NO320374B1 - Ekspresjonsplasmid og fremgangsmate for fremstilling av et rekombinant protein, samt bakterie - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av rekombinante proteiner hos bakterier. Oppfinnelsen angår mer spesielt en ny fremgangsmåte som tillater en øket produksjon av rekombinante proteiner hos bakterier idet man tar i bruk et spesielt stabilt og effektivt ekspresjonssystem omfattende en promotor av bakteriofagen T7 og en stabiliserings-region. Oppfinnelsen angår likeledes plasmider som benyttes ved denne fremgangsmåte og de således produserte proteiner.

Bakteriene og særlig E. coli kan benyttes for å produsere proteiner av diverse opprinnelser på samme måte som prokaryoter og eukaryoter. Særlig kan humanproteiner produseres hos E. coli. For å gjøre dette blir stmkturgenet eller cDNA av genet som koder for det angjeldende protein plassert bak de egnede ekspresjonssignaler (promotor og fikseringssetet for ribosomene), erkjent av E. coli's ekspresjonsmaskineri. Det mest effektive system som benyttes hos E. coli er det system som beskrives av Studier (Studier et al., 1990). Dette system består i anvendelse av promotor av fagen T7 som spesifikt gjenkjennes av RNA-polymerase av den samme bakteriofag (E. coli har per se ingen promotor som gjenkjennes av den samme polymerase). I dette ekspresjonssystem er det en induksjon, for eksempel til IPTG, av ekspresjonen av genet av RNA-polymerasen av fagen T7 (idet denne er anbragt under kontroll av en induktibel promotor som PlacUV5 av E. coli). Fra denne induksjon oppnår man ekspresjon av genet som er plassert under kontroll av promotoren av bakteriofagen T7 som erkjennes av polymerasen. Da polymerasen ikke erkjenner annet enn promotoren oppstrøms genet som skal uttrykkes, uttrykkes dette generelt i meget stor mengde (over noen prosent av de totale bakterielle proteiner). Tallrike publikasjoner beskriver i dag anvendelsen av dette system som til å begynne med ble beskrevet av Studier (Studier et al., 1990).

Som beskrevet ovenfor blir bakterier og særlig E. coli benyttet for produksjon av humanproteiner av farmasøytisk interesse. Da disse proteiner deretter skal benyttes i diverse terapier, er det hensiktsmessig å fremstille dem under hensyntagen til reglene "Bonne Pratique de Production" eller BPL. For å gjøre dette er det uomgjengelig å ha et produksjonssystem som er reproduserbart og som sikrer oppnåelsen av et produkt med definert høy kvalitet og med meget høy renhet. Et av de viktige aspekter ved en produk-sjonsprosess for et protein av farmasøytisk interesse ligger i stammen som tillater produksjon av proteinet. Således må denne stamme sikre en produksjonsmåte som er reproduserbar både hva kvalitet og kvantitet angår.

Hva det kvalitative nivå angår, er det hensiktsmessig å fremstille et protein med en total homogenitet, det vil si med en primærsekvens som er identisk med den til det naturlige protein. Hvis det i en bakteriecelle under fermenteringen produseres en punktmutasjon som modifiserer den kodede sekvens for proteinet som skal uttrykkes, resulterer dette i produksjonen av et modifisert protein blandet med proteinet med villsekvens. I mennesker kan dette modifiserte protein medføre en immunreaksjon som kan være meget ugunstig for behandlingen eller, under en senere behandling, denne gang medfører en alvorlig immunreaksjon.

Når det gjelder det kvantitative nivå, er det sagt at prosessen må være reproduserbar. Dette utgjør et vesentlig trekk ved kvaliteten for det oppnådde produkt. Videre kreves det at det hos de forskjellige produksjonlotter befinner seg de samme mengder av syntetisert protein pr. biomasseenhet etter samme tidsenhet under anvendelse av de samme dyrkings- og vekstbetingelser. Et meget vesentlig aspekt ved denne reproduserbarhet når det gjelder produksjonen av proteinet ligger i nærværet av plasmidet som bærer ekspresjonskassetten i bakteriecellene. En fermenteringsprosess er desto bedre styrt når alle cellene har plasmidet ved slutten av dyrkingen (før og etter produksjon av proteinet). For å holde plasmidet i bakteriene tilsetter man generelt til dyrkingsmediet et antibiotikum som er selektivt for nærværet av plasmidet. Dette kan medføre forskjellige problemer: omkostningene i forbindelse med dette antibiotikum ved preparering av mediet i fermentoren; da dette antibiotikum ikke kan steriliseres ved autoklavering bør det tilsettes ekstemporalt til dyrkingsmediet; dette antibiotikum kan ikke være stabilt og danne toksiske transformeringsprodukter hos mennesker eller hos visse pasienter og føre til uønskede bivirkninger; antibiotikumet kan heller ikke i seg selv være toksiske hos mennesker eller hos visse pasienter føre til uønskede bivirkninger. I de sistnevnte to tilfeller må det påvises at i det rensede produkt, er spormengden av toksiske produkter som tilsvarer enten antibiotikumet eller derav deriverte produkter, er ved de administrerte mengder under risikonivåene for sekundære eller toksiske virkninger. Dette medfører kompliserte og kostbare prøver.

Foreliggende oppfinnelse tillater å bøte på disse problemer. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et særlig effektivt ekspresjonssystem i hvilket antibiotikumet ikke er nødvendig for å holde på plasmidet under bakteriegenerasj onene som forløper i fermentoren. Oppfinnelsen ligger særlig i konstruksjonen av et plasmidisk ekspresjonssystem i hvilket ekspresjonen skjer ved hjelp av en promotor av bakteriofag T7 og omfatter i tillegg en stabiliserende region. Systemet ifølge oppfinnelsen er særlig fordelaktig fordi, tvert imot det som observeres for systemet ifølge Studier et al., tillater å holde plasmidene i alle bakterieceller etter induksjon av ekspresjonen av proteinet som skal uttrykkes, under dyrkingsbetingelser der det ikke er antibiotika, det vil si uten seleksjonstrykk. Plasmidene ifølge Studier (Studier et al., 1990) blir etter induksjon av ekspresjonen kun gjenfunnet i en meget liten fraksjon av cellene. Det er klart at systemet ifølge oppfinnelsen sterkt stabiliserer plasmidene, noe som øker produksjonsnivået for de rekombinante proteiner og prosessen reproduserbarhet. Den stabiliserende region som benyttes for konstruksjonen av plasmidene ifølge oppfinnelsen er mer spesielt avledet av fragmentet par av plasmidet RP4.

En hovedgjenstand for foreliggende oppfinnelse ligger således i et ekspresjonsplasmid omfattende en nukleinsyresekvens av interesse under kontroll av en promotor av bakteriofagen T7 og et stabiliserende område omfattende hele eller en del av området par av plasmidet RP4 eller et derivat derav.

Fortrinnsvis er promotoren av bakteriofagen T7 som benyttes i plasmidene ifølge oppfinnelsen promotoren av genet 10.

Som antydet ovenfor er stabiliseirngsområdet som benyttes i oppfinnelsens plasmider

avledet fra fragmentet par av plasmidet RP4 (Gerlitz et al., 1990). Dette fragment bærer forskjellige funksjoner (særlig 5 gener kalt par A, parB, parC, parD og parE) og særlig et protein som kan ha et spesifikt rekombinaseaktivitetssete som sannsynligvis tillater å løse plasmidiske dimerer (Eberl et al., 1994). Dette par-fragment kan isoleres fra plasmid RP4 og klones på ekspresjonsplasmidene ifølge oppfinnelsen som beskrevet i eksemplene. Videre kan fragmentet modifiseres før eller etter innføringen i plasmidene ifølge oppfinnelsen. Således kan det stabiliserende området av plasmidene ifølge oppfinnelsen helt eller delvis bestå av par-området av plasmidet RP4 eller et derivat derav.

Særlig kan det stabiliserende området av plasmidene bestå av innskuddet Pstl av plasmidet pTUG3 eller under fragmentene Sphl-Sphl-SphI av pOH23 eller Sphl-Sphl-Clal av pOH41 eller Sphl-Sphl-BamHI av pGMA28 eller Sphl-Sphl-BamHI av pGMA27 som er beskrevet av Gerlitz et al. i 1990, eller ethvert subfragment av innskuddet Pstl av pTUG3 inneholdende i det minste innskudd Sphl-Sphl-BamHI av pGMA27. Mens innskuddet Pstl av pTUG3 inneholder genene parCBA-parDE og de flankerende områder inneholder innskuddene i pGM27 eller pGM28 ikke annet enn genene parCBA-parDE' og det flankerende 5'-området. Det stabiliserende området kan likeledes bestå av genene parDE eller av genet parD og dets promotorområde eller en annen promotor som allerede beskrevet av Roberts et al. i 1994. Dette området kan oppnås fra fragmentet Styl-Clal inneholdt i plasmidet pTUG3. Det stabiliserende området kan også bestå av en hvilken som kombinasjon av to, tre eller fire gener par inneholdt i plasmidet pTUG3, for eksempel parA-parD eller parB-parD eller par AC-parD eller parBA-parDE med deres promotorområde eller en annen promotor.

Uttrykket derivat av par-området omfatter et hvilket som helst fragment som oppnås ved genetisk og/eller kjemisk modifisering av par-området og i stand til å realisere stabile plasmidet ifølge oppfinnelsen. Særlig kan disse derivater oppnås ved delesjoner, mutasjoner, addisjoner, spaltinger, ligasjoner og så videre, ved par-området av plasmidet RP4 i henhold til velkjente teknikker. Deretter kan funksjonaliteten for derivatene prøves som beskrevet i eksemplene (se særlig eksempel 2).

Fortrinnsvis omfatter, i plasmidene ifølge oppfinnelsen, det stabiliserende området en del av par-området av plasmidet RP4.1 en særlig utførelsesform består det stabiliserende området av fragmentet som ligger mellom 6038 og 8499 i sekvensen SEQ ID nr. 1.

Plasmidene ifølge oppfinnelsen omfatter videre operatoren LacO og genet LacW. Det er fastslått at på tross av nærværet en promotor av bakteriofagen T7 som er spesifikk for en polymerase som ikke er til stede hos E. coli, skjer det en basal ekspresjon av nukleinsyresekvensen av interesse uten induktor. Denne restekspresjon kan indusere en viss reduksjon av plasmidets stabilitet. Nærværet i plasmidene ifølge oppfinnelsen av operatoren LacO og genet LacK tillater med fordel å oppnå en mer regulert ekspresjon av nukleinsyresekvensen og særlig å inhibere enhver ekspresjon i fravær av induktor. Plasmidene som har disse elementer har således en øket stabilitet og øket ekspresjonskontroll. For å oppnå den tilsiktede effekt blir operatoren lacO med fordel plassert nedstrøms promotoren av bakteriofagen T7 og oppstrøms nukleinsyresekvensen av interesse som angitt i eksemplene. Genet lacll skytes inn i plasmidet, fortrinnsvis med sin egen promotor, i et område som ikke er essensielt for plasmidets tilsiktede egenskaper. Således blir genet fortrinnsvis innskutt utenfor par-området og ekspresjonskassetten for nukleinsyresekvensen av interesse. Sekvensene av denne operator og genet lacll er gitt i sekvensen SEQ ID nr. 1. Det skal være klart at disse elementer kan erstattes med homologe sekvenser eller sekvenser som har ekvivalente funksjoner.

I en særlig foretrukket utførelsesform omfatter plasmidene ifølge oppfinnelsen likeledes en transkripsjonsterminator, anordnet nedstrøms nukleinsyresekvensen av interesse. Fortrinnsvis er den benyttede transkripsjonsterrninator den til genet av bakteriofagen T7 hvis promotor benyttes. Fortrinnsvis dreier det seg om terminatoren T(j) av bakteriofagen T7.

Nukleinsyresekvensen av interesse som er til stede i plasmidene ifølge oppfinnelsen kan være en hvilken som helst sekvens som koder for et farmasøytisk eller agroalimentært protein av interesse eller kan benyttes for biokatalyse. Det kan dreie seg om et strukturgen, en komplementær DNA-sekvens, en syntetisk eller semi-syntetisk sekvens, og så videre.

Fortrinnsvis koder nukleinsyresekvensen for et farmasøytisk protein av interesse, for eksempel valgt blant enzymer, blodderivater, hormoner, lymfokiner (interleukiner, interferoner, TNF, og så videre), vekstfaktorer, neurotransmittorer eller deres forløpere eller synteseenzymer, trofiske faktorer: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofin, og så videre; apolipoproteinene: ApoAI, ApoAIV, ApoE, og så videre, dystrofln eller et minidystrofin, proteinet CFTR forbundet med mukoviskidose, tumorsuppressorgenene: p53, Rb, Rapi A, DCC, k-rev, og så videre, genene som koder for faktorer implikert i koaguleringen: faktorene VII, VIE, DC, genene som intervenerer i fordelingen av DNA, og så videre.

I en særlig utførelsesform av oppfinnelsen koder nukleinsyresekvensen av interesse for en vekstfaktor for sure fibroblaster (aFGF). cDNA til den native form av genet av humane aFGF er identifisert, sekvensert og klonet (Jaye et al., 1986 og 1987). Dette cDNA kan kode for forskjellige former av aFGF i henhold til nærværet av delesjoner i den N-terminale delen og særlig formene som omfatter 154,140 eller også 134 aminosyrer. Videre kan det også fremstilles naturlige eller kunstige varianter som resulterer fra modifikasjoner på grunn av delesjon, mutasjon og/eller addisjon av ett eller flere basepar i sekvensen av det native (for eksempel en N-terminal metionin). I en helt spesiell utførelsesform av oppfinnelsen koder nukleinsyresekvensen av interesse for aFGF(154). Som spesielt eksempel kan man nevne plasmidet pXL2435 som oppviser sekvensen SEQ ED nr. 1.

En ytterligere gjenstand for oppfinnelsen er en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante proteiner. Mer spesielt omfatter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen i å dyrke en bakterie inneholdende: et plasmid som beskrevet ovenfor som bærer en nukleinsyresekvens som koder for proteinet, og

genet av RNA-polymerasen av bakteriofagen T7,

under betingelser som tillater ekspresjon av nukleinsyresekvensen.

Som antydet tidligere ligger det vesentlige ved systemet i anvendelsen av en promotor av bakteriofagen T7, erkjent spesifikt av RNA-polymerasen av den samme bakteriofag T7. Den benyttede bakterie kan således i tillegg til plasmidet ifølge oppfinnelsen omfatte en kassett som tillater ekspresjon av RNA-polymerasen av bakteriofagen T7. Denne kassett kan enten være integrert i genomet av den benyttede bakterie (stamme E. coli BL21,DE3), eller være båret av et andre plasmid eller en fag, eller også være til stede på plasmidet ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis er, i ekspresjonskassetten, genet som koder for RNA-polymerasen av bakteriofagen T7 plassert under kontroll av en induktibel promotor som promotoren lac, trp eller recA. Dette tillater på kontrollert måte å indusere produksjonen av RNA-polymerase i cellen og således åkontrollere ekspresjonen av nukleinsyresekvensen av interesse, plassert under kontroll av promotoren som er spesifikk for denne RNA-polymerase. Fortrinnsvis er den induktible promotor som kontrollerer ekspresjonen av RNA-polymerasen av bakteriofagen T7 promotoren PlacUV5 av E. coli som induseres spesifikt i nærvær av D?TG.

Som antydet i større detalj i eksemplene tillater fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen således en produksjon av økede mengder og på reproduserbar måte av ikke-modifiserte proteiner. Denne fremgangsmåte tillater således en industriell produksjon av rekombinante proteiner av farmasøytisk kvalitet.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er særlig egnet for fremstilling av vekstfaktorer for rekombinante fibroblaster (særlig aFGF, bFGF). Således er en særlig gjenstand for oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant aFGF i henhold til hvilken man dyrker en bakterie inneholdende plasmidet pXL2435 og genet av RNA-polymerase av bakteriofagen T7 under betingelser som tillater ekspresjon av nukleinsyresekvensen og der man gjenvinner fremstilt aFGF.

Foreliggende oppfinnelse omfatter således et ekspresjonsplasmid, kjennetegnet ved det omfatter en nukleinsyresekvens av interesse under kontroll av en promotor av bakteriofagen T7 og et stabiliserende område omfattende hele eller en del av området par av plasmidet RP4 eller et derivat derav og i tillegg omfatter operatoren lacO og genet lacR

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en fremgangsmåte for fremstilling av et

rekombinant protein, kjennetegnet ved at man dyrker en bakterie inneholdende:

et plasmid i henhold til ett av kravene 1 til 10 med en nuklemsyresekvens som

koder for proteinet, og

polymerase-RNA-genet av bakteriofagen T7,

under betingelser som tillater ekspresjon av nukleinsyresekvensen.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant aFGF, kjennetegnet ved at man dyrker en bakterie inneholdende plasmidet pXL2435 ifølge SEQ ID NO: 1 og polymerase-RNA-genet av bakteriofagen T7 under betingelser som tillater ekspresjon av nukleinsyresekvensen, og gjenvinner aFGF-produktet.

Oppfinnelsen skal beskrives mer fullstendig ved hjelp av de følgende illustrerende eksempler.

Benyttede forkortelser:

aFGF: sur vekstfaktor for fibroblaster

bp: bas ep ar

DO: optisk densitet

E. coli: Escherichia coli

D?TG: isopropyltio-B-D-galaktosid

kb: kilobaser

kDa: kilodalton

Km: kanamycin

LB: Luria-Bertani-medium

PAGE-SDS: elektroforese med gel inneholdende akrylamid, NjN-metylenbisakrylamid

og natriumdodecylsulfat.

T7: bakteriofag T7

Figurforklaring:

Figur 1: Konstruksjon av plasmidet pXL2435.

A - Konstruksjonsskjema: Fragmentene Accl-Ndel på 3,2 kb av pETl la og 2,8 kb av pXL2283 ligeres for å gi plasmidet pXL2434; plasmidet pXL2434, digerert med Bglll, ligeres med fragmentet BamHI på 2,4 kb av pXL2433 for å gi pXL2435.

B - Kart over plasmid pXL2435: aFGF: gen som koder for aFGF; Ampr: gen for ampicillinresistens; Kmr: resistensgen mot kanamycin; lacN: gen som koder for en øket syntese av repressoren Lac; ori: replikasjonsopprinnelse for ColEl; parDE'parCBA: gener for locus par av RP4; pT7: promotoren <plO av T7 og operatoren lacO; T(j>: terminatoren T<|> av T7. Pilene indikerer genenes transkripsjonsretning. Restriksjons-enzymsetene som indikerer er de som benyttes under kloningen. Tall i parenteser tilsvarer posisjonen i basepar på sekvensen SEQ JD nr. 1.

Figur 2: Visualisering av proteinet aFGF, produsert av E. coli BL21, DE3 i fravær av antibiotika og i nærvær av plasmid pXL2283 eller pXL2434 eller pXL2435 etter induksjon med D?TG. De totale celleekstrakter deponeres på gelen. M: markør for molekylarvektene angitt i kDa, pilen antyder molekylvekten for aFGF.

Sekvens SED ID nr. 1: Nukleotidsekvensen av pXL2435 på 8501 bp. Posisjon 1 på sekvensen tilsvarer kuttingssetet til Bgin av pETl la. Genet aFGF befinner seg mellom posisjonene 108 og 575, locusen for par ligger mellom posisjonene 6038 og 8499, det vil si parE' fra 8248 til 8499, parD fra 8001 til 8252, parC fra 7850 til 7557, parB fra 7560 til 7027 og parA fra 7066 til 6407; promotoren <|>10 av T7 mellom posisjonene 20 og 36, lacO mellom posisjonene 39 og 63, terminatoren T(|> av T7 mellom posisjonene 586 og 708 og genet lacW mellom posisjonene 5636 og 4554.

Generelle teknikker for kloning, molekylærbiologi og biokjemi.

De klassiske metoder for molekylærbiologien som sentrifugering av plasmidisk DNA i cesiumkloird-etidiumbromid-gradient, fermentering med restriksjonsenzymer, elektroforese på gel, elektroeluering av DNA-fragmentene fra agarosegeler, transformering i E. coli, precipitering av nukleinsyre, og så videre, er alle beskrevet i litteraturen (Sambrook et al., 1989). Restriksjonsenzymene leveres av New-Eng Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) eller Amersham Ltd. (Amersham).

For ligaturene blir DNA-fragmentene separert i henhold til størrelse på 0,7% agarosegel, renset ved elektroeluering, ekstrahert med fenol, precipitert med etanol og deretter inkubert i en buffer Tris-HCl, pH 7,4, 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, i nærvær av DNA-ligase av fagen T4 (Biolabs). Ligerte DNA eller rene plasmidiske DNA benyttes for å transformere den kompetentgjorte stamme: E. coli BL21, DE3 [F" ompT hsdSB(rB-mB-) gal dem (DE3)] (Studier et al., 1990) og E. coli TG1 [A(lac proA,B), supE, thi, hsdD5/ F' traD36, proA<+>, B<+>, lacW, lacZAM15]

(Gibson, 1984). De plasmidiske DNA renses i henhold til den alkaliske lyseringsteknikk som er beskrevet av Sambrook et al. i 1989.

Kulturmediet LB benyttes for den bakteriologiske del (Sambrook et al., 1989). Fortynningene av bakteriesuspensjonene skaleres deretter på LB-medium fl asker som, hvis nødvendig, er supplert med 50 mg/l kanamycin.

Den protokoll som er beskrevet av Studier et al. i 1990 benyttes for å fremstille aFGF ved hjelp av stammen BL21, DE3 som bærer et ekspresjonsplasmid av aFGF (pXL2283 eller pXL2434 eller pXL2435 som beskrevet i eksempel 1).

Produksjonen av aFGF kvantifiseres på totale celleekstrakter. Etter lysering av bakteriene blir prøvene avsatt på en 15 %-ig SDS-PAGE-gel som, etter elektroforese, farves med Coomassie-blått (Denéfle et al., 1987). Med prøvene fra stammene som produserer aFGF observeres det et bånd ved en tilsynelatende molekylvekt på 16 kDa. Det gjennomføres en semi-tørr overføring på nitrocellulosemembranen (Sambrook et al., 1989), membranet behandles i henhold til protokollen ifølge Vectastain-kitt (Biosys SA, Frankrike) for å tillate en detektering av immunologisk aFGF (antistoff anti-aFGF bovin oppnådd i kanin, markedsføres av Sigma, Frankrike; og anti-IgG av kanin) på kolorimetrisk måte ved hjelp av kompleks, biotinylert avidinperoksydase. En annen semi-tørr overføring på Pro-Blott-membran gjennomføres (Masudaira, 1987), membranet farves med Coomassie-blått og molekylvektssignalet som opptrer ved 16 kDa skjæres ut. Denne del av membranet underkastes en nedbrytning i henhold til Edman, 1956, ved hjelp av en mikrosekvensør fra Applied Biosystems, modell 477A, med en 120/7-analysator i linje og benyttet i henhold til konstruktørens instruksjoner.

Eksempel 1: Konstruksjon av et stabilt plasmid med regulert ekspresjon av

cDNA av human aFGF.

Dette eksempel beskriver de konstruksjoner som gjennomføres for å oppnå et stabilt og meget regulert plasmid som tillater produksjon av aFGF i E. coli.

cDNA av nativ form av genet av human aFGF (470 pb) (Jaye et al., 1986 og 1987) identifiseres, sekvenseres og klones i ekspresjonsvektoren pET9 (Studier et al., 1990) på setene Ndel og BamHI for å oppnå ekspresjonsplasmidet pMJ42, i det følgende kalt pXL2283 (se figur 1). Innskuddet Ndel-AccI på 2,8 kb av plasmidet pXL2283 ligeres med fragmentet Ndel-AccI på 3,2 kb av plasmidet pETl la (Studier et al., 1990) for derved å oppnå ekspresjonsplasmidet pXL2434. Dette plasmid skiller seg fra pXL2283 ved nærværet av genet lacll og operatoren lacO som tillater å oppnå en mer regulert ekspresjon av aFGF. BamHI-setene innføres deretter ved ekstremitetene av fragmentet parCBA-parDE' på 2,46 kb som stammer fra plasmidet pGMA28 (Gerlitz et al., 1990). For dette formålet ble fragmentet Sphl-Sphl-BamHI på 2,46 kb av pGMA28 klonet i plasmidet pUC18 (Yanish-Perron et al., 1985), fermentert med Sphl-BamHI for å oppnå plasmidet pGMA60 (H. Schwab et al., personlig meddelelse). Fragmentet på 2,46 kb Hindm-ExoRI av plasmidet pGM60 blir deretter klonet inn i plasmidet pMTL22 (Chambers et al., 1988) fermentert med HindHI og EcoRI for å gi pXL2433. Innskuddet BamHI (parCBA-parDE<1>) av plasmidet pXL2433 innføres på setet Bgin av plasmidet pXL2434 for derved å gi plasmidet pXL2435. På figur 1 er det vist et konstruksjonsskjema og plasmidkartet for pXL2435 og sekvensen på 8501 pb av plasmidet pXL2435 er beskrevet (SEQ ID nr. 1). Mens den sekvens som er beskrevet i artikkelen av Gerlitz et al. i 1990 ikke er annet enn partiell (125 basepar må føyes til ved 3'), er denne 3'-delen av sekvensen verifisert på plasmidene pXL2433 og pXL2435 og på sekvensen SEQ ID nr. 1. En rekapitulering av egenskapene for de tre ekspresjonsplasmider er gitt i tabell 1.

Eksempel 2: Stabilitet for ekspresjonsplasmidet under fremstillingen av aFGF.

Dette eksempel beskriver fremstillingen i flytende medium av aFGF fra en stamme av rekombinant E. coli som har et ekspresjonsplasmid av aFGF, T7-polymerase avhengig, og som er dyrket i fravær av plasmidseleksjon. Etter produksjon av aFGF blir nærværet av plasmid oppfylt ved motstandsevne hos bakteriene mot kanamycin hvis resistensgen bæres av plasmidene som er beskrevet i eksempel 1. Til slutt blir det produserte aFGF-protein karakterisert ved klassiske, biokjemiske metoder.

Eksempel 2. 1: Stabilitet av ekspresjonsplasmidet i fravær av

induksjonsbetingelser for produksjon av aFGF.

Plasmidene pXL2283, pXL2434 og pXL2435 innføres ved transformering i stammen BL21, DE3 (Studier et al., 1990). Blant transformantene som seleksjoneres på LB-gelosemedium inneholdende kanamycin, blir to transformanter, valgt tilfeldig, dyrket 16 timer i flytende LB-medium i nærvær av kanamycin. Kulturene fortynnes til 1/100 og dyrkes i LB-medium i nærvær av kanamycin inntil den optiske densitet ved 600 nm ligger mellom 0,2 og 0,6. En fortynning av kulturene til 1/100 LB-medium gjennomføres i 10 ml medium og stammene dyrkes inntil den optiske densitet ligger mellom 0,17 og 0,6. Denne fortynning-bakterievekst i medium uten antibiotika ved 37°C gjentas seks ganger og tilsvarer totalt et antall generasjoner på mer enn 30, oppnådd etter 2 dager. Bakteriene spres på LB-gelosemedium. Etter vekst blir 100 kloner strippet ut på LB-gelosemedium og LB-medium inneholdende Km. I tabell 2 vises hyppigheten av kloner som er resistente mot Km etter minst 30 generasjoner uten seleksjonstrykk på plasmidet.

Dette eksempel viser at fragmentet par av RP4 stabiliserer plasmidet i fravær av seleksjonstrykk, selv om stabiliseringseffekten kun er moderat.

Eksempel 2. 2: Stabilitet hos ekspresjonsplasmidet under

induksjonsbetingelser for produksjon av aFGF.

Bakteriene som er dyrket i minst 30 generasjoner i fravær av antibiotikum (som beskrevet i eksempel 2.1) fortynnes til 1/100 i LB-medium og dyrkes 12 timer og fortynnes så igjen til 1/100 i LB-medium. Når bakteriene har formert seg til optisk densitet på 0,5 til 0,8, ble 1 mM D?TG tilsatt og bakteriene dyrket i 4 timer for å tillate produksjon av aFGF som kvantifiseres på totalcelleekstrakter avsatt på 15% SDS-PAGE-gel og farvet med Coomassie-blått (se figur 2). Bakteriene spres på LB-gelosemedium. Etter vekst blir 100 kloner stripet ut på LB-gelosemedium og LB inneholdende kanamycin. I tabell 2 vises frekvensen av kloner som er resistente mot kanamycin etter produksjon av aFGF uten seleksjonstrykk på plasmidet.

Dette eksempel viser uten tvetydighet at fragmentet par induserer en meget vesentlig segregasjonen stabilitet etter ekspresjon av aFGF ved å benytte ekspresjonssystemet avhengig av polymerasen av fagen T7.

Eksempel 2. 3: Karakterisering av proteinet aFGF, produsert i

nærvær av ekspresjonsplasmidet av aFGF.

Under de induksjonsbetingelser for produksjon som er beskrevet i eksempel 2.2, blir det oppnådde protein aFGF visualisert, se figur 2, på 15% PAGE-SDS-gel, farvet med Coomassie-blått, og med en molekylvekt som kommer til syne ved 16 kDa, i overensstemmelse med de biokjemiske data som er gitt og den publiserte sekvens (Jaye et al., 1986 og 1987). Videre blir dette protein forklart ved immunologisk kolorimetrisk detektering ved bruk av antistoff anti-aFGF bovin. Den N-terminale sekvens av proteinet som er produsert med stammen BL21, DE3 pXL2435 bestemmes deretter fra den totale ekstrakt som renses ved PAGE-SDS-elektroforese som beskrevet i generelle biokjemiske teknikker. Den oppnådde sekvens er A-E-G-E-I-T-T-F-T-A-L-T (SEQ ID nr. 2), den er identisk med den N-terminale sekvens av det native protein (Jaye et al., 1986) og det terminale metionin kuttes med metionylaminopeptidase av E. coli som diskutert av Hirel et al., 1989.

Dette viser dog at proteinet som fremstilles ved hjelp av et ekspresjonsstabilt plasmid i E. coli som beskrevet i eksempel 2.2 er aFGF-proteinet og at den N-terminale sekvens ikke er kuttet.

Referanseliste

Chambers S., Prio S., Barstow D., og Minton N., (1988) "Gene, 68: 139-149.

Denéfle P., Kovarik S., Guiton J.D., Cartwright T., og Mayaux J.-F., (1987) "Gene", 56: 61-70.

Eberl L., Kristensen C, Givskov M., Grohmann E., Gerlitz M., og Schwab H., (1994)

"Mol. Microbiol.", 12:131-141.

Edman P.. (1956), "Acta Chemica Scandinavia", 10: 761-768.

Gerlitz et al., (1990), "J. Bact.", 172: 6194-6203.

Gibson T. (1984) "Ph.D.", University of Cambridge, Cambridge, England.

Hirel P., Schmitter P., Dessen P., og Blanquet S., (1989), "Proe. Nati. Acad. Sei.", 86: 8247-8251.

Jaye M., Howk R., Burgess W., Ricca G., Chui I., Ravera M., 0'Brien S., Modi W.,

Maciag T., og Drohan, W., (1986), "Science", 233: 541-545.

Jaye M., Burgess W., Shaw A., Drohan W., (1987), "J. Biol. Chem.", 262: 16612-16617.

MatsudairaP., (1987), "J. Biol. Chem.", 262: 10035-10038.

Roberts et al. (1994), "J. Mol. Biol.", 373: 35-51.

Sambrook J., Fritsch E.F., og Maniatis T., (1989), "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", 2. utgave, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor

Laboratory Press.

Studier W.F., Rosenberg A.H., Dunn J.J., og Duberndorff J.W. (1990) "Methods

Enzymol.", 185: 89-60.

Yanisch-Perrson C, Vieira J., Messing J., (1985), "Gene", 33: 1033-119.

Claims (18)

1. Ekspresjonsplasmid, karakterisert ved at det omfatter en nukleinsyresekvens av interesse under kontroll av en promotor av bakteriofagen T7 og et stabiliserende område omfattende hele eller en del av området par av plasmidet RP4 eller et derivat derav og i tillegg omfatter operatoren lacO og genet lacW.

2. Plasmid ifølge krav 1, karakterisert ved at promotoren av bakteriofagen T7 er promotoren av genet 10.

3. Plasmid ifølge krav 1, karakterisert ved at det stabiliserende området omfatter en del av par-området av plasmidet RP4.

4. Plasmid ifølge krav 3, karakterisert ved at det stabiliserende området består av fragmenter som ligger mellom restene 6038 og 8499 av sekvens SEQ ID nr 1.

5. Plasmid ifølge krav 1, karakterisert ved at operatoren lacO befinner seg nedstrøms promotoren av bakteriofagen T7 og oppstrøms nukleinsyresekvensen av interesse.

6. Plasmid ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at nukleinsyresekvensen av interesse koder for et protein av farmasøytisk, agroalimentær interesse eller for biokatalyse-anvendelse.

7. Plasmid ifølge krav 6, karakterisert ved at nukleinsyresekvensen av interesse koder for et protein valgt blant enzymer, blodderivater, hormoner, lymfokiner, vekstfaktorer, neurotransmittorer eller deres forløpere eller synteseenzymer, trofiske faktorer, apolipoproteiner, dystrofin eller et minidystrofin, proteinet CFTR, tumorsuppressorgener, gener som koder for faktorer implikert i koaguleringen eller genene som intervenerer i fordelingen av DNA.

8. Plasmid ifølge krav 7, karakterisert ved at nukleinsyresekvensen av interesse koder for en sur vekstfaktor for fibroblaster (aFGF).

9. Plasmid ifølge krav 8, karakterisert ved at nukleinsyresekvensen av interesse koder for aFGF(154).

10. Plasmid pXL2435, karakterisert ved at den viser sekvensen SEQ ID nr. 1.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant protein, karakterisert ved at man dyrker en bakterie inneholdende: et plasmid i henhold til ett av kravene 1 til 10 med en nukleinsyresekvens som koder for proteinet, og polymerase-RNA-genet av bakteriofagen T7, under betingelser som tillater ekspresjon av nukleinsyresekvensen.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at polymerase-RNA-genet av bakteriofagen T7 er anbragt under kontroll av en induktibel promotor.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 11 eller 12, karakterisert v e d at polymerase-RNA-genet av bakteriofagen T7 er integrert i genomet til den benyttede bakterie.

14. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 11 til 13, karakterisert ved at bakterien er valgt blant stammer av E. coli.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at bakterien er stammen E. coli BL21, DE3.

16. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 11 til 15 for fremstilling av rekombinant aFGF.

17. Fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant aFGF, karakterisert ved at man dyrker en bakterie inneholdende plasmidet pXL2435 ifølge SEQ TD NO: 1 og polymerase-RNA-genet av bakteriofagen T7 under betingelser som tillater ekspresjon av nukleinsyresekvensen, og gjenvinner aFGF-produktet.

18. Bakterie, karakterisert ved at den er transformert med et plasmid i henhold til et av kravene 1 til 10.