JP2624308B2 - 高度に抑制しうる発現制御配列 - Google Patents

高度に抑制しうる発現制御配列

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、高効率で、かつ高度の抑制が可能な発現制
御配列類、これらの発現制御配列を含有する発現ベクタ
ー類、これらの発現ベクターにより形質転換された微生
物類、及び組換えDNA技術によるそれらの製造方法に関
する。また、本発明は、これらの高度に抑制可能な発現
制御配列、発現ベクター及び形質転換微生物による原核
及び真核性蛋白質類（Pro−and eukaryotic proteins）
の製造方法に関する。
宿主細胞中での蛋白質の産生レベルは、３種の主要な
印紙：細胞内の構造遺伝子のコピー数、該構造遺伝子コ
ピーが転写される効率及び生じたメッセンジャーRNA（m
RNA）が翻訳される効率により決定される。転写及び翻
訳効率は、所望の構造遺伝子またはコード配列の前方に
通常位置しているヌクレオチド配列類に順次依存する。
これらのヌクレオチド配列（発現制御配列）は、なかん
ずく転写開始のためにRNAポリメラーゼがプロモーター
配列に結合する位置〔The EMBO Journal5,2995−3000
（1986）参照〕及び翻訳開始のためにリボゾームが結合
し、mRNA（転写の生成物）と相互作用する位置を定め
る。
すべての発現制御配列が同じ効率を有しているのでは
ない。従って、高い発現率を得るためには所望の蛋白質
に対する特定のコード配列を、その隣接するヌクレオチ
ド配列から分離し、そして他の発現制御配列にそれを連
結することがしばしば有利となる。これを完了した後、
新たに結合されたDNA断片は、細胞内で構造遺伝子のコ
ピーを増大させるために、コピー数の多いプラスミドま
たはバクテリオファージの誘導体中に挿入され、これに
よって同時に所望の蛋白質の収率を改善することができ
る。
通常非毒性の遺伝子産生物の過剰な産生は、宿主細胞
に対してしばしば有害であり、固有の宿主−ベクター系
の安定性を低下させるので、クローン化遺伝子の転写及
び翻訳効率の改善に加えて、発現制御配列は、微生物の
育生期間中、発現の調節ができるように調節可能でなけ
ればならない。調節可能な発現制御配列として考慮され
るものは、該発現制御配列によって所望の蛋白質の多量
の発現を有利にするために、例えば宿主細胞を増殖して
いる間はスイッチを切ることができ、次いで所望の時点
で再びスイッチを入れることができる。
前述の条件を満足する種々の発現制御配列が、所望の
蛋白質をコードするDNA配列及び遺伝子の発現のために
用いられてきた。かかる発現制御配列は、例えばScienc
e 198,1056−1063（1977）（Itakuraらによる）、Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.76,106−110（1979）（Goeddelら
による）、Nature 283,171−174（1980）（Emtageらに
よる）、Science 205,602−607（1979）（Martialらに
よる）、Gene 5,59−76（1979）（Bernardらによる）、
Gene 25,167−178（1983）（Ammannらによる）、Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.80,21−25（1983）（dc Boerらに
よる）及びヨーロッパ特許出願公開番号第41767号及び
第186069号により知られている。
本発明によると、高効率で、かつ高度に抑制し得る発
現制御配列が、低シグナル強度及び高イン・ビボ・プロ
モーター強度を有するプロモーター配列類と、高会合速
度（Kass）を有するオペレーター／リプレッサー系との
組合せにより得られることが見出された。これらの発現
制御配列は、公知の発現制御配列に対し、第１にはそれ
らが1000倍以上抑制可能であること及び誘発後は理想的
な生育温度において高いRNA合成速度（＞10PbLa単位）
をもたらすことによって区別される。
従って、本発明は、約１・106−1.5・108M-1・sec-1
の低シグナル強度及び10−100PbLa単位の高イン・ビボ
・プロモーター強度を有するプロモーター配列類と、約
１・108−１・1011M-1・sec-1の高会合速度を有し、100
0より高い抑制率を生じるオペレーター／リプレッサー
系とを組合せてなることを特徴とす発現制御配列に関す
る。
プロモーターのシグナル強度は、プロモーターとRNA
ポリメラーゼとの間の会合速度（Kass）により特定され
る。本発明による発現制御配列におけるプロモーター配
列のシグナル強度としては、約１・106−1.5・108M-1・
sec-1のKass値が考慮され、従ってより好ましいKass値
は６・107M-1・sec-1である。Kass値は、実施例３に記
載するように測定される。
イン・ビボ・プロモーター強度は、個々のプロモータ
ー配列により仲介されるRNA合成速度によって定義さ
れ、PbLa単位をもって測定される。これに関しては、De
uschleらの文献〔The EMBO Journal 5,2987−2994（198
6）〕を参考にすることができる。本発明による発現配
列の高イン・ビボ・プロモーター強度としては、RNA合
成速度が10−100、好ましくは20PbLa単位より大きいも
のが考慮される。
オペレーター／リプレッサー系の会合速度（Kass）
は、リプレッサーがオペレーターに結合する速度を示
す。本発明による発現制御配列のオペレーター／リプレ
ッサー系については、Kass値が約１・108−１・1011M-1
・sec-1が考慮され、従ってlac−オペレーター／リプレ
ッサー系〔Biochemistry 25,3845−3852（1986）〕に対
して記載されているKass値２・109M-1・sec-1が特に好
ましい。
本発明による発現制御配列のプロモーター配列として
は、例えばE.coli等のグラム陰性微生物由来、例えばB.
subtilis及びB.stearothermophilis等のグラム陽性微生
物由来ならびに対応するファージ由来の天然のプロモー
ター配列及び変異または合成により特異的に変更を受け
た機能的変異体ならびにこれらのプロモーター配列の組
み合わせが考慮される。本発明による発現制御配列の好
ましいプロモーター配列は、Ｔ−コリファージ類由来の
もので、T7A1プロモーター〔そのヌクレオチド配列は、
第８図に示され、これを以下A1プロモーター（PA1）と
して示す〕が特に好ましい。
オペレーター／リプレッサー系としては、化学誘発剤
により直接的に誘発可能であり、天然の状態または対応
する変化（例えば変異）の後に抑制率が1000より大であ
るすべての系が考慮され、これらの直接誘発可能な系
は、SOS機能（lexA/recA系）により、または温度により
誘発可能な系、例えばPLオペレーター／リプレッサー系
ではないものと理解される。化学的誘発により直接制御
可能な系は、例えばラクトース、ガラクトース、トリプ
トファン及びテトラサイクリン・オペロンの制御単位な
らびに他の消極的に制御可能なオペロン、すなわち、オ
ペレーター／リプレッサー反応を通して調節可能なオペ
ロンに属している。これに関しては、Miller及びReznik
offの文献（“The operon"、Cold Spring Harbor Labor
ator、1980）に加え、Hillenらの文献〔J.Mol.Biol.17
2,185−201（1984）〕を参考にすることができる。特に
好ましいオペレーター／リプレッサー系は、天然のlac
−オペレーター／リプレッサー系（Miller及びReznikof
fの前出文献）及び先に記載したオペレーター／リプレ
ッサー系の変異物で、変異または合成により特異的に変
形され、1000より大なる抑制因子を許容するものであ
る。“抑制率”なる用語は、誘発剤の存在及び非存在下
におけるイン・ビボ・プロモーター強度の商を示してい
る。
本発明による発現制御配列の製造は、それ自体公知で
あって文献に記載されている組換えDNA技術によって行
なうことができる。これに関しては、Maniatisらの文献
（“Molecular Cloning"Cold Spring Harbor Laborator
y、1982）を参考にすることができる。
低シグナル強度及び高イン・ビボ・プロモーター強度
を有するプロモーター配列は、１またはそれ以上のオペ
レーター／リプレッサー系と融合して本発明による発現
制御配列を与えることができる。単一のオペレーター／
リプレッサー系を使用する場合には、これを低シグナル
強度及び高イン・ビボ・プロモーター強度を有するプロ
モーター配列の内部または外部に配置することができ
る。従って、オペレーター／リプレッサー系は、プロモ
ーター配列中に組込まれ、種々の位置においてそれを部
分的に置換し、先行し、または継続することが可能であ
る。好ましくは、オペレーター／リプレッサー系は、プ
ロモーター配列中に組込まれ、かくして特に好ましい組
込み位置は、−12位と−29位（第８図中の名称）の間の
スペーサー領域となる。２種のオペレーター／リプレッ
サー系を使用する場合は、両者を低シグナル強度及び高
イン・ビボ・プロモーター強度を有するプロモーター配
列の内部若しくは外部に配置するか、または、一方を低
シグナル強度及び高イン・ビボ・プロモーター強度を有
するプロモーター配列の内部に配置し、他方を外部に配
置することができる。好ましくは、一方をスペーサー領
域に組込み、他方を５′−位の上流側に組込んで、オペ
レーター／リプレッサー系の２つのオペレーター配列の
間にリプレッサー結合により、最大の協同性を得るよう
にして、これにより約30,000に達する抑制因子を得るこ
とができる。
本発明の好ましい発現制御配列は、化学DNA合成によ
り得られ、それによりlac−オペレーター配列の機能的
部分は、T7A1プロモーター配列の機能的部分と連結され
た。かくして得られた好ましい発現制御配列AlOSAl、Al
OPSAlOP21、AlOPSAlOP29、AlpOPSAL及びOPAlOPSAlの構
築は、以下の実施例２に詳細に記載されている。これら
の発現制御配列のヌクレオチド配列は、第５図及び第９
図にそれぞれ示されており、また特徴的性質は、第８表
にまとめられている。
前記lac−オペレーター配列は、lac−リプレッサーに
より消極的に制御される。細胞内に充分な量のリプレッ
サー分子を得るためには、例えばlacIq遺伝子の組込み
〔Miller及びReznikoffの前出文献、CalosのNature 27
4,762−765（1978）〕等の公知の方法によりベクターま
たは細菌の染色体において相当する遺伝子を過剰に発現
させることができる。
本発明による発現制御配列は、グラム陰性及び／また
はグラム陽性菌中で複製可能な適当な発現ベクター中に
それ自体公知の方法で挿入することができる。適当なベ
クターは、染色体、表染色体及び合成DNA配列の分節、
例えば種々の公知のプラスミド及びファージDNA類から
構築することができる。これに関しては、前記Maniatis
らの文献を参照することができる。特に適当なベクター
は、pDS系のプラスミド類〔BujardらのMethod in Enzym
ology,Wu及びGrossmann編、Academic Press社、Vol.15
5,416−433（1978）〕である。
しかしながら本発明による発現制御配列は、グラム陰
性及びグラム陽性菌の染色体に挿入することもでき、か
くしてベクターによる作業の際に要した抗生物質等の選
択剤を廃止することができる。
本発明による発現制御配列を用いて発現し得る適切な
DNA配列としては、イン・ビボまたはイン・ビトロにお
いて原核または真核性蛋白質をコードするものが考慮さ
れうる。例えば、このようなDNA配列は、酵素、ホルモ
ン、免疫制御、抗ウイルスまたは抗腫瘍活性を有する蛋
白質、抗体、抗原及び他の有用な原核または真核性蛋白
質をコードし得る。
本発明による発現制御配列を用いて発現し得る蛋白質
としては、例えば、マラリア表面抗原、特に5.1表面抗
原、Plasmodium falciparumのCS蛋白質及びp190蛋白
質、リンホカイン類、インターフェロン類、インシュリ
ン及びインシュリン前駆体、HIV1及び２のエンベロープ
及び構造蛋白質、成長ホルモンならびに成長ホルモン分
泌因子が考慮されうる。
発現ベクターに挿入され、原核または真核性蛋白質を
コードするDNA配列を、本発明による発現制御配列を用
いて発現させる方法は、それ自体公知であり、前記Mani
atisらの文献に記載されている。それらは、次の工程か
らなる： （ａ）好適な細菌、有利にはE.coli、Salmonella typhi
muriumまたはB.subtilisの、所望の原核または真核性蛋
白質をコードするDNAが前記発現制御配列に有効に連結
されている発現ベクターによる形質転換； （ｂ）かくしてえ得られ細菌の好適な生育条件下での培
養； （ｃ）所望の蛋白質の単離、及び要すれば精製。
細菌、有利にはE.coli、Salmonella typhimuriumまた
はB.subtilisの染色体に挿入される本発明による発現制
御配列を用いた原核または真核性蛋白質をコードするDN
A配列の発現は、次の工程により行なえる： （ａ）所望の原核または真核性蛋白質のコード配列と有
効に結合される前記発現制御配列の、好適な細菌染色体
への挿入； （ｂ）かくして得られた細菌の好適な生育条件下での培
養； 及び （ｃ）所望の蛋白質の単離、及び要すれば精製。
適切な宿主生物の選択は、当業者に知られた種々の因
子により定められる。かくして、例えば選択したベクタ
ーとの適合性、発現生成物の毒性、発現の特性、生物学
的安全処置の必要性及び費用が役割を演じ、かつこれら
のすべての因子間での妥協点が見出されなければならな
い。
適切な宿主生物としては、グラム陰性及びグラム陽性
宿主生物、例えばE.coli、Salmonella typhimurium及び
B.subtilisの株類が考慮される。E.coli株M15は、本発
明において特に好ましい宿主生物である。しかしながら
前記E.coli株とは別に、他の一般に入手可能なE.coli株
類、例えばE.coli294（ATCC No.31446）、E.coli RRl
（ATCC No.31343）及びE.coli W3110（ATCC No.27325）
もまた使用することができる。
以下の実施例は、本発明のより良い理解に役立つ。こ
れらの実施例は、添付された図面及び表と関連させて読
むことにより、より良く理解されるであろう。以下の略
号及び記号がこれらの図面及び表中に示されている： Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｈ、Ha、Ｋ、Ｐ、Sa、Ｘ及びXbは、それ
ぞれ制限エンドヌクレアーゼBamHI、ClaI、EcoRI、Hind
III、HpaI、KpnI、PstI、SalI、XhoI及びXbaIの切断部
位を示している。
は、遺伝子bla、lacI及びneoのプロモーター類を示し； は、遺伝子bla、cat、neo、lacI及びlacZのリボゾーム
結合部位を示し； は、ターミネーターt0、T1及びTEを示し、矢印はターミ
ネーターの機能的配向を示し； は、発現制御配列AlOPSAl、lacOP29及びPN25を示し； は、発現制御配列OPAlOPSAl中のオペレーターOPを示
し； は、複製に必要な領域（repl.）を示し； は、ジヒドロ葉酸塩還元酵素（dhfr）クロラムフェニコ
ール・アセチルトランスフェラーゼ（cat）、lacリプレ
ッサー（lacI）、β−ラクタマーゼ（bla）、β−ガラ
クトシダーゼ（lacZ）及びネオマイシン・ホスホトラン
スフェラーゼ（neo）に対するコード領域を示す。
第１図 プラスミドpDS1,t01+の図式的表示及びヌクレオチド
配列。該プラスミドは、第1a図に図式的に示されてい
る。ヌクレオチド配列（第1b図）において、図式的表示
で与えられた制限エンドヌクレアーゼの認識部位には上
線が付され、一方、β−ラクタマーゼ（bla）及びジヒ
ドロ葉酸塩還元酵素（dhfr）のコード領域にはそれぞれ
下線が付されている。
第２図 プラスミドpDS3の図式的表示及びヌクレオチド配列。
該プラスミドは、第2a図に図式的に示されている。ヌク
レオチド配列（第2b図）において、図式的表示で与えら
れた制限エンドヌクレアーゼの認識部位には上線が付さ
れ、一方、β−ラクタマーゼ（bla）及びジヒドロ葉酸
塩還元酵素（dhfr）のコード領域にはそれぞれ下線が付
されている。
第３図 プラスミドpML3/lacOP29の図式的表示及びヌクレオチ
ド配列。該プラスミドは、第3a図に図式的に示されてい
る。知られている限りを与えられているヌクレオチド配
列（第3b図）において、図式的表示において与えられた
制限エンドヌクレアーゼの認識部位には上線が付され、
一方、β−ラクタマーゼ（bla）、lac−リプレッサー
（lacI）及びβ−ガラクトシダーゼ（lacZ）のコード領
域にはそれぞれ下線が付されている。
第４図 プラスミドpDMI,1の図式的表示及びヌクレオチド配
列。該プラスミドは、第4a図に図式的に示されている。
ヌクレオチド配列（第4b図）において、図式的表示で与
えられた制限エンドヌクレアーゼの認識部位には上線が
付され、一方、ネオマイシン・ホスホトランスフェラー
ゼ（neo）及びlac−リプレッサー（lacI）のコード領域
にはそれぞれ下線が付されている。
第５図 発現制御配列lacOP29（ａ）、tacOP29（ｂ）、N25OPS
N25OP29（ｃ）、AlOPSAl（ｄ）、AlOPSCONAl（ｅ）、Al
pOPSAl（ｆ）、OPUAl（ｇ）、OPUAlCON（ｈ）、AlOPSAl
OP21（ｉ）及び AlOPSAlOP29（ｊ）をそれぞれ有する
XhoI−EcoRI断片のヌクレオチド配列。これらの配列
において、PNA合成が始まるヌクレオチド（＋）及び−1
0位と−35位との領域には下線が付され、一方、lac−オ
ペレーター配列には上線が付されている。
第６図 プロモーターPN25を有するEcoRI断片のヌクレオチド
配列。該配列において、RNA合成が始まるヌクレオチド
及び−10位と−35位との領域には下線が付されている。
第７図 発現制御配列N25*/0及びN25OPSN25をそれぞれ有するX
hoI−EcoRI断片のヌクレオチド配列。これらの配列にお
いて、RNA合成が始まる各ヌクレオチド及び−10位と−3
5位との領域には下線が付され、一方、lac−オペレータ
ー配列には上線が付されている。
第８図 プロモーターPA1を有するXhoI−EcoRI断片のヌクレオ
チド配列。該配列において、RNA合成が始まるヌクレオ
チド（＋１位）及び−10位と−35位周辺の領域には下線
が付されている。
第９図 発現制御配列OPAlOPSAlを含むSalI−EcoRI断片のヌク
レオチド配列。該配列において、RNA合成が始まるヌク
レオチド及び−10位と−35位周辺の領域には下線が付さ
れ、一方、lac−オペレーター配列には上線が付されて
いる。
第10図 プラスミドpDS1/PN25，t01+の図式的表示。プロモー
ターPN25からの転写は時計回り方向である。
第11図 プラスミドpDS3/AlOPSAlの構築の図式的表示。該発現
制御配列A1OPSA1からの転写は、時計回り方向である。
第12図 プラスミドpDS3/OPAlOPSAlの構築の図式的表示。転写
が時計回り方向である発現制御配列OPAlOPSAlを有するS
alI−EcoRI断片のヌクレオチド配列は、第９図に与えら
れている。
第13図 プラスミドpML3/AlOPAlの構築の図式的表示。該構築
において、発現制御配列lacOP29を含むプラスミドpML3/
lacOP29のXhoI−EcoRI断片は、発現制御配列AlOPSAlを
含む相当するXhoI−EcoRI断片で置換されている。
第14図 プラスミドpML3/OPAlOPSAlの構築の図式的表示。該プ
ラスミドの構築には３種のDNA断片：発現制御配列OPAlO
PSAlを含むpDS3/OPAlOPSAl由来のSalI−EcoRI断片、lac
Z遺伝子の部分を含むpML3/lacOP29由来のEcoRI−ClaI断
片及びpML3/lacOP29由来の大きい方のClaI−XhoI断片を
使用した。この構築において、SalI及びXhoIに対する切
断部位を互いに連結し、これによって両切断部位を破壊
した。
第15図 活性RNAP濃度0.42nM及びプロモーター濃度0.02nMにお
けるRNAP及びプロモーターPN25の複合体（complex）形
成の時間依存的進行。
第16図 反応時間の関数としての式−ln〔（A0−Ｘ）／A0〕の
活性RNAP濃度0.42nM及びプロモーターPN25濃度0.02nMに
おけるグラフ的表示。
第17図 プロモーター濃度0.02nMならびに活性RNAP濃度0.32nM
（実験２）及び0.15nM（実験３）のそれぞれにおけるRN
APとプロモーターPN25との複合体形成の時間依存的進行
のグラフ的表示。
第18図 反応時間の関数としての式−ln〔（A0−Ｘ）／A0〕の
プロモーター濃度0.02nMならびに活性RNAP濃度0.32nM
（実験２）及び0.15nM（実験３）のそれぞれにおけるグ
ラフ的表示。
第19図 プロモーターPN25を内部標準としたプロモーターPA1
に対する複合体形成速度の決定：−ln〔（B0−Ｙ）／
B0〕が−ln〔（A0−Ｘ）／A0〕に対してプロットされて
いる。
第20図 プロモーターPA1を内部標準とした発現制御配列AlOPS
Alに対する複合体形成速度の決定：−ln〔（B0−Ｙ）／
B0〕が−ln〔（A0−Ｘ）／A0〕に対してプロットされて
いる。
第21図 β−ガラクトシダーゼ単位のPbLa単位への変換因子の
決定：発現制御配列tacOP29、N25OP29、OPUAl及びOPUAl
CONの制御下におけるβ−ガラクトシダーゼ単位が対応
するPbLa単位に対してプロットされている。
実施例１ 使用プラスミドの記載 A.基本的事項 プラスミドpDS1,t01+（第１図）、pDS3（第２図）、p
ML3/lacOP29（第３図）及びpDMI,1（第４図）を発現制
御配列の製造及びそれらの性質の特徴付けに用いた。こ
れらのプラスミドにより形質転換されたE.coli細胞は、
ゲッチンゲンのDeutschen Sammlung von Mikroorganism
en（DSM）にブダペスト条約に基づき、1984年12月11日
付〔E.coliM15（pDS1,t01+）,DSM No.3135〕、1985年10
月３日付〔E.coli M15（pDS5/RBSII,3A＋5A;pDMI,1）,D
SM No.3517〕及び1987年８月５日付〔E.coli M15（pDS
3）,DSM No.4198;E.coli M15（pML3/;lacOP29）,DSM N
o.4199〕で寄託されている。
B.プラスミドpDS1,t01+ 制限エンドヌクレアーゼXbaI及びEcoRIの切断部位、
ならびに複製領域及び細胞にアンピシリン耐性を付与す
るβ−ラクタマーゼ遺伝子の間にあるpDS1,t01+（第１
図）の部分は、プラスミドpBR322〔Bolivarらの、Gene
2,95−113（1977）;Sutcliffeの、Cold Spring Harbor
Symp.Quant.Biol.43,77−90（1979）〕から誘導され
る。該プラスミドの残りの部分は、制限エンドヌクレア
ーゼXhoI、EcoRI及びBamHIの切断部位、それに続くマウ
ス細胞株AT−3000のジヒドロ葉酸塩還元酵素の遺伝子
〔ChangらのNature 275,617−624（1978）;Mastersらの
Gene 21,59−63（1983）〕、E.coliファージ・ラムダの
ターミネーターt0〔SchwarzらのNature 272,410−414
（1978）〕及びクロラムフェニコール・アセチルトラン
スフェラーゼのプロモーターを欠損した遺伝子（Marcol
iらのFEBS Letters,110,11−14（1980）〕を有してい
る。
C.プラスミドpDS3 プラスミドpDS3（第２図）は、プラスミドpDS1,t01+
とは、一方では種々の制限エンドヌクレアーゼの切断部
位のほかにE.coli rrnBオペロンのターミネーターT1〔B
rosiusらのJ.Mol.Biol.148,107−127（1981）〕を有す
る領域において、他方ではクロラムフェニコール・アセ
チルトランスフェラーゼの遺伝子内に制限エンドヌクレ
アーゼEcoRIの切断部位が存在しない点において異なっ
ている。
D.プラスミドpML3/lacOP29 制限エンドヌクレアーゼSalI及びEcoRIの切断部位、
ならびに複製領域及びβ−ラクタマーゼ遺伝子の間にあ
るpML3/lacOP29（第３図）の部分は、プラスミドpBR322
（Bolivarらの前出文献、Sutcliffeの前出文献）から誘
導される。該プラスミドの残りの部分は、lac−リプレ
ッサーをコードする完全なlacI遺伝子〔Faraboughの、N
ature 274,765−769（1978）〕に加え、E.coliファージ
T7のターミネーターTE（Dunn及びStudierの、J.Mol.Bio
l.166,477−535（1983）〕、発現制御配列lacOP29（実
施例２参照）及びβ−ガラクトシダーゼのプロモーター
を欠損した遺伝子（Kalninsらの、EMBO J.2,593−597
（1983）〕を有している。
E.プラスミドpDMI,1 プラスミドpDMI,1（第４図）は、E.coli細胞類にカナ
マイシン耐性を付与するトランスポゾンTn5由来のネオ
マイシン・フォスフォトランスフェラーゼの遺伝子〔Be
ckらの、Gene 19,327−336（1982）〕及びlac−リプレ
ッサーをコードし、プロモーターの変異Iq（CalosのNat
ure 274,762−765（1978）〕を有するlacI遺伝子（Fara
bough,前出文献）を有している。更に、プラスミドpDM
I,1は、複製及びドーター（daughter）細胞への安定な
伝達に要するすべての情報を含むプラスミドpACYC184
〔Chang及びCohenの、J.Bacteriol.134,1141−1156（19
78）〕の領域を含んでいる。プラスミドpDMI,1は、前述
したプラスミド類及びそれらの誘導体と交換可能であ
る。
実施例２ 発現制御配列の製造及びクローニング A.基本的事項 発現制御配列の製造後、それらを、性質の特徴付けの
ために適当なプラスミド類中に組込んだ。
B.発現制御配列の製造 1.発現制御配列lacOP29、tacOP29、AlOPSCONAl、OPUA
l、OPUAlCON、N25OPSN25OP29、PA1、AlOPSAl、AlpOPSA
l、AlOPSAlOP21及びAlOPSAlOP29 これらの発現制御配列の製造のために、最初単鎖DNA
断片を化学的に合成した〔Bannwarth及びIaizaの、DNA
5,413−419（1986）〕。次いで、これらの断片を、文献
（Maniatisらの前出文献）記載の方法に従ってハイブリ
ッド化し、連結した。かくして得られた２重鎖XhoI−Ec
oRI断片の配列は、対応する発現制御配列を有してお
り、それぞれ第５図及び第８図に示されている。
2.発現制御配列PN25、N25*/0及びN25OP29 発現制御配列PN25、N25*/0及びN25OP29（第６図及び
第７図）は、上記の項に記載したのと同様にして製造す
ることができる。
3.発現制御配列OPAlOPSAl 発現制御配列OPAlOPSAlの配列は、第９図に示されて
いる。その製造は、Ｄ項に記載されている。
C.プロモーターPN25のプラスミドpDS1,t01+への組込み プロモーターPN25をプラスミドpDS1,t01+（第１図）
中に、文献（Maniatisらの前出文献）記載の方法に従っ
てEcoRI断片の部分（第６図参照）として組込み、かく
してプラスミドpDS1/PN25，t01+（第10図）を得た。こ
のプラスミドは、プロモーターPN25を大量に製造するた
めの原料として使用した。
D.発現制御配列のプラスミドpDS3への組込み 発現制御配列lacOP29、tacOP29、OPUAl、OPUAlCON、P
N25、N25*/O、N25OP29、N25OPSN25OP29、PA1、AlOPSA
1、AlOPSAlOP21、AlOPSAlOP29、AlOPSCONAl及びAlpOPSA
Lを、プラスミドpDS3（第２図）中に文献（Maniatisら
の前出文献）によって公知の方法により組込んだ。この
ようなクローニングのひとつを、第11図に、発現制御配
列AlOPSAlを例として図式的に示してある。
発現制御配列OPAlOPSAlを、lac−オペレーターの回文
的な配列を含む化学合成DNA断片を、プラスミドpDS3/Al
OPSAl（第11図）のHpaI切断部位に組込むことにより製
造した（第12図）。
対応する発現制御配列を有するpDS3の誘導体類を、プ
ロモーターとRNAPとの会合速度の決定のみならず、個々
の発現制御配列のプロモーター強度の決定にも使用し
た。
E.発現制御配列のプラスミドpML3/lacOP29への組込み プラスミドpML3/lacOP29（第３図）は、制限エンドヌ
クレアーゼXhoI及びEcoRIの切断部位の間に発現制御配
列lacOP29を有している。これらのプラスミドを、文献
（Maniatisらの前出文献）記載の方法に従い、lacOP29
をそれぞれ、発現制御配列tacOP29、N25OP29、N25OPSN2
5OP29、AlOPSAl、AlOPSAlOP21、AlOPSAlOP29、AlOPSCON
Al、AlpOPSA1、OPUAl及びOPUAlCONのひとつにより置き
替えることにより製造した（第13図）。
発現制御配列OPAlOPSAlを含むプラスミドpML3/OPAlOP
SAlは、第14図に図式的に示したようにして製造した。
対応する発現制御配列を含有する、得られたpML3誘導
体類は、抑制された条件下におけるイン・ビボ・プロモ
ーター強度の測定に使用した。
実施例３ シグナル強度の測定 A.基本的事項 プロモーター及びプロモーター／オペレーター要素の
各々のシグナル強度を測定するために、まず、E.coliRN
Aポリメラーゼ（RNAP）とプロモーターPN25との間の会
合速度（Kass）を完全に測定した。次いで、残るシグナ
ルのKass値を、プロモーターPN25を内部標準として用い
て相対的な測定により測定した。
B.RNAPとプロモーターPN25におけるKassの測定 RNAPとプロモーターPN25におけるKassを、RNAP濃度と
反応時間との関数としてRNAP/プロモーター複合体（com
plex）形成を定量的に測定することに基づく、フィルタ
ー結合実験により測定した。RNAPのみならず、プロモー
ターも生物学的物質であるので、このような実験の評価
には、両反応物について活性分子濃度が既知であること
が想定される。従って、例えばRNAPについては、蛋白質
濃度ではなく、活性ポリメラーゼ分子濃度が考慮されな
ければならない。同様のことは、プロモーターPN25なら
びに非特異的結合及び会合反応の終止における競合物と
して用いられる単鎖fd−DNAについても適合する。従っ
て、Kassの測定についての実際の実験を記述する前に、
以下の複合体形成速度の論理的誘導に関する記述に従っ
てすべての反応物の生成及び分析を詳細に説明する。
1.Kassの論理的誘導 一般的な反応式、 式中、Ｒは、RNAPの遊離濃度を示し、 Ｐは、プロモーターの遊離濃度を示し、 RPは、RNAP/プロモーター複合体の濃度を示し、 Kassは、会合速度を示し、かつ Kassは、解離定数を示す。
次式は、単位時間あたりの反応の進行に適用できる。
dP/dt＝−Kass×Ｒ×Ｐ＋Kdiss×RP RNAP/プロモーター複合体の半減期が長い、すなわ
ち、解離定数Kdissが小さいときは、Kdiss×RPの項を無
視することができ、そして dP/dt＝−Kass×Ｒ×Ｐ （１） が単位時間あたりのプロモーター濃度の変化に適用でき
る。
Ｒ及びＰは、時間と共に変化する。しかしながらRNAP
が大過剰において存在する場合は、反応の時間中その濃
度は、一定（すなわちＲ＝一定の場合、dR/dt＝０）で
あるとみなすことができ、 Kass×Ｒ＝ｍ （２） が適用される。
従って、単位時間あたりのプロモーター濃度の変化に
対して（（１）及び（２）式を参照）： dP/dt＝−ｍ×Ｐ 又は変換して： −dP/P＝ｍ×dt が適用される。この式を積分することにより： −lnP＝ｍ×ｔ （３） が得られる。
式（３）は、速度定数ｍ〔1/sec〕を有する一次反応
式、すなわち、形式的には“RNAP/プロモーター複合体
中の遊離のプロモーターの分解”に対応する。この場合
Ｐは、時下ｔの時点における遊離のプロモーターの量で
ある（ｔ＝Osecに対してＰ＝１）。この量は実験的に測
定することができる（６項参照）、A0（プロモーターの
総量）及び×（反応時間ｔの時点におけるRNAP/プロモ
ーター複合体の量）の知見から、いわゆる“擬一次”定
数ｍが３式を用いて計算することができ： Ｐ＝（A0−Ｘ）／A0 また ｍ＝−ln〔（A0−Ｘ）／A0〕/t （４） が得られる。プロモーター／オペレーター複合体の形成
が、二次の２分子反応であるため、定数ｍは、RNAPの濃
度に依存する。これが知られている場合には、会合速度
Kassは、式 ｍ＝Kass×Ｒ （２） 及び ｍ＝−ln〔（A0−Ｘ）／A0〕/t （４） を考慮して次のように計算される： Kass×Ｒ＝−ln〔（A0−Ｘ）／A0〕/t または変換して： Kass＝−ln〔（A0−Ｘ）／A0〕／（ｔ×Ｒ） （５） Kassの誘導において、逆反応、すなわちRNAP/プロモー
ター複合体の分解は無視することができる（Kdiss×RP
＝０）と思われていた。このような分解は、一次反応で
あり、従って反応物の濃度に左右される。一方、会合
は、濃度依存性である。従って、Kassの測定にあたって
は、複合体の分解が無視できる期間に会合工程が起こる
ように、反応物濃度を高く選択しなければならない。こ
のことは、RNAP/プロモーター複合体類の安定性につい
ての知見を想定している。
更に、反応経過中において、遊離のRNAPの濃度は、一
定であるとみなし得ると想定した。この目的のため、RN
APは、プロモーターに対し大過剰に存在しなければなら
ず、この場合、RNAPが非特異的なDNA配列に対しても結
合し得ることを考慮しなければならない。このような非
特異的結合部位の数は、単離された小さいDNA断片上の
プロモーターを調べることによって小さく保つことがで
きる。プロモーターあたり、約10RNAP分子の過剰量によ
って、反応経過中、遊離RNAPの濃度は、一定であるとみ
なすことができる。
2.プロモーターPN25を含むプローブの製造 プラスミドpDS1/PN25，t01+（第10図）は、254bp Eco
RI断片（第６図）上のプロモーターPN25を含んでいる。
このプラスミドは、前記EcoRI断片をXhoI切断部位に隣
接している、プラスミドpDS1,t01+（第１図）のEcoRI切
断部位に組込むことによって構築した。プロモーター断
片を精製するために、まずプラスミドpDS1/PN25，t01+
を精製し（Maniatisらの前出文献）、次いでこのプラス
ミド0.5mgを制限エンドヌクレアーゼEcoRIにより切断し
た。フェノール抽出及びエタノール沈澱（Maniatisらの
前出文献）の後、切断DNAをTE緩衝液（10mM トリスHC
l、1mM EDTA、pH7.6）に溶解し、試料緩衝液を加えた
後、6.％ポリアクリルアミド・ゲル中で電気泳動にかけ
た（Maniatisらの前出文献）。引き続き、プロモーター
PN25を有する断片をメスによりゲルから切り出し、DEAE
ペーパー（DE81,Whatman,英国）上で電気泳動にかけ
た。エタノール及びTE緩衝液による３重の洗浄の後、ペ
ーパーを空気中で乾燥し、その後DNAを10mMのトリスHC
l、1mMのEDTA及び1.5MのNClを含むpH7.6の緩衝液で溶離
した。得られたDNA溶液をTE緩衝液により1:3に希釈した
後、DNAをエタノールで沈澱させ、沈澱物を80％エタノ
ールで洗浄し、次いでDNAをTE緩衝液に溶解した。
このDNA溶液の濃度を、まずMahlerら〔J.Mol.Biol.9,
801−811（1964）〕により記載されているように分光学
的に測定した。次いで、DNA保存溶液の一部をTE緩衝液
で1:30に希釈し、引き続きこの希釈溶液の吸光について
TE緩衝液をブランクとして測定した。以下の値が得られ
た。
ΔE260＝0.108 ΔE260／ΔE280＝1.86 ΔE280＝0.058 ΔE260＝50μg DNA/mlである変換因子及び希釈因子を
考慮して、保存溶液について162μg/mlのDNA濃度が得ら
れる。この値は、プロモーター断片の長さ（254bp）を
考慮すると0.96pモルDNA断片／μｌの濃度に対応する。
260及び280nmにおける吸光度の関係は、DNA溶液の純度
に関する主張を認める。DNA溶液の高い純度は、ΔE260
／ΔE280について得られた1.86の値から結論し得る。
DNA溶液の濃度は、また、この溶液を既知濃度（ΔＥ
測定）のプラスミドpDS1,t01+のRNAを含まない溶液と比
較することによって測定した。この目的のため、プロモ
ーター断片を含むDNA溶液の0.09pモルに配分したものに
それぞれ0.2、0.1、0.05及び0.025pモルの切断pDS1,t01
+プラスミドDNAを混合し、６％PAAゲル中にて特徴付け
を行なった（Maniatisらの前出文献）。得られたフェロ
グラムを密度分析的に評価し、かくしてプロモーター断
片について0.8pモル／μｌの濃度を切断pDS1,t01+プラ
スミドDNAとの比較において得た。
プロモーター断片の純度を測定するために、まず0.36
pモルのこの断片をPAAゲル中で特徴付けた。エチジウム
・ブロマイドにより染色した後、不純物は検出されなか
った。更に、その断片を32Pにより放射活性的に標識化
し（下記参照）、また電気泳動的にも特徴付けた。オー
トラジオグラフィーにより、プロモーター断片のみが検
出できた。
要約すると、プロモーターPN25を有する単離したEcoR
I断片が、実質的量のRNAまたはDNAによって汚染されて
おらず、0.88±0.08pモル／μｌの濃度において存在し
ていることが立証された。活性ポリメラーゼの濃度を測
定する実験（下記参照）においては、プロモーター・プ
ローブとして、プロモーターPN25を有する単離されたEc
oRI断片由来及び32Pにより放射活性的に標識化した対応
する断片由来の混合物を用いた。この放射活性的に標識
化されたDNAは、次のように製造した：ますDNAをCIP
（仔牛胸腺アルカリホスファターゼ）により脱ホスホリ
ル化し（Maniatisらの前出文献）、次いでT4−ポリヌク
レオチド・キナーゼを用いて32P（γ−32PATP、Amersha
m、3000Ci/mモル）を導入することによって標識化した
（Maniatisらの前出文献）。次いで、放射活性的に標識
化したプロモーターPN25を有するEcoRI断片をセファデ
ックス（Sephadex）G75（Pharmacia、スエーデン）上の
クロマトグラフィーにより精製した。このプローブの比
活性を測定するために、一方で放射活性を測定し、また
他方でDNA濃度を前処理され、単離されたEcoRI断片に対
して電気泳動的に測定した（上記参照）。次いで、所定
の濃度及び比活性のプロモーターPN25を有するプローブ
が、未処理及び放射活性に標識化したEcoRI断片を混合
することにより得られた。
3.単鎖 M13mp8−DNAの製造及び特徴付け 単鎖 M13mp8−DNAをRNAPのDNAに対する非特異的結合
において競合物としてのみならず、会合反応の停止にも
用いた。このDNAの製造及び特徴付けを以下に記載す
る。E.coli JM101細胞（Maniatisらの前出文献;GIBCO−
BRL,バーゼル）を0.01pモルのM13mp8− RFI−DNA（Phar
macia、スエーデン）によりMorrison〔Method of Enzmo
logy 68,326−331（1979）〕に記載された方法に従って
形質転換した。次いで、これらの細胞を、イソプロピル
チオガラクトシド（IPTG）及びＸ−ゲル（５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）
を含む指示プレート上に塗布した。ここで、J.H.Miller
の文献“Experiments in Molecular Genetics"、Cold S
pring Harbor Laboratory（1972）並びにMessing及びVi
eiraの論文Gene19,269−276（1982）を参考にすること
ができる。形質転換されたE.coli JM101細胞を含む濃厚
なプラークを、これらの指示プレートの上部カンテン層
からパスツール・ピペットにより取り、10mlのLB培地中
に移し、そして振盪培養器（37℃、220rpm）中で８時間
培養した。引き続き、細胞を遠心分離し、M13mp8ファー
ジを含む上澄みをE.coli JM101細胞の再感染に用いた。
この目的のため、まず500mlのM9最少培地（J.H.Miller
の前出文献）中のE.coli JM101細胞をOD600＝２まで育
生し（37℃、220rpm）、その後、M13mp8ファージを含む
1mlの上澄（上記参照）をそれらの細胞に加えた。37℃
にて更に12時間培養した後、細胞を遠心分離した。該フ
ァージを３％ポリエチレングリコール（PEG 6000）及び
0.5M NaClにより上澄から沈澱させ、次いで遠心分離し
た。沈澱物を20mlのTE緩衝液中に再懸濁し、65℃にてフ
ェノール（200mMトリスHCl、pH8中に平衡化されてい
る）及びフェノール／クロロホルム（1:1）により各々
の場合に２回抽出を行なった。
引き続き、かくして遊離された単鎖M13mp8−DNAをエ
タノールにより沈澱させ、そして1mlのTE緩衝液中に溶
解させた。このDNA溶液の濃度を分光学的に測定し（Mah
lerらの前出文献）、かくして変換因子1OD260＝36μｇ
の単鎖DNA/mを基礎とした。
4.RNAP溶液中の活性ポリメラーゼ濃度の測定 RNAP溶液中の活性E.coliRNAポリメラーゼの濃度を測
定するために、RNAPを過剰のプロモーター断片の存在下
で培養した後、形成されたRNAP/プロモーター複合体の
量をフィルター結合実験により測定した。この量から、
結合したE.coliRNAポリメラーゼの濃度を、用いたプロ
モーター断片の量を考慮して計算した。このようにして
測定された結合可能なRNAPの濃度は、遊離の活性なRNAP
の濃度と等価であった。
このような濃度測定の一例を以下に記述する。0.12p
モルのプロモーター断片（第Ｂ、２項参照；比活性;4×
104cpmｐモル）を37℃にて２分間、50μｌの結合緩衝液
（20mM トリスHCl、ph8.0、10mM MgCl2、0.1mM EDTA、
1mM DTT、５％グリセーロル、120mM KCl）中で培養し
た。E.coliRNAP（Pharmacia、スエーデン）を０℃にて1
20mM KClを含むBB中に希釈した。それぞれの場合におい
て、100μｌの該希釈物を37℃にて２分間培養し、次い
でプロモーター断片を含む溶液中にピペットにより入れ
た。これらのバッチを37℃に５分間保ち、その後37℃に
て２分間前培養した0.8μｇの単鎖M13mp8−DNA（第Ｂ、
３項参照）を含むBB 300μｌを加えた。37℃にて更に５
分間培養した後、これらのバッチを37℃にてニトロセル
ロース上で濾過した。このような濾過処理の一例を以下
に記述する。まずニトロセルロース・フィルター（ニト
ロセルロース・フィルターBA、0.45μm;Sartorius、ゲ
ッチンゲン）を小さい正方形片（４×4mm）に切断し、
そして40mM KClを含むBB中に浸した。次いで、このよう
な断片の一つを、ガラス・フリット上に置かれ、同様に
浸漬したグラスファイバーフィルター（GF/A、Whatma
n）上に移した。更に37℃の水溶中に立てられたガラス
・フリットを水流ポンプに連結した。それらの反応バッ
チ（上記参照）を濾過速度1ml/分にて濾過した。その
後、フィルターを40mM KClを含むBB1ml（37℃に予熱）
にて注いだ。フィルターに結合したDNAの遊離のため
に、該ニトロセルロース・フィルターをピペット・チッ
プ（エッペンドルフ）によりエッペンドルフ試験管中に
詰め込み、そして、20μｌの溶離緩衝液（EB）（10mMト
リスHCl、1mM EDTA、0.1％SDS、pH8）を加えた後、ピペ
ット・チップにより圧搾した。溶離バッチを氷上に30分
間置き、次いで55分間遠心分離した（エッペンドルフ・
ベンチ・遠心分離機、12000rpm）。その後、溶離溶液を
分取し、別のエッペンドルフ試験管に移し入れた。該フ
ィルターに50μｌのTE緩衝液を加え、該バッチを３分間
振盪した（エッペンドルフ振盪機）。次いで、洗浄溶液
を分取し、該溶離溶液に合した。３回の溶離及び洗浄工
程の総計の後、約95％の結合DNAが溶離された（フィル
ターに結合した残留活性の計算による照査）。存在し得
る破砕されたフィルター断片をすべて遠心分離により除
いた後（上記参照）、溶離液の放射活性を測定した（21
0μｌ）。
RNAP溶液中の活性ポリメラーゼ濃度の計算を以下に記
述する。プロモーター断片に比較して過剰の活性ポリメ
ラーゼにより、それらの数値はプラトーを作り、ここで
プラトー値が0.12pモルのプロモーター断片の量に対応
する（実験において使用したものと同じ断片濃度）。プ
ロモーター断片に対するポリメラーゼの不足分において
得られた数値から、任意のRNAP希釈物に対しても活性ポ
リメラーゼの濃度を、希釈因子を考慮したうえで不足RN
APの数値／過剰RNAPの数値の比によって測定することが
できる。
5.RNAP/プロモーター複合体の半減期の測定 Kassの誘導体においては、実験過程中におけるRNAP/
プロモーター複合体の分解は無視できるものと仮定した
（第Ｂ、１項参照）。この仮定をRNAP/プロモーター複
合体の半減期を測定することによる実験にて検討した。
かかる測定の一例を以下に記述する。まず、0.06pモル
のプロモーター断片（第Ｂ、２項参照；比活性2.4×106
cpm/pモル）を、1.2Pモルの活性ポリメラーゼと共に120
mM KClを含むBB中で37℃にて５分間培養することによ
り、RNAP/PN25複合体を形成させた。５μｇの単鎖M13mp
8−DNA（第Ｂ、３項参照）を加えた後、37℃に保ったバ
ッチから種々の時点（０−180分）で試料を取り出し、3
7℃にてニトロセルロース・フィルター上で濾過した
（第Ｂ、４項参照）。フィルターに結合した放射活性を
第Ｂ、４項と同様にして測定し、得られた値を反応時間
に対してプロットした。このグラフの評価は、これらの
実験条件下において、RNAPとプロモーターPN25との複合
体が約３時間の半減期を有することを示した。
6.RNAPとプロモーターPN25とについてのKassの測定 RNAPとプロモーターPN25とについてのKassの測定のた
めの動力学的計測を、“擬一次”条件下、すなわち大過
剰のRNAPにより行なった。この目的のために、実験条件
及び反応時間を逆反応、すなわち形成されたRNAP/プロ
モーター複合体の分解が無視できるように選択した（約
180分間の複合体の半減期に対し、実験時間は最大７分
間；第Ｂ、５項参照）。これらの結合実験は、すべて単
一の図式に従って行ない、かくしてこれら実験の３種の
独立した系において反応体積のみならず反応物の濃度も
変えた。かくしてPN25プロモーター断片を緩衝溶液中で
前培養し、その後、同様にして緩衝溶液中で前培養し、
その活性ポリメラーゼ濃度を、第Ｂ、４項に記載したよ
うに並行して行われた実験により測定されたRNAP溶液を
添加し、該反応をこれらのバッチを混合して開始した。
選択された反応時間（１−120秒間）後、単鎖M13mp8−D
NA（第Ｂ、３項参照）を添加することにより、反応を停
止させた。その後、形成されたRNAP/プロモーター複合
体をフィルター結合実験（第Ｂ、４項参照）を介して定
量的に記録した。会合速度Kassの測定のための３種の実
験を以下に記述する。
実験１ 120mM KClを含有するBB中の50μｌのPN25プロモータ
ー断片（0.045nM、比活性３×106cpm/pM）を、37℃で２
分間培養した。RNAPを、０℃で、120mM KClを含有するB
B中において段階的に希釈した〔それぞれ（1:10から1:2
0）〕。その後、100μｌの1:5000希釈液を、37℃で２分
間、前培養した。（活性ポリメラーゼの濃度が0.42nMに
なった;B、４項参照）。該PN25プロモーター断片溶液と
該RNAP溶液を合し、それらのバッチを混合することによ
って会合反応を開始させた。37℃で10秒間培養した後、
37℃で２分間培養した0.8μｇの単鎖M13mp8−DNAを含有
する300μｌのBB溶液を添加した。37℃で５分間培養し
た後、前記したと同様に該バッチを37℃でニトロセルロ
ース上で濾過し、40mM KClを含有する200μｌのBBでフ
ィルターを洗浄し、次いで、フィルターに結合した放射
活性を測定した。
更に、同一の条件下に11回の実験を行ない、それぞれ
単鎖M13mp8−DNAを添加することにより、１、２、３、
４、５、６、７、８、15、20、60及び120秒後に会合反
応を停止させた。12の全ての部分的な実験で得られた数
値を、第15図中における反応時間に対応させてプロット
した。第15図中、点数は、フィルターに結合した最大放
射活性を示す。この値を測定するために50μｌのPN25プ
ロモーター断片を、120mM KCl及び1pモルの活性ポリメ
ラーゼを含有する100μｌのBBと共に、37℃で３分間培
養した。その後、反応を停止させ、前記の様にしてバッ
チを得た。結合可能な最大放射活性（A0）は、使用した
プロモーター断片（又は100％RNAP/PN25複合体）の量に
対応する。時間ｔにおける点A0と結合放射活性（Ｘ）と
の差は、遊離のプロモーター断片に対する相対的測定値
となる。数式（A0−Ｘ）A0は、かくして時間ｔに於ける
点の遊離のプロモーター断片の量を与える。数式−1n
〔A0−Ｘ）A0を、全ての部分的実験に対して計算し、反
応時間ｔに対応させてプロットした（第16図参照）。回
帰直線の勾配ｍは、第１項からの式（３）及び式（４）
の速度定数に対応し、ｍ＝0.12/秒であると計算され
た。0.42nMの活性ポリメラーゼの濃度（第Ｂ、４項にお
いて測定）に関して、Kass＝m/R（第１項における式
（２））の関係によって2.8×108M-1・sec-1のKassを得
た。
実験２及び実験３ 実験１と同様な方法によって、実験２及び実験３を行
ない、かくして、各反応溶液に基づく反応物は、以下の
濃度によって示された。
実験２ プロモーター断片PN25 :0.02nM 活性RNAP :0.32nM 反応時間 :2、４、８、10、15、20 及び60秒 実験３ プロモーター断片PN25 :0.02nM 活性RNAP :0.15nM 反応時間 :2、４、８、10、15、20 及び60秒 実験１に述べたと同様にして数値を評価し（第17図及
び第18図参照）、以下の値を測定した。
実験２ ｍ＝0.104/sec:Kass＝3.2×108M-1・sec-1 実験３ ｍ＝0.04/sec:Kass＝2.7×108M-1・sec-1 ３回の全ての実験を平均して、RNAP及びプロモーター
PN25に対する会合速度Kassとして以下の値を得た。
Kass＝2.9×108M-1・sec-1 測定の誤差が、プロモーター断片及び選択RNAPの濃度
測定のみならずフィルター結合実験において約10％であ
るため、この値は、約15％の誤差を受けることになる。
C.内部標準としてプロモーターPN25及びPA1を各々用い
る比較測定を介してのRNAP及び各種の発現制御配列に対
する会合速度の測定 1.理論 内部標準としてプロモーターPN25及びPA1を各々用い
た比較測定によって、RNAP及び発現制御配列tacOP29、N
25*/O、N25OP29、N25OpS N25Op29、Al、AlOPSAL、AlOPS
CONAl、AlpOPSAL及びOPAlOPSAlに対する複合体形成速度
を測定した。かくして、以下の考え方を基本にした。
異なるプロモーター類の混合物において、RNAPが過剰
に存在すると、プロモーター類は、RNAPとの複合体形成
速度に応じて競合する。
RNAPとプロモーター間の２次の二分子反応の単位時間
当りのプロモーター濃度における変化に対しては、形成
した複合体類の高い半減期の場合、式（１）（第Ｂ項参
照）dp/dt＝Kass×Ｒ×Ｐが適用される。
異なるプロモーター類を有する反応混合物において、
いかなる時点においても遊離のRNAPの濃度は、全てのプ
ロモーターに対して同一である。従って会合速度Kass，
a及びKass，bを有する２種類のプロモーターａ及びｂに
対して以下の関係が適用される。
−dPa／Pa×1/Kass，a＝Ｒ×dt −dPb／Pb×1/Kass，b＝Ｒ×dt Ｒ×dtは、両方のプロモーターに対して同一であるた
め、 −dPa／Pa×1/Kass，a＝−dPb／Pb×1/Kass，b 又は変換された −dPa／Pa＝−Kass，a／Kass，b×dPb／Pb が適用される。
積分後、 −ln〔（A0−Ｘ）／A0〕＝−Kass，a／Kass，b×ln
〔（B0−Ｙ）B0〕 又は、 Kass，b＝Kass，a×−ln〔（B0−Ｙ）B0〕／−ln〔（A0
−Ｘ）A0〕 （６） 式中、A0及びB0は、過剰のRNAPにおいて結合する、プ
ロモーターａ及びｂのそれぞれの総量を示し、また、Ｘ
及びＹは、過剰のRNAPにおいて形成する、RNAP及びプロ
モーターａならびにRNAP及びプロモーターｂのそれぞれ
からの複合体の量を示す、が得られる。
2.内部標準としてのプロモーターPN25との会合速度の測
定 対応する発現制御配列（実施例２参照）を有する放射
活性標識DNA断片（第Ｂ、２項参照）を、結合緩衝液
（第Ｂ、６項参照）中、異なった量のRNAPと共に30μｌ
の並行バッチ中、37℃で２分間培養した。
次いで、１μｇの単鎖M13mp8−DNA（第Ｂ、３項参
照）を含む、20μｌの結合緩衝液（37℃）を添加して、
更に37℃で２分間後、これらのバッチをニトロセルロー
スフィルター上で濾過する（第Ｂ、４項参照）前に、会
合反応を停止させた。
フィルターに維持された複合体を、溶出し（第Ｂ、４
項参照）、フェノールで抽出後、DNAを30μｌの試料緩
衝液において取り出す前に、エタノールで沈澱させた。
次いで、存在するDNAの３分の１を、Maniatis（前出文
献）の方法に従って8.3Mの尿素を有する36％のポリアク
リルアミドゲル中で電気泳動し、オートラジオグラフィ
ーで視覚化した。
プロモーターに対するRNAPのそれぞれの比率に関して
は、最初にそれぞれのプロモーターに対して結合プロモ
ーターの量を測定した（PN25に対してＸが、プロモータ
ーに対してＹが測定される）。この目的のために、それ
ぞれの場合において、特定のRNAPを用いた実験に対応す
るオートラジオグラムにおける個々のトレースを、密度
計測的に測定した（密度計Elscript 400、Hirschmann、
Unterhachingen、BRD）。プロモーターに対するRNAPの
比率が１に等しく又はそれよりも大であるトレースか
ら、結合しうるプロモーターの総量に対する平均値が得
られた（PN25に対するA0、プロモーターに対するB0が測
定される）。
会合速度の測定に関しては、−ln〔（A0−Ｘ）／A0〕
及び−ln〔（B0−Ｙ）／B0〕に対する値が計算され、各
RNAP/プロモーター比と各々対応させて図式的にプロッ
トされた。得られた線ｍの勾配は、式（６）から −ln〔B0−Ｙ）／B0〕／−ln〔（A0−Ｘ）／A0〕 に相当する。この値及びプロモーターPN25の会合速度に
より、測定したプロモーターに対する会合速度が式
（６）によって得られる。
プロモーターAlに対する会合速度の測定については、
以下実施例によって記載されている。７つの並行バッチ
において、異なった量のRNAP（0.004〜0.012pモル）と
共にプロモーターPN25（〜10,000cpm）を有する約0.02p
モルの断片及びプロモーターPA1（〜10,000cpm）を有す
る約0.02pモルの断片を各々のケースにおいて培養し
た。RNAP/プロモーター比、得られた密度計測値及びそ
れらから計算された値を、それぞれの実験について第１
表に示した。
第１表に示した値は、図示的に第19図に示されてい
る。値ｍ＝0.5は、直線の勾配として得られた。これら
により、以下の式は、式（６）によって得られる（前記
参照）： Kass，A1＝Kass，N25xm（Kass，N25＝2.9×108M-1xsec
-1） Kass，A1＝2.9×0.5×108M-1xsec-1 Kass，A1＝1.5×108M-1xsec-1 以下の会合速度は、残りの発現制御配列に対して得ら
れた。
tacOP29:Kass＝0.85×108M-1xsec-1 N25*/O:Kass＝2.9×108M-1xsec-1 N25OP29:Kass＝2.9×108M-1xsec-1 N25OPSN25OP29:Kass＝2.9×108M-1xsec-1 これらの値は、約15％の誤差を受けうる。
3.内部標準としてのプロモーターPA1を用いた会合速度
を測定 第Ｃ、２項と同様にして、内部標準としてのプロモー
ターPA1を用いて発現制御配列AlOPSAl、AlOPSCONAl、Al
pOPAl及びOPAlOPSAlの会合速度を測定した。要素AlOPSA
lに対する会合速度の測定については、以下実施例によ
って記載されている。異なる量のRNAPを用いて行なった
４回の並行実験に対してRNAP/プロモーター比、得られ
た密度計測値及びそれらから計算された値を第２表に示
した。
第２表に示した値を、図式的に第20図に示した。値ｍ
＝0.4は、直線の勾配として得られた。これらと式
（６）によって以下の式が得られる： Kass，AlOPSAl＝Kass，A1xm（Kass，A1＝1.5×108M-1xs
ec-1） Kass，AlOPSAl＝1.5×0.4×108M-1xsec-1） Kass，AlOPSAl＝0.6×108M-1xsec-1 以下の会合速度は、残りの発現制御配列に対して得ら
れた。
AlOPSCONAl:Kass＝1.7×108M-1xsec-1 AlpOPSAl:Kass＝0.6×108M-1xsec-1 OPAlOPSAl:Kass＝0.6×108M-1xsec-1 これらの値は、約15％の誤差を受けうる。
実施例４ 発現制御配列のイン・ビボ・プロモーター強度（誘発さ
れた）の測定 A.基本的事項 Deuschle等（前出文献）によって述べられた方法に従
って、発現制御配列のイン・ビボ・プロモーター強度
を、内部標準としてのβ−ラクタマーゼ遺伝子（PbLa）
に対するプロモーターと比較して測定した。この目的の
ために、対応する発現制御配列を有するpDS3誘導体類
を、プラスミドpDMI,1を含んだE.coli M15細胞中に形質
転換させた。特定の時間中、IPTG（インデューサー）の
存在下に合成し、放射活性的に標識化されたDNAを、次
にこれらの形質転換体の培養物から単離し、次いで以下
の過剰に存在する単鎖DNAプローブに対し、異なったバ
ッチ中に於てハイブリッド形成を行なった:1）M13mp9dh
fr−DNA、２）M13mp9bla−DNA及び３）対照区としてM13
mp9−DNA.RNase処理し、ハイブリッド形成しなかったRN
Aを分解させた後、バッチをニトロセルロース上で濾過
した。RNA/DNAハイブリッドがニトロセルロース上に残
存するため、フィルターに結合した放射活性は、使用し
たDNAプローブに対して相補的な個々のバッチ中に存在
するRNAの量についての測定値となる。対照区（単鎖M13
mp9−DNA）中に結合した放射活性を差し引いた後、単鎖
M13mp9bla−DNA（このDNAは、PbLaの制御下に合成し
た）によって結合した放射活性に対する、単鎖M13mp9dh
fr−DNA（対応するRNAは、測定されるべき発現制御配列
の制御下に合成した）によって結合した放射活性の比を
決定した。必要な修正後、この比は、PbLa単位中の測定
された発現制御配列のプロモーター強度を与える。
B.単鎖M13mp9、M13mp9dhfr及びM13mp9blaファージDNA類
の調製 ファージM13mp9dhfrの調製のために、公知の方法（Ma
niatisらの前出文献）に従って、dhfr遺伝子を含んでい
るプラスミドpDS1,t01+のBamHI−HindIII断片を、ファ
ージM13mp9（pharmaciaスエーデン;BamHI及びHindIIIで
開裂されたもの）のDNAに組込んだ。同様な方法によっ
てファージM13mp9blaを調製し、かくして、プラスミドp
DS1,t01+からのEcoRI−PstI断片を、bla遺伝子の部分を
用いてファージM13mp9（EcoRI及びPstIで開裂されたも
の）のDNAに組込んだ。その後、単鎖M13mp8−DNAの調製
のための実施例3B、３に述べたと同様の方法によって単
鎖M13mp9−DNA、M13mp9dhfr−DNA及びM13mp9bla−DNAを
調製した。
C.イン・ビボ・プロモーター強度（誘発された）の測定 Deuschleら（前出文献）によって述べられた方法に従
って、プロモーター強度の測定を以下の通り行なった。
1.イン・ビボ・標識化3H−RNAの調製 プラスミドpDMI,1を含むE.coli M15細胞及び種々の発
現制御配列の一つを有するpDS3誘導体（実施例２参照）
を、20％グリセリン中、−20℃で貯蔵した。100μg/ml
のアンピシリン及び25μg/mlのカナマイシンを含む10ml
のLB培地に、前記保存培地を接種し、振盪培養機（180r
pm）中、37℃で一夜生育させた。0.1mlのこの一夜培養
物を、５％のカゼイン水解物、0.1％のバクトトリプト
ン、0.05％の酵母抽出物、0.05％のNaCl、0.5％のグリ
セロール、1mMのIPTG、100μg/mlのアンピシリン及び25
μg/mlのカナマイシンを含み、予め37℃に温められた25
mlのM9最少栄養培地（J.H.Miller、前出文献）中に希釈
した。OD600＝0.6の光学密度になるまで、これらの細胞
を、振盪培養機中（250rpm）、37℃で生育させた。0.5m
Ciの5,6−3H−ウリジン（40−60mCi/ミリモル1mCi/ml水
溶液;Amersham、Braunschweig、FRG）を、10mlのこの培
養物に添加した。45秒後、液体窒素によって該培養物を
急速に０℃に冷却し、これらの細胞を遠心分離し、次い
でTES緩衝液（20mMのトリス−NCl、pH8.0、10mMのEDT
A、100mMのNaCl、１％のSDS）中に再懸濁させた。95℃
で３分間培養した後、Glisinらによって述べられた方法
〔Biochemistry13,2633−2637（1974）〕に従って、得
られた破壊細胞の混合物を遠心分離した（CsCl勾配遠心
分離、1500,000×ｇ、16時間、20℃）。上澄み液を除去
した後、加熱したメスで遠心分離試験管を底から0.8cm
上の所で切断した。該試験管の底部中のRNAを、0.2％の
SDSを含む２×80μｌのTE緩衝液で溶解し、次いで3Mの
酢酸ナトリウムの存在下、エタノールで沈澱させた。こ
の沈澱物を、80％のエタノールで洗浄し、真空乾燥し、
次いでハイブリッド形成緩衝液中に溶解させた（以下を
参照）。一般的に、10mlの培養物から１−３×105cpm/
μgRNAの比活性を有する200−300μｇのRNAが得られ
た。
2.過剰量の単鎖DNAに対するRNAのハイブリッド形成 全てのハイブリッド形成を、20μｌのハイブリッド形
成緩衝液（50％のホルムアミド、300mMのNaCl、20mMの
トリス−HCl、pH8.0、0.5mM EDTA）中、42℃で２時間行
なった。代表的な実験においては、10μｌのイン・ビボ
・3H−RNA（〜５×105cpm）を、10μｌの単鎖M13mp9−D
NA（0.2pモル、対照区）、M13mp9dhfr−DNA（0.2pモ
ル）及びM13mp9bla−DNA（0.2pモル）のそれぞれに混合
し、65℃で３分間培養し、次いで42℃で２時間保った。
3.ハイブリッド化したRNAの定量化 ハイブリッド形成バッチを、２×SSC緩衝液で10倍に
希釈し、ニトロセルロースフィルター（0.45μm BA85フ
ィルター、ミニホールド系、Scheicher及びSchiill、FR
G）を通して濾過した。単鎖M13mp9−DNAに使用したフィ
ルターの容量は、約6pモル／cm2であった。このフィル
ターを、2mlの２×SSC緩衝液で洗浄し、減圧下、80℃で
30分間焼き、次いで、50μg/mlのRNaseAを含む100mlの
２×SSC緩衝液中、42℃で１時間培養した。その後、該
フィルターを、42℃において、10分間で各々のケースに
つき、100mlの２×SSC緩衝液で３回洗浄した。該フィル
ターを乾燥後、これに保持された放射活性を、液体シン
チレーション（“万能液体シンチレーター”、NEN）中
で数えた。bla−特異的RNAに対するdhfr−特異的RNAの
比を、種々のRNA内のウリジンの数に注意しながら計算
した。dhfr及びblaに特異的単鎖DNA挿入物は、それぞれ
169及び148のウリジン（148/169＝0.87）をコードする
ため、PbLa単位中の所望の発現制御配列のイン・ビボ強
度Ｓは、式： Ｓ＝0.87×（cpmdhfr−cpmcontroL）／ （cpmbLa−cpmcontroL） によって得られる。
D.発現制御配列のイン・ビボ・プロモーター強度 種々の発現制御配列のそれぞれに対するイン・ビボ・
プロモーター強度の測定を、第Ｃ項に述べたと同様に少
なくとも３回行ない、かくして合成した放射活性標識化
RNAを、それぞれの場合において２回測定した。発現制
御配列AlOPSAlに対しては、例えば合成RNAの測定におけ
る以下の値が得られた。
これらとともに、イン・ビボ・プロモーター強度に対
して、以下の値が得られた。
S1＝0.87×（33581−38）／（839−38） ＝36.4PbLa単位 S2＝0.87×（36099−22）／（831−22） ＝38.8PbLa単位 37.6PbLa単位のイン・ビボ・プロモーター強度は、平
均値として計算された。
３回の測定の総和について平均をとると、発現制御配
列AlOPSAlに対して、38.1±3.4PbLa単位のプロモーター
強度が計算された。試験した全ての発現制御配列に対し
て先に述べた様に測定されたプロモーター強度は、第３
表に示されている。
実施例５ 個々の発現制御配列の抑制率の測定 A.基本的事項 個々の発現制御配列に対する抑制因子、即ち、誘発及
び抑制条件下に於けるイン・ビボ・プロモーター強度の
比は、以下の通り測定した。
ａ）100より小さい抑制率を有する発現制御配列 発現制御配列tacOP29、N25*/O、N25OP29、OPUAl及びO
PUAlCONは、イン・ビボにおいて、抑制条件下（過剰の
リプレッサー、インダクターなし）下、直接測定するに
充分な量のRNAを生じさせた。次にイン・ビボ・プロモ
ーター強度（誘発された）として実施例４において測定
した値を用いて、各抑制率を計算した。
ｂ）100より大きい抑制率を有する発現制御配列 発現制御配列lacOP29、N25OPSA25OP29、AlOPSAl、AlO
PSAlOP21、AlOPSAlOP29、AlOPSCONAl、AlpOPSAl及びOPA
lOPSAlに対するイン・ビボ・プロモーター強度を、抑制
条件下、間接的に測定した。この目的のために、個々の
因子に対しては、抑制条件下、適当な系において生じた
β−ガラクトシダーゼの量を、酵素的試験によって最初
に測定した。次いでかくして得られた値を、修正因子に
よってPbLa単位に変換した。次いで抑制率を、実施例４
において測定した値に基づいて計算した。
B.抑制条件下における発現制御配列のイン・ビボ・プロ
モーター強度（PbLa単位）の直接的測定 抑制条件下におけるイン・ビボ・プロモーター強度
を、IPTGの添加を行なわなかったことを除き、実施例４
に述べたと同様にして測定した。得られた値は、第４表
にまめとられている。
C.抑制条件下における発現制御配列のイン・ビボ・プロ
モーター強度の間接的測定 1.β−ガラクトシダーゼ単位の測定 文献（Maniatisらの前出文献）に記載された公知の方
法に従って、発現制御配列lacOP29、tacOP29、N25OP2
9、N25OPSN25OP29、AlOPSAl、AlOPSAlOP21、AlOPSAlOP2
9、AlOPSCONAl、AlpOPSAl、OPAlOPSAl、OPUAl及びOPUAl
CONを、有するpML3誘導体類を、先ずE.coli M15細胞に
形質転換させた。次いで対応するプラスミドを有する得
られた形質転換されたE.coli M15細胞を対数期まで生育
させ、J.H.Miller（“Experi−ments in molecular gen
etics"、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、1972）の
方法に従って、β−ガラクトシダーゼの量を測定した。
この測定の一つを、発現制御配列N25OP29に対する１つ
の例として以下に示す。
10mlの補足された最少栄養培地（J.H.Miller、前出文
献）に、プラスミドpML3/N25OP29を含む形質転換された
E.coli M15細胞の一夜培養物0.05mlを接種し、振盪培養
機（200rpm）中、37℃で培養した。0.55のOD600（600nm
の波長における光学密度）に到達した後、培養物を氷上
に20分間置いた。その後、光学密度を再び測定した。OD
600＝0.607の値が得られた。次いで0.1mlの培養物を、
Ｚ緩衝液（J.H.Miller、前出文献）で希釈し、1mlの最
終容量にした。この試料を、対照区（1mlのＺ緩衝液）
と共に以下の様に処理した。
60μｌのクロロホルム及び30μｌの0.1％SDS（細胞破
裂）の添加； 渦動による10分間の試料の混合； 28℃、５分間の試料の培養； 200μｌのONPG（J.H.Miller、前出文献）の添加； 渦動による試料の混合； 黄着色が見える迄、28℃に於ける試料の培養； 250μｌの2M Na2CO3の添加（ONPGとNa2CO3との添加の
間の時間は、15分）； 渦動による試料の混合； 細胞断片の遠心分離（Eppendorfベンチ遠心分離、130
00rpm、５分間）；及び 対照区に対する420nmにおける吸光の測定。
ΔE420＝0.737の値を得た。先に述べたJ.H.Millerの文
献に記載された式に従って、 β−ガラクトシダーゼ単位＝ 1000×ΔE420／OD600×Ｖ×ｔ 式中、ΔE420は、対照区に対する反応バッチのE420測
定値（0.737）であり、OD600は、使用した培養物試料の
細胞密度（0.607）であり、ｔは、反応時間（1.5分間）
であって、Ｖは、使用した培養物の容量（0.1ml）であ
る。
8094のβ−ガラクトシダーゼ単位が計算された。８回
の実験を平均して、8160±450のβ−ガラクトシダーゼ
単位を得た。
測定した全ての発現制御配列に対して得られた値を第
５表にまとめ、かくして、各発現制御配列に対して少な
くとも４回の測定を行った。
第５表 発現制御配列 β−ガラクトシダーゼ単位 lacOP29 30 ± 5 tacOP29 1510 ± 170 N25OP29 8160 ± 450 N25OPSN25OP29 99 ± 6 AlOPSAl 110 ± 2 AlOPSCONAl 220 ± 12 A1POPSAl 58 ± 3 OPAlOPSAl 56 ± 1 OPUAl 13700 ± 3000 OPUAlCON 8500 ± 2000 AlOPSAlOP29 23 ± 3AlOPSAlOP21 15 ± 3 2.PbLa単位へのβ−ガラクトシダーゼの変換に対する因
子の測定 発現制御配列tacOP29、N25OP29、OPUAl及びOPUAlCON
に対する、抑制条件下におけるイン・ビボプロモーター
強度を直接的（PbLa単位、第４表）ばかりでなく間接的
（β−ガラクトシダーゼ単位、第５表）にも測定するこ
とができた。得られた値を、それぞれに対応させて第21
図中にプロットした。回帰直線の勾配は、PbLa単位への
β−ガラクトシダーゼの変換に対する測定値である。50
00のβ−ガラクトシダーゼ単位／PbLa単位の値が測定さ
れた。
3.PbLa単位中におけるβ−ガラクトシダーゼの変換 変換ファクター5000のβ−ガラクトシダーゼ単位／P
bLaの単位によって、PbLa単位（第６表）を、測定した
β−ガラクトシダーゼ単位（第５表）から対応する発現
制御配列に対して計算した。
D.抑制率の計算 第３表、第４表及び第６表に掲載された値を使用し
て、個々の発現制御配列に対する抑制率（誘発されたP
bLa単位／抑制されたPbLa単位）を計算した（第７
表）。
E.個々の発現制御配列の特性のまとめ 個々の発現制御配列に対して得られた、イン・ビボ・
会合速度に対する値、イン・ビボ・プロモーター強度に
対する値及び抑制率に対する値を、以下の第８表にまと
めた。
【図面の簡単な説明】
第1a図は、プラスミドpDS1,t01+の図式的表示、第1b図
は、プラスミドpDS1,t01+のヌクレオチド配列、第2a図
は、プラスミドpDS3の図式的表示、第2b図は、プラスミ
ドpDS3のヌクレオチド配列、第3a図は、プラスミドpML3
/lacOP29の図式的表示、第3b図は、プラスミドpML3/lac
OP29のヌクレオチド配列、第4a図、プラスミドpDMI,1の
図式的表示、第4b図は、プラスミドpDMI,1のヌクレオチ
ド配列、第５図は、発現制御配列のヌクレオチド配列、
第６図は、プロモーターPN25のEcoRI断片のヌクレオチ
ド配列、第７図は、発現制御配列N25*/O及びN25OPSN25
を含むXhoI−EcoRI断片のヌクレオチド配列、第８図
は、プロモーターPA1を有するXhoI−EcoRI断片のヌクレ
オチド配列、第９図は、発現制御配列OPAlOPSAlを含むS
alI−EcoRI断片のヌクレオチド配列、第10図は、プラス
ミドpDS1/PN25，t01+の図式的表示、第11図は、プラス
ミドpDS3/AlOPSAlの構築の図式的表示、第12図は、プラ
スミドpSD3/OPAlOPSAlの構築の図式的表示、第13図は、
プラスミドpML3/AlOPAlの構築の図式的表示、第14図
は、プラスミドpML3/OPAlOPSAlの構築の図式的表示、第
15図は、RNAPとプロモーターPN25の複合体形成反応のグ
ラフ、第16図は、反応時間の関数としての−ln〔（A0−
Ｘ）／A0〕のグラフ、第17図は、RNAPとプロモーターP
N25の複合体形成反応のグラフ、第18図は、反応時間の
関数としての−ln〔（A0−Ｘ）／A0〕のグラフ、第19図
は、複合体形成速度の決定のための−ln〔（A0−Ｘ）／
A0〕と−ln〔（B0−Ｙ）／B0〕の関係をプロットしたグ
ラフ、第20図は、複合体形成速度の決定のための−ln
〔（A0−Ｘ）／A0〕と−ln〔（B0−Ｙ）／B0〕との関係
をプロットしたグラフ、及び第21図は、β−ガラクトシ
ダーゼ単位のPbLa単位への変換因子を決定するためのグ
ラフを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:42）

Claims (30)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】約１・106−1.5・108M-1・sec-1の低シグ
    ナル強度及び10−100PbLa単位の高イン・ビボ・プロモ
    ーター強度を有するプロモーター配列類と約１・108−
    １・1011M-1・sec-1の高会合速度を有し、1000より高い
    抑制率を生じるオペレーター／リプレッサー系との組合
    わせからなることを特徴とす発現制御配列。
  2. 【請求項２】低シグナル強度及び高イン・ビボ・プロモ
    ーター強度を有するプロモーター配列が、約６・107M-1
    ・sec-1のシグナル強度及び20PbLa単位以上のイン・ビ
    ボ・プロモーター強度を有することを特徴とする請求項
    １に記載の発現制御配列。
  3. 【請求項３】高会合速度を有するオペレーター／リプレ
    ッサー系が２・109M-1・sec-1の高会合速度を有するこ
    とを特徴とする請求項１又は２に記載の発現制御配列。
  4. 【請求項４】プロモーター配列とグラム陰性菌からのオ
    ペレーター／リプレッサーとの組合わせによって得られ
    る請求項１−３のいずれかに記載の発現制御配列。
  5. 【請求項５】Ｔ−コリファージからのプロモーター配列
    と1ac−オペレーター／リプレッサー系との組合わせに
    よって得られる請求項４に記載の発現制御配列。
  6. 【請求項６】T7A1プロモーターと1ac−オペレーター／
    リプレッサー系との組合わせによって得られる請求項５
    に記載の発現制御配列。
  7. 【請求項７】ヌクレオチド配列 の機能部分を有する請求項６に記載の発現制御配列。
  8. 【請求項８】ヌクレオチド配列 の機能部分を有する請求項６に記載の発現制御配列。
  9. 【請求項９】ヌクレオチド配列 の機能部分を有する請求項６に記載の発現制御配列。
  10. 【請求項１０】ヌクレオチド配列 の機能部分を有する請求項６に記載の発現制御配列。
  11. 【請求項１１】ヌクレオチド配列 の機能部分を有する請求項６に記載の発現制御配列。
  12. 【請求項１２】請求項１−11のいずれかに記載の発現制
    御配列を含む発現ベクター。
  13. 【請求項１３】グラム陰性菌及び／又はグラム陽性細菌
    中において複製しうる請求項12に記載の発現ベクター。
  14. 【請求項１４】E.coli中において複製しうる請求項13に
    記載の発現ベクター。
  15. 【請求項１５】B.subtilis中において複製しうる請求項
    13に記載の発現ベクター。
  16. 【請求項１６】Salmonella typhimurium中において複製
    しうる請求項13に記載の発現ベクター。
  17. 【請求項１７】請求項12−16に記載の発現ベクターを含
    む細菌。
  18. 【請求項１８】E.coli細胞である請求項17に記載の細
    菌。
  19. 【請求項１９】E.coli M15細胞である請求項18に記載の
    細菌。
  20. 【請求項２０】B.subtilis細胞である請求項17に記載の
    細菌。
  21. 【請求項２１】Salmonella typhimurium細胞である請求
    項17に記載の細菌。
  22. 【請求項２２】染色体中に請求項１−11のいずれかに記
    載の発現制御配列を含む細菌。
  23. 【請求項２３】E.coli細胞である請求項22に記載の細
    菌。
  24. 【請求項２４】B.subtilis細胞である請求項22に記載の
    細菌。
  25. 【請求項２５】Salmonella typhimurium細胞である請求
    項22に記載の細菌。
  26. 【請求項２６】原核性蛋白質又は真核性蛋白質をコード
    するDNA配列が請求項１−11のいずれかに記載の発現制
    御配列に有効に結合されている発現ベクターにより、細
    菌を形質転換させ、次いで適当な条件下に培養し、該蛋
    白質を単離し、所望により精製することを特徴とする原
    核性蛋白質又は真核性蛋白質の製造方法。
  27. 【請求項２７】細菌がE.coli、Salmonella typhimurium
    又はB.subtilis細胞である請求項26に記載の製造方法。
  28. 【請求項２８】原核性蛋白質又は真核性蛋白質をコード
    し、請求項１−11のいずれかに記載された発現制御配列
    に有効に結合しているDNA配列を細菌の染色体に導入
    し、次いでこの細菌を適当な条件下に培養し、該蛋白質
    を単離し、所望により精製することを特徴とする原核性
    蛋白質又は真核性蛋白質の製造方法。
  29. 【請求項２９】細菌がE.coli、Salmonella typhimurium
    又はB.subtilis細胞である請求項28に記載の製造方法。
  30. 【請求項３０】請求項１−13のいずれかに記載の発現制
    御配列を使用することを特徴とする原核性蛋白質又は真
    核性蛋白質の発現法。
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