MXPA97001614A - Procedimiento de produccion de proteinas recombinantes, plasmidos y celulas modificadas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a plásmidos de expresión que comprenden una secuencia de unácido nucleico de interés bajo el control de un promotor del bacteriófago T7 y una región estabilizadora que comprende la totalidad o una parte de la región par del plásmido RP4 o de un derivado del mismo;y a su utilización para la producción de productos recombinantes.

Description

PROCEDIMIENTO DE PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES, PLASMIDOS Y CÉLULAS MODIFICADAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la producción de proteínas recombinantes en bacterias. Esta se refiere más parti ularmente a un nuevo procedimiento que permite una producción elevada de proteínas recombinantes en bacterias. utilizando un sistema de expresión particularmente estable y eficaz que comprende un promotor del bacteriófago T7 y una región de estabilización. La presente invención igualmente se refiere a los plásmidos utilizables en este procedimiento y a las proteínas recombinantes asi producidas. Las bacterias y en particular E. cal i se pueden utilizar para producir proteínas de diversos orígenes, ya sea de procariotes o de eucariotes. En particular, las proteínas humanas se pueden producir en E. col i . Para esto, el gen de estructura o el ADNc del gen que codifica para la protelna en cuestión, debe ser colocado atrás de las señales de expresión apropiadas (promotor y sitio de fijación de ribosomas) reconocidas por la maquinaria de expresión de E. col i . El sistema más eficaz utilizado en E. cal i es el sistema descrito por Studier (Studier et al.. 1990). Este sistema consiste en la utilización de un promotor del fago T7 que es reconocido específicamente por REF: 24018 la ARN polimerasa de este mismo bacteriófago (jr_ col i no posee per se ningún promotor reconocido por esta misma poiimerasa). En este sistema de expresión hay una inducción, por ejemplo en el IPTG, de la expresión del gen de la ARN polimerasa del fago T7 (estando este posicionado bajo el control de un promotor inducible tal como el PlácOV5 de E. col i) . Esta inducción da como resultado la expresión del gen colocada bajo el control del bacteriófago T7 reconocido por la polimerasa. Como la polimerasa no reconoce al promotor cadena arriba del gen por expresar, éste es expresado, en general, a un nivel muy elevado (por arriba de cualquier por ciento de proteínas totales bacterianas). Numerosas publicaciones en la actualidad mencionan la utilización de este sistema inicialmente descrito por Studier (Studier et al., 1990). Tal como se indicó anteriormente, las bacterias y en particular E. col i, se utilizan para la producción de proteínas humanas de interés farmacéutico. Si estas proteínas deben ser utilizadas en diversas técnicas, es conveniente prepararlas respetando la reglas de las buenas prácticas de manufacturas (BPL) . Para lograr esto, es indispensable poseer un sistema de producción que sea reproducible y que asegure la obtención de un producto de calidad altamente definida, que tenga una gran dureza. Uno de los aspectos importantes de un procedimiento de producción de una proteína de interés farmacéutico, recibe en la cepa que permite la producción de dicha protelna. En efecto, es necesario que esta cepa asegure un modo de producción reproducible tanto a nivel cualitativo como a nivel cuantitativo. A nivel cualitativo, por ejemplo, es conveniente producir una proteína de una homogeneidad total; es decir, que tenga una secuencia primaria idéntica a la de la proteína natural. En efecto, si en una célula bacteriana. en el transcurso de la fermentación, se produce una mutación puntual que modifica la secuencia codificada de la proteína por expresar, se obtendrá como resultado la producción de una protelna modificada mezclada con la proteína de secuencia natural. Una vez en el ser humano, esta proteina modificada podría inducir una reacción inmunitaria que podría ser nefasta en el tratamiento, o bien, durante un tratamiento posterior podria producir una reacción inmunitaria grave. A nivel cuantitativo, se admite que un procedimiento debe ser reproducible. Esto constituye una prueba de la calidad del producto obtenido. Asi pues, es necesario que haya entre los diferentes lotes de producción la misma velocidad de síntesis de la proteina en cuestión por unidad de biomasa. en la misma unidad de tiempo, utilizando las mismas condiciones de cultivo y de crecimiento. Un aspecto muy importante de esta reprod- ibilidad del nivel de la producción de la proteína, reside en la presencia del plásmido que porta el cartucho de expresión en las células bacterianas. Un procedimiento de fermentación se domina mejor cuando todas las células poseen el plásmido al final del cultivo (antes y después de la producción de la protelna) . Para mantener el plásmido en las bacterias, en general se agrega al medio de cultivo un antibiótico selectivo para la presencia del plásmido. Esto puede presentar diversos problemas: el costo del antibiótico a nivel de la preparación del medio de fermentación; como el antibiótico no puede ser esterilizado por autoclave, es conveniente agregarlo extemporáneamente al medio de cultivo, el antibiótico podria no ser estable y generar productos de transformación tóxicos en el hombre, o por lo menos conducir en ciertos pacientes a efectos secundarios indeseables; el antibiótico también podría ser tóxico por si mismo en el hombre, o cuando menos conducir, en ciertos pacientes, a efectos secundarios indeseables. En estos dos últimos casos, será necesario demostrar que en el producto purificado. las trazas de productos tóxicos correspondientes ya sea al antibiótico, o bien a los productos derivados, son inferiores, para las dosis administradas, que los niveles susceptibles de producir efectos secundarios o tóxicos. Esto se traduce en estudios prolongados y costosos. La presente invención permite resolver estos problemas. La presente invención proporciona, en efecto, un sistema de expresión particularmente eficaz, en el cual el antibiótico no es necesario para mantener el plásmido en el curso de las generaciones bacterianas que se desarrollan en el fermentador. La presente invención recibe en particular, en la construcción de un sistema de expresión plasmídica en el cual la expresión se realiza gracias a un promotor del bactriófago T7. y que comprende una región estábil izadora. El sistema de conformidad con la presente invención es particularmente ventajoso porque contrariamente a lo observado en el sistema de Studier et al. permite mantener los plásmidos en todas las células bacterianas después de la inducción de la expresión de la proteina por expresar» en condiciones de cultivo en las que no hay antibiótico; es decir. sin presión de selección. Los plásmidos de Studier (Studier et al., 1990) . después de la inducción de la expresión, no son recuperados más que en una fracción muy pequeña de las células. Está claro que el sistema de la presente invención estabiliza fuertemente los plásmidos. lo cual aumenta los niveles de producción de las proteínas recombinantes y la reproducibi 1 idad del procedimiento. La región de estabilización utilizada para la construcción de los plasmidos de conformidad con la presente invención, se deriva más precisamente del fragmento P n?ar del, p.la,smi.d.o RP4. Un primer objetivo de la presente invención reside, pues. en un plásmido de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de interés bajo el control de un promotor del bacteriófago T7 y una región est bil izadora que comprende la totalidad o una parte de la región par del plásmido RP4 o de un derivado del mismo. De preferencia, el promotor del bacteriófago T7 utilizado en los plásmidos de la presente invención, es el promotor del gen 10. Tal como se indicó anteriormente. la región estábil izadora utilizada en los plásmidos de la presente invención se deriva del fragmento par del plásmido RP4 (Gerlitz et al.. 1990). Este fragmento tiene diferentes funciones ( en particular 5 genes designados como par A . parB, parC, parD y parE) y principalmente una proteina que debe tener una actividad de recombinación especifica de sitio, que permita probablemente separar los dímeros plasmidicos (Eberl et al.. 1994). Este fragmento par se puede aislar a partir del plásmido RP4 y clonar en los plásmidos de expresión de la presente invención, de la manera descrita en los ejemplos. Por otro lado, este fragmento se puede modificar antes o después de su introducción en los plásmidos de la invención. Así pues, la región estabi 1 izadora de los plásmidos de la presente invención puede estar constituida por la totalidad o una parte de la región par dßl pla3mido RP4 0 d? un d?rivado del mismo. En particular. la región estábil izadora de los plásmidos puede estar constituida por el inserto PstI del plásmido pTUG3 o de sus fragmentos Sp l-Sphl-Sphl del pOH23 o Sp l-Sphl-Cl l del pOH41 o Sphl-Sphl-BapHI del pGMA2? o del Sphl-Sphl-Ba l del pGMA27. los cuales son descritos por Gerlitz et al.. 1990 o del subfragmento del insertoPs-:I del pTUG3 que contiene cuando menos el inserto Sphl-Sphl-BapHI del pGMA27. Cuando el inserto Pstl del pTUG3 contiene los genes parCBA-parDE y las regiones de los flancos, los insertos del pGMA27 o del pGMA28 no contienen más que los genes parCBA-parDE ' y la región 5' del flanco. La región est bil izadora igualmente puede estar constituida por los genes parDE o por el gen parD y por la región promotora o cualquier otro promotor tal como los descritos por Roberts et al.. 1994. Esta región se puede obtener a partir del fragmento Styl-Clal contenido en el plásmido pTUG3. La región est bil izadora también puede estar constituida por cualquier combinación de 2. 3 o 43 genes par contenidos en el plásmido pTUG3. por ejemplo parA-parD o parB-parD o parAC-parD o parBA-parDE. con su región promotora o con cualquier otro promotor. El término derivado de la región pa comprende cualquier fragmento obtenido por modificación genética y/o química de la región par y que sea apto para la realización de los plásmidos estables de conformidad con la presente invención. En particular, estos derivados se pueden obtener mediante deleciones, mutaciones, adiciones, rompimientos, ligamientos, etc. a nivel de la región par del plásmido RP4. según las técnicas conocidas por los técnicos en la materia. Posteriormente, la funcionalidad de los derivados se puede probar de la manera descrita en los ejemplos (véase principalmente el Ejemplo 2) . Ventajosamente en los plásmidos de conformidad con la presente invención, la región est bil izadora comprende una parte de la región p r del plásmido RP4. En una modalidad particular de realización, la región estábil izadora está constituida por un fragmento comprendido entre los residuos 6038 y 8499 de la secuencia SEQ ID No 1. En una modalidad preferida, los plásmidos de la presente invención comprenden, además, el operador ¡acO y el gen lacf . En efecto, se ha constatado que a pesar de la presencia de un promotor del bacteriófago T7 especifico de una polimerasa no presente en E. col i, se produce una expresión basal de la secuencia del ácido nucleico de interés sin inductor. Esta expresión residual puede inducir una cierta base de estabilidad del plásmido. En los plásmidos de la presente invención, la presencia del operador l a c0 y del gen 1 ¿¡cI pßrmitß ventajosamente obtener una expresión más regulada de la secuencia del ácido nucleico y en particular, permite inhibir cualquier expresión en ausencia del inductor. Los plásmidos que incorporan estos elementos poseen entonces, una mayor estabilidad y un mayor control de la expresión. Para obtener el efecto deseado, el operador jacO ventajosamente es colocado cadena abajo del promotor del bacteriófago T7 y cadena arriba de la secuencia del ácido nucleico de interés, tal como se indica en los ejemplos. El gen l cl^ se inserta en el plásmido. de preferencia con su propio promotor, en una región no esencial para las propiedades deseadas para el plásmido. Asi pues, el gen de preferencia se inserta a parte de la región par y del cartucho de expresión de la secuencia del ácido nucleico de interés. Las secuencias de este operador y del gen l cl^ están dadas en la secuencia SEQ ID No 1. Deben entenderse que estos elementos pueden ser reemplazados por secuencias homologas o que posean funciones equivalentes. En una modalidad particularmente preferida, los plásmidos de conformidad con ia presente invención comprenden igualmente un terminador de transcripción, situado cadena abajo de la secuencia del ácido nucleico de interés. Ventajosamente. el terminador de transcripción utilizado es el del gen del bacteriófago T7 cuyo promotor es utilizado. De preferencia se trata de un treminador Phi del bacteriófago T7. La secuencia de ácido nucleico de interés presente en los plásmidos de conformidad con la presente invención, puede ser cualquier frecuencia que codifique para una proteína de interés farmacéutico, agroalimentario o que pueda ser utilizada para la biocatálisis. Se puede tratar de un gen de estructura, de una secuencia de ADN complementaria, de una secuencia sintética, semisintética, ets . De preferencia, la secuencia de ácido nucleico que codifica para una protelna de interés farmacéutico, se selecciona por ejemplo del grupo que consiste de las enzimas, derivados sanguíneos, hormonas. linfocinas ( interleucinas. interferones TNF. etc.). factores de crecimiento, neurotransmisores o sus precursores o enzimas de síntesis, factores tróficos: BDNF. CNTF. MGF. IGF. GMF. aFGF, bFGF. NT3. NT5. HARP/pleiotrofina. etc; apol ipoprotßínas: ApoAI. ApoAIV. ApoE. etc.. distrofina o una minidistrofina. proteina CFTR asociada con la mucovisidosis. genes supresores de tumores: p53. Rv.

RaplA, DCC, k-rev, etc.. genes que codifican para factores implicados en la coagulación: factores VII, VIII. IX, genes que intervienen en la reparación del ADN. etc. En una modalidad particular de la presente invención. la secuencia de ácido nucleico de interés codifica para un factor de crecimiento de fibroblastos ácido (aFGF) . El ADNc de la forma nativa del gen aFGF humano ha sido identificado, secuenciado y clonado (Jaye et al.. 1986 y 1987). Este ADNc puede codificar para diferentes formas del aFGF. según la presencia de deleciones en la fracción N-terminal, y principalmente formas que comprenden 154. 140 o los mismos 134 aminoácidos. Además. igualmente se pueden producir variantes naturales o artificiales, dando como resultado modificaciones por deleción. mutación y/o adición de uno o más pares de bases en la secuencia del gen nativo (por ejemplo de una metionina N-tßrminal). En una modalidad también especifica de la presente invención, la secuencia del ácido nucleico de interés codifica para el aFGF(154) . A manera de ejemplo especifico, se puede citar el plásmido pXL2435 presentado en la secuencia SEQ ID No 1. Otro objetivo de la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de proteínas recombinantes. Más particularmente el procedimiento de producción de conformidad con la invención consiste en cultivar una bacteria que contiene: -Un plásmido tal como el anteriormente descrito, portador de una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicha protßína. -El gen de la ARN polimerasa del bacteriófago T7. en condiciones que -permitan la expresión de la secuencia del ácido nucleico. Tal como se indicó anteriormente, el interés del sistema reside principalmente en la utilización de un promotor del bacteriófago T7 reconocido específicamente por la ARN polimerasa del mismo bacteriófago T7. La bacteria utilizada, entonces, debe comprender, además del plásmido de la presente invención, un cartucho que permita la expresión de la ARN polimerasa del bacteriófago T7.

Este cartucho puede estar ya sea integrado al genoma de la bacteria utilizada (cepa E. col i BL2^ DE3) ^ Q bißn pußdß ser portado por un segundo plásmido o un fago, aún estar presente en el plásmido de la presente invención. Ventajosamente, en el cartucho de expresión, el gen que codifica para el ARN de la polimerasa del bacteriófago T7 está colocado bajo el control de un promotor inducible tal como el promotor lac. trp o rßcA . Esto permite en efecto inducir de manera controlada, la producción de la ARN polimerasa en la célula y, por lo tanto, controlar la expresión de la secuencia de ácido nucleico de interés colocada bajo el control del promotor especifico de dicha ARN polimerasa. De preferencia el promotor inducible que controla la expresión de la ARN polimerasa del bacteriófago T7 es el promotor P l a cUV5 d? E col i ?l cual es inducido específicamente en presencia de IPTG . Tal como .se indicará con mayor detalle en los ejemplos, el procedimiento de la presente invención permite una producción, a tasas elevadas y de manera reproducible, de proteínas no modificadas. Este procedimiento permite también una producción industrial de proteínas recombinantes de calidad farmacéutica. El procedimiento de conformidad con la presente invención está particularmente adaptado para la producción de factores de crecimiento de fibroblastos recombinantes (aFGF, bFGF principalmente) . Asi pues, un objetivo particular de la presente invención reside en un procedimiento de preparación de aFGF recombinante, según el cual se cultiva una bacteria conteniendo el plásmido pXL2435 y el gen de la ARN polimerasa del bacteriófago T7. en condiciones que permitan la expresión de la secuencia del ácido nucleico y se recupera el producto aFGF. La presente invención será descrita de manera más completa con la ayuda de los siguientes ejemplos, los cuales se deben considerar como ilustrativos y no 1 imitantes . ABREVIATURAS UTILIZADAS. aFGF: factor de crecimiento ácido de fibroblastos pb: pares de bases DO: densidad óptica E. col i : Escherichia col i IPTG : isopropi ltio-ß-D-galactósido kb: kilobases kDa: kilodaltons Km: kanamicina LB: medio de Luria-Bertani PAGE-SDS: electroforesis en gel que contiene acrilamida, N.N' -meti lenbisacri lamida y dodecilsulfato de sodio. T7: bacteriófago T7 LEYENDAS DE FIGURAS: Figura 1: Construcción del plásmido pXL2435. A-Esquema de construcciones: Los fragmento AccI-Ndel de 3.2 kb del pETlla y de 2.8 kb del pXL2283 fueron ligados para generar el plásmido pXL2434; el plásmido pXL2434 fue digerido con Bglll y ligado con el fragmento BairHI de 2.4 kb del pXL2433. para crear el pXL2435. B-Mapa del plásmido pXL2435: aFGF: gen que codifica para la aFGF; Ampr: gen de resistencia a la ampicilina: Kmr: gen de resistencia a la kanamicina; laclq-. gen que codifica para una síntesis elevada del represor Lac; ori : origen de replicación de ColEl; parDE ' parCBA : genes del locus par del RP4; pT7: promotor 10 del T7 y operador lacO: TF: terminador TF del T7. Las flechas indican la dirección de transcripción de los genes. Los sitios de las enzimas de restricción indicados, son aquellos que fueron utilizados durante las clonaciones. Las cifras escritas entre paréntesis corresponden a las posiciones, en pares de bases, sobre la secuencia SEQ ID No. 1. Figura 2: Visual ización de la proteína aFGF producida por E. col i BL21, DE3 en ausencia del antibiótico y en presencia del plásmido pXL2283 o pXL2434 o pXL2435, después de la inducción con IPTG. Los extractos celulares totales se depositaron en el gel. M: marcadores de peso molecular que son idénticos én kDa, la flecha indica el peso molecular del aFGF. Secuencia SEQ ID No. 1: Secuencia nucleotidica del plásmido pXL2435 de 8501 pb. La posición 1 sobre la secuencia corresponde al sitio de acoplamiento de la enzima Bglll del pETlla. El gen aFGF se sitúa entre las posiciones 108 a 575. el locus par. entre las posiciones 6038 y 8499; es decir. parE ' de 8248 a 8499. parD de 8001 a 8252. parC de 7850 a 7557, parB de 7560 a 7027 y parA de 7066 a 6407; el promotor F10 del T7 entre las posiciones 20 y 36, lacO entre las posiciones 39 y 63. el terminador TF del T7 entre las posiciones 586 y 708 y el gen ¡acl* entre las posiciones 5636 y 4554. TÉCNICAS GENERALES DE CLONACIÓN, DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y DE BIOQUÍMICA. Los métodos clásicos de la biología molecular. tales como la configuración de ADN plasmidico en gradiente de cloruro de cesio/bromuro de etidio. las digestiones por enzimas de restricción, la electroforesis en gel, la electroelusión de los fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa, la transformación en E. col i . la precipitación de los ácidos nucleicos, etc., se describen en la literatura científica (Sambrook et a l . 1989). Las enzimas de restricción fueron proporcionadas por New-England Biolabs (Biolabs) , Bethesda Reseach Laboratories (BRL) o Amersham Ltd (Amersham) . Para los ligamientos, los fragmentos de ADN se separaron según su tamaño en geles de agarosa al 0 . 7%, se purificaron por electroelusión, se sometieron a extracción con fenol, se precipitaron con etanol y después se incubaron en una solución reguladora de Tris-HCl pH 7.4. 50 mM. MgCl2 10 mM. DTT 10 mM. ATP 2 mM. en presencia de ADN ligasa del fago T4 (Biolabs). Los ADN ligados o los ADN plas idicos puros se utilizaron para transformar la cepa, volviéndola competente: E. col i BL21. DE3 [F ompT hsdS (r - -- ) gal dcm (DE3)j (Studier et al . , 1990) y E. col i TG1 [ h ac proA . B) . supE. thi. hsdD5/ F ' traD36. proA+ . B+ . lac 1. (Gibson. 1984). Los ADN plasmídicos se purificaron siguiendo la técnica de lisis alcalina descrita por Sambrook et a l . , 1989. El medio de cultivo LB se utilizó para la parte bacteriológica (Sambrook et a l . , 1989). Posteriormente, diluciones de la suspensión bacteriana fueron inoculadas en placas de medio LB suplementadas con. si fuera necesario, kanamicina a 50 mg/1. El protocolo descrito por Studier et a l . , 1990 fue utilizado para producir un aFGF con la ayuda de la cepa BL21. DE3 portadora de un plásmido de expresión del aFGF (pXL2283 o pXL2434 o pXL2435 descrito en el Ejemplo 1) . La producción del aFGF se cuantificó en los extractos celulares totales. Después de lisar las bacterias, se colocaron muestras en un gel de SDS-PAGE al 15*. el cual después de la electroforesis fue coloreado con azul de Coomassie (Denéfle et al . , 1987). Con las muestras provenientes de las cepas productoras del aFGF se observó una banda de un peso molecular aparente de 16 kDa. Se realizó una transferencia semi-sec en una membrana de microcelulosa (Sambrook et a l . . 1989). la membrana se trató según el protocolo del equipo Vectastain (Biosys SA. Francia) . para permitir una detección inmunológica del aFGF (anticuerpos contra aFGF bovino obtenidos en conejos, vendidos por Sigma, Francia; y anticuerpos contra IgG de conejo) colorimétrica con la ayuda del complejo avidina peroxidasa biotinado. Se realizó otra transferencia semi-sec en membrana Pro-Blott (Matsudaira. 1987) , la membrana se tifió con azul de Coomassie y la banda de peso molecular aparente de 16 kDa fue cortada. Esta parte de la membrana fue sometida a la de.gradación de Ed an, 1956, con la ayuda de un microsecuenciador de Applied Biosystems modelo 477A. que contiene un analizador 130/7 en línea y se utilizó según las especificaciones del fabricante. Ejemplo 1 - Construcción de un plásmido estable y regulado para la expresión del ADNc del aFGF humano. Este ejemplo describe las construcciones realizadas para obtener un plásmido estable y muy regulado, que permite la producción del aFGF en E. col i . El ADNc de la forma nativa del gen del aFGF humano (470 pb) (Jaye ?t a l . , 1986 y 1987) se identificó, se secuenció y se clonó en el vector de expresión pET9 (Studier et al . . 1990) en los sitios -Vdel y Bai?il . para generar el plásmido de expresión pMJ42. denominado de aquí en adelante como pXL2283 (véase la Figura 1). El inserto Ndel-Accl de 2.8 kb del plásmido pXL2283 fue ligado con el fragmento Ndel-Accl de 3.2 kb del plásmido pETlla (Studißr ßt a l . . 1990) para crear el plásmido de expresión pXL2434.

Este plásmido es diferente al pXL2283 por la presencia del gen l ci ^ y del operador lacO, permitiendo obtener una expresi n mas regulada del aFGF. Los sitios Ba ül posteriormente fueron introducidos a los extremos del fragmento parCBA- parDE' de 2.46 kb proveniente del plás ido pGMA28 (Gerlitz et a l . , 1990). Para esto, el fragmento Sphl-Sphl-BapHI de 2.46 kb del pGMA28 fue clonado en el plásmido pUCl? (Yanish-Perron et a l . . 1985). fue digerido con Sphl-Bapiil para generar el plásmido pGMA60 (H. Schwab et a l . , comunicación personal). El fragmento de 2.46 kb Hi/7dIII-£'coRI del plásmido pGMA60. posteriormente. fue clonado en el plásmido pMTL22 (Chambers et al . . 1988). fue digerido H?ndI II y EcdRI para generar el pXL2433. El inserto Bapiil ( parCBA-parDE' ) del plásmido pXL2433 se introdujo en el sitio Bgl l l del plásmido pXL2434. para crear el plásmido pXL2435. En la Figura 1 se representa un esquema de las construcciones y del mapa del plásmido pXL2435. además de la secuencia de 8501 pb del plásmido pXL2435 (SEQ ID No. 1). Como la secuencia descrita en el artículo de Gerlitz et a l . . 1990 no es mas que parcial (125 pares de bases para agregar en 3'). este extremo 3' de la secuencia fue verificado en los plásmidos pXL2433 y pXL2435 y en la secuencia SEQ ID No. 1. En la Tabla 1 se presenta una recapitulación de las características de los tres plásmidos de expresión.

Tabla 1. Características de los plásmidos de expresión Ejemplo 2 - Estabilidad del plásmido de expresión en el transcurso de la producción del aFGF. Este ejemplo describe la producción, en medio liquido, de aFGF a partir de una cepa de E. col i recombinante. que posee un plásmido de expresión de aFGF. dependiente de la T7-polimerasa y que se cultiva en la ausencia de selección del plásmido. Después de la producción del aFGF. la presencia del plásmido es monitoreada por la resistencia de las bacterias a la kanamicina, cuyo gen de resistencia es portado por los plásmidos descritos en el Ejemplo 1. Por último. la proteína aFGF producida fue caracteriza mediante los métodos de bioquímica clásica. Ejemplo 2.2 - Estabilidad del plásmido de expresión en ausencia de condiciones de inducción de la producción de aFGF. Los plásmidos pXL2283, pXL2434 y pXL2435 se introducen por transformación en la cepa BL21. DE3 (Studißr et a l . . 1990). Entre las transformantes que fueron seleccionadas en el medio de gelosa LB conteniendo kanamicina. dos transformantes, tomadas al azar, fueron cultivadas 16 horas en medio liquido LB en presencia de kanamicina. El cultivo fue diluido 1/100 y se cultivó en medio LB en presencia de kanamicina hasta que la densidad óptica a 600 nm cayera entre 0.2 y 0.6. Se realizó una dilución de los cultivos 1/100 en medio LB en 10 mi de medio y las cepas se cultivaron hasta obtener una DO comprendida entre 0.17 y 0.6. Esta dilución-crecimiento de las bacterias en el medio sin antibiótico a 37'C, fue repetida seis veces y correspondió a un total de generaciones mayor de 30. obtenido después de dos días. Las bacterias fueron inoculadas en medio de gelosa LB. Después del crecimiento. 100 clonas fueron inoculadas por estría en gelosa LB y en medio LB conteniendo la Km. En la Tabla 2 se presenta la frecuencia de clonas resistentes a Km después de cuando menos 30 generaciones sin presión de selección del plásmido. Este ejemplo demuestra que el fragmento p „amrv. a.ßi, RP4 estabiliza al plásmido en ausencia de presión de selección. aunque este efecto de estabilización es moderado . Ejemplo 2.2 - Estabilidad del plásmido de expresión en las condiciones de inducción de la producción de aFGF. Las bacterias cultivadas durante cuando menos 30 en ausencia de antibiótico (tal como se describe en el Ejemplo 2.1) se diluyeron 1/100 en medio LB y se cultivaron 12 horas, después de lo cual se diluyeron 1/100 en medio LB. Posteriormente, las bacterias fueron puestas a una DO de 0.5 a 0.8; se agregó IPTG 1 mM y las bacterias se cultivaron durante 4 horas, para permitir la producción del aFGF. el cual se suantificó en los extractos celulares totales puestos en gel SDS-PAGE al 15* y teñidos con azul de Coomassie (véase la Figura 2) . Las bacterias fueron inoculadas en gelosa LB. Después del crecimiento, se sembraron por estria 100 clonas en los medio gelosa LB y LB conteniendo kanamicina. En la Tabla 2 se presenta la frecuencia de clonas resistentes a la kanamicina después de la producción del aFGF sin presión de selección del plásmido.

Este ejemplo demuestra, sin ambigüedad, que el fragmento p r induce una estabilidad segregacional muy importante después de la expresión del aFGF. utilizando el sistema de expresión dependiente de la polimerasa del fago T7. Tabla 2. Porcentaje de clonas resistentes a la kanamicina después de crecer solas o crecer (cuando menos 30 generaciones) después de la expresión, sin presión de selección del plásmido. € : expresión del aFGF no detectada después de la tinción con azul de Coomassie ++ : expresión muy elevada del aFGF, aproximadamente 10% de las proteínas totales.

Ejemplo 2.3 - Caracterización de la protßína aFGF producida en presencia del plásmido de expresión del aFGF. En las condiciones de inducción de producción descritas en el Ejemplo 2.2, la proteina aFGF obtenida fue visualizada, véase la Figura 2. mediante gel de PAGE-SDS al 15* teñido con azul de Coomassie y migra con un peso molecular aparente de 16 kDa. lo cual está de acuerdo con los datos bioquímicos descritos y con la secuencia publicada (Jaye et a l . . 1986 y 1987). Además, esta proteina fue revelada mediante una detección inmunológica colorimétrica utilizando anticuerpos contra aFGF bovinos. La secuencia N-terminal de la proteína producida por la cepa BL21. DE3 pXL2435. fue determinada a partir del extracto total. el cual se purificó mediante electroforesis PAGE-SDS. tal como se describe en las técnicas generales de la bioquímica. La secuencia obtenida es A-E-G-E-I-T-T-F-T-A-L-T (SEQ ID No.2). la cual es idéntica a la secuencia N-terminal de la proteina nativa (Jaye et al . . 1986) y la metionina terminal fue cortada por la enzima metionilaminopeptidasa de E. coli . tal como describe en Hirel et al . . 1989.

Este ejemplo demuestra, pues, que la proteina producida con la ayuda de un plásmido de expresión estable en E. co l i . descrita en el Ejemplo 2.2, es la proteína aFGF y que su secuencia N-terminal no está truncada.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) Solicitante: (A) NOMBRE: RHONE-POULENC RORER S.A. (B) CALLE: 20, avenue R. Aron (C) CIUDAD: Antony (E) PAÍS: Francia (F) CÓDIGO POSTAL: 920165 (ii) Titulo de la invención: Procedimiento de producción de proteínas recombinantes. plásmidos y células modificadas (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 2 (iv) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA (A) TIPO DE MEDIO: Cinta (B) COMPUTADORA: Compatible con IBM PC (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Reléase No. 1. Versión 1.25 (OEB) (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8501 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: No (?v) ANTISENTIDO: No (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 GATCTCGATC CCGCGAAATT AATACGACTC ACTATAGGGG AATTGTGAGC GGATAACAAT 60 TCCCCTCTAG AAATAATTTT GTTTAACtT AAGAAGGAGA TATACATATG GCTGAAGGGG 120 AAATCACCAC CTTCACAGCC CTGACCGAGA AGTTTAATCT GCCTCCAGGG AATTACAAGA 1T0 AGCCCAAACT CCTCTACTGT AGCAACGGGG GCCACTTCCT GAGGATCCTT CCGGATGGCA 240 CAGTGGATGG GACAAGGGAC AGGAGCGACC AGCACATTCA GCTGCAGCTC AGTGCGGAAA 300 GCGTGGGGGA GGTGTATATA AAGAGTACCG AGACTGGCCA GTACTTGGCC ATGGACACCG 360 ACGGGCTTTT ATACGGCTCA CAGACACCAA ATGAGGAATG TTTGTTCCTG GAAAGGCTGG 20 AGGAGAACCA TTACAACACC TATATATCCA AGAAGCATGC AGAGAAGAAT TGGTTTGTTG 4T0 GCCTCAAGAA GAATGGGAGC TGCAAACGCG GTCCTCGGAC TCACTATGGC CAGAAAGCAA 540 TCTTGTTTCT CCCCCTGCCA GTCTCTTCTG ATTAAAGAGA TCCGGCTGCT AACAAAGCCC 600 GAAAGGAAGC TGAGTTGGCT GCTGCCACCG CTGAGCAATA ACTAGCATAA CCCCTTGGGG 660 CCTCTAAACG 3GTCTTGAGG GGTTTTTTGC TGAAAGGAGG AACTATATCC GGATATCCAC 720 - ?3 - AG3AC3G3TG G3TC3CCA7 3ATCGCGTA3 TC3ATA3T33 C7CCAAGTAG C3AAGCGAGC 78 A33AC7G33C 3GC33C3AAA 3C33TC33AC A373CT 3A 3AAC333TGC GCATA3AAAT 84 T3CATCAAC3 CATA7A3C3C TA3CAGCAC3 C7.A7AGT3AC 7GGCGA73C7 GTC33AATGG 90 ACGATATCCC GCAAGAGGCC C33CAG7ACC 33CATAACCA AGCCTATGCC TACAGCATCC 96 AG33T3AC33 73CC3AGGAT 3AC3AT3AGC 3CATTGTTAG ATTTCATACA CGGTGCCTGA 102 CTGC377AGC AATTTAACTG 7GA7AAAC7A CCGCATTAAA GCTTATCGAT GATAAGCTGT 108 CAAACATGAG AATTCTTAGA AAAACTCATC GAGCATCAAA TGAAACTGCA ATTTATTCAT 114 ATCA3GATTA TCAATACCAT ATTTTTGAAA AAGCCGTTTC TGTAATGAAG GAGAAAACTC 120 ACC3AGGCAG TTCCATAGGA TGGCAAGATC CTGGTATCGG TCTGCGATTC CGACTCGTCC 126 AACATCAATA CAACCTATTA ATTTCCCCTC GTCAAAAATA AGGTTATCAA GTGAGAAATC 132 ACCATGAGTG ACGACTGAAT CCGGTGAGAA TGGCAAAAGC TTATGCATTT CTTTCCAGAC 138 TTGTTCAACA GGCCAGCCAT TACGCTCGTC ATCAAAATCA CTCGCATCAA CCAAACCGTT 144 ATTCATTCGT GATTGCGCCT GAGCGAGACG AAATACGCGA TCGCTGTTAA AAGGACAATT 150 ACAAACAGGA ATCGAATGCA ACCGGCGCAG GAACACTGCC AGCGCATCAA CAATATTTTC 156 ACCTGAATCA GGATATTCTT CTAATACCTG GAATGCTGTT TTCCCGGGGA TCGCAGTGGT 162 GAGTAACCAT GCATCATCAG GAGTACGGAT AAAATGCTTG ATGGTCGGAA GAGGCATAAA 168 TTCCGTCAGC CAGTTTAGTC TGACCATCTC ATCTGTAACA TCATTGGCAA CGCTACCTTT 174 GCCATGTTTC AGAAACAACT CTGGCGCATC GGGCTTCCCA TACAATCGAT AGATTGTCGC 180 ACCTGATTGC CCGACATTAT CGCGAGCCCA TTTATACCCA TATAAATCAG CATCCATGTT 186 GGAATTTAAT CGCGGCCTCG AGCAAGACGT TTCCCGTTGA ATATGGCTCA TAACACCCCT 192 TGTATTACTG TTTATGTAAG CAGACAGTTT TATTGTTCAT GACCAAAATC CCTTAACGTG 198 AGT???CGTT CCACTGAGCG TCAGACCCCG TAGAAAAGAT CAAAGGATCT TCTTGAGATC 20 CTT? TGCT GCGCGTAATC TGCTGCTTGC AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG 21 TTTGTTTGCC GGATCAAGAG CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG 21 CGCAGATACC AAATACTSTC CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC TTCAAGAACT 22 CTGTAGCACC GCCTACATAC CTCGCTCTGC TAATCCTGTT ACCAGTGGCT GCTGCCAGTG 22 GCGATAAGTC GTGTCTTACC GGGTTGGACT CAAGACGATA GTTACCGGAT AAGGCGCAGC 23 GGTCGGGCTG AACGGGGGGT TCGTGCACAC AGCCCAGCTT GGAGCGAACG ACCTACACCG 24 AACTGAGATA CCTACAGCGT GAGCTATGAG AAAGCGCCAC GCTTCCCGAA GGGAGAAAGG 24 CGGACAGGTA TCCGGTAAGC GGCAGGGTCG GAACAGGAGA GCGCACGAGG GAGCTTCCAG 25 - 1.9 J JGJ-?V.-V. -.----..-. . ..-...-._-. 3 .3333777-3 33A337373A C773AGC37C 2580 .•A.....J.J A. J.T J-.? J-IJJJGCGGA 3CC7A733.-A AAACGCCAGC AACGCGGCCT 2640 7777A33377 33733CC777 733733CC77 773C7CACA7 377C777CC7 3C377ATCCC 2700 C73A773737 33A7.?AC337 A77A333CC7 773AG73A3C 73A7ACC3CT GGCCGCAGCC 2^60 3AAC3ACC3A 3C3CAGC3AG 7CA373AGC3 A33AAGC33A AGAGCGCCTG A7GCGGTATT 2820 7TC7CCT7AC 3CA7C7373C GGTATTTCAC ACCGCA7A7A 7GGTGCACTC TCAGTACAAT 2880 C7GC7C7GAT GCCGCATAGT TAAGCCAGTA 7ACAC7CC3C TATCGCTACG 7GAC7GGGTC . 2940 A7GGC7GCGC CCCGACACCC GCCAACACCC GC7GACGCGC CC7GACGGGC 7TGTCTGCTC 3000 CCGGCATCC3 CTTACA3ACA AGCT3TGACC 3TCTCCGGGA GCTGCATGTG TCAGAGGTTT 3060 TCACCGTCAT CACCGAAACG CGCGAGGCAG CTGCGGTAAA GCTCATCAGC GTGGTCGTGA 3120 AGCGATTCAC AGATGTCTGC CTGTTCATCC GCGTCCAGCT CGTTGAGTTT CTCCAGAAGC 3180 GTTAATGTCT GGCTTCTGAT AAAGCGGGCC ATGTTAAGGG CGGTTTTTTC CTGTTTGGTC 3240 ACTGATGCCT CCGTGTAAGG GGGATTTCTG TTCATGGGGG TAATGATACC GATGAAACGA 3300 GAGAGGATGC TCACGATACG GGTTACTGAT GATGAACATG CCCGGTTACT GGAACGTTGT 3360 GAGGGTAAAC AACTGGCGGT ATGGATGCGG CGGGACCAGA GAAAAATCAC TCAGGGTCAA 3420 TGCCAGCGCT TCGTTAATAC AGATGTAGGT GTTCCACAGG GTAGCCAGCA GCATCCTGCG 3480 ATGCAGATCC GGAACATAAT GGTGCAGGGC GCTGACTTCC GCGTTTCCAG ACTTTACGAA 3540 ACACGGAAAC CGAAGACCAT TCATGTTGTT GCTCAGGTCG CAGACGTTTT GCAGCAGCAG 3600 TCGCTTCACG TTCGCTCGCG TATCGGTGAT TCATTCTGCT AACCAGTAAG GCAACCCCGC 3660 CAGCCTAGCC GGGTCCTCAA CGACAGGAGC ACGATCATGC GCACCCGTGG CCAGGACCCA 3720 ACGCTGCCCG AGATGCGCCG CGTGCGGCTG CTGGAGATGG CGGACGCGAT GGATATGTTC 3780 TGCCAAGGGT TGGTTTGCGC ATTCACAGTT CTCCGCAAGA ATTGATTGGC TCCAATTCTT 3340 GGAGTGGTGA ATCCGTTAGC GAGGTGCCGC CGGCTTCCAT TCAGGTCGAG GTGGCCCGGC 3900 TCCATGCACC GCGACGCAAC GCGGGGAGGC AGACAAGGTA TAGGGCGGCG CCTACAATCC 3960 ATGCCAACCC GTTCCATGTG CTCGCCGAGG CGGCATAAAT CGCCGTGACG ATCAGCGGTC 4020 CAGTGATCGA AGTTAGGCTG GTAAGAGCCG CGAGCGATCC TTGAAGCTGT CCCTGATGGT 4080 CGTCATCTAC CTGCCTGGAC AGCATGGCCT GCAACGCGGG CATCCCGATG CCGCCGGAAG 4140 CGAGAAGAAT CATAATGGGG AAGGCCATCC AGCCTCGCGT CGCGAACGCC AGCAAGACGT 4200 AGCCCAGCGC GTCGGCCGCC ATGCCGGCGA TAATGGCCTG CTTCTCGCCG AAACGTTTGG 4260 TGGCGGGACC AGTGACGAAG GCTTGAGCGA GGGCGTGCAA GATTCCGAAT ACCGCAAGCG 4320 CA7C3733C3 C737A3C3AA A3C3373373 33C3AAAA7S ACCCAGAGCG 4380 ..-33333A3 737337A33 AG77G3A7GA 7A.-AGAA3AC i.373A7AA37 3C33CGACGA 4440 7A373A7GC7 33333CC3AC CGGAAGGAGC 73AC733377 GAA33C7C7C AAGGGCATCG 4500 3773A3A733 C3373CC7AA 73A3TGAGC7 AAC77ACA77 AAT73CG773 CGC7CAC7GC 4560 CC3-777CCA G.CJGGAAAC C737C373CC A3C7GCA77A A7GAA7C3GC CAACGC3CGG 4620 33A3AGGC33 7773C37AT7 333C3CCA3G 3T3GT7777C 7TT7CACCAG 7GAGACGGGC 4630 AACAGCTGAT 73CCC77CAC C3CC73GCCC 73AGAGAG77 GCAGCAAGCG GTCCACGCTG 4740 G7773CCCCA 3CA33C3AAA A7CC73777G A7GG7GGTTA ACGGC3GGAT ATAACATGAG 4800 C7G7C77C33 TATCGT GTA 7CCCACTACC GAGATA7CCG CACCAACGCG CAGCCCGGAC 4860 TCGGTAA73G CGCGCATTGC GCCCAGCGCC ATCTGATCGT TGGCAACCAG CATCGCAGTG 4920 G3AACGATGC CCTCA77CAG CATTTGCATG 3TT7GTTGAA AACCGGACAT GGCACTCCAG 4980 TCGCCTTCCC GTTCCGCTAT CGGCTGAATT TGATTGCGAG TGAGATATTT ATGCCAGCCA 5040 GCCAGACGCA 3ACGCGCCGA GACAGAACTT AATGGGCCCG CTAACAGCGC GATTTGCTGG 5100 TGACCCAATG CGACCAGATG CTCCACGCCC AGTCGCGTAC CGTCTTCATG GGAGAAAATA 5160 ATACTGTTGA T3GGTGTCTG GTCAGAGACA TCAAGAAATA ACGCCGGAAC ATTAGTGCAG 5220 GCAGCTTCCA CAGCAATGGC ATCCTGGTCA TCCAGCGGAT AGTTAATGAT CAGCCCACTG 5280 ACGCGTTGCG CGAGAAGATT GTGCACCGCC GCTTTACAGG CTTCGACGCC GCTTCGTTCT 5340 ACCATCGACA CCACCACGCT GGCACCCAGT TGATCGGCGC GAGATTTAAT CGCCGCGACA 5400 ATTTGCGACG GCGCGTGCAG GGCCAGACTG GAGGTGGCAA CGCCAATCAG CAACGACTGT 5460 TTGCCCGCCA GTTGTTGTGC CACGCGGTTG GGAATGTAAT TCAGCTCCGC CATCGCCGCT 5520 TCCACTTTTT CCCGCGTTTT CGCAGAAACG TGGCTGGCCT GGTTCACCAC GCGGGAAACG 5580 GTCTGATAAG AGACACCGGC ATACTCTGCG ACATCGTATA ACGTTACTGG TTTCACATTC 5640 ACCACCCTGA ATTGACTCTC TTCCGGGCGC TATCATGCCA TACCGCGAAA GGTTTTGCGC 5700 CATTCGATGG TGTCCGGGAT CTCGACGCTC TCCCTTATGC GACTCCTGCA TTAGGAAGCA 5760 GCCCAGTAGT AGGTTGAGGC CGTTGAGCAC CGCCGCCGCA AGGAATGGTG CATGCAAGGA 5820 GATGGCGCCC AACAGTCCCC CGGCCACGGG GCCTGCCACC ATACCCACGC CGAAACAAGC 5880 GCTCATGAGC CCGAAGTGGC GAGCCCGATC 7TCCCCATCG GTGATGTCGG CGATATAGGC 5940 GCCAGCAACC GCACCTGTGG CGCCGGTGA7 GCCGGCCACG ATGCGTCCGG CGTAGAGGAT 6000 CGAGATCCAT ATGACGTCGA C3CGTCTGCA GAAGCTTGCA TGCCAGCTTC 7GGTTCGTCG 6060 GC73GGTGAT 3GCGTC3GTT 773GC33GC3 3CGTCGGCGC GATCGCCAGC GCGAAGCAAC 6120 JU^. J I?^? .~ J^ J JL? * J J 733CC77333 C77C77CCGC 3ACCAGGTGA 6180 - 3GACAT CA -T J?, J<- J •J.-V - J J? * ^ 733CC33GT3 33ATGAAAAG GCGAACTCGC 6240 — J j * J J * TGCTCAACAG 377CGCATCC GCGCCCTTCG 6300 J. GCCCTGGCC 3AGGGG3AAA 3C3AGGA73T AGGTAGGGCG CTCGCAGCGG 6360 CCC7GCGGGA CGCGAAAAGG 7GAGAAAA3C CGGGCAC7GC CCGGC777AT TTTTGCTGCT 6420 GCGCGTTCCA GGCCGCCCAC ACTCGTTTGA CC7GGCTCGG GCTGCATCCG ACCAGCTTGG 6480 CCGTCTTGGC AATGCTCGAT CCGCCGGAGC GAAGCGTGAT GATGCGGTCG TGCATGCCGG 6540 CGTCACGTTT GCGGCCGGTG TAGCGGCCGG CGGCCTTCGC CAACTGGACA CCCTGACGTT 6600 GACGCTCGCG CCGATCCTCG TAGTCGTCGC GGGCCATCTG CAAGGCGAGC TTCAAAAGCA 6660 TGTCCTGGAC GGATTCCAGA ACGATTTTCG CCACTCCGTT CGCCTCGGCG GCCAGCTCCG 6720 ACAGGTCCAC CACGCCAGGC ACGGCCAGCT TGGCCCCTTT GGCCCGGATC GACGCAACCA 6780 GGCGCTCGGC CTCGGCCAAC GGCAAGCGGC TGATGCGGTC GATCTTCTCC GCAACGACGA 6840 CTTCACCAGG TTGCAGGTCC GCGATCATGC GCAGCAGCTC GGGCCGGTCG GCGCGTGCGC 6900 CGGACGCCTT CTCGCGGTAG ATGCCGGCGA CGTAGTACCC GGCGGCCCGC GTGGCCGCTA 6960 CAAGGCTCTC CTGGCGTTCA AGATTCTGCT CGTCCGTACT GGCGCGCAGG TAGATGCGGG 7020 CGACCTTCAA CCTTCGTCCC TCCGGTTGTT GCTCTCGCGT CGCCATTTCC ACGGCTCGAC 7080 GGCGTGCGGA TCGGACCAGA GGCCGACGCG CTTGCCTCGC GCCTCCTGTT CGAGCCGCAG 7140 CATTTCAGGG TCGGCCGCGC GGCCGTGGAA GCGATAGGCC CACGCCATGC CCTGGTGAAC 7200 CATCGCGGCG TTGACGTTGC GCGGCTGCGG CGGCCGGCTG GCCAGCTCCA TGTTGACCCA 7260 CACGGTGCCC AGCGTGCGGC CGTAACGGTC GGTGTCCTTC TCGTCGACCA GGACGTGCCG 7320 GCGGAACACC ATGCCGGCCA GCGCCTGGCG CGCACGTTCG CCGAAGGCTT GCCGCTTTTC 7380 CGGCGCGTCA ATGTCCACCA GGCGCACGCG CACCGGCTGC TTGTCTACCA GCACGTCGAT 7440 GGTGTCGCCG TCGATGATGC GCACGACCTC GCCGCGCAGC TCGGCCCATG CCGGCGAGGC 7500 AACGACCAGG ACGGCCAGCG CGGCAGCGGC GCGCAGCATG GCGTAGCTTC GGCGCTTCAT 7560 GCGTGGCCCC ATTGCTGATG ATCGGGGTAC GCCAGGTGCA GCACTGCATC GAAATTGGCC 7620 TTGCAGTAGC CGTCCAGCGC CACCCGCGAG CCGAACGCCG GCGAAAGGTA CTCGACCAGG 7680 CCGGGCCGGT CGCGGACCTC GCGCCCCAGG ACGTGGATGC GCCGGCCGCG TGTGCCGTCG 7740 GGTCCAGGCA CGAAGGCCAG CGCCTCGATG TTGAAGTCGA TGGATAGAAG TTGTCGGTAG 7800 TGCTTGGCCG CCCTCATCGC GTCCCCCT7G GTCAAATTGG GTATACCCAT TTGGGCCTAG 7860 TCTAGCCGGC ATGGCGCATT ACAGCAATAC GCAATTTAAA TGCGCCTAGC GCATTTTCCC 7920 3ACCT7AA73 C3CC73333C 737A3CC7CA 33C33ACA7A 7373C7AATG 7GGT7ACGTG 7980 7.-.7777A733 A3377A7C3A A7GAGC33CC 73ACAA7CGA 3A7GACGGAC CAGCAGCACC 3040 A3A3C373AA AGCCC733C3 3CC773CAGG 3CAA3ACCA7 7.AAGCAA7AC 3CCCTCGAAC 3100 3737377CCC C337GAC3C7 3A73CCGA7C AGGCATGGCA 3GAAC73AAA ACCATGC7GG 8160 33AACC3CAT CAAC3A7GGG C77GCCGGCA AGG7GTCCAC CAAGAGCGTC GGCGAAATTC 3220 77GAT3AAGA ACTCAGCG3G GATCGCGCTT GACGGCCTAC ATCCTCACGG CTGAGGCCGA 3280 AGCCGATCTA CGCGGCATCA TCCGCTACAC GCGCCGGGAG TGGGGCGCGG CGCAGGTGCG 8340 CCGC7A7A7C GCTAAGCTGG AACAGGGCAT AGCCAGGCTT GCCGCCGGCG AAGGCCCGTT 3400 TAAGGACATG AGCGAACTCT TTCCCGCGCT GCGGATGGCC CGCTGCGAAC ACCACTACGT 8460 TTTTTGCCTG CCGCGTGCGG GCGAACCCGC GTTGGTCGTC G 8501 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteina (iii) HIPOTÉTICA: No (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: Ala Glu Gly Glu He Thr Thr Phe Thr Ala Leu Thr 5 10 REFERENCIAS Chambers, S.. Prior, S., Barstow. D.. y Minton, N. (1988) Gene 68: 139-14 . Denéfle P., Kovarik, S., Guitón. J.D., Cartwright, T. , y Mayaux, J.-F. (1987) Gene 56: 61-70. Eberl L. , Kristensen C, GivskovM.. Grohmann E. , Gerlitz M.. y Schawb H. (1994) Mol . Microbiol . 12: 131-141. Edman P. (1956) Acta Chemica Scandinavia 10: 761-768. Gerlitz et a l . . (1990) J. Bact . 172: 6194-6203. Gibson T. (1984) Ph.D.. Universidad de Cambridge.

Cambridg. Inglaterra. Hirel P., Schmitter P.. Dessen P., y Blanquet S. (1989) Proc . Na t i . Acad. Se i 86: 8247-8251. Jaye M.. Howk R.. Burgess W. , Ricca G., Chui I.. Ravera M., O'Brien S.. Modi W.. Maciag T. , y Drohan W. (1986) Science 233: 541-545. Jaye M.. Burgess W.. Shaw A.. Drohan W. (1987) J. Biol .

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Se hace constar que con relación a esta fecha. el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la practica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecedente, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES 1. Un plásmido de expresión caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico de interés bajo el control de un promotor del bacteriófago T7 y una región estabi 1 izadora que comprende la totalidad o una parte de la región par del plásmido RP4 o un derivado del mismo.
2. 2. El plásmido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor del bacteriófago T7 es el promotor del gen 10.
3. 3. El plásmido de conformidad con la reivindicación 1. caracterizado porque la región estabi 1 izadora comprende una porción de la región par del plásmido RP4.
4. 4. El plásmido de conformidad con la reivindicación 3. caracterizado porque la región estábil izadora está constituida por un fragmento comprendido entre los residuos 6038 y 8499 de la secuencia SEQ ID No. 1.
5. 5. El plásmido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes. caracterizado porque además comprende el operador lacO y el gen lac 1 .
6. 6. El plásmido de conformidad con la reivindicación 5. caracterizado porque el operador lacO está situado cadena abajo del promotor del bacteriófago T7 y cadena arriba de la secuencia de ácido nucleico de interés .
7. 7. El plásmido de conformidadcon cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la secuencia de ácidonucleicode de interés codifica para una proteínade interés farmacéutico, agroalimentario o utilizableen biocatál isís.
8. 8. El plásmido según la reivindicación 7, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de interés codifica parauna protefna que se se- lecciona del grupo que consiste de enzimas, derivados sanguíneos, hormonas. linfocinas. factores de crecimiento. neurotransmisores o sus precursores o enzimas de síntesis, factores tróficos, apol ipoproteínas. distrofina o una minidistrofina. proteína CFTR, genes supresores de tumores, genes que codifican para factores implicados en la coagulación o genes que intervienen en la reparación del ADN.
9. 9. El plásmido de conformidad con la reivindicación 8. caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de interés codifica para un factor de crecimiento ácido de fibroblastos (aFGF) .
10. 10. El plásmido de conformidad con la reivindicación 9. caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de interés codifica para el aFGF(154) .
11. 11. El plásmido pXL2435 presentado en la secuencia SEQ ID No. 1.
12. 12. Un procedimiento de producción de proteina rßcombinante. caracterizado porque se cultiva una bacteria conteniendo: un plásmido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 portador de una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicha proteina, y el gen de la ARN polimerasa del bacteriófago T7. en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico.
13. 13. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el gen de la ARN polimerasa del bacteriófago T7 está bajo el control de un promotor inducible.
14. 14. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13. caracterizado porque el gen de la ARN polimerasa del bacteriófago T7 está integrado al genoma de la bacteria utilizada.
15. 15. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14. caracterizado porque la bacteria se selecciona entre las cepas de E. coli .
16. 16. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 15. caracterizado porque la bacteria es la cepa E. col i BL21. DE3.
17. 17. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16. caracterizado porque sirve para la producción de un aFGF recombinante .
18. 18. Un procedimiento de preparación de un aFGF recombinante. caracterizado porque se cultiva una bacteria conteniendo el plásmido pXL2435 y el gen de la ARN polimerasa del bacteriófago T7. en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico; y se recupera el aFGF producido.
19. 19. Una bacteria transformada por un plásmido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.