Blott-membraanille (Mat- * * sudaira, 1987), membraani värjätään Coomassie-sinisellä ja *·**· 25 16 kDa:n näennäistä molekyylipainoa vastaava nauha leika- ·· • *·· taan irti. Membraanin tähän osaan kohdistetaan Edman- :T: degradaatio, 1956, Applied Biosystems malli 477A mikrose- kventoijan avulla, johon on kytketty 120/7-analysaattori ja jota käytetään laitevalmistajan ohjeiden mukaan.
.···. 30 Esimerkki 1 • · *·* Plasmidin rakentaminen, joka on stabiili ja jonka • · • · · : ihmis-aFGF-cDNA:n ilmentyminen on säädelty • · * Tässä esimerkissä kuvataan rakenteita, jotka vai- . .*. mistettiin plasmidin saamiseksi, joka on stabiili ja hyvin • · · : 35 säädelty mahdollistaen aFGF:n tuottamisen E. colissa. Ih- • · · ---- mis-aFGF-geenin (470 ep) (Jaye et ai., 1986 ja 1987) natii- 12 vin muodon cDNA identifioitiin, sekventoitiin ja kloonattiin ilmentämisvektoriin pET9 (Studier et ai. , 1990) Ndel-ja BamHI-kohtiin ilmentämisplasmidin pMJ42 muodostamiseksi, jotka kutsutaan jatkossa pXL2283:ksi (katso kuvio 1). Plas-5 midin pXL2283 2,8 ke:n Ndel-AccI-insertti ligatoitiin plas-midin pETlla (Studier et ai., 1990) 3,2 ke:n Ndel-Accl- fragmentiiin, jolloin saatiin ilmentämisplasmidi pXL2434. Tämä plasmidi poikkeaa pXL2283:sta geenin lacIQ ja operaattorin IacO läsnäolon osalta, jolloin tässä saadaan aFGF:n 10 säädellympi ilmentyminen. BamHI-kohdat liitettiin sitten plasmidista pGMA28 (Gerlitz et ai., 1990) peräisin olevan 2.46 ke:n parCBA-parDE'-fragmentin päihin. Tätä varten pGMA28:n 2,46 ke:n SphI-Sphl-BamHI-fragmentti kloonattiin plasmidiin pUCl8 (Yanish-Perron et ai. , 1985), jota oli 15 pilkottu Sphl-BamHI:llä, plasmidin pGMA60 saamiseksi (H. Schwab et ai., henkilökoht. yhteydenotto). Plasmidin pGMA60 2.46 ke:n Hindlll-EcoRl-fragmentti kloonattiin sitten plasmidiin pMTL22 (Chambers et ai., 1988), jota oli pilkottu
Hindin:11a ja EcoRI:llä, pXL2433:n muodostamiseksi. Plas- 20 midin pXL2433 BamHI(parCBA-parDE')-insertti vietiin plasmi- ... din pXL2434 Bglll-kohtaan plasmidin pXL2435 luomiseksi. Ku- • · - viossa 1 esitetään rakentamiskaavio ja kartta plasmidille • · *···[ pXL2435 ja plasmidin pXL2435 8 501 ep:n sekvenssi kuvataan * 1 (sekvenssi tunnusnumero 1). Joskin Gerlitzin et ai., 1990, *·2· 25 julkaisussa kuvattu sekvenssi on vain osittainen (125 emäs- ·· • 1·· paria on lisättävä 3'), sekvenssin tämä 3'-osa todennettiin plasmideilla pXL2433 ja pXL2435 ja sekvenssistä tunnusnumero 1. Yhteenveto näiden kolmen plasmidin ominaispiirteistä esitetään taulukossa 1.
• · · ··· » · » · ··· « : · · • · ·· · ··· ··· • · • · ··· · • · »· 2 • · 13
Taulukko 1
Ilmentämisplasmidien ominaispiirteet Plasmidi PXL2283 tai pXL2434 PXL2435 PMJ42 5 Koko (ke) 4,8 6 8,5
Johdannainen: pBR322 pBR322 pBR322
Resistenssi kanamysiini kanamysiini kanamysiini pT7-promoottori T7-Fiil0 T7-Fiil0 T7-Fiil0
IacO - + + 10 T-Fii-päättäjä T7-T-Fii T7-T-Fii T7-T-Fii aFGF cDNA + + + laclq - + + parCBA-parDE' - - + 15 Esimerkki 2
Ilmentämisplasmidin stabiilisuus aFGF:n tuotannon aikana Tässä esimerkissä kuvataan aFGF:n tuotantoa nestemäisessä kasvualustassa lähtien yhdistelmä-DNA-E. coli-20 kannasta, joka sisältää T7-polymeraasiriippuvaisen aFGF- .···. ilmentämisplasmidin ja jota viljellään siten, ettei plasmi- • · #··^ diin kohdistu valikointipainetta. aFGF:n tuotannon jälkeen • · ***. plasmidin läsnäoloa seurataan bakteerien resistenssistä ka- [ namysiinille, jonka resistenssigeenin esimerkissä 1 kuvatut 25 plasmidit käsittävät. Lopuksi tuotettua aFGF-proteiinia ka- • · : *· rakterisoidaan tavanomaisin biokemiallisen menetelmin.
: Esimerkki 2.1
Ilmentämisplasmidin stabiilisuus aFGF-tuotantoa in-dusoivien olosuhteiden puuttuessa 30 Plasmidit pXL2283, pXL2434 ja pXL2435 viedään • · · . transformoimalla kantaan BL21,DE3 (Studier et ai, , 1990).
• · · *·|#· Transformanteista, jotka valikoidaan kanamyysiiniä sisäl- • · *···* tävllä, LB-agar-kasvualustapinnalla, kanta umpimähkään va- : littua transformanttia viljellään 16 tunnin ajan nestemäi- ♦ ·· 35 sessä LB-kasvualustassa kanamysiinin läsnä ollessa. Viljel- • · mä laimennetaan 1/100 ja kasvatetaan LB-kasvualustassa ka- 14 namysiinin läsnä ollessa kunnes optinen tiheys 600 nm:ssä on 0,2 - 0,6. Viljelmien laimentaminen 1/100 LB-kasvualus-taan suoritetaan 10 ml:ssa kasvualustaa, ja kantoja viljellään kunnes O. D. on 0,17 - 0,6. Tämä bakteerien laimenta-5 miskasvatus kasvualustassa ilman antibioottia 37 °C:ssa toistetaan 6 kertaan ja vastaa kaikkiaan yli 30:n sukupol-vilukua, johon päästään kahdessa päivässä. Bakteerit levitetään LB-agar-kasvualustapinnalle. Kasvatuksen jälkeen 100 kloonia viivasiirrostetaan LB-agar-kasvualustalle ja Km:ä 10 sisältävään LB:iin. Taulukossa 2 esitetään Km:lie resis tenttien kloonien esiintymistiheys vähintään 30 solupolven jälkeen ilmen plasmidin valikointipainetta.
Tämä esimerkki osoittaa, että RP4:n par-fragmentti stabiloi plasmidia valikointipaineen puuttuessa, joskin tä-15 mä stabiloiva vaikutus on korkeintaan kohtuullinen.
Esimerkki 2.2
Ilmentämisplasmidin stabiilisuus aFGF-tuotaimon in-dusointiolosuhteissa
Bakteerit, joita on kasvatettu vähintään 30 polven 20 ajan ilman antibioottia (kuten kuvataan esimerkissä 2.1), .···. laimennetaan 1/100 LB-kasvualustaan ja kasvatetaan 12 tun- • · .···. nin ajan, minkä jälkeen ne laimennetaan 1/100 LB-kasvualus- **'. taan. Kun bakteerit ovat lisääntyneet O.D.-arvoon 0,5 - :···· . 0,8, lisätään lPTG:tä pitoisuuteen 1 mM ja bakteereita kas- • · · · | 1 25 vatetaan 4 tunnin ajan aFGF-tuotannon mahdollistamiseksi, ** joka tuotanto kvantitoidaan 15-%:iselle SDS-PAGE-geelille • · · .· 1 sijoitetuista ja Coomassie-sinisellä värjätyistä kokonais- solu-uutteista (katso kuvio 2) . Bakteerit levitetään LB- agar-kasvualustalle. Kasvatuksen jälkeen 100 kloonia viiva- ’2: 3 0 siirrostetaan agar-LB-kasvualustalle ja kanamysiiniä sisäl- • · · tävälle LB-kasvualustalle. Taulukossa 2 esitetään kanamy- • · *·/ siinille resistenttien kloonien esiintymistiheys aFGF-tuo- ···' tannon jälkeen, kun plasmidin valikointipainetta ei ole käytetty.
s · · · 2 • 9 9 15 Tämä esimerkki osoittaa ilman ambivalenssia, että par-fragmentti indusoi hyvin huomattavan segregationaalisen stabiilisuuden ilmennettäessä aFGF käyttäen T7-fagipolyme-raasista riippuvaista ilmentämissysteemiä.
5 Taulukko 2
Kanamysiinille resistenttien kloonien prosentuaalinen osuus vain kasvatuksen tai kasvatuksen (vähintään 30 polvea) ja sitten ilmentämisen jälkeen plasmidin valikoin-tipainetta käyttämättä 10 viljely-laimennos Viljely-ilmennys ilman kanamysiiniä ilman kanamysiiniä
Plasmidi Kpl Km: lie res. Kpl Km:lie res. aFGP- pXL polvia klooni-% polvia klooni-¾ tuotanto 2283 (nro 1) 30 20 45 0,1 eeta 15 2283 (nro 2) 30 10 45 0,2 eeta 2434 (nro 1) 40 100 45 1 ++ 2434 (nro 2) 40 99 45 5 ++ 2435 (nro 1) 40 100 45 99 ++ 2435 (nro 1) 40 100 45 100 ++ 20 eeta: Coomassie-sinivärjäyksen jälkeen ei todetun aFGF:n ilmenty- .···. minen • · • · · ··· ++: aFGF:n hyvin kohonnut ilmentyminen, noin 0 % kokonaisproteii- • e • · · , . neista • · * 1 25 Esimerkki 2.3 • · : *·· aFGF-ilmentämisplasmidin läsnä ollessa tuotetun e · · v 1 aFGF-proteiinin karakterisointi
Esimerkissä 2.2 kuvatuissa tuotannon indusointiolo-suhteissa saatu aFGF-proteiini visualisoidaan, katso kuvio ;***. 30 2, 15-%:isessa SDS-PAGE-geelissä, joka värjätään Coomassie- • · · . 1. sinisellä, ja se kulkee näennäisen molekyylipainon 16 kDa • · · •1j#1 mukaisesti kuvattujen biokemiallisten parametrien ja jul- • · *···1 kaistun sekvenssin (Jaye et ai., 1986 ja 1987) mukaan. Li- • ...........
: säksi tämä proteiini osoitetaan immunologisesti toteamalla • · · 3 5 kolorometrisesti käyttäen anti-aFGF-nautavasta-ainetta.
• ·
Kannalla BL21,DE3 pXL2435 tuotetun proteiinin N-pääsek- 16 venssi määritettiin sitten lähtien kokonaisuutteesta, jotka puhdistettiin SDS-PAGE-elektroforeesilla kuten kuvataan yleisissä biokemiallisissa tekniikoissa. Saatu sekvenssi on A-E-G-E-I-T-T-F-T-A-L-T (sekvenssi tunnusnumero 2), se on 5 identtinen natiivin proteiinin N-pääsekvenssiin nähden (Jaye et ai. , 1986) ja päässä sijaitsevan metioniinin on leikannut colin metionyyliaminopeptidaasi kuten ovat esittäneet Hirel et ai., 1989.
Tämä esimerkki osoittaa siten, että esimerkissä 2.2 10 kuvatun mukaisen, Eh_ colissa stabiilin ilmentämisplasmidin avulla tuotettu proteiini on aFGF-proteiini, ja että sen N~ pääsekvenssi on ole typistynyt.
• · · • · • · • · · »II • · • · • · · • · • · • · • · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · • · • · · • · • · t • · · • · · · • · · • · • · • · · • · · • · · • · · 1 · • · · • · · • · 17
Viiteluettelo
Chambers, S., Prior, S., Barstow, D., and Minton, N (1988) Gene 68: 139-149. Denefle P., Kovarik, S. , Guilon, J,D., Cartwright, T,, and Mayaux, J.-F. (1987) Gene 56: 61 -70.
Eberl L., Kristensen C., Givskov M., Grohmann E., Gerlitz M., and Schawb H.
(\994) Mol, Microbiol. 12: 131-141.
Edman P. (1956) Ac/a Chemica Scandinavia 10: 761-768.
Gerlitz et al„ (1990)./. Bad. 172: 6194-6203
Gibson T. (1984) Ph D., University of Cambridge, Cambridge, England.
Hirel P., Schmitter P., Dessen P., and Blanquet S. (1989) Proc. Nad. Acad. Sci. 86: 8247-8251.
Jaye M., Howk R., Burgess W., Ricca G., Chui I., Ravera M., O'Brien S., Modi W„ Maciag T., and Drohan W, (1986) Science 233: 541-545.
Jaye M., Burgess W„ Shaw A., Drohan W. (1987) ,/, Biol. Chem. 262: 16612-16617.
Matsudaira P. (1987)./. Biol. Chem. 262: 10035-10038.
Roberts et al. (i994)J. Mol. Biol. 237: 35-51.
• · ·
Sambrook J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd edn. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring • · ... Harbor Laboratory Press, • · • ·
Studier, W. F., Rosenberg, A. H, Dunn, J. J., and Duberndorff, J. W. (1990) Methods EnzymoL 185:89-60.
...· Yanisch-Perron, C., Vieira, J., Messing, J. (1985) Gene 33: 1033-119.
• · • · ·· · »·· »·· • · • · ft·· ft · • · • · • · 18
Sekvenssi1istaus (1) YLEISET TIEDOT:
(i) (A) NIMI: Rhone-Poulenc Rorer S.A
(B) KATU: 20, avenue R. ARON
(C) KAUPUNKI: Antony
(E) MAA: FRANCE
(F) POSTINUMERO: 920165 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Menetelmä yhdistelmä-DNA-proteiinien, plasmidien ja modifioitujen solujen tuottamiseksi (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 2 (iv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC -yhteensopiva
(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS
(D) OHJELMISTO: Patenln Release #1.0, versio #1.25 (OEB) (2) SEKVENSSIN NRO 1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 8501 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ’...· (C) JUOSTEISUUS: kaksi säikeinen ,···. (D) TOPOLOGIA: renkaanmuotoinen ···
:··: {ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(iii) HYPOTEETTINEN: ei « (iii) ANTI-SENSE: ei • · · ' ♦ · • · • · · • · • · » »·· • · • · i · · »· · • · • ♦ • « • « 1 · ♦ ♦ 19 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 1: GATCTCGATC CCGCGAAATT AATACGACTC ACTATAGGGG AATTGTGAGC GGATAACAAT 60 TCCCCTCTAG AAATAATTTT GTTTAACTTT AAGAAGGAGA TATACATATG GCTGAAGGGG 120 AAATCACCAC CTTCACAGCC CTGACCGAGA AGTTTAATCT GCCTCCAGGG AATTACAAGA 180 AGCCCAAACT CCTCTACTGT AGCAACGGGG GCCACTTCCT GAGGATCCTT CCGGATGGCA 240 CAGTGGATGG GACAAGGGAC AGGAGCGACC AGCACATTCA GCTGCAGCTC AGTGCGGAAA 300 GCGTGGGGGA GGTGTATATA AAGAGTACCG AGACTGGCCA GTACTTGGCC ATGGACACCG 360 ACGGGCTTTT ATACGGCTCA CAGACACCAA ATGAGGAATG TTTGTTCCTG GAAAGGCTGG 420 AGGAGAACCA TTACAACACC TATATATCCA AGAAGCATGC AGAGAAGAAT TGGTTTGTTG 480 GCCTCAAGAA GAATGGGAGC TGCAAACGCG GTCCTCGGAC TCACTATGGC CAGAAAGCAA 540 TCTTGTTTCT CCCCCTGCCA GTCTCTTCTG ATTAAAGAGA TCCGGCTGCT AACAAAGCCC 600 GAAAGGAAGC TGAGTTGGCT GCTGCCACCG CTGAGCAATA ACTAGCATAA CCCCTTGGGG 660 CCTCTAAACG GGTCTTGAGG GGTTTTTTGC TGAAAGGAGG AACTATATCC GGATATCCAC 720 AGGACGGGTG TGGTCGCCAT GATCGCGTAG TCGATAGTGG CTCCAAGTAG CGAAGCGAGC 780 AGGACTGGGC GGCGGCCAAA GCGGTCGGAC AGTGCTCCGA GAACGGGTGC GCATAGAAAT 840 TGCATCAACG CATATAGCGC TAGCAGCACG CCATAGTGAC TGGCGATGCT GTCGGAATGG 900 ACGATATCCC GCAAGAGGCC CGGCAGTACC GGCATAACCA AGCCTATGCC TACAGCATCC 960 AGGGTGACGG TGCCGAGGAT GACGATGAGC GCATTGTTAG ATTTCATACA CGGTGCCTGA 1020 ... CTGCGTTAGC AATTTAACTG TGATAAACTA CCGCATTAAA GCTTATCGAT GATAAGCTGT 1080 • · • · '··· CAAACATGAG AATTCTTAGA AAAACTCATC GAGCATCAAA TGAAACTGCA ATTTATTCAT 1140 • · • · ATCAGGATTA TCAATACCAT ATTTTTGAAA AAGCCGTTTC TGTAATGAAG GAGAAAACTC 1200 • · ii; ACCGAGGCAG TTCCATAGGA TGGCAAGATC CTGGTATCGG TCTGCGATTC CGACTCGTCC 1260 • · .. AACATCAATA CAACCTATTA ATTTCCCCTC GTCAAAAATA AGGTTATCAA GTGAGAAATC 1320 • · • · · *... ACCATGAGTG ACGACTGAAT CCGGTGAGAA TGGCAAAAGC TTATGCATTT CTTTCCAGAC 1380 • · · • · · TTGTTCAACA GGCCAGCCAT TACGCTCGTC ATCAAAATCA CTCGCATCAA CCAAACCGTT 1440 ... ATTCATTCGT GATTGCGCCT GAGCGAGACG AAATACGCGA TCGCTGTTAA AAGGACAATT 1500 • · · • · · ACAAACAGGA ATCGAATGCA ACCGGCGCAG GAACÄCTGCC AGCGCATCAA CAATATTTTC 1560 • · • · *11 ACCTGAATCA GGATATTCTT CTAATACCTG GAATGCTGTT TTCCCGGGGA TCGCAGTGGT 1620 • · • · · M : GAGTAACCAT GCATCATCAG GAGTACGGAT AAAATGCTTG ATGGTCGGAA GAGGCATAAA 1680 • · · • · *·..1 TTCCGTCAGC CAGTTTAGTC TGACCATCTC ATCTGTAACA TCATTGGCAA CGCTACCTTT 1740 • · · • · · ··· 2 2 · • · · • · · • · 20 GCCATGTTTC AGAAACAACT CTGGCGCATC GGGCTTCCCA TACAATCGAT AGATTGTCGC 1800 ACCTGATTGC CCGACATTAT CGCGAGCCCA TTTATACCCA TATAAATCAG CATCCATGTT 1860 GGAATTTAAT CGCGGCCTCG AGCAAGACGT TTCCCGTTGA ATATGGCTCA TAACACCCCT 1920 TGTATTACTG TTTATGTAAG CAGACAGTTT TATTGTTCAT GACCAAAATC CCTTAACGTG 1980 AGTTTTCGTT CCACTGAGCG TCAGACCCCG TAGAAAAGAT CAAAGGATCT TCTTGAGATC 2040 gtttttttct gcgcgtaatc t:gctgcttgc AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG 2100 TTTGTTTGCC GGATCAAGAG CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG 2160 CGCAGATACC AAATACTGTC CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC TTCAAGAACT 2220 CTGTAGCACC GCCTACATAC CTCGCTCTGC TAATCCTGTT ACCAGTGGCT GCTGCCAGTG 2200 GCGATAAGTC GTGTCTTACC GGGTTGGACT CAAGACGATA GTTACCGGAT AAGGCGCAGC 2340 GGTCGGGCTG AACGGGGGGT TCGTGCACAC AGCCCAGCTT GGAGCGAACG ACCTACACCG 2400 AACTGAGATA CCTACAGCGT GAGCTATGAG AAAGCGCCAC GCTTCCCGAA' GGGAGAAAGG 2460 CGGACAGGTA TCCGGTAAGC GGCAGGGTCG GAACAGGAGA GCGCACGKGG GAGCTTCCAG 2520 GGGGAAACGC CTGGTATCTT TATAGTCCTG TCGGGTTTCG CCACCTCTGA CTTGAGCGTC 2580 GATTTTTGTG ATGCTCGTCA GGGGGGCGGA GCCTATGGAA AAACGCCAGC AACGCGGCCT 2640 TTTTACGGTT CCTGGCCTTT TGCTGGCCTT TTGCTCACAT GTTCTTTCCT GCGTTATCCC 2700 CTGATTCTGT GGATAACCGT ATTACCGCCT TTGAGTGAGC TGATACCGCT CGCCGCAGCC 2760 GAACGACCGA GCGCAGCGAG TCAGTGAGCG AGGAAGCGGA AGAGCGCCTG ATGCGGTATT 2 $20
TTCTCCTTAC GCATCTGTGC GGTATTTCAC ACCGCATATA TGGTGCACTC TCAGTACAAT 28BO
• · · CTGCTCTGAT GCCGCATAGT TAAGCCAGTA TACACTCCGC TATCGCTACG TGACTGGGTC 2940 ··· ;...· ATGGCTGCGC CCCGACACCC GCCAACACCC GCTGACGCGC CCTGACGGGC TTGTCTGCTC 3000 ·**· CCGGCATCCG CTTACAGACA AGCTGTGACC GTCTCCGGGA GCTGCATGTG TCAGAGGITT 3060 TCACCGTCAT CACCGAAACG CGCGAGGCAG CTGCGGTAAA GCTCATCAGC GTGGTCGTGA 3120 AGCGATTCAC AGATGTCTGC CTGTTCATCC GCGTCCAGCT CGTTGAGTTT CTCCAGAAGC 3180 ··· ,! ί GTTAATGTCT GGCTTCTGAT AAAGCGGGCC ATGTTAAGGG CGGTTTTTTC CTGTTTGGTC 3240 ACTGATGCCT CCGTGTAAGG GGGATTTCTG TTCATGGGGG TAATGATACC GATGAAACGA 3300 ··· Ϊ GAGAGGATGC TCACGATACG GGTTACTGAT GATGAACATG CCCGGTTACT GGAACGTTGT 3360 ··· : GAGGGTAAAC AACTGGCGGT ATGGATGCGG CGGGACCAGA GAAAAATCAC TCAGGGTCAA 3420 ··· TGCCAGCGCT TCGTTAATAC AGATGTAGGT GTTCCACAGG GTAGCCAGCA GCATCCTGCG 3480 • · »· · »·· »·· • ♦ • · »·· ► · • · ·· > · 21 ATGCAGATCC GGAACATAAT GGTGCAGGGC GCTGACTTCC GCGTTTCCAG ACTTTACGAA 3540 ACACGGAAAC CGAAGACCAT TCATGTTGTT GCTCAGGTCG CAGACGTTTT GCAGCAGCAG 3600 TCGCTTCACG TTCGCTCGCG TATCGGTGAT TCATTCTGCT AACCAGTAAG GCAACCCCGC 3660 CAGCCTAGCC GGGTCCTCAA CGACAGGAGC ACGATCATGC GCACCCGTGG CCAGGACCCA 3720 ACGCTGCCCG AGATGCGCCG CGTGCGGCTG CTGGAGATGG CGGACGCGAT GGATATGTTC 3780 TGCCAAGGGT TGGTTTGCGC ATTCACAGTT CTCCGCAAGA ATTGATTGGC TCCAATTCTT 3840 GGAGTGGTGA ATCCGTTAGC GAGGTGCCGC CGGCTTCCAT TCAGGTCGAG GTGGCCCGGC 3900 TCCATGCACC GCGACGCAAC GCGGGGAGGC AGACAAGGTA TAGGGCGGCG CCTACAATCC 3960 ATGCCAACCC GT7CCATGTG CTCGCCGAGG CGGCATAAAT CGCCGTGACG ATCAGCGGTC 4020 CAGTGATCGA AGTTAGGCTG GTAAGAGCCG CGAGCGATCC TTGAAGCTGT CCCTGATGGT 4080 CGTCATCTAC CTGCCTGGAC AGCATGGCCT GCAACGCGGG CATCCCGATG CCGCCGGAAG 4140 CGAGAAGAAT CATAATGGGG AAGGCCATCC AGCCTCGCGT CGCGAACGCC AGCAAGACGT 4200 AGCCCAGCGC GTCGGCCGCC ATGCCGGCGA TAATGGCCTG CTTCTCGCCG AAACGTTTGG 4260 TGGCGGGACC AGTGACGAAG GCTTGAGCGA GGGCGTGCAA GATTCCGAAT ACCGCAAGCG 4320 ACAGGCCGAT CATCGTCGCG CTCCAGCGAA AGCGGTCCTC GCCGAAAATG ACCCAGAGCG 4380 CTGCCGGCAC CTGTCCTACG AGTTGCATGA TAAAGAAGAC AGTCATAAGT GCGGCGACGA 4440 TAGTCATGCC CCGCGCCCAC CGGAAGGAGC TGACTGGGTT GAAGGCTCTC AAGGGCATCG 4500 GTCGAGATCC CGGTGCCTAA TGAGTGAGCT AACTTACATT AATTGCGTTG CGCTCACTGC 4560 .,. CCGCTTTCCA GTCGGGAAAC CTGTCGTGCC AGCTGCATTA ATGAATCGGC CAACGCGCGG 4620 • · *** GGAGAGGCGG TTTGCGTATT GGGCGCCAGG GTGGTTTTTC TTTTCACCAG TGAGACGGGC 4680 • · • · ***. AACAGCTGAT TGCCCTTCAC CGCCTGGCCC TGAGAGAGTT GCAGCAAGCG GTCCACGCTG 4740 • · . GTTTGCCCCA GCAGGCGAAA ATCCTGTTTG ATGGTGGTTA ACGGCGGGAT ATAACATGAG 4800 • · ,. CTGTCTTCGG TATCGTCGTA TCCCACTACC GAGATATCCG CACCAACGCG CAGCCCGGAC 4860 • · TCGGTAATGG CGCGCATTGC GCCCAGCGCC ATCTGATCGT TGGCAACCAG CATCGCAGTG 4920 • · · • · · * GGAACGATGC CCTCATTCAG CATTTGCATG GTTTGTTGAA AACCGGACAT GGCACTCCAG 4980 ... TCGCCTTCCC GTTCCGCTAT CGGCTGAATT TGATTGCGAG TGAGATATTT ATGCOAGCCA 5040 • · · • · · I.. GCCAGACGCA GACGCGCCGA GACAGAACTT AATGGGCCCG CTAACAGCGC GATTTGCTGG 5100 • · • · 7 TGACCCAATG CGACCAGATG CTCCACGCCC AGTCGCGTAC CGTCTTCATG GGAGAAAATA 5160 Φ · • · · :.: : ATACTGTTGA TGGGTGTCTG GTCAGAGACA TCAAGAAATA ACGCCGGAAC ATTAGTGCAG 5220 • · · • · • · • · · • · · • · · • · « • · • · · • ·· • · 22 .
GCAGCTTCCA CAGCAATGGC ATCCTGGTCA TCCAGCGGAT AGTTAATGAT CAGCCCACTG 5280 ACGCGTTGCG CGAGAAGATT GTGCACCGCC GCTTTACAGG CTTCGACGCC GCTTCGTTCT 5340 ACCATCGACA CCACCACGCT GGCACCCAGT TGATCGGCGC GAGATTTAAT CGCCGCGACA 5400 ATTTGCGACG GCGCGTGCAG GGCCAGACTG GAGGTGGCAA CGCCAATCAG CAACGACTGT 5450 TTGCCCGCCA GTTGTTGTGC CACGCGGTTG GGAATGTAAT TCAGCTCCGC CATCGCCGCT 5520 TCCACTTTTT CCCGCGTTTT CGCAGAAACG TGGCTGGCCT GGTTCACCAC GCGGGAAACG 5580 GTCTGATAAG AGACACCGGC ATACTCTGCG ACATCGTATA ACGTTACTGG rrrCACATTC 5640 ACCACCCTGA ATTGACTCTC TTCCGGGCGC TATCATGCCA TACCGCGAAA GGTTTTGCGC 5700 CATTCGATGG TGTCCGGGAT CTCGACGCTC TCCCTTATGC GACTCCTGCA TTAGGAAGCA 5760 GCCCAGTAGT AGGTTGAGGC CGTTGAGCAC CGCCGCCGCA AGGAATGGTG CATGCAAGGA 5820 GATGGCGCCC AACAG'i'CCCC CGGCCACGGG GCCTGCCACC ATACCCACGC CGAAACAAGC 5880 GCTCATGAGC CCGAAGTGGC GAGCCCGATC TTCCCCATCG GTGATGTCGG CGATATAGGC 5940 GCCAGCAACC GCACCTGTGG CGCCGGTGAT GCCGGCCACG ATGCGTCCGG CGTAGAGGAT 6000 CGAGATCCAT ATGACGTCGA CGCGTCTGCA GAAGCTTGCA TGCCAGCTTC TGGTTCGTCG 6060 GCTGGGTGAT GGCGTCGGTT TTGGCCGGCG GCGTCGGCGC GATCGCCAGC GCGAAGCAAC 6120 TGGCGTTCCT CGGCGAACAT AGCGGCATGG TGGCCTTCGG CTTCTTCCGC GACCAGGTGA 6180 AGGACATGCA CTGCGATGCG GACGTGATCC TGGCCCGGTG GGATGAAAAG GCGAACTCGC 6240 CGGTGGTCTA CCGCTGCCCG AAGGCGTACC TGCTCAACAG GTTCGCATCC GCGCCCTTCG 6300 TGCCCTGGCC GGACTACACC gagggggaaa GCGAGGATCT AGGTAGGGCG CTCGCAGCGG 6360 ···. CCCTGCGGGA CGCGAAAAGG TGAGAAAAGC CGGGCACTGC CCGGCTTTAT TTTTGCTGCT 6420 ·· · *··. GCGCGTTCCA GGCCGCCCAC ACTCGTTTGA CCTGGCTCGG GCTGCATCCG ACCAGCTTGG 6480 »·« ...: CCGTCTTGGC AATGCTCGAT CCGCCGGAGC GAAGCGTGAT GATGCGGTCG TGCATGCCGG 6540 • .
...: CGTCACGTTT GCGGCCGGTG TAGCGGCCGG CGGCCTTCGC CAACTGGACA CCCTGACGTT 6600 • · GACGCTCGCG CCGATCCTCG TAGTCGTCGC GGGCCATCTG CAAGGCGAGC TTCAAAAGCA 6660 ·· ...# TGTCCTGGAC GGATTCCAGA ACGATTTTCG CCACTCCGTT CGCCTCGGCG GCCAGCTCCG 6720 ♦ ACAGGTCCAC CACGCCAGGC ACGGCCAGCT TGGCCCCTTT GGCCCGGATC GACGCAACCA 6780 GGCGCTCGGC CTCGGCCAAC GGCAAGCGGC TGATGCGGTC GATCTTCTCC GCAACGACGA 6840 • · • · !.. CTTCACCAGG TTGCAGGTCC GCGATCATGC GCAGCAGCTC GGGCCGGTCG GCGCGTGCGC 6900 1' CGGACGCCTT CTCGCGGTAG ATGCCGGCGA CGTAGTACCC GGCGGCCCGC GTGGCCGCTA 6960 • · ! I CAAGGCTCTC CTGGCGTTCA AGATTCTGCT CGTCCGTACT GGCGCGCAGG TAGATGCGGG 7020 • · • · ♦ • · • · « · ♦ • ♦ ♦ ♦ 23 CGACCTTCAA CCTTCGTCCC TCCGGTTGTT GCTCTCGCGT CGCCATTTCC ACGGCTCGAC 7080 GGCGTGCGGA TCGGACCAGA GGCCGACGCG CTTGCCTCGC GCCTCCTGTT CGAGCCGCAG 7140 CATTTCAGGG TCGGCCGCGC GGCCGTGGAA GCGATAGGCC CACGCCATGC CCTGGTGAAC 7200 CATCGCGGCG TTGACGTTGC GCGGCTGCGG CGGCCGGCTG GCCAGCTCCA TGTTGACCCA 7260 CACGGTGCCC AGCGTGCGGC CGTAACGGTC GGTGTCCTTC TCGTCGACCA GGACGTGCCG 7320 GCGGAACACC ATGCCGGCCA GCGCCTGGCG CGCACGTTCG CCGAAGGCTT GCCGCTTTTC 7380 CGGCGCGTCA ATGTCCACCA GGCGCACGCG CACCGGCTGC TTGTCTACCA GCACGTCGAT 7440 GGTGTCGCCG TCGATGATGC GCACGACCTC GCCGCGCAGC TCGGCCCATG CCGGCGAGGC 7500 AACGACCAGG ACGGCCAGCG CGGCAGCGGC GCGCAGCATG GCGTAGCTTC GGCGCTTCAT 7560 GCGTGGCCCC ATTGCTGATG ATCGGGGTAC GCCAGGTGCA GCACTGCATC GAAATTGGCC 7620 TTGCAGTAGC CGTCCAGCGC CACCCGCGAG CCGAACGCCG GCGAAAGGTA CTCGACCAGG 7680 CCGGGCCGGT CGCGGACCTC GCGCCCCAGG ACGTGGATGC GCCGGCCGCG TGTGCCGTCG 7740 GGTCCAGGCA CGAAGGCCAG CGCCTCGATG TTGAAGTCGA TGGATAGAAG TTGTCGGTAG 7800 TGCTTGGCCG CCCTCATCGC GTCCCCCTTG GTCAAATTGG GTATACCCAT TTGGGCCTAG 7Θ60 TCTAGCCGGC ATGGCGCATT ACAGCAATAC GCAATTTA4A TGCGCCTAGC GCATTTTCCC 7920 GACCTTAATG CGCCTCGCGC TGTAGCCTCA CGCCCACATA TGTGCTAATG TGGTTACGTG 7980 TATTTTATGG AGGTTATCCA ATGAGCCGCC TGACAATCGA CATGACGGAC CAGCAGCACC 8040 AGAGCCTGAA AGCCCTGGCC GCCTTGCAGG GCAAGACCAT TAAGCAATAC GCCCTCGAAC 8100 ... GTCTGTTCCC CGGTGACGCT GATGCCGATC AGGCATGGCA GGAACTGAAA ACCATGCTGG 8160 *** GGAACCGCAT CAACGATGGG CTTGCCGGCA AGGTGTCCAC CAAGAGCGTC GGCGAAATTC 8220 ***. TTGATGAAGA ACTCAGCGGG GATCGCGCTT GACGGCCTAC ATCCTCACGG CTGAGGCCGA B280 • · . AGCCGATCTA CGCGGCATCA TCCGCTACAC GCGCCGGGAG TGGGGCGCGG CGCAGGTGCG Θ340 • · . CCGCTATATC GCTAAGCTGG AACAGGGCAT AGCCAGGCTT GCCGCCGGCG AAGGCCCGTT 8400 ♦♦ ... TAAGGACATG AGCGAACTCT TTCCCGCGCT GCGGATGGCC CGCTGCGAAC ACCACTACG'T 8460 • · • · TTTTTGCCTG CCGCGTGCGG GCGAACCCGC GTTGGTCGTC G 8501 • ·· • · • · II»
» · I
• · • · »· « »·· I·· • · • · >·· • · ·♦ 24 (2) SEKVENSSIN NRO 2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini {iii) HYPOTEETTINEN: ei (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 2:
Ala Glu Gly Glu Ile Thr Phe Thr Ala Leu Thr 5 10 • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · • · • · • · • · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · • · • · · • · • · · • · · • · · · • · · • · • · • · · • · · • · · • · · 1 · • · · • · · • ·
Claims (18)
1. Ilmentämisplasmidi, tunnettu siitä, että se käsittää kiinnostavan nukleiinihapposekvenssin T7-bakterio- 5 fagipromoottorin kontrollissa sekä stabiloivan alueen, joka käsittää kokonaisuudessaan tai osittain plasmidin RP4 par-alueen tai tämän johdannaisen ja että se lisäksi käsittää IacO-operaattorin ja laclq -geenin.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tun-10 nettu siitä, että T7-bakteriofagipromoottori on geenin 10 promoottori.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että stabiloiva alue käsittää osan plasmidin RP4 par-alueesta.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen plasmidi, tun nettu siitä, että stabiloiva alue koostuu fragmentista, joka on sekvenssin tunnusnumero 1 tähteiden 6 038 ja 8 499 välissä.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tun-20 nettu siitä, että operaattori IacO sijaitsee alavirtaan T7-bakteriofagipromoottorista ja ylävirtaan kiinnostavasta nukleiinihapposekvenssistä.
• · *···| 6. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen * 1 plasmidi, tunnettu siitä, että kiinnostava nukleiini- ’·1’· 25 happosekvenssi koodit taa farmaseuttisesti, maatalousravitse- • · • 1·· muksellisesti kiinnostavaa proteiinia tai proteiinia, joka on käyttökelpoinen biokatalyysissä.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen plasmidi, tun-nettu siitä, että kiinnostava nukleiinihapposekvenssi .···. 30 koodittaa proteiinia, joka valitaan entsyymeistä, verijoh- • · *·1 dannaisista, hormoneista, lymfokiineistä, kasvutekijöistä, • · · : hermojen välittäjäaineista tai niiden synteesiprekursoreis- • · · ·...· ta tai -entsyymeistä, troofisista tekijöistä, apolipoprote- . .1. iineista, dystrofiinista tai minidystrofiinista, CFTR-pro- • · · • · · .·. : 35 teiinista, kasvaimia suppressoivista geeneistä, geeneistä, • · · • · 26 jotka koodattavat koagulaatioon liittyviä tekijöitä, tai geeneistä, jotka osallistuvat DNA:n korjaamiseen.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että kiinnostava nukleiinihapposekvenssi 5 koodittaa fibroblastien hapanta kasvutekijää (aFGF).
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että kiinnostava nukleiinihapposekvenssi koodittaa aFGF(154):ää.
10. Plasmidi pXL2435, tunnettu siitä, että sillä 10 on sekvenssitunnusnumeron 1 esittämä sekvenssi.
11. Menetelmä yhdistelmä-DNA-proteiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään bakteeria, joka sisältää : - jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukaisen plas-15 midin, joka käsittää mainittua proteiinia koodittavan nuk- leiinihapposekvenssin, ja - T7-bakteriofagin RNA-polymeraasigeenin, olosuhteissa, jotka mahdollistavat nukleiinihappo- sekvenssin ilmentymisen.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tun- nettu siitä, että T7-bakteriofagin RNA-polymeraasigeeni • · on sijoitettu indusoitavan promoottorin kontrolliin. • · ’···1 2
13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen menetel- ** mä, tunnettu siitä, että T7-bakteriofagin RNA-polyme- ’3’ 2 5 raasigeeni on integroitu käytetyn bakteerin genomiin. ·· • 1··
14. Jonkin patenttivaatimuksen 11 - 13 mukainen me- netelmä, tunnettu siitä, että bakteeri valitaan co-li -kannoista.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tun- • · · .···. 30 nettu siitä, että bakteeri on E. coli -kanta BL21,DE3. • 1 - ~~ ’·1
16. Patenttivaatimusten 11 - 15 mukainen menetelmä • · ϊ yhdistelmä-DNA-aFGF:n tuottamiseksi. ··· • · • · ··♦ # · · • · · • · · · • · · 2 • · · 3 • · 27
17. Menetelmä yhdistelmä-DNA-aFGF:n valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään bakteeria, joka sisältää plasmidin pXL2435, jolla on sekvenssitunnusnumero 1 mukainen sekvenssi, ja T7-bakteriofagin RNA-polymeraasigee- 5 nin, olosuhteissa, jotka mahdollistavat nukleiinihapposek-venssin ilmentymisen, ja otetaan talteen tuotettu aFGF.
18. Bakteeri, joka on transformoitu jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukaisella plasmidilla. «·· • · » · ♦ ·· «·· » · ♦ ·· • · φ · »· ► · • · » • ♦· i ♦ · » · · • ·· » · · » · · • · 1 I · I · • · · » · » · · > · · »· · · • · · ► · » · • · · » · · » · · • · · · » · · • · • · 28
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9411049 | 1994-09-16 | ||
| FR9411049A FR2724665B1 (fr) | 1994-09-16 | 1994-09-16 | Procede de production de proteines recombinantes, plasmides et cellules modifiees |
| PCT/FR1995/001178 WO1996008572A1 (fr) | 1994-09-16 | 1995-09-14 | Procede de production de proteines recombinantes, plasmides et cellules modifiees |
| FR9501178 | 1995-09-14 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI971100A0 FI971100A0 (fi) | 1997-03-14 |
| FI971100A FI971100A (fi) | 1997-03-14 |
| FI120238B true FI120238B (fi) | 2009-08-14 |
Family
ID=9466987
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI971100A FI120238B (fi) | 1994-09-16 | 1997-03-14 | Menetelmä yhdistelmä-DNA-proteiinien, plasmidien ja modifioitujen solujen tuottamiseksi |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6143518A (fi) |
| EP (1) | EP0781341B1 (fi) |
| JP (1) | JP3696247B2 (fi) |
| KR (1) | KR100391752B1 (fi) |
| AT (1) | ATE405656T1 (fi) |
| AU (1) | AU708080B2 (fi) |
| CA (1) | CA2197804C (fi) |
| DE (1) | DE69535815D1 (fi) |
| DK (1) | DK0781341T3 (fi) |
| ES (1) | ES2313721T3 (fi) |
| FI (1) | FI120238B (fi) |
| FR (1) | FR2724665B1 (fi) |
| IL (1) | IL115308A (fi) |
| MX (1) | MX9701614A (fi) |
| NO (1) | NO320374B1 (fi) |
| PT (1) | PT781341E (fi) |
| TW (1) | TW517086B (fi) |
| WO (1) | WO1996008572A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA957750B (fi) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9618001D0 (en) | 1996-08-29 | 1996-10-09 | Nyfotek As | Novel expression vectors |
| US20060281681A1 (en) | 1997-05-28 | 2006-12-14 | Pilon Aprile L | Methods and compositions for the reduction of neutrophil influx and for the treatment of bronchpulmonary dysplasia, respiratory distress syndrome, chronic lung disease, pulmonary fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease |
| EP0998945A1 (en) * | 1998-09-30 | 2000-05-10 | Transgene S.A. | Use of magnesium (Mg2+) for the enhancement of gene delivery in gene therapy |
| EP1022337B1 (en) * | 1999-01-20 | 2006-07-26 | Bayer HealthCare AG | Plasmids, their construction and their use in the manufacture of interleukin-4 and interleukin-4 muteins |
| EP1022339B1 (en) | 1999-01-20 | 2006-02-01 | Bayer HealthCare AG | Plasmids, their construction and their use in the manufacture of interleukin-4 and interleukin-4 muteins |
| BR9917526B1 (pt) * | 1999-10-19 | 2013-09-24 | construção de expressão para transformar um hospedeiro unicelular, célula de hospedeiro unicelular bem como método de produzir endopeptidase de lisostafina madura livre de preprolisostafina e prolisostafina | |
| JP5650368B2 (ja) * | 2005-10-27 | 2015-01-07 | 株式会社カネカ | 新規プラスミドベクター及びプラスミドを安定に保持する形質転換体 |
| US9051589B2 (en) * | 2005-10-27 | 2015-06-09 | Kaneka Corporation | Plasmid vector and transformant stably retaining plasmid |
| KR20110014199A (ko) | 2008-05-13 | 2011-02-10 | 클라라산스, 인크. | 비강 비염 치료용 재조합 인간 ｃｃ10 및 이의 조성물 |
| US9168285B2 (en) | 2009-10-15 | 2015-10-27 | Therabron Therapeutics, Inc. | Recombinant human CC10 protein for treatment of influenza and ebola |
| WO2011047065A1 (en) | 2009-10-15 | 2011-04-21 | Clarassance, Inc. | Recombinant human cc10 protein for treatment of influenza |
| BR102014014502B1 (pt) * | 2014-06-13 | 2020-09-15 | Ouro Fino Saúde Animal Ltda | Vetor de expressão |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK410783D0 (da) * | 1982-09-16 | 1983-09-09 | Benzon A Salfred | Fremgangsmade til stabilisering af plasmider |
| DE3247922A1 (de) * | 1982-12-24 | 1984-06-28 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten |
| NZ220917A (en) * | 1986-07-11 | 1991-05-28 | Merck & Co Inc | Human and bovine acidic fibroblast growth factor vectors, hosts and compositions |
| US5175147A (en) * | 1988-08-19 | 1992-12-29 | Takeda Chemical Industries, Ltd | Acid-resistant fgf composition and method of treating ulcerating diseases of the gastrointestinal tract |
| FR2642086B1 (fr) * | 1989-01-26 | 1992-09-04 | Sanofi Sa | Gene recombinant codant pour un facteur basique de croissance des fibroblastes et ledit facteur |
| EP0406738A3 (en) * | 1989-07-03 | 1991-08-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Production of acidic fgf protein |
| FR2661188B1 (fr) * | 1990-04-24 | 1994-07-22 | Rhone Poulenc Sante | Nouveaux vecteurs de clonage et/ou d'expression, procede de preparation et leur utilisation. |
-
1994
- 1994-09-16 FR FR9411049A patent/FR2724665B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-09-14 JP JP50995996A patent/JP3696247B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-14 DK DK95931242T patent/DK0781341T3/da active
- 1995-09-14 CA CA2197804A patent/CA2197804C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-14 EP EP95931242A patent/EP0781341B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-14 ES ES95931242T patent/ES2313721T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-14 PT PT95931242T patent/PT781341E/pt unknown
- 1995-09-14 ZA ZA957750A patent/ZA957750B/xx unknown
- 1995-09-14 AU AU34754/95A patent/AU708080B2/en not_active Expired
- 1995-09-14 US US08/793,900 patent/US6143518A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-14 KR KR1019970701694A patent/KR100391752B1/ko active IP Right Grant
- 1995-09-14 IL IL115308A patent/IL115308A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-09-14 AT AT95931242T patent/ATE405656T1/de active
- 1995-09-14 WO PCT/FR1995/001178 patent/WO1996008572A1/fr active IP Right Grant
- 1995-09-14 MX MX9701614A patent/MX9701614A/es unknown
- 1995-09-14 DE DE69535815T patent/DE69535815D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-16 TW TW084109710A patent/TW517086B/zh not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-03-12 NO NO19971139A patent/NO320374B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-03-14 FI FI971100A patent/FI120238B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL115308A0 (en) | 1995-12-31 |
| PT781341E (pt) | 2008-11-20 |
| ZA957750B (en) | 1996-04-24 |
| IL115308A (en) | 2009-07-20 |
| ES2313721T3 (es) | 2009-03-01 |
| KR100391752B1 (ko) | 2003-10-22 |
| FI971100A0 (fi) | 1997-03-14 |
| CA2197804C (fr) | 2010-11-16 |
| EP0781341A1 (fr) | 1997-07-02 |
| FR2724665A1 (fr) | 1996-03-22 |
| DE69535815D1 (de) | 2008-10-02 |
| NO971139D0 (no) | 1997-03-12 |
| WO1996008572A1 (fr) | 1996-03-21 |
| EP0781341B1 (fr) | 2008-08-20 |
| NO971139L (no) | 1997-03-12 |
| FR2724665B1 (fr) | 1996-12-20 |
| AU708080B2 (en) | 1999-07-29 |
| NO320374B1 (no) | 2005-11-28 |
| TW517086B (en) | 2003-01-11 |
| AU3475495A (en) | 1996-03-29 |
| US6143518A (en) | 2000-11-07 |
| ATE405656T1 (de) | 2008-09-15 |
| DK0781341T3 (da) | 2009-01-05 |
| FI971100A (fi) | 1997-03-14 |
| JPH10505746A (ja) | 1998-06-09 |
| MX9701614A (es) | 1997-06-28 |
| JP3696247B2 (ja) | 2005-09-14 |
| CA2197804A1 (fr) | 1996-03-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6291245B1 (en) | Host-vector system | |
| FI120238B (fi) | Menetelmä yhdistelmä-DNA-proteiinien, plasmidien ja modifioitujen solujen tuottamiseksi | |
| Winans | Transcriptional induction of an Agrobacterium regulatory gene at tandem promoters by plant-released phenolic compounds, phosphate starvation, and acidic growth media | |
| Plamann et al. | Nucleotide sequence of the Salmonella typhimurium metR gene and the metR-metE control region | |
| CA2294760C (en) | Vector for expression of heterologous protein and methods for extracting recombinant protein and for purifying isolated recombinant insulin | |
| MXPA97001614A (en) | Procedure for the production of recombinant proteins, plasmids and cells modifies | |
| KR19990044525A (ko) | 플라스미드의 안정화 | |
| Zimmer et al. | Temperature tolerance of hydrogenase expression in Alcaligenes eutrophus is conferred by a single amino acid exchange in the transcriptional activator HoxA | |
| CA2176236C (en) | Tyrosinase-activator protein fusion enzyme | |
| KR102282778B1 (ko) | 재조합 미생물 및 이의 사용 방법 | |
| US20130189757A1 (en) | Affinity purification of rna under native conditions based on the lambda boxb/n peptide interaction | |
| CN112513066A (zh) | Crm197蛋白质表达 | |
| WO2011086447A2 (en) | Fermentation process for the preparation of recombinant heterologous proteins | |
| CN108410901B (zh) | 无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a及制备方法 | |
| EP0141362A2 (en) | Novel plasmid vector | |
| US11970700B1 (en) | Genetic element E3 for enhanced intracellular expression of target protein encoded in RNA therapeutics | |
| US8628954B2 (en) | Expression cassette, use of the expression cassette, vector, host cell, a method for producing a polypeptide | |
| ES2257853T3 (es) | Construcciones para la expresion controlada de genes recombinantes en celulas procariotas. | |
| Brana et al. | Stability of the hybrid plasmid pIM138 and its curing by some eliminating agents | |
| Zouine et al. | Overproduction, purification and characterization of the HPB12-L24 ribosomal protein of Bacillus subtilis | |
| CN116406370A (zh) | 肽标签和包含其的附加有标签的蛋白 | |
| CN110511951A (zh) | Plb蛋白在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用 | |
| MXPA00010057A (en) | Novel constructs for controlled expression of recombinant proteins in prokaryotic cells | |
| Srinivas | The interaction of multiple cis and trans acting factors affecting the expression of the growth rate regulatedgnd gene of Escherichia coli | |
| JP2003284561A (ja) | プラスミド欠失用組換えプラスミド、アグロバクテリア内のプラスミドを除去する方法、及び、これより得られるプラスミドを欠失した微生物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: AVENTIS PHARMA S.A. |
|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 120238 Country of ref document: FI |
|
| MM | Patent lapsed |