TW517086B - Process for producing recombinant proteins, plasmids and modified cells. - Google Patents
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Description
517086 A7
517086 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（2 ) 據優良製造程序（GPP)製備。爲達到此目的，必需有一種 能重覆製造，並可確保所製造之產品具有高品質與高純度 之製造系統。製造具有醫藥價値之蛋白質的方法中，非常 重要的一個組件是製造該蛋白質之菌株。因此，該菌株必 須能確保不論是在質或量上均可重覆製造之製造模式。 就品質而論，例如，該菌株必須適於製造完全均質之蛋 白質’換T之具有與天然蛋白質相同之初級序列。因此， 在發酵過程中’若在細菌細胞内製造修飾所表現蛋白質之 編碼序列的單點突變時，會製造出與具天然序列之蛋白質 混合在一起之經修飾蛋白質。當施用於人類時，該經修飾 蛋白質引發對治療或其他問題十分有害之免疫反應，於後 續治療時該情況產生嚴重的免疫反應。 就產量而論，任何方法必須能重覆製造乃是不爭的事 灵。包括所獲知產品之品質證明。因此，在相同的時間單 位内，使用相同的培養和生長條件，不同製造批次中，每 單位生物體所合成之該蛋白質量應相同。在製造該蛋白質 <重覆製造能力上，細菌體内攜帶表現匣之質體是一個非 系重要I組件。若全邵細胞在培養末期仍能保有質體，發 酵万法將控制的更好（製造蛋白質之前和後）。在培養基中 通常添加選擇質體存在之抗生素以維持質體於細菌體内。 孩需要衍生出各種問題，例如⑴製備發酵培養基所需抗生 素I成本；⑵由於抗生素無法以壓熱器消毒，因此較好是 在即將使用前添加至培養基中；⑶抗生素未必安定且可能 產生對人體有毒或至少造成某些病患不良副作用之轉形產
(請先閱讀背面之注意事項再本頁)
Ji 訂
517086 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 物；⑷抗生素本身亦可能對人體有毒或至少造成某些病患 不^副作用。對於後二案例，必須證明在經純化產物中之 有毒產物，不論是抗生素或衍生自抗生素之產物的量，以 訑用d里爲基準低於能引起副作用或毒性反應的量。該問 述為要精金且昂貴之研究。 本發明尋求解決此等問題之道。因此，本發明提供一種 特別有效的表現系、统，其中由於細菌後代在發酵器内彼此 傳承，不需要抗生素維持質體。本發明特定而言係關於構 染質體表現系、统，其中包含穩定區域之嗟菌體T7啓動基因 朿動表現。根據本發明之系統別具優點，因爲與所看到之 StucHer et al.系統不同，本系統之培養條件中並不需要 抗生素，亦即在沒有任何選擇壓力下，使質體在表現經謗 發而表現之蛋白質後仍維持在細菌細胞内。謗發表現後， 斯他的兒（Studier et al.，199〇)質體僅存在於細胞之極 小邵分中。本發明系統對質體有強力之穩定作用，藉此增 加重組蛋白質之製造量並提高製造方法之重覆製造能力。 更特定而言，根據本發明質體之穩定區域，其構築是衍生 自質體R P 4之巴(p a r )片段。 本發明係關於一種包含核酸編碼序列之表現質體，其係 由噬菌體T 7啓動基因和穩定區域所控制，該穩定區域包含 質體RP4Kpa〇區域之全部或部分或該區域之衍生物。 右使用邵分Kp ar)區域時，僅能部分穩定本發明質體。 例如只要能有效的穩定質體，可使用1 〇 %，2 〇 %，3 〇 0/〇， 4 0 % ’ 5 0 % ’ 6 0 % ’ 7 0 %，8 0 %，9 0 %，9 5 %，或 9 9 % (請先閲讀背面之注意事項再^^本頁) 1 - - 衣' 本 訂
J
517086 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 '—— ---B7 五、發明説明^^" --- 之Kpar)區域。 用於本發明質體之噬菌體T7啓動基因較好是基因1〇之 啓動基因。 如上所tf，用於本發明質體之穩定區域是衍生自質體 R P 4 K par)片段（Gerlitz 以 ai.，1990)。該片段搞帶各種功能（特別是指定爲par A、g_a_rB、parC、parD和 之5種基因），特別是編碼明顯具有特定位基因重組 酶活性之蛋白質，該活性使其能分解質體二聚體 et al·，1 994)。如實例所述，該i(par)片段能自質體 RP4解離並選殖至本發明表現質體中。再者，在納入本發 明質體之前或之後可修飾該片段。因此，本發明質體之穩 定區域能包含質體RP4之全部或部分i(par)區域或該區 域之衍生物。 特定而言，質體之穩定區域可包含Gerlitz et al.， ”…所描述來自質體卩丁^…之psti插入片段或來自 ρ Ο Η 2 3之副片段gphl _ SphI _ SphI或來自pOH41之 S^iLl-S^iLl-£Xa_I 或來自 pGMA28 之 SphI_SphI - T 或來自 pGMA27 之 S^phl - SphI - B amH I，或來自 pTUG3 插入片段之任何副片段，該片段至少包含來自P G M A 2 7之 S_^iLl - S^JlI - BajnH I 插入片段。若pTUG3 之 P stl 插入片 段包含g^rCB A-B_arDE某因和側列區域，p GM A 2 7或 pGMA2 8之插入片段僅包含DarCB A_parDE丨某因和5,側 列區域。穩定區域亦可包含parDE基因或parD某因，且 係由其本身天然啓動基因區域或Roberts et al·，1994 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公襲） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 本
、1T
517086 五、發明説明（ 已描述之另一啓動基因控制。該區域可得自包含於質體 p T U G 3中之SJxI - £1^1片段。穩定區域亦可包括包含在質 體PTUG3中和2，3或4種基因之任何組合，例如parA—_ 或 或 ^ajiAC-狂rD 或 parDE， 不論是由其本身之天然啓動基因區域或其他啓動基因控 制。 意 事 項 訂 名詞區域之衍生物包括基因和/或化學修飾^區域所獲 得之任何能穩定根據本發明質體之核酸片段。特定而言， 此等衍生物可根據熟於此藝者已知之技術，在質體Rp4之 區域内，經由删除、突變、添加、裂解、配位等方法獲 得。此等衍生物典型的與天然存在之_^區域具相當程度之 序列同質性，較好具有70〇/〇、80〇/〇、9〇%、95%、或 9 9 %同質性。衍生物之功能特性可依實例所述測試（特別 參看實例2)。
本發明質體中穩定區域較好包含質體Rp 4部分^區域。 在一個特殊具體實施例中，穩定區域包含在序列s E Q NO : 1之殘基6038至8499上所發現之片段。 在一個較佳具體實施例中，本發明質體另包含lac。—蝉縱 基因和U_£i_q基因，較好爲二者。頃發現雖然有對大腸桿 菌體内不存在之聚合酶具特定性之噬菌體17啓動基因，核 酸序列之基本表現在無謗發物存在下亦可發生。該殘存表 現能謗使質體穩定性下降。存在於本發明質體内之 操縱基因和L^q基因能有更有效的控制核酸序列表現， 以抑制任何無謗發物之表現。併入此等元件之質體因此展 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（21GX297公襲） 517086 、發明説明（ 現更佳之穩定性和更好/ 每 尺灯的衣現&制。馬達到所需作用，如 只叫所操縱基因較好位於噬菌體τ :和核酸編碼序列之上游。—好是 啓動基因控制，典型的插人與質體所需特性不具關鍵性之 品忒因此，基因較好插在1區域和該核酸編碼序列表現 厘之外。該操縱基因基因序列示於SEQ⑺ν〇 :】 序列。此等元件能以同質序列或具同等功能之序列取代。 在一特殊具體實施例中，根據本發明質體亦包含位於該 核酸編碼序列下游之停止轉錄序列。使用之停止轉錄序列 較好是其啓動基因被使用之噬菌體Τ7基因。停止轉錄序列 較好是噬菌體Τ7之停止轉錄序列。 任何編碼序列可作爲本發明質體中之核酸編碼序列，較 好疋、為碼具醫藥或農藥價値或能用作生物催化作用之肤序 列。邊序列可能是，例如結構基因，互補DNA序列 (cDNA)，合成或半合成序列，等。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 核酸序列較好編碼具醫藥價値之蛋白質，例如酶、血液 產物、荷爾蒙、淋巴細胞活素（例如内白血球素、干擾 素、TNF、等）、生長因素、神經遞質、或合成神經遞質 之前趨體或酶，促因素如BDNF、CNTF、NGF、IGF、 GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5或 HARP/多效活素、 脱輔基脂蛋白如ApoAI、ApoAIV、ApoE、營養不良因 素或微營養不良因素，C F T R蛋白質（與囊性纖維變性有 關），腫瘤抑制基因如p 5 3、R b、R a p 1 A、D C C、k -rev、等，與凝固作用有關之蛋白質因素如因素νΠ、 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 517086 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（7 VIII和IX，或與DNA修護有關之蛋白質。 在本發明的一個特殊具體實施例中，該核酸序列編碼酸 性纖維母細胞生長因素（aFGF)。人類aF(JF基因天然形式 之cDNA已經確認、定其序列並經選殖（Jaye et al， 1 9 8 6和1 9 8 7 )。視N -端邵分是否有刪除作用，該c D n a 能編碼不同形式之aFGF，特別是具有154、14〇或134胺 基酸之形式。亦能產生天然或人工變種，此等變種是在天 然基因序列中（例如一個N _端甲硫胺酸）因刪除、突變和/ 或添加一或多對鹼基之修飾作用所造成的。在本發明之較 佳具體實施例中，該核酸序列編碼a F G ρ ( 1 5 4 )。展現序 列SEQ ID N0 : ;l之質體pXL24 3 5可引述爲一特定實 例〇 本發明亦係關於一種製造重組蛋白質之方法。更特定而 吕’根據本發明製造方法包括在允許核酸編碼序列表現之 條件下培養細菌，該細菌包含： -根據本發明實體，其係包含編碼需表現之多肽的核酸 編碼序列，和 —噬菌體T7 RNA聚合酶之基因。 如上所示，本發明特定而言係關於相同T 7噬菌體之 RNA聚合酶可特定辨識之噬菌體T7啓動基因之用途。因 此’所採用之細菌除了本發明質體外，必須保有促使嗟菌 體T 7 RN A聚合酶表現之匣盒。該匣盒能，例如，整合入 所採用細菌之基因組中（例如大腸桿菌菌株B L· 2 1， DE3)，或由第二質體或噬菌體攜帶或出現在本發明質體 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) -、11 __. -10 - 517086 五、發明説明（ 項 上。編碼喔菌體T7 RNA聚合酶之基因在表厘内較好由可 着發之啓動基因，如i_ac，Irp或r ec A啓動基因控制。因 此在細胞内以控制的方式謗發RN A聚合酶之製造，控制該 核酸編碼序列之表現，該序列是由特定於該RNA聚合酶之 啓動基因控制。控制噬菌體T 7 RN A聚合酶表現之可謗發 啓動基因車父好是大腸样菌p i^cU V5啓動基因，該啓動基 因在IPTG存在下特定謗發。 如實例中所詳示，本發明方法因此大量並以重覆製造之 方式製造未經修飾之蛋白質。該方法因此能以工業生產規 模製造具醫藥品質之重組蛋白質。 本發明方法特別適於製造重組纖維母細胞生長因素（尤其 是aFGF和bFGF)。因此，特定而言本發明方法係關於製 備重、’且aFGF，其中保有質體pXL2435和編碼嗟菌體I? RNA聚合酶之細菌在允許核酸序列表現之條件下培養，再 回收製造之aFGF。 下列實例闡釋本發明。 使用之縮寫： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 a F G F ·故性纖維母細胞生長因素 bp :鹼基對 〇 D ··光密度 E · C.Q.1 i. ·大腸桿菌 IP T G :異丙基硫· β _ D -半乳糖芬 kb :千驗基
本紙張尺度適财_家縣(cns)a4規格(11^7公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 517086 Α7 _ Β7 五、發明説明（9 ) kDa :千道爾頓 Km :康黴素 LB :羅瑞-柏大尼（Luria-Bertani)培養基 PAGE-SDS :使用包含丙烯醯胺，N.N，-亞甲基雙丙烯醯 和硫酸十二烷基鈉鹽凝膠之電泳法。 T7 :噬菌體T7 圖例符號： 圖1 :質體PXL24 3 5之構築 A -構築圖：來自 pETlla 3.2kb 和來自 pXL2283 2.8 kb 之片段配位以製造質體PXL243 4 ; Μ B glTT 消化之質體pXL2434與來自pXL2433之2.4kb B amH I 片段配位以產生pXL243 5。 B -質體pXL2435圖：aF GF :編碼a F G F之基因； Ampr :抗胺苄青黴素之基因；Kmr :抗康徽素之基因； L3^Lq :編碼L a c抑制劑高合成作用之基因；〇 r丨：c 〇 1 e 1 起源之複製作用；parDE'parCBA : RP4巴位置之基 因；pT7 : T7 Φ10啓動基因和iac〇操縱基因；ΤΦ : T7 Τ Φ停止轉錄序列。箭頭顯示基因轉錄的方向。經顯示之 限制酶位置係供選殖之用。括孤内之數字對應序列s E ^ ID NO: 1上鹼基對之位置。 圖2 :説明無抗生素，但質體pXL2283，pXL2434或 PXL243 5存在下，以IPTG謗發後大腸桿SBL21，DE3 製造之aF GF蛋白質。全部細胞提取物倒在凝膠上。M : 分子f圮號，以kDa表示分子量；箭頭指出aFGF之分子 -----------12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（21〇Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再頁) 、?τ J_ 517086 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（10 ) 量° 序列SED ID NO : 1: 8 5 0 1 bp質體pXL2435之核苷酸 序列。序列上位置1對應pE T 1 1 a之Bglll裂解位置。 aF GF基因位於位置1 0 8和5 7 5之間，巴位置位於位置 6038矛口 8499之間，亦即自8248至8499之parE1 ，自 8 00 1 至 8 2 5 2 之 parD ，自 7 8 5 0 至 7 5 5 7 之 p ar C ，自 7 5 6 0 至 7 0 2 7 之 p a r B 和自 7066 至 6407 之 par A ; T 7 Φ 1 0 啓動 基因位於位置2 0和3 6之間，1 a c Ο位於位置3 9和6 3之間， T 7 Τ Φ停止序列介於位置5 8 6和7 0 8之間，laclq基因位 於位置5 6 3 6和4 5 5 4之間。 一般選殖，分子生物和生化技術 在（Sambrook et al.，1 9 8 9)文獻中描述標準分子生物 方法如氣化铯/溴化乙錠梯度中離心質體D n A，限制酶消 化作用’凝膠電泳，自瓊脂糖凝膠電離析D n A片段，轉形 成大肪杯菌，核酸沉殿，等。限制酶由新英格蘭生化實驗 室（Biolabs)，百斯達研究實驗室（Bethes(U Researeh Laboratories (BRL)或艾美山公司（Amersham匕⑷供 應。 就配位作用而言，DNA片段根據其大小在0 7%瓊脂糖 凝膠上分離，以電離析純化，以酚提取，以乙醇沉澱，隨 後在50毫莫耳三羥甲基胺基甲烷_HC1，ρΗ 7 4 , 1〇毫莫 耳濃度MgCl2，10毫莫耳濃度DTT，2毫莫耳濃度Ατρ缓 衝液中，噬菌體T4 DNA連接酶（Bl〇labs)存在下培養。 使用經配位之DNA4純質體DNA轉化菌株：大腸桿菌 - -—--—-________ _ - 本紙張尺度適财_家標^ΓΓϋ^Γ2Κ)χ297公釐 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂 4 517086 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（n ) BL21，DE3 [F " o mp T h s d S 只(r B - m B -) gal dcm (DE3)] (Studier et al·，1 990)和大腸桿菌 TGI [Δ (lac, pro Α·Β、，s u p E , Lhi, h s dD 5 / F 1 tr aD 3 6 . p r ο A+· B +，1 a cIq，1 a c ZΔ M 1 5 ] (Gibson，1984)，已 符合要求。以S ambr ο o k e t al.，1 9 8 9描述之驗性溶胞 技術純化質體DNA樣本。 細菌學邵分使用LB培養基（Sambrook et al.， 1 9 8 9”細菌懸浮液之稀釋液隨後分佈在LB培養皿上，若 有需要該培養皿可補充50毫克/升康黴素。 採用Studier et al·，1 990描述之實驗，在保有表現 aFGF之質體（如實例1所述PXL22 8 3或pXL243 4或 PXL243 5 )的菌株BL21，DE3輔助下製造aFGF。 aF GF之產量是根據總細胞提取物測量。當細菌經溶菌 後，樣本裝在15% SDS-PAGE凝膠上，電泳後以考馬斯 藍染色（Dene fie et al.，1987)。衍生自菌株、製造 aFGF之樣本展現具1 6千道爾頓表觀分子量之長帶。半乾 轉移至硝基纖維素膜上（Sambrook et al.，1989)，根 據實驗並以維克斯坦組（Vectastain kit)(生合SA，法 國）處理該纖維膜以便進行使用抗生物素蛋白/生物素化過 氧化酶複合物之比色免疫測驗（法國西格馬（S i gm a)銷 售，得自兔體之抗牛aFGF抗體，和抗兔IgG)。再一次 半乾轉移至預印植膜（Matsudaira，1987)，使用考馬 斯藍染色該膜，顯現1 6千道爾頓表觀分子量之長帶。該膜 片使用配備有連線120/7分析器，模型477A之應用生物 -14 ~_ 本紙張尺度適用中國國家標準㈣㈠織格⑺以挪公釐) 一〜 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 本 訂
517086 A7 B7________ 五、發明説明（12 ) 系統微序列分析儀進行艾得曼（E dm an，1 9 5 6)降解作 用，其操作依製造商之説明。 實例卜構築穩定及經調節之質體以表現人體aF GF之 c D N A 0 本實例描述如何構築穩定且高度調節之質體供大腸桿菌 體内製造aFGF。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 辨識並序列分析人類aFGF基因天然形式之cDNA (470 bp)(Jaye et al.，1986和1987)並選殖入表現載體 pE T 9 ( S tudi er et al·，1990)之 N d e I 和 B amH I 位置以 製造表現質體pM：M2，後經指定爲PXL22 8 3 (參看圖 1)。來自質體pXL2283,2.8 kb之N d e I - A c c I插入片段 與來自質體卩丑丁11&之3.2]^ Ndel-AccI片段（Studier et al·，1 990)配位以產生表現質體pXL243 4。該質體與 PXL2283不同，另包含laclq基和lacO操縱基因，使 aF GF以更爲控制之方式表現aF GF。隨後BamHI位置納 入衍生自質體卩〇]^1八28之2.46 1^ p ar C R A - p a r D E 1 Ά 段之末端（Gerlitz et al·，1990)。爲進行該步驟，來自 pGMA28-^2.46 kb S phi - S p h I B amH I 片段選殖入質 體 pUC18 中(Yanish-Perron et al·, 1985)，再經 S^iLl-EAJSLHI 消化以製造質體 pGMA60 (H. Schwab et al·，personal communication) ° 來自質體 pGMA60 之2·46 kb HindMI-EcoRI片段隨後選殖入質體 ρ Μ T L 2 2 (chambers et al. , 1 9 8 8 )，經 Hind III - • 15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） 517086 A7 B7 13 五、發明説明（
EcoRI消化以製造pXL243 3。來自質體p X L 2 4 3 3之 BajnHI (parCBA-parDEM插入片段納入質體pXL2434 之Ε_5ΐΙΙ位置以製造質體pXL24 3 5。圖1詳述構築圖和和 質體PXL243 5圖，並描述8 5 0 1 kb之質體pXL24 3 5序列 (SEQ ID NO : 1)。而 Gerlitz et al·，1 990 之研究報 告中所描述之序列僅爲一部分（在3 ’端再添加1 2 5個鹼基 對），該3’部分之序列在質體pXL2433和pXL2435以及 序列SEQ ID NO : 1上確認。三種表現質體之特性摘示 於表1。 表1表現質體之特性 (請先閲讀背面之注意事項再頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 質體 pXL2283 or pMJ42 pXL2434 pXL243 5 大小（kb) 4.8 6 8 . 5 衍生自 pBR3 22 pBR3 22 pBR3 22 抗 kanamycin kanamycin kanamycin 啓動基因 pT7 T7 Φ 1 0 T7 Φ10 T7 Φ 1 0 1 ac Ο - + + Τ Φ停止轉錄序列 T7 ΤΦ T7 ΤΦ T7 ΤΦ aFGF cDNA + + + laclq + + parCB A-ParDF' _ + -16 紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（21〇><297公釐） 517086 A7 B7 五、發明説明（14 ) 實例2 -製造aF GF時表現質體之穩定性 本實例描述液體培養基中由重組大腸桿菌菌株製造 aFGF，該菌株保有需T7聚合酶以表現aFGF之質體，該 菌株之培養不需選擇質體。製造aFGF後，質體之存在與 否是以細菌對康黴素之抵抗力測定，實例1所述之實體搞 帶該抵抗基因。最後，已製造之aF GF蛋白質以標準生化 方法定其特性。 實例2 . 1 -在缺乏謗發aF gf製造之條件下表現質體之穩定 性 以轉化作用使質體pXL22 8 3，pXL243 4和pXL243 5 納入 BL21 ’ DE3 菌株内（Studier et al·，1990)。在含 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 康黴素之LB瓊脂糖培養基上自轉形種中隨機抽出二種轉 形種，在康黴素存在下於液體LB培養基中培養i 6小時。 培養物稀釋1/1 〇〇並在康黴素存在下於LB培養基中培養直 至60 Onm時光密度介於〇·2和〇·6之間。培養物於1〇毫升 LB培養基中稀釋1/100，菌株培養至〇d介於〇 η和〇.6 之間。在3 7X：下，不含抗生素之培養基中重覆該稀釋步驟 與細菌培養六次，二天後總共超過3 〇代。細菌分佈於L B 瓊脂糖上。生長後’在LB瓊脂糖培養基和含Km之LB瓊 脂糖培養基上劃線培養i 〇 〇個純種系。表2顯示無質體選 擇壓力下，至少30代後純種系對Km具抵抗力之情形。 本實例薇明R P 4兰^片段在無選擇壓力下穩定質體，即使 該穩定作用僅爲中等程度。 -17- 517086 A7 B7 15 五、發明説明（ 實例2·2-在謗發製造aFGFi條件下，表現質體之穩定性 典抗生素下至少培養3 〇代之細菌在Lb培養基中稀釋 1 / 1 0 0並培養1 2小時，隨後於l b培養基中再稀釋一次 1/100。當細菌生長至〇D 〇.5至〇8時，添加1毫莫耳濃 度IP TG並培養細菌4小時以製造aFGF，置於經考馬斯藍 木色之1 5 % S D S - P A GE凝膠上依總細胞提取物測量（參 看圖2 )。細菌分散於L B瓊脂糖培養基上。生長後，於[b 瓊脂糖培養基和含康黴素之瓊脂糖培養基上劃線培養丨〇 〇 個純種系。表2顯示在無質體選擇壓力下製造aF GF後對純 種系對康黴素具抵抗力之情形。 該實例明顯證明邑片段在aF GF表現後謗發十分實質之 隔離穩定性，該表現使用需噬菌體T 7聚合酶之表現系統。 表2典任何質體選擇壓力下，單獨生長或生長後（至少超過 3 0代以上）表現，對康黴素產生抵抗力之純種系之百分 比0 (請先閲讀背面之注意事項再本頁)
-訂- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 5Π〇86 A7 ' —____Β7 五、發明説明（16 ) ^——_ 康黴 ----- 素培養 物稀釋液 無康黴素培養物表現/ 質體 代數 對Km具抵抗力 代數 對Km具抵抗力 aFGF 之 _PX^L 之純種系百分比 之純種糸百分比 製造^ 22 8 3 3 0 20 45 0. 1 e (N〇. 2 2 8 3 3 0 10 45 0.2 e (No. 2) -——」 -----* 24 3 4 40 100 4 5 1 +屮 (N〇. 243 4 40 99 45 5 + + (No . 2) 243 5 40 1 00 45 99 + + (N〇 , i) 24 3 5 40 1 00 45 1 00 + + (N〇 . i \ ---— 存 訂 經濟部中央檩準局員工消費合作社印製 € :考馬斯藍染色後未測得aFGF表現 + + :非常多aF GF表現；約總蛋白質之1 〇 %。 實例2· 3-在表現aFGF之質體存在下製造之aFGF蛋白質 之特性。 在實例2· 2所述之謗發條件下製造時，獲得之aFGF蛋白 質在經考馬斯藍染色之1 5 % P A GE - S D S凝膠上以昤眼觀 _ - 19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公釐） - 517086 A7 B7 五、發明説明（ 17 察，參看圖2，以16千道爾頓之表觀分子量移動，與報告 之生化結果和公佈之序列符合（j ay e e t ai，1 9 8 6和 1 9 8 7 )。該蛋白質進一步以使用抗牛aF gf抗體之比色免 疫鑑定法予以證實。菌株BL21、DE3 pXL2435製造之 蛋白質N _端序列以經p a GE - S D S電泳純化之全部提取物 依一般之生化技術測定。獲得之序列爲a_e_g_e-i-t-t-F-T-A-L-T ;與天然蛋白質之ν·端序列相同（jaye et al。，1 9 8 6)，而終端之甲硫胺酸如Hirei et al.，1989 所論被大腸彳n甲硫胺醯胺基肽酶裂解。 該實例因而證明使用在大腸桿菌中穩定之表現質體製造 之蛋白質，如實例2.2所述是N_端序列未經截斷之aF GF 蛋白質。 序列表 C请先閲讀背面之注意事項存本頁) ⑴一般資料： ⑴ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (ϋ) 申請者： (A) 姓名：罔-普南羅普（RHONE_POULENC RORER S.A.) (B) 街· R 街 20 號 ARON (20，avenue R. ARON) (0 市：安東尼（ANTONY) (D) 國家：法國（FRANCE) (E) 郵遞區號：9 2 0 1 6 5 發明標題：製造重組蛋白質、質體及經修飾細胞 _ -20- § 517086 A7 B7 五、發明説明（I8 ) 經濟部令央標準局員工消費合作社印製 法〇 (iii) 序列數：1 (iv) 電腦 閲讀方式： (A) 種類 • 常 (B) 電腦 :IB Μ相容個人電腦 (0 操作系統」P C - D 0 S / M S · D 0 S (D) 軟體 :專利解除 # 1 · 0，# 1 . 2 5 版（Ε Ρ 0 ) SEQ ID NO ： 1資料： (i) 序列 特徵： ㈧ 長度 :8 5 0 1鹼基對 (B) 種類 :核酸 (0 股型： :雙股 (D) 形狀： :圓形 (ii) 分子 類別： cDNA (in) 假設 :無 (in) 相反意義： 無’ (ix) 序列説明： SEQ ID NO : 1 ： GATCTCGATC CCGCGAAATT AATACGACTC ACTATAGGGG AATTGTGAGC GGATAACAAT 60 TCCCCTCTAG AAATAATTTT GTTTAACTTT AAGAAGGAGA TATACATATG GCTGAAGGGG 120 AAATCACCAC CTTCACAGCC CTGACCGAGA AGTTTAATCT GCCTCCAGGG AATTACAAGA 180 AGCCCAAACT CCTCTACTGT AGCAACGGGG GCCACTTCCT GAGGATCCTT CCGGATGGCA 240 CAGTGGATGG GACAAGGGAC AGGAGCGACC AGCACATTCA GCTGCAGCTC AGTGCGGAAA 300 GCGTGGGGGA GGTGTATATA AAGAGTACCG AGACTGGCCA GTACTTGGCC ATGGACACCG 360 ACGGGCTTTT ATACGGCTCA CAGACACCAA ATGAGGAATG TTTGTTCCTG GAAAGGCTGG 420 AGGAGAACCA TTACAACACC TATATATCCA AGAAGCATGC AGAGAAGAAT TGGTTTGTTG 480 GCCTCAAGAA GAATGGGAGC TGCAAACGCG GTCCTCGGAC TCACTATGGC CAGAAAGCAA 540 TCTTGTTTCT CCCCCTGCCA GTCTCTTCTG ATTAAAGAGA TCCGGCTGCT AACAAAGCCC 600 GAAAGGAAGC TGAGTTGGCT GCTGCCACCG CTGAGCAATA ACTAGCATAA CCCCTTGGGG 660 CCTCTAAACG GGTCTTGAGG GGTTTTTTGC TGAAAGGAGG AACTATATCC GGATATCCAC 720 AGGACGGGTG TGGTCGCCAT GATCGCGTAG TCGATAGTGG CTCCAAGTAG CGAAGCGAGC 780 AGGACTGGGC GGCGGCCAAA GCGGTCGGAC AGTGCTCCGA GAACGGGTGC GCATAGAAAT 840 -21- (請先閲讀背面之注意事塡寫本頁) 裝
、^T 線 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)八4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 517086 A7 B7 五、發明説明（19 ) 經濟部令央樣準局員工消費合作社印製 TGCATCAACG CATATAGCGC TAGCAGCACG CCATAGTGAC TGGCGATGCT GTCGGAATGG 900 ACGATATCCC GCAAGAGGCC CGGCAGTACC GGCATAACCA AGCCTATGCC TACAGCATCC 960 AGGGTGACGG TGCCGAGGAT GACGATGAGC GCATTGTTAG ATTTCATACA CGGTGCCTGA 1020 CTGCGTTAGC AATTTAACTG TGATAAACTA CCGCATTAAA GCTTATCGAT GATAAGCTGT 1080 CAAACATGAG AATTCTTAGA AAAACTCATC GAGCATCAAA TGAAACTGCA ATTTATTCAT 1140 ATCAGGATTA TCAATACCAT ATTTTTGAAA AAGCCGTTTC TGTAATGAAG GAGAAAACTC 1200 ACCGAGGCAG TTCCATAGGA TGGCAAGATC CTGGTATCGG TCTGCGATTC CGACTCGTCC 1260 AACATCAATA CAACCTATTA ATTTCCCCTC GTCAAAAATA AGGTTATCAA GTGAGAAATC 1320 ACCATGAGTG ACGACTGAAT CCGGTGAGAA TGGCAAAAGC TTATGCATTT CTTTCCAGAC 1380 TTGTTCAACA GGCCAGCCAT TACGCTCGTC ATCAAAATCA CTCGCATCAA CCAAACCGTT 1440 ATTCATTCGT GATTGCGCCT GAGCGAGACG AAATACGCGA TCGCTGTTAA AAGGACAATT 1500 ACAAACAGGA ATCGAATGCA ACCGGCGCAG GAACACTGCC AGCGCATCAA CAATATTTTC 1560 ACCTGAATCA GGATATTCTT CTAATACCTG GAATGCTGTT TTCCCGGGGA TCGCAGTGGT 1620 GAGTAACCAT GCATCATCAG GAGTACGGAT AAAATGCTTG ATGGTCGGAA GAGGCATAAA 1680 TTCCGTCAGC CAGTTTAGTC TGACCATCTC ATCTGTAACA TCATTGGCAA CGCTACCTTT 1740 GCCATGTTTC AGAAACAACT CTGGCGCATC GGGCTTCCCA TACAATCGAT AGATTGTCGC 1800 ACCTGATTGC CCGACATTAT CGCGAGCCCA TTTATACGCA TATAAATCAG CATCCATGTT I860 GGAATTTAAT CGCGGCCTCG AGCAAGACGT TTCCCGTTGA ATATGGCTCA TAACACCCCT 1920 TGTATTACTG TTTATGTAAG CAGACAGTTT TATTGTTCAT GACCAAAATC CCTTAACGTG 1980 AGTTTTCGTT CCACTGAGCG TCAGACCCCG TAGAAAAGAT CAAAGGATCT TCTTGAGATC 2040 CTTTTTTTCT GCGCGTAATC TGCTGCTTGC AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG 2100 TTTGTTTGCC GGATCAAGAG CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG 2160 CGCAGATACC AAATACTGTC CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC TTCAAGAACT 2220 CTGTAGCACC GCCTACATAC CTCGCTCTGC TAATCCTGTT ACCAGTGGCT GCTGCCAGTG 2280 GCGATAAGTC GTGTCTTACC GGGTTGGACT CAAGACGATA GTTACCGGAT AAGGCGCAGC 2340 GGTCGGGCTG AACGGGGGGT TCGTGCACAC AGCCCAGCTT GGAGCGAACG ACCTACACCG 2400 AACTGAGATA CCTACAGCGT GAGCTATGAG AAAGCGCCAC GCTTCCCGAA GGGAGAAAGG 2460 CGGACAGGTA TCCGGTAAGC GGCAGGGTCG GAACAGGAGA GCGCACGAGG GAGCTTCCAG 2520 GGGGAAACGC CTGGTATCTT TATAGTCCTG TCGGGTTTCG CCACCTCTGA CTTGAGCGTC 2580 GATTTTTGTG ATGCTCGTCA GGGGGGCGGA GCCTATGGAA AAACGCCAGC AACGCGGCCT 2640 TTTTACGGTT CCTGGCCTTT TGCTGGCCTT TTGCTCACAT GTTCTTTCCT GCGTTATCCC 2700 CTGATTCTGT GGATAACCGT ATTACCGCCT TTGAGTGAGC TGATACCGCT CGCCGCAGCC 2760 -22- (請先閱讀背面之注意事！W：填寫本頁) 裝 、訂 線 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 517086 A7 B7 五、發明説明（20 ) 經濟部十央標準局員工消費合作社印製
GAACGACCGA GCGCAGCGAG TCAGTGAGCG AGGAAGCGGA AGAGCGCCTG ATGCGGTATT TTCTCCTTAC GCATCTGTGC GGTATTTCAC ACCGCATATA TGGTGCACTC TCAGTACAAT CTGCTCTGAT GCCGCATAGT TAAGCCAGTA TACACTCCGC TATCGCTACG TGACTGGGTC ATGGCTGCGC CCCGACACCC GCCAACACCC GCTGACGCGC CCTGACGGGC TTGTCTGCTC CCGGCATCCG CTTACAGACA AGCTGTGACC GTCTCCGGGA GCTGCATGTG TCAGAGGTTT TCACCGTCP.T CACCGAAACG CGCGAGGCAG CTGCGGTAAA GCTCATCAGC GTGGTCGTGA AGCGATTCAC AGATGTCTGC CTGTTCATCC GCGTCCAGCT CGTTGAGTTT CTCCAGAAGC GTTAATGTCT GGCTTCTGAT AAAGCGGGCC ATGTTAAGGG CGGTTTTTTC CTGTTTGGTC ACTGATGCCT CCGTGTAAGG GGGATTTCTG TTCATGGGGG TAATGATACC GATGAAACGA GAGAGGATGC TCACGATACG GGTTACTGAT GATGAACATG CCCGGTTACT GGAACGTTGT GAGGGTAAAC AACTGGCGGT ATGGATGCGG CGGGACCAGA GAAAAATCAC TCAGGGTCAA TGCCAGCGCT TCGTTAATAC AGATGTAGGT GTTCCACAGG GTAGCCAGCA GCATCCTGCG ATGCAGATCC GGAACATAAT GGTGCAGGGC GCTGACTTCC GCGTTTCCAG ACTTTACGAA ACACGGAAAC CGAAGACCAT TCATGTTGTT GCTCAGGTCG CAGACGTTTT GCAGCAGCAG TCGCTTCACG TTCGCTCGCG TATCGGTGAT TCATTCTGCT AACCAGTAAG GCAACCCCGC CAGCCTAGCC GGGTCCTCAA CGACAGGAGC ACGATCATGC GCACCCGTGG CCAGGACCCA ACGCTGCCCG AGATGCGCCG CGTGCGGCTG CTGGAGATGG CGGACGCGAT GGATATGTTC TGCCAAGGGT TGGTTTGCGC ATTCACAGTT CTCCGCAAGA ATTGATTGGC TCCAATTCTT GGAGTGGTGA ATCCGTTAGC GAGGTGCCGC CGGCTTCCAT TCAGGTCGAG GTGGCCCGGC TCCATGCACC GCGACGCAAC GCGGGGAGGC AGACAAGGTA TAGGGCGGCG CCTACAATCC ATGCCAACCC GTTCCATGTG CTCGCCGAGG CGGCATAAAT CGCCGTGACG ATCAGCGGTC CAGTGATCGA AGTTAGGCTG GTAAGAGCCG CGAGCGATCC TTGAAGCTGT CCCTGATGGT CGTCATCTAC CTGCCTGGAC AGCATGGCCT GCAACGCGGG CATCCCGATG CCGCCGGAAG CGAGAAGAAT CATAATGGGG AAGGCCATCC AGCCTCGCGT CGCGAACGCC AGCAAGACGT AGCCCAGCGC GTCGGCCGCC ATGCCGGCGA TAATGGCCTG CTTCTCGCCG AAACGTTTGG TGGCGGGACC AGTGACGAAG GCTTGAGCGA GGGCGTGCAA GATTCCGAAT ACCGCAAGCG ACAGGCCGAT CATCGTCGCG CTCCAGCGAA AGCGGTCCTC GCCGAAAATG ACCCAGAGCG CTGCCGGCAC CTGTCCTACG AGTTGCATGA TAAAGAAGAC AGTCATAAGT GCGGCGACGA TAGTCATGCC CCGCGCCCAC CGGAAGGAGC TGACTGGGTT GAAGGCTCTC AAGGGCATCG GTCGAGATCC CGGTGCCTAA TGAGTGAGCT AACTTACATT AATTGCGTTG CGCTCACTGC CCGCTTTCCA GTCGGGAAAC CTGTCGTGCC AGCTGCATTA ATGAATCGGC CAACGCGCGG GGAGAGGCGG TTTGCGTATT GGGCGCCAGG GTGGTTTTTC TTTTCACCAG TGAGACGGGC 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 (請先閱讀背面之注意事填寫未頁) I I 一 裝 、訂 線 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 517086 A7 B7 五、發明説明（21 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 AACAGCTGAT TGCCCTTCAC CGCCTGGCCC TGAGAGAGTT GCAGCAAGCG GTCCACGCTG 4740 GTTTGCCCCA GCAGGCGAAA ATCCTGTTTG ATGGTGGTTA ACGGCGGGAT ATAACATGAG 4800 CTGTCTTCGG TATCGTCGTA TCCCACTACC GAGATATCCG CACCAACGCG CAGCCCGGAC 4860 TCGGTAATGG CGCGCATTGC GCCCAGCGCC ATCTGATCGT TGGCAACCAG CATCGCAGTG 4920 GGAACGATGC CCTCATTCAG CATTTGCATG GTTTGTTGAA AACCGGACAT GGCACTCCAG .4980 TCGCCTTCCC GTTCCGCTAT CGGCTGAATT TGATTGCGAG TGAGATATTT ATGCCAGCCA 5040 GCCAGACGCA GACGCGCCGA GACAGAACTT AATGGGCCCG CTAACAGCGC GATTTGCTGG 5100 TGACCCAATG CGACCAGATG CTCCACGCCC AGTCGCGTAC CGTCTTCATG GGAGAAAATA 5160 ATACTGTTGA TGGGTGTCTG GTCAGAGACA TCAAGAAATA ACGCCGGAAC ATTAGTGCAG 5220 GCAGCTTCCA CAGCAATGGC ATCCTGGTCA TCCAGCGGAT AGTTAATGAT CAGCCCACTG 5280 ACGCGTTGCG CGAGAAGATT GTGCACCGCC GCTTTACAGG CTTCGACGCC GCTTCGTTCT 5340 ACCATCGACA CCACCACGCT GGCACCCAGT TGATCGGCGC GAGATTTAAT CGCCGCGACA 5400 ATTTGCGACG GCGCGTGCAG GGCCAGACTG GAGGTGGCAA CGCCAATCAG CAACGACTGT 5460 TTGCCCGCCA GTTGTTGTGC CACGCGGTTG GGAATGTAAT TCAGCTCCGC CATCGCCGCT 5520 TCCACTTTTT CCCGCGTTTT CGCAGAAACG TGGCTGGCCT GGTTCACCAC GCGGGAAACG 5580 GTCTGATAAG AGACACCGGC ATACTCTGCG ACATCGTATA ACGTTACTGG TTTCACATTC 5640 ACCACCCTGA ATTGACTCTC TTCCGGGCGC TATCATGCCA TACCGCGAAA GGTTTTGCGC 5700 CATTCGATGG TGTCCGGGAT CTCGACGCTC TCCCTTATGC GACTCCTGCA TTAGGAAGCA 5760 GCCCAGTAGT AGGTTGAGGC CGTTGAGCAC CGCCGCCGCA AGGAATGGTG CATGCAAGGA 5820 GATGGCGCCC AACAGTCCCC CGGCCACGGG GCCTGCCACC ATACCCACGC CGAAACAAGC 5880 GCTCATGAGC CCGAAGTGGC GAGCCCGATC TTCCCCATCG GTGATGTCGG CGATATAGGC 5940 GCCAGCAACC GCACCTGTGG CGCCGGTGAT GCCGGCCACG ATGCGTCCGG CGTAGAGGAT 6000 CGAGATCCAT ATGACGTCGA CGCGTCTGCA GAAGCTTGCA TGCCAGCTTC TGGTTCGTCG 6060 GCTGGGTGAT GGCGTCGGTT TTGGCCGGCG GCGTCGGCGC GATCGCCAGC GCGAAGCAAC 6120 TGGCGTTCCT CGGCGAACAT AGCGGCATGG TGGCCTTCGG CTTCTTCCGC GACCAGGTGA 6180 AGGACATGCA CTGCGATGCG GACGTGATCC TGGCCCGGTG GGATGAAAAG GCGAACTCGC 6240 CGGTGGTCTA CCGCTGCCCG AAGGCGTACC TGCTCAACAG GTTCGCATCC GCGCCCTTCG 6300 TGCCCTGGCC GGACTACACC GAGGGGGAAA GCGAGGATCT AGGTAGGGCG CTCGCAGCGG 6360 CCCTGCGGGA CGCGAAAAGG TGAGAAAAGC CGGGCACTGC CCGGCTTTAT TTTTGCTGCT 6420 GCGCGTTCCA GGCCGCCCAC ACTCGTTTGA CCTGGCTCGG GCTGCATCCG ACCAGCTTGG 6480 CCGTCTTGGC AATGCTCGAT CCGCCGGAGC GAAGCGTGAT GATGCGGTCG TGCATGCCGG 6540 CGTCACGTTT GCGGCCGGTG TAGCGGCCGG CGGCCTTCGC CAACTGGACA CCCTGACGTT 6600 -24- (請先閲讀背面之注意事！Λ塡寫本頁) 裝 、τ 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 517086 A7 B7 五、發明説明（22 ) 經濟部t央標準局員工消費合作社印製 GACGCTCGCG CCGATCCTCG TAGTCGTCGC GGGCCATCTG CAAGGCGAGC TTCAAAAGCA 6660 TGTCCTGGAC GGATTCCAGA ACGATTTTCG CCACTCCGTT CGCCTCGGCG GCCAGCTCCG 6720 ACAGGTCCAC CACGCCAGGC ACGGCCAGCT TGGCCCCTTT GGCCCGGATC GACGCAACCA 6780 GGCGCTCGGC CTCGGCCAAC GGCAAGCGGC TGATGCGGTC GATCTTCTCC GCAACGACGA 6840 CTTCACCAGG TTGCAGGTCC GCGATCATGC GCAGCAGCTC GGGCCGGTCG GCGCGTGCGC 6900 CGGACGCCTT CTCGCGGTAG ATGCCGGCGA CGTAGTACCC GGCGGCCCGC GTGGCCGCTA 6960 CAAGGCTCTC CTGGCGTTGA AGATTCTGCT CGTCCGTACT GGCGCGCAGG TAGATGCGGG 7020 CGACCTTCAA CCTTCGTCCC TCCGGTTGTT GCTCTCGCGT CGCCATTTCC ACGGCTCGAC 7080 GGCGTGCGGA TCGGACCAGA GGCCGACGCG CTTGCCTCGC GCCTCCTGTT CGAGCCGCAG 7140 CATTTCAGGG TCGGCCGCGC GGCCGTGGAA GCGATAGGCC CACGCCATGC CCTGGTGAAC 7200 CATCGCGGCG TTGACGTTGC GCGGCTGCGG CGGCCGGCTG GCCAGCTCCA TGTTGACCCA 7260 CACGGTGCCC AGCGTGCGGC CGTAACGGTC GGTGTCCTTC TCGTCGACCA GGACGTGCCG 7320 GCGGAACACC ATGCCGGCCA GCGCCTGGCG CGCACGTTCG CCGAAGGCTT GCCGCTTTTC 7380 CGGCGCGTCA ATGTCCACCA GGCGCACGCG CACCGGCTGC TTGTCTACCA GCACGTCGAT 7440 GGTGTCGCCG TCGATGATGC GCACGACCTC GCCGCGCAGC TCGGCCCATG CCGGCGAGGC 7500 AACGACCAGG ACGGCCAGCG CGGCAGCGGC GCGCAGCATG GCGTAGCTTC GGCGCTTCAT 7560 GCGTGGCCCC ATTGCTGATG ATCGGGGTAC GCCAGGTGCA GCACTGCATC GAAATTGGCC 7620 TTGCAGTAGC CGTCCAGCGC CACCCGCGAG CCGAACGCCG GCGAAAGGTA CTCGACCAGG 7680 ACGTGGATGC GCCGGCCGCG X O 丄 x 7740 GGTCCAGGCA CGAAGGCCAG CGCCTCGATG TTGAAGTCGA TGGATAGAAG TTGTCGGTAG 7800 TGCTTGGCCG CCCTCATCGC GTCCCCCTTG GTCAAATTGG GTATACCCAT TTGGGCCTAG 7860 TCTAGCCGGC ATGGCGCATT ACAGCAATAC GCAATTTAAA TGCGCCTAGC GCATTTTCCC 7920 GACCTTAATG CGCCTCGCGC TGTAGCCTCA CGCCCACATA TGTGCTAATG TGGTTACGTG 7980 TATTTTATGG AGGTTATCCA ATGAGCCGCC TGACAATCGA CATGACGGAC CAGCAGCACC 8040 AGAGCCTGAA AGCCCTGGCC GCCTTGCAGG GCAAGACCAT TAAGCAATAC GCCCTCGAAC 8100 GTCTGTTCCC CGGTGACGCT GATGCCGATC AGGCATGGCA GGAACTGAAA ACCATGCTGG 8160 GGAACCGCAT CAACGATGGG CTTGCCGGCA AGGTGTCCAC CAAGAGCGTC GGCGAAATTC 8220 TTGATGAAGA ACTCAGCGGG GATCGCGCTT GACGGCCTAC ATCCTCACGG CTGAGGCCGA 8280 AGCCGATCTA CGCGGCATCA TCCGCTACAC GCGCCGGGAG TGGGGCGCGG CGCAGGTGCG 8340 CCGCTATATC GCTAAGCTGG AACAGGGCAT AGCCAGGCTT GCCGCCGGCG AAGGCCCGTT 8400 TAAGGACATG AGCGAACTCT TTCCCGCGCT GCGGATGGCC CGCTGCGAAC ACCACTACGT 8460 TTTTTGCCTG CCGCGTGCGG GCGAACCCGC GTTGGTCGTC G 8501 (請先閲讀背面之注意事Ϊ塡寫本頁) 裝
、^T 線 -25- 83.3.10,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 517086 A7 B7 經濟部t央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（23 )參考文獻 Chambers, S., Prior, S., Barstow, D.f and Minton, N. (1988) Gene 68: 139-149. Denefle P., Kovarik, S. , Guiton, J.D., Cartwright, T,, and Mayanx, J.-F. (1987) Gene 56: 61-70. Eberl L., Kristensen C„ Givskov M., Grohmann E.t Gerlitz M., and Schawb H. (1994) Mol Microbiol 12: 131-14L Edman P· (1956) /4(：妇 10: 701-768· Gerlitz et aL, (1990) ·/.及zci. 172: 6194*6203 Gibson T. (1984) Ph.DM University of Cambridge, Cambridge, England Hirel P., Schmitter P., Dessen P., and Blanquet S. (1989) Proc. NatL Acad. ScL 86: 8247-8251. Jaye M” Howk R·, Burgess W” Ricca G” Chui I” Ravera M” CVBrien S” Modi W” Maciag T., and Drohan W. (1986) Science 233: 541-545. Jaye M., Burgess W., Shaw A., Drohan W. (1987) J. Biol Chenu 262: 16612-16617. Matsudaira P. (1987) J. BioL Chenu 262: 10035-10038. Roberts et al. (1994) J. Mol BioL 237: 35-51. Sambrook JM Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd edn. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Studier, W. Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., and Dubemdorff, J. W. (1990) Methods Enzymol 185:89-60. Yanisch-Perron, C.t Vieira, J., Messing, J. (1985) Gene 33: 1033-119. -26- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 I I 一 裝 訂 線
Claims (1)
- 517086 第084109710號專利申請案 戠 中文申請專利範圍修正本（91年η月）S 六、申請專利範圍 1. 一種製備表現質體之方法，其包含將核酸編碼序列在 噬菌體T 7啟動基因（其對應於s E Q I D Ν Ο : 1序列之核 荅酸20至36)和包含全部或部分K par)區域（其對應 於SEQ ID ΝΟ:1序列之核苷酸6038至8499)之穩定 區合併之控制下置入 SEQ ID N0: 1: GATCTCGATC CCGCGAAATT AATACGACTC ACTAXAGGGG AATTGTGAGC GGATAACAAT 60 TCCCCTCTAG aaataatttt GTTTAACTTT AAGAAGGAGA TATACATATG GCTGAAGGGG 120 AAATCACCAC CTTCACAGCC CTGACCGAGA AGTTTAATCT GCCTCCAGGG AATTACAAGA 180 AGCCCAAACT CCTCTACTGT AGCAACGGGG <3CCActtcct GAGGATCCTT CCGGATGGCA 240 CAGTGGATGG GACAAGGGAC AGGAGCGACC AGCACATTCA GCTGCAGCTC AGTGCGGAAA 300 GC<rr<3GGGGA GGTGTATATA AAGAGTACCG AGACTGCCCA GTACTTGGCC ATGGACACCG 360 ACGGGCTTTT ATACGGCTCA CAGACACCAA ATGAGGAATG TTTGTTCCTG GAAAGGCTGG 420 AGGAGAACCA TTACAACACC TATATATCCA ACAAGCATGC AGAGAAGAAT TGCTTTGTTC 480 GCCTCAAGAA GAATGGGAGC TGCAAACGCG GTCCTCGGAC TCACTATGGC CAGAAAGCAA 540 TCrrGTTTCT CCCCCTGCCA GTCTCTrCTG ATTAAAGAGA TCCGGCTGCT AACAAAGCCC 600 GAAAGGAAGC TGACTTGGCr GCTGCCACCG CTGAGCAATA ACTAGCATAA CCCCTTGGGG 660 CCTCTAAACG GGTCTTGAGG GGTTTTTTGC TGAAAGGAGC AACTATATCC GGATATCCAC 720 AGGACGGGTG TGGTCGCCAT GATCGCGTAG TCGATAGTGG CTCCAAGTAG CGAAGCGAGC 780 AGGACTGGGC GGCGGCCAAA GCGGTCGGAC AGTGCTCCGA GAACGGGTGC GCATAGAAAT 840 O:\41\41114-9U115.DOC、4 $紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 517086 六、申請專利範圍 A BCD TGCATCAACG CATATAGCGC TAGCAGCACG CCATAGTGAC TGGCGATGCT GTCGGAATGG 900 ACGATATCCC GCAAGAGGCC CGGCAGTACC GGCATAACCA AGCCTATGCC TACAGCATCC 960 AGGGTGACGG TGCCGAGGAT GACGATGAGC GCATTGTTAG ATTTCATACA CGGTGCCTGA 1020 CTGCGTTAGC AATTTAACTG TGATAAACTA CCGCATTAAA GCTTATCGAT GATAAGCTGT 1080 CAAACATGAG AATTCTTAGA AAAACTCATC GAGCATCAAA TGAAACTGCA ATTTATTCAT 1140 ATCAGGATTA TCAATACCAT ATTTTTGAAA AAGCCGTTTC TGTAATGAAG GAGAAAACTC 1200 ACCGAGGCAG TTCCATAGGA TGGCAAGATC CTGGTATCGG TCTGCGATTC CGACTCGTCC 1260 AACATCAATA CAACCTATTA ATTTCCCCTC GTCAAAAATA AGGTTATCAA GTGAGAAATC 1320 ACCATGAGTG ACGACTGAAT CCGGTGAGAA TGGCAAAAGC TTATGCATTT CTTTCCAGAC 1380 TTGTTCAACA GGCCAGCCAT TACGCTCGTC ATCAAAATCA CTCGCATCAA CCAAACCGTT 1440 ATTCATTCGT GATTGCGCCT GAGCGAGACG AAATACGCGA TCGCTGTTAA AAGGACAATT 1500 ACAAACAGGA ATCGAATGCA ACCGGCGCAG GAACACTGCC AGCGCATCAA CAATATTTTC 1560 ACCTGAATCA GGATATTCTT CTAATACCTG GAATGCTGTT TTCCCGGGGA TCGCAGTGGT 1620 GAGTAACCAT GCATCATCAG GAGTACGGAT AAAATGCTTG ATGGTCGGAA GAGGCATAAA 1680 TTCCGTCAGC CAGTTTAGTC TGACCATCTC ATCTGTAACA TCATTGOCAA CGCTACCTTT 1740 GCCATGTTTC AGAAACAACT CTGGCGCATC GGGCTTCCCA TACAATCGAT AGATTGTCGC 1800 ACCTGATTGC CCGACATTAT CGCGAGCCCA TTTATACCCA TATAAATCAG CATCCATGTT 1860 GGAATTTAAT CGCGGCCTCG AGCAAGACGT TTCCCGTTGA ATATGGCTCA TAACACCCCT 1920 TGTATTACTG TTTATGTAAG CAGACAGTTT TATTGTTCAT GACCAAAATC CCTTAACGTG 1980 AGTTTTCGTT CCACTGAGCG TCAGACCCCG TAGAAAAGAT CAAAGGATCT TCTTGAGATC 2040 CTTTTTTTCT GCGCGTAATC TGCTGCTTGC AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG 2100 TTTGTTTGCC GGATCAAGAG CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG 2160 CGCAGATACC AAATACTGTC CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC TTCAAGAACT 2220 CTGTAGCACC GCCTACATAC CTCGCTCTGC TAATCCTGTT ACCAGTGGCT GCTGCCAGTG 2280 GCGATAAGTC GTGTCTTACC GGGTTGGACT CAAGACGATA GTTACCGGAT AAGGCGCAGC 2340 GGTCGGGCTG AACGGGGGGT TCGTGCACAC AGCCCAGCTT GGAGCGAACG ACCTACACCG 2400 AACTGAGATA CCTACAGCGT GAGCTATGAG AAAGCGCCAC GCTTCCCGAA GGGAGAAAGG 2460 CGGACAGGTA TCCGGTAAGC GGCAGGGTCG GAACAGGAGA GCGCACGAGG GAGCTTCCAG 2520 GGGGAAACGC CTGGTATCTT TATAGTCCTG TCGGGTTTCG CCACCTCXGA CTTGAGCGTC 2580 GATTTTTGTG ATGCTCGTCA GGGGGGCGGA GCCTATGGAA AAACGCCAGC AACGCGGCCT 2640 TTTTACGGTT CCTGGCCTTT TGCTGGCCTT TTGCTCACAT GTTCTTTCCT GCGTTATCCC 2700 CTGATTCTGT GGATAACCGT ATTACCGCCT TTGAGTGAGC TGATACCGCT CGCCGCAGCC 2760 O:\41\41114-91II15.DOa 4 - 2 -本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 517086 六、申請專利範園 A BCD GAACGACCGA GCGCAGCGAG TCAGTGAGCG AX3GAAGCGGA AGAGCGCCTG ATGCGGTATT 2820 TTCTCCTTAC GCATCTGTGC GGTATTTCAC ACCGCATATA TGGTGCACTC TCAGTACAAT 2880 CTGCTCTGAT GCCGCATAGT TAAGCCAGTA TACACTCCGC TATCGCTACG TGACTGGGTC 2940 ATGGCTGCGC CCCGACACCC GCCAACACCC GCTGACGCGC CCTGACGGGC TTGTCTGCTC 3000 CCGGCATCCG CTTACAGACA AGCTGTGACC GTCTCCGGGA GCTGCATGTG TCAGAGGTTT 3060 TCACCGTCAT CACCGAAACG CGCGAGGCAG CTGCGGTAAA GCTCATCAGC GTGGTGGTGA 3120 AGCGATTCAC AGATGTCTGC CTGTTCATCC GCGTCCAGCT CGTTGAGTTT CTCCAGAAGC 3180 GTTAATGTCT GGCTTCTGAT AAAGCGGGCC ATGTTAAGGG CGGTTTTTTC CTGTTTGGTC 3240 ACTGATGCCT CCGTGTAAGG GGGATTTCTG TTCATGGGGG TAATGATACC GATGAAACGA 3300 GAGAGGATGC TCACGATACG GGTTACTGAT GATGAACATG CCCGGTTACT GGAACGTTGT 3360 GAGGGTAAAC AACTGGCGGT ATGGATGCGG CGGGACCAGA^ GAAAAATCAC TCAGGGTCAA 3420 TGCCAGCGCT TCGTTAATAC AGATGTAGGT GTTCCACAGG GTAGCCAGCA GCATCCTGCG 3480 ATGCAGATCC GGAACATAAT GGTGCAGGGC GCTGACTTCC GCGTTTCCAG ACTTTACGAA 3540 ACACGGAAAC CGAAGACCAT TCATGTTGTT GCTCAGGTCG CAGACGTTTT GCAGCAGCAG 3600 TCGCTTCACG TTCGCTCGCG TATCGGTGAT TCATTCTGCT AACCAGTAAG GCAACCCCGC 3660 CAGCCTAGCC GGGTCCTCAA CGACAGGAGC ACGATCATGC GCACCCGTGG CCAGGACCCA 3720 ACGCTGCCCG AGATGCGCCG CGTGCGGCTG CTGGAGATGG CGGACGCGAT GGATATGTTC 3780 TGCCAAGGGT TGGTTTGCGC ATTCACAGTT CTCCGCAAGA ATTGATTGGC TCCAATTCTT 3840 GGAGTGGTGA ATCCGTTAGC GAGGTGCCGC CGGCTTCCAT TCAGGTCGAG GTGGCCCGGC 3900 TCCATGCACC GCGACGCAAC GCGGGGAGGC AGACAAGGTA TAGGGCGGCG CCTACAATCC 3960 ATGCCAACCC GTTCCATGTG CTCGCCGAGG CGGCATAAAT CGCCGTGACG ATCAGCGGTC 4020 CAGTGATCGA AGTTAGGCTG GTAAGAGCCG CGAGCGATCC TTGAAGCTGT CCCTGATGGT 4080 CGTCATCTAC CTGCCTGGAC AGCATGGCCT GCAACGCGGG CATCCCGATG CCGCCGGAAG 4140 CGAGAAGAAT CATAATGGGG -AAGGCCATCC AGCCTCGCGT CGCGAACGCC AGCAAGACCT 4200 AGCCCAGCGC GTCGGCCGCC ATGCCGGCGA TAATGGCCTG CTTCTCGCCG AAACGTTTGG 4260 TGGCGGGACC AGTGACGAAG GCTTGAGCGA GGGCGTGCAA GATTCCGAAT ACCGCAAGCG 4320 ACAGGGCGAT CATCGTCGCG CTCC^GCGAA AGCGGTCCTC GCCGAAAATG ACCCAGAGCG 4380 CTGCCGGCAC CTGTCCTACG AGTTGCATGA TAAAGAAGAC AGTCATAAGT GCGGCGACGA 4440 TAGTCATGCC CCGCGCCCAC CGGAAGGAGC TGACTGGGTT GAAGGCTCTC AAGGGCATCG 4500 GTCGAGATCC CGGTGCCTAA TGAGTGAGCT AACTTACATT AATTGCGTTG CGCTCACTGC 4560 CCGCTTTCCA GTCGGGAAAC CTGTCGTGCC AGCTGCATTA ATGAATCGGC CAACGCGCGG 4620 GGAGAGGCGG TTTGCGTATT GGGCGCCAGG GTGGTTTTTC TTTTCACCAG TGAGACGGGC 4 6 80 O:\41\41114-911115.DOa 4 - 3本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 517086 六、申請專利範圍 AACAGCTGAT TGCCCTTCAC CGCCTGGCCC TGAGAGAGTT GCAGCAAGCG GTCCACGCTG 4740 GTTTGCCCCA GCAGGCGAAA ATCCTGTTTG ATGGTGGTTA ACGGCGGGAT ATAACATGAG 4800 CTGTCTTCGG TATCGTCGTA TCCCACTACC GAGATATCCG CACCAACGCG CAGCCCGGAC 4860 TCGGTAATGG CGCGCATTGC GCCCAGCGCC ATCTGATCGT TGGCAACCAG CATCGCAGTG 4920 GGAACGATGC CCTCATTCAG CATTTGCATG GTTTGTTGAA AACCGGACAT GGCACTCCAG .4980 I TCGCCTTCCC GTTCCGCTAT CGGCTGAATT TGATTGCGAG TGAGATATTT ATGCCAGCCA 5040 . GCCAGACGCA GACGCGCCGA GACAGAACTT AATGGGCCCG CTAACAGCGC GATTTGCTGG 5100 TGACCCAATG CGACCAGATG CTCCACGCCC AGTCGCGTAC CGTCTTCATG GGAGAAAATA 5160 ATACTGTTGA TGGGTGTCTG GTCAGAGACA TCAAGAAATA ACGCCGGAAC ATTAGTGCAG 5220 GCAGCTTCCA CAGCAATGGC ATCCTGGTCA TCCAGCGGAT AGTTAATGAT CAGCCCACTG 5280 ACGCGTTGCG CGAGAAGATT GTGCACCGCC GCTTTACAGG CTTCGACGCC GCTTCGTTCT 5340 ACCATCGACA CCACCACGCT GGCACCCAGT TGATCGGCGC GAGATTTAAT CGCCGCGACA 5400 ATTTGCGACG GCGCGTGCAG GGCCAGACTG GAGGTGGCAA CGCCAATCAG CAACGACTGT 5460 TTGCCCGCCA GTTGTTGTGC CACGCGGTTG GGAATGTAAT TCAGCTCCGC CATCGCCGCT 5520 TCCACTTTTT CCCGCGTTTT CGCAGAAACG TGGCTGGCCT GGTTCACCAC GCGGGAAACG 5580 GTCTGATAAG AGACACCGGC ATACTCTGCG ACATCGTATA ACGTTACTGG TTTCACATTC 5640 ACCACCCTGA ATTGACTCTC TTCCGGGCGC TATCATGCCA TACCGCGAAA GGTTTTGCGC 5700 CATTCGATGG TGTCCGGGAT CTCGACGCTC TCCCTTATGC GACTCCTGCA TTAGGAAGCA 5760 GCCCAGTAGT AGGTTGAGGC CGTTGAGCAC CGCCGCCGCA AGGAATGGTG CATGCAAGGA 5820 GATGGCGCCC AACAGTCCCC CGGCCACGGG GCCTGCCACC ATACCCACGC CGAAACAAGC 5880 GCTCATGAGC CCGAAGTGGC GAGCCCGATC TTCCCCATCG GTGATGTCGG CGATATAGGC 5940 GCCAGCAACC GCACCTGTGG CGCCGGTGAT GCCGGCCACG ATGCGTCCGG CGTAGAGGAT 6000 CGAGATCCAT ATGACGTCGA CGCGTCTGCA GAAGCTTGCA TGCCAGCTTC TGGTTCGTCG 6060 GCTGGGTGAT GGCGTCGGTT TTGGCCGOCG GCGTCGGCGC GATCGCCAGC GCGAAGCAAC 6120 TGGCGTTCCT CGGCGAACAT AGCGGCATGG TGGCCTTCGG CTTCTTCCGC GACCAGGTGA 6180 AGGACATGCA CTGCGATGCG GACGTGATCC TGGCCCGGTG GGATGAAAAG GCGAACTCGC 6240 CGGTGGTCTA CCGCTGCCCG AAGGCGTACC TGCTCAACAG GTTCGCATCC GCGCCCTTCG 6300 TGCCCTGGCC GGACTACACC GAGGGGGAAA GCGAGGATCT AGGTAGGGCG CTCGCAGCGG 6360 CCCTGCGGGA CGCGAAAAGG TGAGAAAAGC CGGGCACTGC CCGGCTTTAT TTTTGCTGCT 6420 GCGCGTTCCA GGCCGCCCAC ACTCGTTTGA CCTGGCTCGG GCTGCATCCG ACCAGCTTGG 6480 CCGTCTTGGC AATGCTCGAT CCGCCGGAGC GAAGCGTGAT GATGCGGTCG TGCATGCCGG 6540 CGTCACGTTT GCGGCCGGTG TAGCGGCCGG CGGCCTTCGC CAACTGGACA CCCTGACGTT 6600 O:\41\41114-911115.DOC\ 4 -4-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 517086 六、申請專利範圍 GACGCTCGCG CCGATCCTCG TAGTCGTCGC GGGCCATCTG CAAGGCGAGC TTCAAAAGCA 6660 TGTCCTGGAC GGATTCCAGA ACGATTTTCG CCACTCCGTT CGCCTCGGCG GCCAGCTCCG 6720 ACAGGTCCAC CACGCCAGGC ACGGCCAGCT ψ TGGCCCCTTT GGCCCGGATC GACGCAACCA 6780 GGCGCTCGGC CTCGGCCAAC GGCAAGCGGC TGATGCGGTC GATCTTCTCC GCAACGACGA 6840 CTTCACCAGG TTGCAGGTCC GCGATCATGC GCAGCAGCTC GGGCCGGTCG GCGCGTGCGC 6900 CGGACGCCTT CTCGCGGTAG ATGCCGGCGA CGTAGTACCC GGCGGCCCGC GTGGCCGCTA 6960 CAAGGCTCTC CTGGCGTTCA AGATTCTGCT CGTCCGTACT GGCGCGCAGG TAGATGCGGG 7020 CGACCTTCAA CCTTCGTCCC TCCGGTTGTT GCTCTCGCGT CGCCATTTCC ACGGCTCGAC 7080 GGCGTGCGGA TCGGACCAGA GGCCGACGCG CTTGCCTCGC GCCTCCTGTT CGAGCCGCAG 7140 CATTTCAGGG TCGGCCGCGC GGCGGTGGAA GCGATAGGCC CACGCGATGC CCTGGTGAAC 7200 CATCGCGGCG TTGACGTTGC GCGGCTGCGG CGGCCGGCTG GCCAGCTCCA TGTTGACCCA 7260 CACGGTGCCC AGCGTGCGGC CGTAACGGTC GGTGTCCTTC TCGTCGACCA GGACGTGCCG 7320 GCGGAACACC ATGCCGGCCA GCGCCTGGCG CGCACGTTCG CCGAAGGCTT GCCGCTTTTC 7380 CGGCGCGTCA ATGTCCACCA GGCGCACGCG CACCGGCTGC TTGTCTACCA GCACGTCGAT 7440 GGTGTCGCCG TCGATGATGC GCACGACCTC GCCGCGCAGC TCGGCCCATG CCGGCGAGGC 7500 AACGACCAGG ACGGCCAGCG CGGCAGCGGC GCGCAGCATG GCGTAGCTTC GGCGCTTCAT 7560 .GCGTGGCCCC ATTGCTGATG ATCGGGGTAC GCCAGGTGCA GCACTGCATC GAAATTGGCC 7620 TTGCAGTAGC CGTCCAGCGC CACCCGCGAG CCGAACGCCG GCGAAAGGTA CTCGACCAGG 7680 CCGGGCCGGT CGCGGACCTC GCGCCCCAGG ACGTGGATGC GCCGGCCGCG TGTGCCGTCG 7740 GGTCCAGGCA CGAAGGCCAG CGCCTCGATG TTGAAGTCGA TGGATAGAAG TTGTCGGTAG 7800 TGCTTGGCCG CCCTCATCGC GTCCCCCTTG GTCAAATTGG GTATACCCAT TTGGGCCTAG 7860 TCTAGCCGGC ATGGCGCATT ACAGCAATAC GCAATTTAAA TGCGCCTAGC GCATTTTCCC 7920 GACCTTAATG CGCCTCGCGC TGTAGCCTCA CGCCCACATA TGTGCTAATG TGGTTACGTG 7980 TATTTTATGG AGGTTATCCA ATGAGCCGCC TGACAATCGA CATGACGGAC CAGCAGCACC 8040 j AGAGCCTGAA AGCCCTGGCC GCCTTGCAGG GCAAGACCAT TAAGCAATAC GCCCTCGAAC 8100 GTCTGTTCCC CGGTGACGCT GATGCCGATC AGGCATGGCA GGAACTGAAA ACCATGCTGG 8160 GGAACCGCAT CAACGATGGG CTTGCCGGCA AGGTGTCCAC CAAGAGCGTC GGCGAAATTC 8220 TTGATGAAGA ACTCAGCGGG GATCGCGCTT GACGGCCTAC ATCCTCACGG CTGAGGCCGA 8280 AGCCGATCTA CGCGGCATCA TCCGCTACAC GCGCCGGGAG TGGGGCGCGG CGCAGGTGCG 8340 CCGCTATATC GCTAAGCTGG AACAGGGCAT AGCCAGGCTT GCCGCCGGCG AAGGCCCGTT 8400 TAAGGACATG AGCGAACTCT TTCCCGCGCT GCGGATGGCC CGCTGCGAAC ACCACTACGT 8460 TTTTTGCCTG CCGCGTGCGG GCGAACCCGC GTTGGTCGTC G 8501 O:\41\41114-911115.DOa 4 -5-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 2·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該噬菌體T 7啟 動基因是基因1〇之啟動基因。 〇·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該穩定區域 包含邵分之K p a r)區域。 4·根據申請專利範圍第3項之方法，其中該穩定區域包含 在序列SEQ ID ΝΟ:1之殘基6038至849 9處所發現之 片段。 5.根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含插入 喿縱基因和Uclq基因。 6·根據申請專利範圍第5項之方法，其中該lac0換縱基 因係位於噬菌體T 7啟動基因之下游和核酸編碼序列之 上游。 7·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該核酸編碼序列 係編碼一種蛋白質，此蛋白質為一種醫藥、農藥或可 用於生物催化作用上。 8·根據申請專利範圍第7項之方法，其中該核酸編碼序列 係編碼一種多肽，其係為酶、血液產物、荷爾蒙、淋 巴細胞活素、生長因素、神經遞質或其前趨體或其供 其使用之合成酶、促因素、脫輔基脂蛋白、營養不良 因素或微營養不良因素、CFTR蛋白質、腫瘤抑制基因 夕月太、與凝固作用有關之多肽因素、或與D N A修補有 關之多肽。 O:\41\41114-911115.DOC\ -6- 59·根據申請專利範圍第8項之方法，其中該核酸編碼序列 係編碼一種酸性纖維母細胞生長因素（a F G F )。 10·根據申請專利範圍第9項之方法，其中該核酸編碼序列 係編碼 a F G F ( 1 5 4 )。 11. 根據申請專利範圍第丨項之方法，其係用於製備具有 SEQ ID N0:1所示序列之質體pxl2435。 12. —種製備保有根據申請專利範圍第1項之方法所製備質 體之細菌之方法，其包含將該質體轉形該細菌。 13·根據申請專利範圍第1 2項之方法，其中該細菌亦保有 用以編碼噬菌體T7 RNA聚合酶之核酸序列。 14·根據申請專利範圍第1 3項之方法，其中該用以編碼噬 菌體T 7 R N A聚合酶之基因序列，係在可誘發啟動基 因之控制下。 15. 根據申請專利範圍第1 3或1 4項之方法，其中該用以編 碼嗟菌體T 7 R N A聚合酶之基因序列，係被整合至細 菌之基因組内。 16. 根據申請專利範圍第1 2項之方法，其中該細菌係為大 腸择萌° 17·根據申請專利範圍第1 6項之方法，其中該細菌係菌株 BL2 1或DE3之大腸桿菌。 O:\41\41114-9im5.DOC\ 4 - 7 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
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