DD237675A1 - Verfahren zur herstellung eines expressionsvektors - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, das zur Herstellung eines neuartigen Expressionsvektors auf der Grundlage eines Hybridpromotors geeignet ist. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Prinziploesung zur effektiven Expression eukaryontischer Gene und damit zur volkswirtschaftlich rentablen Biosynthese tierischer Proteine in Mikroorganismen, speziell in E.coli, zu schaffen. Erfindungsgemaess wird die codierende DNS-Sequenz eines Polypeptids, insbesondere Praeproinsulin des Menschen, Humaninterferon, BLV-Proteine, Influenzavirus-Proteine oder Teilsequenzen dieser Proteine mit einer Einheit, die die fuer die Kontrolle der Expression notwendigen Nucleotidsequenzabschnitte enthaelt, so verbunden, dass zur Kontrolle der Expression eine kombinierte Einheit verwendet wird, die Nucleotidsequenzabschnitte mindestens zweier verschiedener natuerlicher, prokaryotischer Kontrolleinheiten enthaelt. Es wird eine kombinierte Einheit verwendet, die hinsichtlich Basenfolge und Abstand zwischen den fuer Transkription und Translation essentiellen Hauptbestandteilen, insbesondere "-35-, -10-Region", Transkriptionsstartpunkt, Bindungsort der 16 S-RNS und Translationsstartpunkt, durch in-vitro-Mutagenese variiert ist.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, das zur Herstellung eines neuartigen Expressionsvektors auf der Grundlage eines Hybridpromotors geeignet ist.

Der durch dieses Verfahren konstruierte Expressionsvektor ist zur Expression unterschiedlicher Gene, eukaryontischer wie prokaryontischer, multivalent einsetzbar und schafft entscheidende Voraussetzungen, um die mikrobielle Massenbiosynthese ausgewählter, vorzugsweise tierischer Proteine in E.coli wirtschaftlich effektiv zu gestalten.

Das Verfahren ist in der mikrobiologisch-biotechnologischen Industrie anwendbar.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Einleitend werden die folgenden, in der Erfindungsbeschreibung verwendeten Begriffe erläutert:

Kontrolleinheit (der Expression): enhält mehrere Elemente (Kontrollelemente) zur Kontrolle von Transkription und Translation Kontrollelemente: sind der Promotor, bestehend aus einer "-35- und -10-Region", der Transkriptionsstartpunkt und der Ribosomenbindungsort, bestehend aus SHINE-DALGARNO-Sequenz und Translationsstartpunkt.

Hybrid-Promotor: enthält eine "-35-Region" aus einer natürlichen Kontrolleinheit und eine "-10-Region" aus einer anderen natürlichen Kontrolleinheit. Der Hybrid-Promotor repräsentiert damit eine kombinierte Kontrolleinheit.

Transkriptionsstartpunkt: entspricht der Position einer DNS, an der die mRNS-Synthese beginnt; zwischen der "-10-Region" und der SD-Sequenz liegend.

Translationsstartpunkt: entspricht der Position einer DNS bzw. einer rmRNS, an der die Proteinbipsynthese beginnt (N-Terminus), gekennzeichnet durch das Triplett ATG bzw. AUG

bla: Gensymbol für/3-Lactamase ivm: in vitro mutagenisiert bzw. in vitro hergestellt

Aufgrund der molekularbiojogischen Unterschiede in der Regulation der Genexpression von Eu- und Prokaryonten ABELSON, J.: Ann.Rev. Biochem.48,1035-1069 (1979) erscheint es zweckmäßig, prokaryontische Kontrollelemente (z.B. Promotor, Ribosomenbindungsort) für die effektive Transkription und Translation eukaryontischerfunktioneller Gene (ds-cDNS, chemischsynthetisierte DNS, genomische DNS ohne Intronstrukturen in Prokaryonten) zu verwenden und durch gentechnische Maßnahmen Kontrollelemente und Gene in geeigneter Form zusammenzuschalten. Auf diese Weise geschaffene Expressionsvektoren sind eine entscheidende Voraussetzung für effektive Massensynthesen ausgewählter, insbesondere tierischer Proteine in Mikroorganismen.

Alle bisher bekannten Prinziplösungen beruhen auf der Ausnutzung einer bestimmten prokaryontischen Kontrolleinheit (bestehend aus den Kontrollelementen) und ihres Zusammenschlusses mit der betreffenden eukaryontischen Proteinkodierenden Sequenz (Strukturgen), wobei entweder fusionierte Strukturgene (ein Teil prokaryontisch, ein Teil eukaryontisch) oder Hybrid-Ribosomenbindungsorte (bestehend aus einem 16S-RNS-Bindungsort bzw. einer prokaryontischen SHINE-DALGARNO-Sequenz (SHINE, J., und L. DALGARNO: Nature, Lond. 254,34-38 [1975]) und einem Translationsstartpunkt ([Codon ATG bzw. AUG], das vom zu kontrollierenden bzw. zu exprimierenden eukaryontischen Strukturgen stammt) gebildet werden. Dabei entsteht im ersten Fall ein fusioniertes Protein, im zweiten Fall das gewünschte Protein ohne zusätzliche prokaryontische Anteile. Das Prinzip der fusionierten Proteine ist bei ITAKURA et al. (Science 198,1056-1063 [1977] und VILLA-KOMAROFF et al. (Proc. Nat. Acad.Sei. USA 75,3727-3731 [1978]), das Prinzip des Hybrid-Ribosomenbindungsortes bei GOEDDEL et.al. (Nature, Lond.281,544-548 [1979]) dargelegt.

Damit beschränken sich alle bis heute bekannten Verfahren auf die Nutzung von Transkriptions-Translations-Kontrolleinheiten, die sich evolutionär entwickelten und die in bioregulatorisch optimierten Organismen vorkommen. Diese Kontrolleinheiten sind zwar optimal innerhalb natürlicher Bedingungen, aber sicherlich nicht optimal in ihrer Struktur (Nukleotidsequenz) hinsichtlich der maximalen Expression eines beliebigen Strukturgens, das willkürlich dieser Kontrolleinheit nachgeschaltet wird. Letzteres ist zu erwarten, weil die beabsichtigte Überproduktion einem unphysiologischen Zustand gleichkommt. Damit sind natürliche Kontrolleinheiten per se nur bedingt für eine technische Nutzung geeignet.

Versuche, die Expressionskontrolleinheiten im Promotor- bis SHINE-DALGARNO-Bereich durch Zusammensetzung verschiedener Teilbereiche einer Expressions-Kontrolleinheit (z.B. "-35-Region", "-10-Region", Transkriptionsinitiations-Startpunkt, Ribosomenbindungsort), die aus unterschiedlichen Kontrolleinheiten stammen, sowie durch Abänderung de Nukleotidsequenzen und der Abstände innerhalb und zwischen diesen Teilbereichen mittels in-vitro-Mutagenese zu optimieren, wurden bisher nicht durchgeführt.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, einen neuartigen Expressionsvektor auf der Grundlage eines Hybridpromotors zu schaffen, der eine biotechnologische Nutzung hinsichtlich der Realisierung eines hohen Expressionsniveaus eukaryontischer (tierischer) Gene und damit eine effektive mikrobielle Synthese eukaryontischer Proteine ermöglicht.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Prinziplösung zur effektiven Expression eukaryontischer Gene und damit zur volkswirtschaftlich rentablen Biosynthese tierischer Proteine in Mikroorganismen, speziell in E.coli, zu schaffen: Die Herstellung des Expressionsvektors bzw. des Hybrid-Promotors geht von zu kombinierenden Sequenzbereichen aus mindestens zwei unterschiedlichen, natürlichen prokaryontischen Kontrolleinheiten aus (Abb. 1). Vorzugsweise sind das die Kontrolleinheit für die frühen Gene des PhageriT7 und die für das TEM i-ß-Lactamase-Gen (bla-Gen). Letzteres wird durch dasVektorplasmid pBR322 bereits codiert.

Die Kombination der verschiedenen Kontrollbereiche wird mittels gentechnischer Verfahren, einschließlich in-vitro-Mutagenese, durch Basenaustausche und Abstandsänderungen zwischen und innerhalb der verschiedenen Teilkontrollbereiche ("-35-und-10-Region", Transkriptionsstartpunkt, Bindungsort der 16 S-RNS und Translationsstartpunkt) variiert und hinsichtlich der maximalen Expression des nachgeschalteten Gens optimiert. Der Translationsstartpunkt (ATG bzw. Initiationscodon) wird durch ein natürliches prokaryontisches Strukturgen, bevorzugt durch das bla-Gen, gebildet, wobei das jeweils nachgeschaltete Gen in einen übereinstimmenden Leserahmen mit dem Translationsstartpunkt gebracht wird. Als Modellprotein dient die jS-Lactamase selbst. Der entsprechende kodierende Abschnitt des bla-Gens ist durch Gene anderer Proteine ersetzbar. Die neu zu konstruierende Expressionskontrolleinheit befindet sich auf einem Plasmid wie pBR322 oder auf einem Phagen-DNS-Vektor, wie z. B. Lambda-DNS.

Der „-35-Bereich" der Expressionskontrolleinheit des bla-Genswird durch einen funktionell ähnlichen Bereich aus der Kontrolleinheit der frühen Region des PhagenT7 ausgetauscht. Bezogen auf den Protein-codierenden Abschnitt, wird 5'-terminal die „35-Region" desT7A3-Promotors unmittelbar der „-10-Region" der/3-Lactamase-Kontrolleinheit vorgeschaltet, wobei diese beiden Regionen den Hybrid-Promotor gemeinsam bilden. Der entscheidende Teil der „35-Region" des Hybridpromotors besteht damit aus der Sequenz „5'GTTGACAA". Diese ist identisch mit der „35-Region" desT7A3-Promotors, aber auch mit der des trp-Promotors. Sie könnte auch chemisch synthetisiert oder durch in-vitro-Mutagenese anderer natürlicher Promotoren hergestellt werden.

Zur Kopplung der Teilbereiche des Hybridpromotors wird der Rsal-Spaltort unmittelbar vor der „-10-Region" des T7A3-Promotors benutzt. Dabei wird ein Abstand von 16-19Bp, bevorzugt 17Bp, zwischen der „-35- und -10-Region" innerhalb des Hybridpromotors eingehalten. Aufgrund verschiedener theoretischer Möglichkeiten (Abb. 2 und 3) wird die Hybridpromotorregion erfindungsgemäß mittels in-vitro-Mutagenese so optimiert, daß eine Steigerung der Promotorstärke der kombinierten Kontrolleinheit erreicht wird.

Die „-10-Region" des Hybrid-Promotors besteht zunächst aus der „-10-Region" des Promotors des bla-Gens mit der Sequenz „TTCAATAATATT", die sich 26 bzw. 14Bp vor dem Translationsstartpunkt der /3-Lactamase befindet. In Abb.2 sind die relativ ungewöhnlichen Sequenzen der Kontrollregion des bla-Gens auf der Grundlage der Nukleotidsequenz der Plasmids pBR322 analysiert. Die Bevorzugung der Variante „GAGACA-17 Bp-TTCAAT" beruht auf der Anwesenheit eines T-Nukleotids an der ersten Stelleder „10-Region", auf dem Abstand von 17Bp zwischen der vermutlichen „35- und -10-Region" sowie auf dem in Frage kommenden Transkriptionsstartpunkt (Abb. 2 und 3). Davon ausgehend wird die natürliche Sequenz der „-10-Region" des Hybridpromotors erfindungsgemäß so abgeändert, daß sie mindestens die Basenfolge „TNNNNT", vorzugsweise „TNNAAT" bzw. „TATAAT", enthält, wobei N einesder4Nukleotide bedeutet. Auch die Sequenz zwischen der „-10-Region" und dem Translationsstartpunkt wird mittels in-vitro-Mutagenese weiter verändert und hinsichtlich der Erhöhung des Expressionsniveaus des nachfolgenden Protein-codierenden Gens optimiert. Dabei werden die Nukleotidsequenz und der Abstand zwischen der „-10-Region" und der SHINE-DALGARNO-Sequenz (SD-Sequenz) verändert, vorzugsweise verlängert. Das gilt auch für den Abstand und die Basenfolge zwischen der SD-Sequenz des bla-Gens („AAGGA") und dem ATG-Codon, wobei der natürliche Abstand von 5 Bp auf vorzugsweise 7-11 Bp verlängert und der Homologiebereich der SD-Sequenz mit der 16S-RNS erweitert wird.

Die Abstandsänderungen können auch durch Verwendung synthetischer oder eukaryontischer DNS erreicht werden. Der Translationsstartpunkt (ATG bzw. Initiationscodon) stammt entweder aus dem zum N-terminalen Ende der natürlichen Signalsequenz der /3-Lactamase korrespondierenden (diese Variante wird bevorzugt) oder aus einem anderen geeigneten ATG-Codon der Codierung eines Proteins (Fremdproteins) viralen, humanen, pro-oder eukaryontischen Ursprungs. Dabei ist es notwendig, chemisch synthetisierte Verbindungsstücke zu verwenden, um den geeigneten Anschluß an die SD-Sequenz auf der einen Seite und im richtigen Leserahmen an die kodierende Sequenz des zu exprimierenden Proteins auf der anderen Seite herzustellen. Damit ist die Konstruktion geeignet, die unmittelbare Synthese von Fremdproteinen in E.coli anzuregen. Um den Transport des' Fremdproteins in den periplasmatischen Raum von E. coli zu erreichen, wird die natürliche Signalsequenz („Präsequenz") der/3-Lactamase (entspricht der 1. bis 23. N-terminalen Aminosäure) ausgenutzt und ein Signalvektor geschaffen. Hierzu wird erfindungsgemäß die kodierende DNS-Sequenz des bla-Gens vom 3'-Ende (korrespondierend zum C-Terminus der /3-Lactamase) in Richtung 5'-Bereich exakt durch enzymatischen Abbau verkürzt, so daß nur noch die Kodierung für die 1. bis 23. Aminosäure erhalten bleibt.

Der Übergang im Bereich der Kodierung für die 24. Aminosäure der /3-Lactamase in die jeweilige eukaryontische Sequenz wird durch spezifische Übergangssequenzen (chemisch-synthetisierte Oligonukleotide bzw. Verbindungssequenzen) bewerkstelligt. Der Übergang vermittelt den Anschluß der vorgeschalteten /3-Lactamase-Präsequenz auf der einen Seite und der nachgeschalteten kodierenden Sequenz des zu exprimierenden Proteins auf der anderen Seite im richtigen Leserahmen. Der auf dieser Grundlage entstehende Expressionsvektor ist geeignet, das natürliche Expressionsniveau der /3-Lactamase um mindestens eine Größenordnung zu steigern. Der Vektor ist zur Expression unterschiedlicher Gene einsetzbar und schafft damit Voraussetzungen, die mikrobielle Massenbiosynthese ausgewählter, vorzugsweise tierischer Proteine in E. coli wirtschaftlich effektiv zu gestalten. Natürlich stehen volkswirtschaftlich bedeutsame Proteine, z. B. Peptidhormone, antiviral wirksame Proteine, immunologisch wirksame Proteine, aber auch Enzyme und andere Protein-Wirkstoffe dabei im Mittelpunkt. Insbesondere handelt es sich um Präproinsulin des Menschen, Humaninterferon, BLV-Proteine, Influenzavirus-Proteine oder Teilsequenzen der genannten Proteine.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird durch nachstehende Ausführungsbeispiele erläutert, wobei die Konstruktion der multivalent einsetzbaren Kontrolleinheit in mehreren Etappen erfolgt (Abb.4).

1. Konstruktion der Hybrid-Kontrolleinheit

1.1. Konstruktion eines zusätzlichen EcoRI-Erkennungsortes in der bla-Präsequenz von pBR322 Die Einführung eines zweiten EcoRI-Ortes (ivmEcoRI) wird durchgeführt, um einerseits die nachfolgenden Konstruktionen zu erleichtern und andererseits die Multivalenz des Einsatzes des Vektors zu erhöhen. Außerdem ist dieser Ort für Konstruktionen von Bedeutung, die unmittelbar Fremdprotein ohne prokaryontischen Anteil codieren sollen. In Abb. 5 sind die Einzelschritte dargelegt. Die natürliche Codierung der Signalsequenz von /3-Lactamase enthält im Bereich der 2. bis 4. N-terminalen Aminosäure die Nukleotidsequenz „AGTATTCAA". Durch Transversion von T in A entsteht ein EcoRI-Ort. Dabei wird die

2. Aminosäure Serin in Arginin umgewandelt. Dieser Austausch sollte unerheblich sein, da im Signalabschnitt des Prä-Hüllproteins des Phagenfd an der vergleichbaren 2. Aminosäureposition ein Lysinrest vorkommt.

Als methodische Grundlage dient die Synthese eines spezifischen Oligonukleotids, 3'CTCTTAAGTT, das zur in-vitro-Mutagenese eingesetzt wird.

Die Mutagenese wird nach Spaltung des Plasmids pBR322 mit EcoRI-Endonukleasein Gegenwart von Äthidiumbromid (Einstrangbruch) und Exonukleaselll-Behandlung durch Hybridisation mit dem Oligonukleotid und anschließender

oivmoi-iiceai (κι FNOW-Fraament) sowie Liaase durchgeführt. Nach Klonierung wird das gesuchte

Als weiterführende Variante (s.Abb.5) wird der natürliche EcoRI-Ort von pBR322 durch EcoRI-Spaltung und S1-Nukleasebehandlung entfernt und der Hindlll-Ort für die weiteren Konstruktionen anstelle des natürlichen EcoRI-Ortes verwendet.

Die Einführung des ivmEcoRI-Ortes ist nicht unbedingt notwendig und kann zu verschiedenen Etappen vorgenommen werden.

Die folgenden Konstruktionspläne sind deshalb zunächst für pBR322 angegeben. Diese Pläne sind problemlos durcheinfache Modifikation, z. B. Verwendung von Hindill-Spaltungen anstelle der EcoRI-Spaltungen, auf pBR322ivmEcoRI übertragbar.

1.2. Klonierung des T7A3-Promotors in pBR322 Vorbereitung des Vektors pBR322

Nach Doppelspaltung mit EcoRI- und Pstl-Endonuklease wird das kleine Fragment isoliert und anschließend mit AIuI- und Hpall-Endonuklease weiterbehandelt sowie das entstehende Fragmentgemisch mit T4-Ligase erneut gekoppelt. Unter anderen entsteht ein linearer Vektor, der ein AIuI- und ein Hpall-Ende aufweist. Wichtig für die spätere Identifizierung ist dabei, daß der einmalige Pvul- und ein Rsal-Ort entfernt wird (Abb. 6a).

Vorbereitung der T7-DNS und Klonierung

T7-DNS, 40000Bp, enthält in einer Entfernung von etwa 8000Bp, bezogen auf den Terminus, der der frühen Region benachbart ist, einen Dpnll-Ort, in einer Entfernung von etwa 2000Bp einen Hpal-Ort und in einervon 1450Bp einen Haelll-Ort (Abb.7). Unter Benutzung dieser Endonukleasen ist es möglich, schließlich ein 1450 Bp-Fragment, das den frühen Promotor A3 enthält, zu reinigen. Wichtig ist, daß in diesem Bereich kein Pstl-Ort existiert.

Durch Spaltung des Fragments mit Hpall- und Alul-Endonuklease entsteht ein 185Bp-Spaltstück, das anschließend in den vorbereiteten linearen Vektor kloniert werden kann (Abb. 6 b, 6c). Dieses klonierte Fragment enthält im „-10-Bereich" des T7A3-Promotors einen Rsal-Ort, der zur Charakterisierung des gesuchten Klons unmittelbar beiträgt: Abwesenheit eines Pvul-Ortes von pBR322 bei gleichzeitigem, relativ konstanten Rsal-Spaltmuster, d. h. 3 Rsal-Spaltstücke.

Herstellung einer Hhal-Deletion im pBR322 T7A3

Um die Reste der ß-Lactamase-Nukleotidsequenz, insbesondere den gesamten Kontrollbereich des /3-Lactamase-Gens zu entfernen, wird der beschriebene pBR322T7A3-Vektor mit Hindlll- und Pstl-Endonuklease gespalten, das kleine Fragment isoliert und mit Hhal-Endonuklease weiterbehandelt und erneut mit T4-Ligase gekoppelt (Abb. 8). Die Produkte werden mit dem großen Pstl-Hindlll-Fragment verbunden und in E. coli transferiert

Gesucht wird der pBR322 T7A3 (154Bp)-Vektor, der nur noch 154Bp der T7-DNS enthält.

1.3. Konstruktion des Hybrid-Promotors „T7A3pbla"

Die Konstruktion wird durch die Existenz eines Rsal-Spaltortes im Bereich des Übergangs zur „-10-Region" des T7A3-Promotors erleichtert. Um so schwieriger ist die Konstruktion auf der Seite des bla-Promotors. Praktisch sind nurterminale Kürzungsverfahren aussichtsreich. Für diese Art Verfahren ist es aber wichtig, daß der Ort des Beginns des enzymatischen Abbaus nicht zu weit entfernt vom angestrebten Punkt in der Sequenz liegt. Aus diesen Gründen ergeben sich mehrere Konstruktionsteile. Im Teil I (Abb. 9) wird ein neuer einmaliger Bcll-Ort in die Sequenz zwischen der vermutlichen „-35-und -10-Region" des bla-Promotors des pBR322-Plasmids eingeführt.

Die in-vitro-Mutagenese wird ortsgerichtet mit einem synthetischen Oligonukleotid durchgeführt, das den gewünschten Basenaustausch vermittelt.

Im Teil Il (Abb. 10) muß die Sequenz in der natürlichen „-10-Region" des bla-Promotors geändert werden: Dies geschieht in erster Linie, um nachfolgend eine exakte Verkürzung so durchführen zu können, daß der Hybrid-Promotor später einen Abstand von 17 Bp zwischen der „-35- und-10-Region" enthält. Andererseits handelt es sich auch mit hoher Wahrscheinlichkeit um eine „promotor up"-Mutation, da die ersten beiden Nukleotide der PRIBNOW-Box aus TA (Consensus) statt aus TT (bla-Promotor) bestehen wurden. Gleichzeitig wird mit dieser Mutation die spätere Rekonstruktion des Rsal-Ortes am Übergang der T7- in die pBR322-DNS ermöglicht.

Vom Standpunkt der weiteren Optimierung des Promotors ist eine zweite Mutation (3. Position der PRIBNOW-Box) ebenfalls interessant. Diese Mutation könnte durch das ohnehin zu synthetisierende Oligonukleotid eingeführt oder nachträglich durch in-vitro-Mutagenese mit Hydroxy-dCTP erzielt werden.

Im Teil III (Abb.11) ist eine Konstruktion beschrieben, die mit statistischer Sicherheit u.a. auch zur gewünschten Verkürzung bis zur 2. Nukleotidposition im „-10-Bereich" des bla-Promotors führt. Durch das angegebene Verfahren entsteht eine Vielzahl von Molekülen heterogener Länge. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Heterogenität der entstehenden Moleküle durch anschließende Restriktionsspaltung am vom Promotor entgegengesetzt liegenden DNS-Terminus einzuschränken. Teil III kann durch Teil V ersetzt werden.

Im Teil IV (Abb. 12) erfolgt die Konstruktion des Vektors, der die „-35-Region" desT7A3-Promotors unmittelbar beisteuert. Diese ist auf einfache Weise durch Restriktionsspaltung, Fragmentreinigung und Kopplung durchführbar.

Im Teil V (Abb. 13) wird der alternative Weg zum Teil III, ein exaktes terminales „Kürzen" beschrieben. Für diesen Teil ist die Bcll-Mutation (Teil I) besonders wichtig.

Neben den Details des Kürzungsverfahrens ist im Teil V auch die endgültige Konstruktion des Hybrid-Promotors angegeben. Ein entscheidendes Hilfsmittel ist hierbei das biologische Selektionssystem, da nur die gewünschten Strukturen in der Lage sind, Ampicillinresistenz zu verursachen. Außerdem besteht die Wahrscheinlichkeit, erhöhtes Expressionsniveau unmittelbar durch steigende-Ampicillinresistenz nachzuweisen.

Weitere der Optimierung des Hybrid-Promotors wie der Kontrolleinheit dienende Änderungen in der Sequenz und in den Abständen sind nach der Konstruktion dieser Hybrid-Einheit vorzunehmen. Diese Maßnahmen sind dann aber mit weniger Aufwand und Risiko behaftet.

Im Teil Vl (Abb. 14) wird eine Variante zu Teil V beschrieben, die notwendig ist, falls ein Bcll-Ort (s.Teil I) nicht zur Verfügung steht.

Diese Variante ist allerdings aufwendiger.

Die Gesamtkonstruktion ergibt den Expressionsvektor pEVT7A3blaHP.

-O- £.01 Ό ΙΌ

2. Konstruktion des bla-Signalsequenz-Vektors

2.1. Variante „Übergangssequenz"

Das Kernstück dieser Konstruktion besteht in einer Verkürzung der ß-Lactamase-codierenden Sequenz vom C-Terminus zur Präsequenz hin. Ausgegangen wird von pBR322, pBR322ivmEcoRI oder pEVT7A3blaHP. Hier ist nur die Variante pBR322 bzw. pBR322ivmEcoRI näher erläutert (Abb. 15).

Nach Rsäl-Spaltung wird das kleinste Fragment isoliert und mit Mbol-Endonuklease weiterbehandelt. Das entstehende größte Spaltstück (480 Bp) wird isoliert und in mehreren Zyklen mit T4-DNS-Polymerase und verschiedenen Nukleotiden inkubiert. Auf diese Weise ist es möglich, eine präzise Verkürzung bis zum Triplett Ala23GCT vorzunehmen. Ala23 ist die letzte Aminosäure der Präsequenz von /3-Lactamase. Mit S1-Nuklease wird der freigelegte komplementäre Strang ebenfalls entfernt. Die Veränderungen am gegenüberliegenden Ende des Spaltstücks führen zur Verkürzung vom Nukleotid +165 zum Nukleotid + 147.

Durch Spaltung mit Hindlll-Endonuklease am Ort +31 wird dieser nicht interessante, veränderte Terminus entfernt, wobei gleichzeitig ein kohäsives Ende entsteht. Der Übergang im Bereich der Kodierung für die 24. Aminosäure der/3-Lactamase in die jeweilige eukaryontische Sequenz wird durch spezifische Übergangssequenzen (chemisch-synthetisierte Oligonukleotide bzw. Verbindungssequenzen) bewerkstelligt. Der Übergang vermittelt den Anschluß der vorgeschalteten 0-Lactamase-Präsequenz auf der einen Seite und der nachgeschalteten kodierenden Sequenz des zu exprimierenden Proteins auf der anderen Seite im richtigen Leserahmen.

2.2. Variante „Smal-Vektor"

Um die Multivalenz des Vektors weiter zu erhöhen, wird vorteilhafterweise ein Smal-Ort, der wiederum für pBR322 einmalig ist, durch Basensubstitution in unmittelbarer Nähe zum C-Terminus der /3-Lactamase-Signalsequenz erzeugt. In Abb. 16 sind die Details dargelegt. Kernstück dieses Konstruktionsteils ist eine in-vitro-Mutagenese an partiell einsträngigem Plasmid im Bereich des bla-Gens durch Inkubation mit DNS-Polymerase, dNTP und Hydroxy-dCTP. Das in-vitro-mutagenisierte Material wird in E.coli transferiert, die Plasmid-DNS mehrerer Klone gemeinsam gereinigt, mit Smal-Endonuklease gespalten, linearisiertes Material vom unveränderten Plasmid (ccc-Form) getrennt, danach erneut gekoppelt und transferiert. Auf diese Weise entsteht ein zweiter bla-Signalsequenzvektor; pBR322ivmSmal (Ap⁺Tc⁺) bla⁺.

Funktion:

Herkunft;

Struktur:

Kopplungsatellen: CÜbergänge)

in-vitro-Mutaganeae:

weitere in-vitro-KUitagenage;

RHA-Polymersse-Bindung und Initiation der REA-Synthasθ

17A3-Promotor

Promotor

Ribo somenbindung und Initiation d Pro t ein sy nt ho se

Ribo soinenbin dung ε ort Transport

Signalsequenz

des ß-Lactamaae-Gene von pBR322 Premdprat ein-Codierung

eukaryontlsch, prokaryontisch oder eynthet.

d-Ρτο t el η

f-35-Region¹¹

γ britf,- Promo to

|-ητη

iRsal 107

ivm Bell

I.

Promotormutation

Sequenz und

Abstand

C-35/-1O)

Sequenz und

Abstand C-1O/SD)

Sequenz und

Abstand CSD/ATG)

"EcoRI" in-

* vivo-

Spal-

tung

ivm

EooRI

Deletion der

Signalsequenz

f-S» <ϋΛ *Ώ

Promo tor oligoCdü)

Ribosomenbindungsort Er emdpro t ein-Strukturgon

co rt-

CD ft)

Abb. 2 : Analyse der möglichen Promotorregion. dea bla-Geiis (TEMI-ß-Lactamaae)

1) pBR322. . .Scofll ...,, "I Ps ti.... -200. -210.

5 ' ATGCGCTCATGAGACAATAAGGGTGATAAATGGTTGAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATG "-35" "-10" SD fMet

2)	a)	AT GA GAGAATAAC C	16 - 19Bp	TTCAATAATÄTT	TTCAAT Mbla" C3)b),)
	b)	t	19		TTAACT trp
	ο)		17		TACGAT T7A3
3)	d)	ATGAGA	20	TTCAAT	TATAAT lacUV5
	e)	GAGACA	14	TTCAAT b evorzuÄt e Varian-
	f)	GAGACA	16	AATAAT
	ATAACC	17	AATAAT
	ATAAGG	17	TAATAT
	ATAAGC	AATATT
4)	Consensus TTGACA	TATAAT
5)	Vergleich mit anderen	Kontrοllre«ionen
		17
		17
		17
		18
	GAGACA
	TTGAGA
	TTGACA
	TTTACA

1) Nukleotidsequenzi im Bereich des -150. bia -211. Nukleotids von pBR322 , bezogen auf den EcoRI-Ort und den codierend (+) DHA'-Strang;

SD = SHISE-DALGARIiO-Sequenz, fMet = N-Terminus der Prä-ß-Lactamase

2) Kennzeichnung der möglichen "-35- und -10-Eegißn"

3) Varianten und Abstände

4) ConsensiLssequenz: übereinstimmende Hukleotide sind in 3) und 5) unterstrichen

5) Vergleich der vorgeschlagenen Variante 3)b) mit ausgewählten Kontrollregionen anderer Gene aus E.coli oder E.coli-Phagen

Lbb. 3 : Analyse des möglichen Initiationsortes de: Transkription des bla-Gena

1) Consensus

"-10-Region" 4 - 8 Bp Pu

(CAT)

; -200. -210.

5' TTGAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATG "-10-" !„„. SD fMat

3) Varianten a) 6 b). 7

4) Vergl aich

ι*"

mfiSA-Synthese

"-1O" 6 TT^AA 6/7CTGTT

5 TGGAA - 3

¹I

7 TTGLAAA

6 XGGAAT 6 TGGAAA

(Variante 3)a)) fdll, Lambda-PO lacUV5

(Variante 3)b))

lacUV5

0Ι174-Δ

trp

1) Variationen ("Consensus") beim Vergleich verschiedener Initiation3Orte der oR3A-Synthe3e , Pu = Purin-aukleotid, "CAT" häufig gefunden

2) Nukleotidsequenz ia Bereich de3 -183. bi3 -211. ^'uideotida von DER322 , bezogen auf den EcoIüL-Ort und den codierenden C+) Strang der DIiA;

SD = SHINS-DAlGAHIiO-Sequenz, fMat = 3-Terainua der Pr~i-£-Lactaxaae, I₅₃^ = Initiatlanaort dar Transkription

3) 2 vorgeschlagene Varianten und Abstände zur vermutlichen "-10-Region" (s. Abb. 2 )

4) Vergleich der hier vorgeschlagenen Varianten ziit ausgewählten, bekannten Initiationaorten, die ait G oder A identisch oind; i^i Fall-von laclIV5 existieren 2 Orte: sowohl G al3 auch A, die beide als Initiationeort airkaaa sind

3 7 67

Abb. 4: Übersicht zu den Stappan der Konstruktionexprimierender Vektoren

Klonierung "Huffian— Proinaulla" Konstruktion d®a oultivalent einaetsbaran Sxprasaionsvektora (Eybrid-Prcaotor)

Llonierung "andsrar

Protaina"

lonieruAg PPI-da-

pazifiaciia j atruktioci

·®³

|üb organg a J

)rien- i ftierunirl

fee oRI-Ort-KjDn at ruction ia bla-|

Austausch nicht Aualausch

Signalvaktor

andaxar d3-cD3Aⁿ i

Vereinigung der getrennt optisiertan Strukturen (Konstruktion)

S Il

Hxpreasioziavektor

(Hybrid-Proaotor)

pE7T7A3pblaHP

yekrtor für |3uman-Proinsulin

Jk. ISxpreaaiana-1vektor für jP andere" !Proteine

Modif izderungen i fc-s Bereich des ! Ist rule tür gen a Modifizierung exs

Ij₁ a Bereich dss ptrukturgea

Abb. 5 : Konstruktion eines zusätzlichen EcoRI-Ortes in der Signals equenz des bla-Gena - pBE322ivmEcoRI

1) Grundlage der in-vitra-Iiutageneae

1 4

fMet S er lie Gin na tür liehe

5' ATG AGT_J£T_CAA ...

der ß-Lactamaae

3« G TCT TAA GTT mutagenisierendes ivmEcoRI — as-Oligonukleotid (-215.

(Tranaversion) Position)

2) Synthese des apeaiflachen ss-Oligonukleotids (komplementär zum. codierenden ( + ) Strang im H-terminalen

Bereich der Signal sequen7.)

3) Spaltung von pBR322-ESA mit EcoRI- oder HindiII-Endonuklease in Gegenwart von Äthidiuabromid (—^>Einatxangbruch)

4) RrnnnV-1 e^eeTTI—Bfthqnfliung —^ ireilegea der komplementären und Bildung eines partiellen Einstrangbereiches

HindlllEcoRI

5) Hybridisation mit dem as-Oligonukleotid

6) Reparatur synthese mit DNA-Po lymeras el (KLEIiOW-Fragment) (und Ligase)

7) Klonierung und Identifizierung durch EcoRI-Spaltung: gesuchtes Plasmid mit 2 EcoRI-Orten

Vorauagehende Variante - Entfernung des natürlichen EcoRI-Ortes

voa pBH322

a) EcoHI-Spaltung von pBR322

b) Reparatur der EcoRI-Enden, mit E.coli-DKA-Polymeraael und dATP und dTTP oder/und Abbau

mit Sl-Hukleaae

c) Kopplung mit T4-Ligaae

d) Klonierung und Identifizierung mit EcoRI-Spaltung (—> Unveränderte ccc—Form von pBR322)

e) Schritte 2) bia 7), wobei 3) mit Hindlll-Endonuldeaae erfolgt und in 7) die EcoRI-Spaltung zur linearen Form von pBR322 führt

Abb. 6: Kloxu.en.3ng eines T7-DNA-Reatriktioa3fragmenta In ü.coli' Klonlerung de3 T7A3-Promotora - pB&322T7A3

a. Vorbereitung: des p3R322-Yektorg

1) EcoäI- und Pstl-Doppelspaltung von pBR322 —^ 3609 + 732 Bp

2) getrennte Reinigung beider Spaltstücke

3) Weiterbehandlung des kleinen Fragments rait Alul-und Hpall-Endonukleaae

EcoBI Rsal Pvul AIuI AIuI Pa ti AIuI

Ο -515 -626 -S₁3 -706 -752, _A(4_T

-460 -7Ό2 5

Hpall· Spall CuGG

4) Unmittelbare Kopplung/oder erst nacii Reinigung/der beiden äußeren Subfragmente mit dem 3609 Bp -Fragment; u.a. entsteht

Hpall EcoRI (3603 Bp -fragment) ori Patl AIuI

-460 0 -752 -70$

(dieser Vektor enthält keinen Pvul-Ort und nur noch 2RsaI-0rt<

b. Vorbereitung der T7-DIIA ^X^ ³* ^{Abb# 7}

5) Spaltung der. T7-DHA (40000 Bp) mit HaellX-Endonuklease -> u.a. entsteht ein 5'terminales 1450 Bp -Fragment, das die frühe T7-Region bzw. die frühen T7-Promotoren enthält

6) Reinigung aller 1450 Bp-SpaltstOcke (+100 Bp)

7) Doppelspaltung aller Fragmente aus 6) mit Hpall- und AIuX-Endonuklease -3» u.a. entsteht ein 185 Bp-Fragment, das den T7A3-Promotor sowie 2 RsaX-Orte und.unterschiedliche Enden aufweist

Spall 185 Bp AIuI

639. 824.

T7-miA-Spaltatück 5* CGG ^rr^ —AG

³ t ₅t 26t 55 fit 92- ^

Hhal Hhal Rsal

Raal

c. Klooierung des T7AluI-HpaIX(185 Bp)-Fragments

8) Reinigung aller 185 Bp -Fragmente (Genauigkeit +50 Bp)

9) Kopplung mit dem genannten Vektor (4)), Klonierung und Identifizierung mittels Pvul- und Rsal-Spaltungen:

kein Pvul-Ort, 3 Fragmente mit Rsal (ohne das 7 Bp -Fragment;;

Abb. 7: Restriktionakarte von 17-DNA (lineares Genom)

L	2 B	g"	D	DpnII-Orte I !	(GATG) A	Ul	100% G
ι
	300 Bp^			—	a.

p 8,.2SW GIQ

_!' frühe Region."

Protein.-kinase (Teil)

HpaII	Hhal	185 Bp	92	AIuI
		idf mhf VHJ. Γ
Hhal	55 1 7 j

ITA3"-35"

T7A3 T7A3

H_--JJH ti _ -JQII

il 670. .

GGGG

Raal 725.

Im Bereich, der HpaI-Fragmente P-H-G befindet sich kein Patl-

Ort

. A₀ bis

sind die frühsn Promotoren«

ocr = "overcoming restriction"

237 £75

Abb. 8: Konstruktion einer Hhal-Deletionamutaute dea pBR322T7A3Ci85Bp)-Plasmida - Entfernung der bla-Kontrollsequenz

1) Betl- und Hindill-Doρρelspaltung des T7A3-Plaamida

2) getrennte Reinigung beider Patl-HindllX—Fragmente

3) Spaltung des kleineren Fragmente mit

EcoRX ΕΠ-tftT ffh«T HpaII Hh«T +31. 0. -104. -436·. -460.

ι 5 » 26

J_

Raal Rsal AluIPst

-706^-75 55 t7| 92

Deletion.

CEntfernung der ρBH322-Sequenz vom -"ΙΟφ. bia -460.. Hukleotid aowie einea Teila der T7-DTTA bsa, des T7A2-Promotora)

4) Kopplung der entstehenden Eragmente mit dem. großen Patl-Hindlll-Eragment mittels T4-Ligaae

5) Klonierung ^"<ü T^ent^fi ^ ^rt^ngj alle entateilenden Klone ent halten mindeatens daa gesuchte T7A3-Fragment; Überprüfung der Länge der klonierten Sequenz, auf Abwesenheit des Pvul-Ortes und auf Anwesenheit von. 3 Raal—Fragmenten (das 7Bp-Fragment nicht berücksichtigt)

der gesuchte Klon:

pBR322T7A3Ci54Bp> mit 3913 Bp Plaamid-

größe

+31

t

0.

-104

Raal RsaX T7A3₄ .

AIuX Patl -706.-752. L

Rs£ ^π670_β." (Τ7) _β ^"725."

5AGGAGGGG AGATAAGGTG AAACAAAACG GTTGACAAGA TGAAGTAAAG AGGGf

17 Bp «^

T7-DSA-Sequenzen

Promotor-^t1-35- und -10-Region"

ρ BR322-S e qu enaen

Stopcodons der Translation im unterschiedlichen Raster

Abb. y: Konstruktion des Hybrid-Proraotora "T7A3pbla^! Einführung eines Bcll-Qrtea in pBR322

PBR322 EcoRI "-35" pbla "-10" bla Patl

0. ' -752,

natürliche Sequenz _$, ScCTGATAAATGC

ivmBdl (Tranarveraian)

1) Synthese des spezifischen sa-Qligonnkleotids ^'ACTAGTIACG

2) HindIXI-Spaltung des pBH322-Pla3mida in Gegenwart von Äthidiumbromid C—^Einatrangbruch) (odar acoRX-Spaltung)

3) Abbau des komplementärsn Strangee mit Exonukleaaelll und Bildung eines partiellen Einstrangbereichea

4> Hybridisation mit dem. spezifiachen Oligonukleotid 5) Reparatursynthese mit DHA-PoIymeraae und Ligaae

Hindill EcoRI Patl

6) Transfer und Klonierung

7) Reinigung der Plasmide, Identifizierung durch Anwesenheit eines neuen, einmaligen Restriktionsortea (Bell)

8) RestriktionsanaIyae zur Kartierung des Bcll-Ortes: -175.

9) Prüfung des Einflusses des Baaenaustauschea, der ziarischen der °-35- und der -10-Region" liegt, auf das bla-Eipressionsniveau

Abb. ΊΟ: Konstruktion des Hybrid-Promotors "T7A3pbla"

bla-Promotor-aiutation im pBR322 (pBR322ivmj3bla1)

EcoRI pbla SD,, bla Pstl Q. _ ^bla -752,

^ 2

5' TGGTTGAATAATATTGAAAAAGGAA Consensus 5' TATAAT

Se^uenT* ³' ^AT.^GTTA (^T —>A Transversion)

1) Chemische Synthese des spezifischen Oligonukleotids (as-)

3' CGATGTTA C !comp lern ent är ex (-) Strang, . mutagenes ss-Oligonukleotid)

2) Spaltung von pBB.322 mit Hindlll-Endonuklease oder von" pBR322ivmBclI mit Bell-Endonuklease

3) Schritte 3) bis 6·) wie. Abb. 9

4) Charakterisierung des Expressionsniveaus verschiedener Klone; vermutlich "promoter up - mutation" und erhöhtes ß-Lactamase-Expressionsniveau

oder

5) Analyse der Hukleotidsequenz der betreffenden Region von mehreren Klonen.

bla-Promotor-Doppelmutation (pBR322ivmpbla2)

1) Chemische Synthese des spezifischen Oligonukleotids

. 3' CGATATTATTA ^x>}

2) Schritte 2) bis 5) wie oben angegeben

x) Der zweite Basenaustausch betrifft eine Transition. Diese ist auch durch in-vitro-Hutagenese mit Hydroxy-dCTP zu erreichen.

237 67

Abb. 41: Konstruktion des Hybrld-Promotora "T7A3pbla" "Statistischer terminaler Abbau"

(Entfernung der Sequenzen, die der "-10-Region^u des Promoters pbla 5'-terminal vorgelagert sind)

1) Hindlll-Sall- Doppel spaltung, von pBR322-DNA oder Bcll-Sall-J)oppelspaltung von pBR3?21 vmBclI

2) präparative Reinigung des größeren Pragmenta (3740 Bp im. erster Fall)

3) terminaler Abbau mit Lambda-Exonuklease Coder Exonukleaselll) sowie mit Sl-Huklease, anschließend Reparatur der Enden mit DNA-Polymerasel

HindTTT 783 _bla Pa ti 2957 Sail

Abbau Abbau

unterschiedliche Abbauprodukte

4) Spaltung das hängen—heterogenen DNA—Gemiscna mit Pstl—Endonuklease

5) Reinigung aller Spaltatücka, deren Länge 550 bia 650 Bp beträgt; sie weisen ^n homogenes Patl-Ende und »In heterogenes) basengepaartes Ende auf

Dia ι

t .» ^*j£Z—'j...^

6) weitere Schritte s. ab Schritt 5 AbWf3)

Abb. Λ2: Konstruktion des Hybrid-Promotora "T7A3Dbla" Vorbereitung der T7A3"-35-Region"

1) Hindlll-Rsal-Doppelspaltung des Vektors pBR322T7A3(154Bp) (o. Abb. 8)

Hindlll EcoHI „—,-, Rsal Rsal Pstl Baal Rsal Hindlll , ³¹- Hhal , ι ^36Q9· ²²⁸²' ¹S⁵' 31.,

190 ^JJ 7

2117 134

1463

(es entstehen 5' Fragmente)

2) preparative Reinigung des 12o Bp -Spaltatücks CT7A3"-35-^lf)

3) Kopplung dieses Fragments mit dem pBR322-HindIII-PatI-(3578Bp; Spalt stück, durcü. 14-Lig.ase

Pstl	3578	Hindlll EcoRI __.	, Rsa
	I . 190 ;	55'

4) präparative Reinigung des 3768 Bp -Produkts

5) weitere Schritte s. ab Schritt 5 Abb. 13)

und Kopplung der T7A3^w-35-Regiaa" mit der pbla"-1Q-Region"

angestrebter exakter Übergang von T7A3"-35-Region" und "-10-Region" von pbla:

5¹GC GCACCACGGC ACATAAGGTG AAACAAAACG...

♦..5'GTTGACAACA TGAAGTAAAC ACGGOkCAAI AATATTGAAA AAGGAAGAGT ATG. "-35" ~|^!I-10" ^SDbla

Übergang

T7-DUA Raal-Ort pBR322-DNA

rekonstruiert

Abb. >/3: Konstruktion dea Hybrid-Promotors "T7A3pbla" "Exakter terminaler Abbau" und Klonierung

(Entfernung der Sequenzen, die der "-10-Region" des Promotora pbla 5·'-terminal vorgelagert sind)

1) Ball-Spaltung von pBR322ivmBclIivmpbla1-(2) in Gegenwart von Äthidiumbromid

2.) exakter terminal er Abbau mit T4-D2IA-Polymera3e in 2 Zyklen Hindlll ImBcII ivmpblai 568 Bp Pstl

5' ..*.TGATCAAIGCTACAAT.... V ....ACTAGTTACGATGTTA....

5' ....TGATCAATGCTACAAT.... 1. Zyklus mit dGTP 3* ....ACTACr GATGTTA....

5' ^..TGAICAATGCTkCAAT.... X. Zyklus mit dTTP

V ....ACTAG

EGTTA....

3). Weiterbehandlung mit S1-Huklease und Patl-Endonukleaae 4) Reinigung dea kleinen Fragments (5£8 Bp)

"-10-Region" bla Patl

5) Kopplung, der "-10-Region"-Spaltstüeke mit dem vorbereiteten T7A3"-35-"Vektor mittels T4-Ligase (s. Abb. Ί2)

6) Transfer und Klonierung, Selektion auf: Ap^r, Tc^r

7) Charakterisierung: - erhöhtes Expressionsnlveau.

- Längenbestimmung

- Restriktionsanalyse

- NukleotidsequenÄanalyse des Übergang

der gesuchte Klon enthält den gybrid-Promotor - "pEVT7A3blaHP"

Hindlll EcoRI Hhal Rsal Rsal Pstl Rsal Rsal Hindli: 31. Q. -104. -184, -515. -752. 2282. 165. 31.

55Bp IT7A3 ΐ pbla

55 Bp -Spaltstück T7-DNA (Sequenz s. Abb. 8),

*3 Übergang (exakt) s. Abb. Ί2, unten

Abb. 44 : Konstruktion des Hybrid-Promotors "T7A3pbla" "Exakter terminaler Abbau"

(Entfernung der Sequenzen, die der "-10-Region" des Promotors pbla 5'-terminal vorgelagert sind)

1) HindiII-Pvul-Doppelspaltung von ρBR322ivmpbla1ivmEcoRI oder ...ivmSmal

2) Reinigung des kleinen Fragments (657 Bp)

ivm

Hhal

Raal Pvul -436. -515. -626

Hixxdlll EcoRI ,31. 0.

135

3) Spaltung de3 Pragaenta mit Ehal-Endonuklease

4) präparative Reinigung des größten Spaltstücka (332 Bp)

5) exakter terminal er Abbau mit T4-DliA-Polymerase in mehreren Zyklen mit unterschiedlichen Nukleotiden (9 Zyklen)

a)	dATP
b)	dGTP
c)	dGTP
d)	dGTP
e)	dTTP
f)	dGTP
g)	dGTP
h)	dGTP
i)	dTTP

Verkürzung auf Position

-115. Hukleotid -130.

-148.

-152.

-158.

-164.

-174.

-182.

-184. ("-10-Region")

Diese Zyklen führen auf der anderen "Seite" zu einer Verkürzung vom -436. zum -382. Hukleotid (entspricht der 58. Aminosäure der ß-Lactamaae).

6) Abbau der komplementären Enden mit Si-üuklease (und Reparatur mit B2A-Polymerasel)

7) Spaltung deo verkürzten Pragmenta" nit ScoRI oder Smal_ in^ oignalbereich der ü-Lactaisase (und Reinigung der Produkte)

c, i'4-Ligaae-Kopplung von 7) mit der. 192 Bp -Prägnant (T7A3"-35" und de^ i^ro2en üindIII-ivm£coRI oder -ivsiSEal-Gpaltstiick

j- .'.ei*»«jrζur.ar.dlun^· wie K'ob. Ί 3 , ab Jchritt o)

Abb. Ί5: Konstruktion des bla-Signalsequenz-VeJctora

Exakter terminaler Abbpu

1) Rsal-Spaltung von pBR322 oder pBR3221vmEcoBI: _x)

3 Fragmente - 2117, 1564 und 680 Bp

2) Reinigung des kleinsten SpaltStücks

oR

T5„eT ρ_ΛΛτ,_τ ivmEcoRI _ _

iisal EcoRX Rsal

Hindlll Mbol Mt»ol Mbol

31. -315.-351.-36a.

GIuAsD 35.36*.

3) Spaltung des Fragments mit Mbol-Endonuk.1 eaae in 4 Spaltstücke 480, 147, 36 und 17 Bp

4) präparative Reinigung des 480 Bp -Fragments

5) exakter terminaler Abbau mittels T4-DHA-Polymerase in 4 Zyklen

am Mbol-Ende: a) dGTP Verkürzung auf Position Ala34 -303.

b) dAIP Aap33 -30c.

c) dCTP Leu28 -2"5O.

d) dTTP Ala23 -2Γ7-

tbol

22. 33.

.. .PheAla TiarLeu AspAlaGlu

... TTTGGTGAGGGAGAAACGGTCKlTGAAAGTAAAA(IAIGyTGAApATC 3 ^f

i, k

Cder Abbau am Rsal-Ende führt vom 165. zum 147. Hukleotid)

6) Behandlung des Produkts mit S1-Nuklease und Hindlll-Endonuklease

(Rsal) Hindlll EcoRI Alä23 (Mbol)

JISbGA

31 277

7) Reinigung des 308 Bp -Spaltstücks (Hindlll-Ala23-)

bei Verwendung von pE7T7A3blaHP : RruI-(-515 .) Sail-(+652) -

Spaltung

237 '67

Abb. ^iS: Konstruktion, des bla-SignalsequenÄ-Vektors

Variante "Smal-Vektor" (für "andere" ds-cDHA)

1) Spaltung von pBR322 mittels EcoBI-Eadonnkleaae in Gegenwart von ÄffiH f^.j, TTffiTpTTiTrTj e\ (—$ T^tbh)

2) Sxonnkleaselll-Behandlung und Freilegung dea komplementären Stranges

EcoRI bla. AlaSLsProGluThr Pstl 0. 23 27 -752* GAATTC GGIGAGGCAGAAACG

χ χ

χ erwünschte Austausche: , PxoGlu

•«..5'.CCGAGAA..··

,5'.CCGGGGA,

(der 1. Austausch fuhrt zu einem, neuen HpaJX-Grt,

der 2. Austausch zu einem Aminosäure· austausch. GIu-P¹CcIy so^is zu einem Smal- bz^ar, Xmal-Ort

CCCGGG CCCGGG

3) Reparatur synthese mit T4 -DHA- Po lym erase,

dAIP, dTTP, dGTP und in einwni bestimmten Verhältnis mit dGTP Coder mit E.coil-DlA-Polymerasel-KISHOW-Fragment);

4) u.U. Kopplung bsra. Schließen des Einstrangbruchs

5) Transfer, iCLonierung und Plasmidpräparation einer größeren α η ?s\ ifi Klone sOOie

präparative Spaltung mit Smal-Endonuklease

6) Reinigung aller linearisierten Smal-Plasmide

7) Ringschlufl mit T4.-Ligase unter Bedingungen, die im wesentlichen monomere ccc—Formen ergeben

8) Transfer und Reklonierung

9) Reinigung einzelner Plasmide und Restrüctionsanalyse zur

Bestimmung der Lage des Smal-Ortes

1 O) Zum Ausschluß weiterer Mutationen wird ein Fragment minimaler Größe, das den Smal-Ort noch enthält, in den entsprechend vorbereiteten Vektor erneut rekloniert.

Claims (16)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung eines Expressionsvektors, der in einem Mikroorganismus die Expression eines Polypeptids, insbesondere Präproinsulin des Menschen, Humaninterferon, BLV-Proteine, Influenzavirus-Proteine oder Teilsequenzen der genannten Proteine, bewirkt, durch operables Verbinden einer dieses Polypeptid codierenden DNS-Sequenz mit einer Einheit, die die für die Kontrolle der Expression notwendigen Nucliotidsequenzabschnitte enthält, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kontrolle der Expression eine kombinierte Einheit verwendet wird, die Nucleotidsequenzabschnitte mindestens zweier verschiedener natürlicher, prokaryotischer Kontrolleinheiten enthält.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine kombinierte Einheit verwendet wird, die hinsichtlich Basenfolge und Abstand zwischen den für Transkription und Translation essentiellen Hauptbestandteilen, insbesondere "-35-, -10-Region", Transkriptionsstartpunkt, Bindungsort der 16 S-RNS und Translationsstartpunkt, durch in-vitro-Mutagenese variiert ist.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine kombinierte Einheit mit einem Translationsstartpunkt verwendet wird, der aus einer natürlichen prokaryotischen Sequenz gebildet ist.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das nachgeschaltete Strukturgen in Lesephase mit dem Translationsstartpunkt gebracht wird.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die kombinierte Einheit in ein Plasmid oder einen Lambda-DNS-Vektor eingebaut wird.
6. 6. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine kombinierte Einheit verwendet wird, die Kontrollsequenzen der frühen Region des Phagen T7 und die natürliche Kontrollsequenz des /3-Laktamase-Gens enthält.
7. 7. Verfahren nach Punkt 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine kombinierte Einheit verwendet wird, die, bezogen auf den Protein kodierenden Abschnitt, 5'-terminal aus der "-35-Region" des A3-Promotors des Phagen T7 und anschließend aus der "-10-Region" bis einschließlich Ribosomenbindungsort der Expressionskontrolleinheit des /3-Laktamase-Gens aus pBR322 besteht.
8. 8. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß als "-35-Region" der kombinierten Einheit eine Sequenz 5'GTTGACAA verwendet wird.
9. 9. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß als "-35-Region" des T7A3-Promotors die "-35-Region" bis zum Rsal-Spaltort unmittelbar vor der "-10-Region" des Promotors verwendet wird, so daß ein Abstand von 16-19 Basenpaaren, vorzugsweise 17 Basenpaaren, bis zur "-10-Region" der Kontrolleinheit des /3-Laktamase-Gens eingehalten wird.
10. 10. Verfahren nach Punkt 6 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz zwischen "-35-Region" und "-10-Region" durch in-vitro-Mutagenese so verändert wird, daß eine Steigerung der Promotorstärke der kombinierten Einheit erreicht wird.
11. 11. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine kombinierte Einheit verwendet wird, in der die "-10-Region" aus der natürlichen "-10-Region " des Promotors des /3-Laktamase-Gens mit der Sequenz 5'TTCAATAATATT besteht, die sich 26 bzw. 14 Bp vor dem ATG-Startkodon der /3-Laktamase befindet.
12. 12. Verfahren nach Punkt 11, dadurch gekennzeichnet, daß die natürliche "-10-Region" durch in-vitro-Mutagenese so abgeändert wird, daß die Sequenz mindestens noch die Basenfolge TNNNNT, vorzugsweise TNNAAT bzw. TATAAT, enthält, wobei N eines der 4 Nukleotide bedeutet.
13. 13. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand und die Basenfolge zwischen der "-10-Region" und der Ribosomenbindungsregion im Bereich der SHINE-DALGARNO-Sequenz, bestehend aus AAGGA, durch in-vitro-Mutageneseverfahren abgeändert, vorzugsweise verlängert, wird.
14. 14. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand und die Basenfolge zwischen der SHINE-DALGARNO-Sequenz und dem ATG-Startkodon durch in-vitro-Mutagenese-Verfahren verändert, vorzugsweise von 5 Bp in der natürlichen Sequenz auf 7 bis 11 Bp verlängert, wird.
15. 15. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenzim Bereich des ATG-Startkodons der /3-Laktamase chemisch synthetisiert und der Anschluß an die SHINE-DALGARNO-Sequenz auf der einen Seite und der Anschluß im richtigen Leserahmen an die kodierende Sequenz des zu exprimierenden Proteins auf der anderen Seite vermittelt wird.
16. 16. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenzim Bereich der 24. Aminosäure der ξ-Laktamase nach dem ATG-Startkodon chemisch synthetisiert und der Anschluß an die vorgeschaltete ξ-Laktamase-Präsequenz auf der einen Seite und der Anschluß im richtigen Leserahmen an die kodierende Sequenz des zu exprimierenden Proteins auf der anderen Seite vermittelt wird.

    Hierzu 16 Seiten Zeichnungen