DD237676A1 - Verfahren zur biosynthese von human-proinsulin oder human-proinsulin-derivaten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Biosynthese von Human-Praeproinsulin, Human-Proinsulin oder Human-Proinsulin-Derivaten unter der Kontrolle einer prokaryontischen Kontrollsequenz. Ziel der Erfindung ist es, Klone mit vollstaendig codierenden Nukleotidsequenzen fuer Human-Proinsulin, fuer Human-, Schweine- oder Hunde-Praeproinsulin herzustellen. Erfindungsgemaess wird von einer Laengen-heterogenen doppelstraengigen, komplementaeren Desoxyribonukleinsaeure ausgegangen. Die Kopplung der ds-cDNS-Molekuele erfolgt an einen Vektor durch die Synthese homopolymerer Einstrangenden, und die Hybridmolekuele werden in einen Wirt transferiert. Die Insulin-ds-cDNS-Sequenzen werden durch in-vitro-Mutagenese so veraendert, dass sie mindestens fuer die A- und B-Kette von Humaninsulin codieren und dass ein exakter Uebergang von der prokaryontischen Kontrollsequenz in die codierende Sequenz so ermoeglicht wird, dass Human-Proinsulin oder Human-Proinsulin-Derivate nach in-vivo-Abspaltung einer prokaryontischen Signalsequenz oder nach in-vitro-Spaltung mit Bromcyan direkt entstehen. Als prokaryontische Kontrolleinheit wird vorzugsweise ein Hybrid-Promotor verwendet, diese Expressionsstruktur wird optimiert und befindet sich auf einem replikationsfaehigen Vektor.

Description

Hierzu 10 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Klonierung von Nukleotidsequenzen von Human-Präproinsulin, Schweine-Präproinsulin oder Hunde-Präproinsulin, zur in-vitro-Mutagenese dieser Sequenzen und zur Kopplung der betreffenden Sequenzen an einen Expressionsrektor, der transformierte Wirte zur Synthese von Human-Präproinsulin, Human-Proinsulin oder Human-Proinsulin-Derivaten anregt

Das Verfahren ist in der mikrobiologisch-pharmakologischen Industrie nutzbar. Die Erfindung hat Bedeutung für die Medizin.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Klonierung eukaryontischer Nukleotidsequenzen als biologische Informationsträger in prokaryontischen Empfängern ist eine seit 1975 in zunehmendem Maße international angewendete Methodik, die verschiedene gentechnische Lösungen umfaßt (R. WU: [Hrsg.]: Methods in Enzymology 68 [1979]). In mehreren Fällen gelang es, eukaryontische Sequenzen unter der Kontrolle prokaryontischer Transkriptions- und Translations-Kontrollelemente so zu manipulieren, daß die mikrobielle Synthese eukaryontischer Proteine erreicht wurde, z. B.

— Somatostation ITAKURA et al. Science 198,1056(1977)

— Human-Wachstumshormon GOEDDEL et al. Nature 281, 544 (1979) MARTIAL et al. Science 205,602 (1980)

— Hämagglutinin (FPV) EMTAGE et al. Nature 283,171 (1980)

— Humaninterferon GOEDDEL et al. Nucl. Acids Res. 8,4057 (1980) — Humaninterferon DERYNCK et al. Nature 287,193 (1980)

— Antigen (MKS-Virus) KÜPPER et al. Nature 289, 555(1981)

GOEDDEL et al. (Proc. natn. Acad. Sei. USA 76,106 (1979)

entwickelten ein Verfahren zur mikrobiellen Synthese der A- bzw. B-Kette von Humaninsulin in getrennten Rekombinantenstämmen, wobei die Synthese unter der Kontrolle des Promotors aus dem Laktose-Operon stand, die A- und B-Kette wurden nach Reinigung durch Knüpfung von Disulfidbrücken in Humaninsulin umgewandelt.

In den zitierten und bisher vorliegenden Lösungen wurden die mikrowellen Synthesen unter der Kontrolle natürlicher starker Promotoren prokaryontischer Promotoren, ζ. B. pi_ac' p_trp und Lambda-p_L, durchgeführt. Die Expressionshöhen der bisher verwendeten Promotoren sind jedoch noch nicht befriedigend. Es wurde bereits vorgeschlagen, einen prokaryontischen Hybrid-Promotor zur Expressionskontrolle nachgestalteterfunktionellereukaryontischer Gene zu schaffen. Ein solcher Promotor wurde bisher noch nicht mit Human-Insulin-Gen verbunden.

In der DD-PS 143794 wurde ferner beschrieben, durch differenziertes Schwänzen von ds-cDNS-Molekülen die längsten Moleküle, die am ehesten damit auch die vollständige Codierung für ein eukaryontisches Protein tragen, aus einer heterogenen Population zu selektieren.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, Klone mit vollständig codierenden Nukleotidsequenzen für Human-Proinsulin, für Human-, Schweineoder Hunde-Präproinsulin herzustellen und die Sequenzen so zu modifizieren, daß sie unter der Kontrolle des Hybridpromotors die mikrobielle Synthese von Human-Proinsulin oder Human-Proinsulin-Derivaten anregen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die bisher bekannten Klonierungstechniken so weiter zu entwickeln, daß Human-Proinsulin oder Human-Proinsulin-Derivate unter der Kontrolle einer neuartigen prokaryontischen Expressionskontrolleinheit biosynthetisch so hergestellt werden, daß Human-Proinsulin oder Human-Proinsulin-Derivate entweder durch in-vivo-Abspaltung einer prokaryontischen Signalsequenz oder nach in-vitro-Spaltung mit Bromcyan entstehen. Die Erfindung beruht auf dem Gedanken, einen unmittelbaren Übergang von einer prokaryontischen Signalsequenz in die codierende Sequenz für Human-Proinsulin oder Human-Proinsulin-Derivate so zu konstruieren, daß in vivo nach Abspaltung der prokaryontischen Präsequenz Human-Proinsulin exakt mit der ersten Aminosäure der B-Kette N-terminal beginnt. Die Erfindung geht zunächst davon aus, daß verschiedene natürliche Quellen (chromosomale DNS, polyA⁺-RNS) als Ausgangsmaterial geeignet sind, um nach in-vitro-Mutagenese eine codierende Sequenz für authentisches Humaninsulin zu liefern. Es wird von polyA⁺-RNS aus Pankreas des Menschen, aber auch aus Pankreas des Schweines, des Hundes oder anderer Spezies, deren Aminosäuresequenzen der A- und B-Kette von Insulin nur wenige Austausche, vorzugsweise nur einen Austausch, von der Aminosäuresequenz der A- und B-Kette des Humaninsulins aufweisen, ausgegangen. Diese polyA⁺-RNS wird in an sich bekannter Weise durch Umkehrtranskription und Doppelstrang-cDNS-Synthese in ein längenheterogenes ds-cDNS-Gemisch überführt; die entstehenden ds-cDNS-Moleküle werden mit Hilfe von homopolymeren Einstrangenden (terminaleTransferase-Reaktion) an einen entsprechend vorbereiteten Vektor, vorzugsweise pBR 322, der mit Pstl-Endonuklease linearisiert wurde, gekoppelt und in einen Wirt, vorzugsweise E. coli, transferiert. Die klonierten Insulin-DNS-Sequenzen, sofern sie aus Quellen stammen, die kein Humanmaterial darstellen, werden durch in-vitro-Mutagenese so verändert, daß sie danach mindestens für die A- und B-Kette von Humaninsulin codieren. Außerdem wird die codierende Sequenz danach durch in-vitro-Mutageneseverfahren so verändert, daß ein exakter Übergang von der prokaryontischen Kontrollsequenz in die codierende Sequenz, d. h. in die B-Kette, die dem N-Terminus von Proinsulin entspricht, ermöglicht wird, so daß Human-Proinsulin oder Human-Proinsulin-Derivate nach in-vivo-Abspaltung einer prokaryontischen Signalsequenz oder nach in-vitro-Spaltung mit Bromcyan direkt entstehen. Als Kontrolleinheit wird vorzugsweise folgender Hybrid-Promotor verwendet: Die„-35-Region"der /3-Laktamase-Expressionskontrolleinheitwird durch einen funktionell ähnlichen Bereich aus der Kontrolleinheit der frühen Region des Phagen T7 ausgetauscht, so daß der entscheidende Teil der „-35-Region" des Hybridpromotors aus der „-35-Region" des T7A3-Promotors oder einer identischen Sequenz „GTTGACAA", unabhängig ob diese aus einem anderen natürlichen Promotor (z. B. trp-Promotor) oder chemisch-synthetisch oder durch in-vitro-Mutagenese hergestellt wird, besteht. Diese Sequenz stimmt mit der Consensus-Sequenz für die „-35-Region" (SIEBENLIST,U.: Nucl.Acids.Res.6,1895-1905(1979]) überein. Zur Kopplung der Teilbereiche wird der Rsal-Ort unmittelbar vor der „-10-Region" des T7A3-Promotors vorteilhafterweise benutzt. Dabei wird ein Abstand von 16 bis 19 Basenpaaren, bevorzugt 17 Basenpaare, zwischen der „-35-" und „-10-Region" des Hybridpromotors eingehalten. Außerdem wird durch in-vitro-Mutagenese die Basenfolge innerhalb dieses Abstandes verändert, so daß eine Steigerung der Promotorstärke erreicht wird. Diese Expressionsstruktur wird gegebenenfalls weiter optimiert und kann auf replikationsfähige Vektoren (z. B. E.coli-Plasmide, wie pBR322, E. coli-Phagen wie Lambda) übertragen werden.

Ausgehend von einer Längen-heterogenen Population von Doppelstrang-cDNS-Molekülen wird das Verfahren erfindungsgemäß so geführt, daß mittels terminaler Transferaserreaktion homopolymere Einstrangenden mit einer durchschnittlichen Länge von 30-60 Nukleotiden (dCMP-Reste) an die ds-cDNS-Moleküle angehängt werden, dagegen an die linearen Plasmidvektor homopolymere Einstrangenden mit einer durchschnittlichen Länge von nur 8-16 Nukleotiden (dGMP-Reste) angehängt werden. Die verschiedenartig vorbereiteten Moleküle werden über die homopolymeren, komlementären Einstrangenden aneinander gelagert und in kompetente Wirte, vorzugsweise in mit CaCI₂-behandelte E.coli-Bakterien, transferiert. Der transformierte Wirt wird in ein für sein Wachstum geeignetes Medium gegeben und das entstandene Polypeptid nach in-vivo-Abspaltung der prokaryontischen Signalsequenz oder nach in-vitro-Spaltung mit Bromcyan isoliert. Die Rekombinantenklone werden in bekannter Weise identifiziert und Insulin-Sequenzen repräsentierende Klone selektiert. Durch in-vitro-Mutagenese wird ein einmaliger Hpal-Restriktionsort im Bereich der 2.-3. Aminosäure der B-Kette geschaffen. Vorzugsweise wird zur ih-vitro-Mutagenese ein spezifisches Einstrang-Oligonukleotid, das die Sequenz 3' AAA CAA TTG GTT 5' enthält, eingesetzt. Erfindungsgemäß wird im Bereich der2.-3. Aminosäure der B-Kette der natürliche Codierung so abgeändert, daß ein Hpal-Ort entsteht, ohne dabei die natürliche Aminosäuresequenz zu verändern. Anschließend wird eine prokaryontische Signalsequenz unmittelbar und exakt vor die Aminosäuresequenz von Human-Proinsulin oder Human-Proinsulin-Derivaten lokalisiert. Hierzu ist es erforderlich, daß die Codierung der/3-Lactamase, wie sie im Plasmid pBR322 vorliegt, vom C-terminalen Bereich aus durch enzymatische terminale Kürzungsverfahren so verkürzt wird, daß nur noch die Codierung für den Präabschnitt (1 .-23. Aminosäure der /3-Lactamase) übrig bleibt.

Die Konstruktionslösung für den spezifischen Übergang der ß-Lactamase-Signalsequenz (Präabschnitt) in die Human-Proinsulinsequenz (Abb. 1) beruht auf folgenden Voraussetzungen:

— die Präzision des Übergangs „...AIa23/Phe1Val2Asn3..." muß unbedingt eingehalten werden. Dadurch sind die Codierungsmöglichkeiten eindeutig bestimmt und begrenzt.

— Es muß ein einmaliger Restriktionsort in der Nähe des Übergangs in der natürlichen Sequenz für Human-Proinsulin geschaffen werden, der die Codierung innerhalb der Möglichkeiten des degenierten Codes für die authentischen Aminosäuren dennoch gestattet.

— Aufgrund der natürlichen Nukleotidsequenz für Human-Proinsulin ergibt sich die Möglichkeit, einen Hpal-Ort im Bereich der 2. und 3. Aminosäure der B-Kette zu schaffen. Dieser Ort ist gleichzeitig auch einmalig für das Plasmid pBR322.

— Die codierende Sequenzfürß-Lactamase wird durch terminaleenzymatischeterminale Kürzungsverfahren vom C-terminalen Bereich aus so eingeschränkt, daß nur noch die Codierung für die 1.-23. Aminosäure übrig bleibt.

— Zur Kopplung der so vorbereiteten Sequenzen des Vektor-DNS und der Human-Proinsulin-ds-cDNS muß ein spezifisches ds-Oligonukleotid chemisch synthetisiert werden. Dieses muß aus gentechnischen Gründen außerdem unterschiedliche Enden aufweisen, damit die Konstruktion richtungsorientiert durchführbar ist. Deshalb wird an dem zur B3-Position benachbarten 3'-Ende ein kohäsives Pstl-Ende synthetisiert.

Das erfindungsgemäß einzusetzende spezifische Oligonukleotid ist durch die Sequenz 5'TTTGTTAACTGCAs'

3'AAACAA TTG

gekennzeichnet. Es codiert für die ersten drei N-terminalen Aminosäuren der B-Kette von Humaninsulin. Es wird als Übergangsstück zwischen dem Präabschnitt der ß-Lactamase und dem codierenden Abschnitt für Human-Proinsulin oder Human-Proinsulin-Derivate geschaltet, wobei die natürliche Sequenz N-terminal am neugeschaffenen Hpal-Ort in der Nähe des N-Terminus von Proinsulin beginnt.

Dieser oder ein.analoger Weg zum exakten Übergang einer prokaryontischen Signalsequenz in die spezifische eukaryontische Sequenz ist bisher nicht beschrieben worden.

In Varianten des Verfahrens wird nicht nur von der natürlichen Human-Proinsulin-Sequenz ausgegangen. Durch in-vitro-Mutagenese wird erreicht, das C-Peptid, welches u.a. eine Bedeutung für die Faltung des Proinsulinmoleküls in der Weise hat, daß die authentische Aneinanderlagerung der A- und B-Kette gefördert wird, so daß Humaninsulin nach Abspaltung des C-Peptids entsteht, so zu verändern, daß es nur noch aus 4-8 Aminosäuren besteht. Diese Verkürzung wirkt begünstigend auf den Faltungsprozeß. Die Entfernung der codierenden Sequenz für die Mehrzahl der Aminosäuren des C-Peptids wird erreicht, indem die äaßeren Pstl-Fragmente der Human-Proinsulin-Codierung miteinander unter Ausschluß der inneren Pstl-Fragmente, verbunden werden. Bei Anwendung dieses Verfahrens wird es gleichzeitig möglich, unter Umgehung der ds-cDNS-Synthese, unmittelbar genomische Humaninsulin-codierende DNS einzusetzen, da gleichzeitig mit Entfernung der „inneren" C-Peptidcodieruhg auch die 2. Intronsequenz entfernt wird. Die Llntronsequenz stört ohnehin nicht, da sie sich nicht im codierenden Teil des Gens befindet.

Außerdem ist es möglich, andere natürliche Quellen für die Herstellung Human-Proinsulin-codierender Sequenzen zu verwenden. Durch die erfindungsgemäße Verfahrensführung wird die Position B30 vom funktioneilen Schweineinsulin-Gen durch in-vitro-Mutagenese so verändert, daß aus der Alanin-Codierung für den B30-ResteineThreonincodierung,wiesieim Fall von Human-Proinsulin vorliegt, entsteht. Hierzu wird erfindungsgemäß ein synthetisches Oligonukleotid mit der Sequenz 3' TTCTGGGC 5'zur in-vitro-Mutagenese verwendet.

Das gleiche Verfahren ist natürlich anwendbar auf andere codierende Sequenzen, die sich wie Schweineinsulin nur in einer einzigen Aminosäure von Humaninsulin unterscheiden. So hat z. .B. Hundeinsulin dieselbe Aminosäuresequenz wie das Insulin aus Schweinen, und das gleiche Oligonukleotid ist zur in-vitro-Mutagenese einsetzbar. Selbstverständlich ist das gleiche Prinzip auch anwendbar, um die codierende Sequenz anderer Insulinspezies, die sich in wenigen Aminosäurepositionen von der Humaninsulin-Sequenz unterscheiden, durch in-vitro-Mutagenese so zu verändern, daß eine Codierung für Humaninsulin resultiert. Auch diese Veränderungen liegen im Geltungsbereich der Erfindung.

Außerdem kann durch in-vitro-Mutagenese auch eine unmittelbare Verknüpfung der B- und Α-Kette, die durch 1 bis 2 Methioninreste voneinander getrennt werden, unter Ausschluß des C-Peptids durchgeführt werden. Erfindungsgemäß wird hierzu ein spezifisches Oligonukleotid verwendet, das im 3'-Bereich des Oligonukleotids zum C-Terminus der B-Kette und im 5'-Bereich zum N-Terminus der Α-Kette korrespondiert und im Mittelteil die Codierung für eine oder zwei Methioninreste zusätzlich enthält.

Dieses in-vitro-Mutagenverfahren bewirkt damit die gleichzeitige Deletion der Codierung für das C-Peptid und gleichzeitig die Additon der Methionincodierung. In den natürlichen A- und B-Ketten des Humaninsulins kommen keine Methioninreste vor. Die so vorbereiteten codierenden Sequenzen für Human-Proinsulin oder die Human-Proinsulin-Derivate werden unter die Kontrolle eines prokaryontischen Promotors gebracht, wobei vorzugsweise der oben beschriebene Hybrid-Promotor verwendet wird. Für bestimmte Ausführungen des Verfahrens kann es auch zweckmäßig sein, vor das Human-Proinsulin einen Methioninrest zu schalten: erfindungsgemäß wird hierzu im codierenden Abschnitt für ß-Lactamase ein EcoRl-Ort durch in-vitro-Mutagenese an der Position der 2. und 3. N-terminalen Aminosäure des Präabschnitts durch in-vitro-Mutagenese erzeugt und damit gleichzeitig die Codierung für die Präabschnitt der /3-Lactamase entfernt. Die Verbindung der so vorbereiteten prokaryontischen Sequenz mit der Human-Proinsulin-Sequenz, letztere beginnend am bereits durch in-vitro-Mutagenese erzeugten Hpal-Ort, wird durch ein spezifisches ds-Oligonukleotid mit der Sequenz Met B1 B2

5' TG TTT GTT 3'

3' AC AAA CAA 5' hergestellt.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird die Herstellung von Human-Präproinsulin, Human-Proinsulin oder Human-Proinsulin-Derivaten ermöglicht. Der exakte Übergang von einer prokaryontischen in die spezifische eukaryontische Sequenz und die angegebenen Varianten sind neu.

rVa CriinHimn o^ll nu^ketohon^ Hi ι roh Δι lofi'ihn inneKoicniolo nähor OrI al Itort warnen

Ausführungsbeispiel

1. Konstruktion des Human-Proinsulin-Expressionsvektors

1.1. Klonierung von ds-cDNS aus Human-Pankreas und in-yitro-Mutagnese

Die Konstruktion des Human-P.roinsulin-Expressionsvektors erfolgt in mehreren Schritten.

Die Klonierung von ds-cDNS (Teil I; Abb. 2) beruht auf dem gleichen Prinzip, das bei der Klonierung von Karpfen-Präproinsulinds-cDNS (DD 154547) erprobt wurde. Zunächst wird unter Anwendung der Homopolymeren-Kopplungstechnik die ds-cDNS im Pstl-Ort von pBR322 kloniert und ein spezifischer Klon, der das vollständige Gen repräsentiert, gesucht. Der zu selektierende Klon muß 5'-terminal mindestens ab der ersten Aminosäure der B-Kette die spezifische Sequenz enthalten, um für die weiteren Arbeiten geeignet zu sein. Zur Erhöhung der Effektivität der Klonierung kommt das Verfahren des differenzierten Schwänzens zum Einsatz.

Einführung eines einmaligen Hpal-Ortes in die klonierte Sequenz

Um die exakte Verbindung der Human-Proinsulin-Sequenz mit der Kontrolleinheit zu gewährleisten, ist die Einführung eines Hpal-Ortes besonders vorteilhaft (Abb. 3). Die Codierung für Val2 und Asn3 der B-Kette (5'GTGAAC) erhält durch in-vitro-Mutagenese unter Benutzung eines spezifischen Oligonukleotids (3'AAACAATTGGTT) den spezifischen Erkennungsort (5'GTTAAC). Durch dieses Mutageneseverfahren ist es möglich, die notwendige Basentransversion durchzuführen. Der Hpal-Ort ist für die Humaninsulin- wie für die pBR322-Sequenz einmalig.

Nach Behandlung der DNS in vitro und Transfer dieser DNS in E. coli werden aus der Gesamtpopulation die Klone selektiert, die den Hpal-Ort besitzen.

Dazu ist es vorteilhaft, die Plasmid-DNS mehrerer Klone gemeinsam zu reinigen, die DNS mit Hpal-Endonuklease zu spalten, das lineare Plasmid zu reinigen, erneut zu koppeln und zu transferieren. Auch hier erfolgt eine Linearisierung von Plasmid-DNS nur, wenn der entsprechende Restriktionsort erfolgreich hergestellt wurde. Weiterhin ist es notwendig, die Integrität der übrigen ds-cDNS-Sequenz mittels Restriktionsanalyse zu überprüfen.

Zur Konstruktion des Expressionsvektors wird nach einer Hpal-Sall-Doppelspaltung das größere der beiden entstehenden Fragmente isoliert und zur weiteren Konstruktion eingesetzt. Die beschriebene Konstruktion des Hpal-Ortes kann dadurch umgangen werden, daß für die Synthese des zweiten Stranges der ds-cDNA nicht die Haarnadelstruktur, sondern unmittelbar das entsprechende modifizierte Oligonukleotid (5'TTTGTTAACCAA) verwendet wird.

In-vitro-Mutagenese zur Entfernung eines partiellen C-Peptid-Anteils

Human-Präproinsulin (HPPI) enthält im codierenden Genbereich für das C-Peptid drei Pstl-Orte, jedoch keine in den übrigen Sequenzbereichen. Die Pstl-Orte codieren für Leucin und Glutamin und befinden sich außerdem im gleichen Leseraster. Durch Pstl-Spaltung und erneute Kopplung mit Ligase entstehen Deletionsmutanten, die u-.a. auch das gewünschte Plasmid repräsentieren (Teil III, Abb.4). Durch entsprechende Subklonierung, Plasmidgewinnung und Restriktionsanalyse wird das gesuchte Plasmid identifiziert.

Plasmide dieser Art könnten ein modifiziertes Proinsulin synthetisieren, das sich effektiver in biologisch aktives Insulin proteinchemisch umwandeln läßt.

In-vitro-Mutagenese von ds-cDNS für Präproinsulin des Schweins

Schweineinsulin (A-und B-Kette) unterscheidet sich von Hurnaninsulin nur in der Aminosäureposition B30 (AIa statt Thr). Aus diesem Grund ist es möglich, die Nukleotidsequenz für Schweineinsulin durch einen einzigen ,Basenaustausch so zu verändern, daß diese Sequenz Humaninsulin codiert. Dasselbe gilt für die Nukleotidsequenz von Hundeinsulin. Hundepankreas empfiehlt sich aus Gründen der RNase-Armut.

Die Durchführung des Mutageneseverfahrens (Teil IV, Abb. 5) erfordert alle Schritte, die bereits für die Klonierung von Human-PPI-Sequenzen dargelegt wurden, und außerdem die spezifische Mutagenese. Hierfür ist die chemische Synthese des spezifischen Oligonukleotids 3'TTCTGGGC erforderlich. Aus dem Vergleich der Nukleotidsequenzdaten von Humaninsulin und Ratteninsulin wird postuliert, daß sich Schweineinsulin von Humaninsulin im betreffenden codierenden Bereich allein durch den Austausch B30ThrACC—>B30AlaGCC unterscheidet. Dieser postulierte Wechsel ist die einzige Möglichkeit, um innerhalb eines evolutionären Basenaustausches den Aminosäureaustausch zu verursachen. Für diesen Austausch existieren drei weitere Möglichkeiten, die aber jeweils 2 Basenaustausche erfordern würden, die für ein Triplett aber unwahrscheinlich sind. Diese Betrachtungen berücksichtigen, daß das Schwein dem Menschen evolutionär näher steht.als die Ratte. Deshalb gibt die Sequenz der Ratte Aufschluß über die vermutliche Variabilität der Nukleotidsequenz der betreffenden Region von Schweineinsulin im Vergleich mit der von Hurnaninsulin. Deshalb umfaßt das ss-Oligonukleotid eine Region, die außer dem angegebenen Austausch mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit keinen weiteren enthält.

1.2. Kopplung der getrennt optimierten Einheiten zum Human-Proinsulin-Expressionsvektor

Nach Rsal-Spaltung wird das kleinste Fragment von pBR322 isoliert und mit Mbol-Endonuklease weiterbehandelt. Das entstehende größte Spaltstück (480Bp) wird isoliert und in mehreren Zyklen mitT4-DNA-Polymerase und verschiedenen Nukleotiden inkubiert. Auf diese Weise ist es möglich, eine präzise Verkürzung bis zum Triplett Ala23GCT vorzunehmen. Ala23 ist die letzte Aminosäure der Signalsequenz von /3-Lactamase. Mit S1-Nuklease wird der freigelegte komplementäre Strang ebenfalls entfernt. Die Veränderungen am gegenüberliegenden Ende des Spaltstücks führen zur Verkürzung vom Nukleotid + 165zum Nukleotid+ 147.

Durch Spaltung mit Hindlll-Endonuklease am Ort + 31 kann dieser nicht interessante, veränderte Terminus enfernt werden, wobei gleichzeitig ein kohäsives Ende entsteht.

Das gesuchte Fragment wird präparativ getrennt und mit einer spezfischen Zwischensequenz (Abb. 6), die partiell doppelsträngig ist, die ein basengepaartes und ein kohäsives Ende aufweist sowie für die ersten drei Aminosäuren der B-Kette (PheValAsn), für einen Hpal-Ort und partiell für einen Pstl-Ort codiert, mittels T4-Ligase gekoppelt, anschließend mit dem großen Hindlll-Pstl-Fragment vermischt, erneut gekoppelt und schließlich transferiert.

Auf diese Weise entsteht ein bla-Signalsequenz-Vektor pBR322ivmHpal (Ap^-Tc⁺) bla~, der genau am Ende der ß-Lactamase-Signalsequenz in den N-Terminus der B-Kette von Human-Proinsulin übergeht (Abb.7). Außerdem enthält der Vektor einen einmaligen Hpal- bzw. Pstl-Ort, der einerseits den Anschluß an die Human-Proinsulinsequenz und andererseits die multivalente Verwendung des Vektors für andere eukaryontische Sequenzen gewährleistet.

Die getrennt optimierten Vektoren werden über den neu eingeführten Hpal-Ortam C-terminalen Ende der/3-Lactamase-Signalsequenz miteinander verbunden (Teil V, Abb. 8). Die Kopplung der DNS des Expressionsvektors pEVTyASblaHPivmEcoRiivmHpalbla" mit der DNS des HPPI-Hpal-Plasmids führt zu einem einzigen Produkt. Dieser HPI-Expressionsvektor codiert unter der Kontrolle des Hybrid-Promotors T7A3blaHP die Synthese eines Präproinsulins, das eine prokaryontischen Signalabschnitt enthält.

Die Signalsequenz bewirkt den Transport des Präproinsulins in den periplastmatischen Raum und wirk exakt in vivo abgespalten.

Das Produkt Human-Proinsulin wird durch tryptische Spaltung anschließend in biologisch aktives Insulin umgewandelt. Im nachfolgenden Beispiel wird eine weitere Konstruktion angegeben, die durch Einführung von Methioninresten zwischen der B- und Α-Kette eine chemische Spaltung des Proinsulins und damit eine Umwandlung in biologisch aktives Insulin ermöglichen

1.3. Weitere Modifizierungen am HPI-Expressionsvektor — Einführung von Methioninresten Einführung von Methionin am N-Terminus von Proinsulin

Diese Variante (Teil Vl) (Abb. 9) wird erforderlich, wenn die Signalsequenz von ß-Lactamase in vivo nicht exakt abgespalten wird oder aus anderen Gründen ein Transport von Human-Proinsulin in den periplasmatischen Raum nicht vorteilhaft ist. Zur Durchführung ist es notwendig, einen EcoRI-Ort unmittelbar nach dem Initiationscodon der /3-Lactamase einzuführen. Weiterhin wird eine Zwischensequenz synthetisiert, die für MetPheVal codiert, gleichzeitig das Leseraster einhält und den EcoRI-Ort rekonstruiert. Außerdem wird eine partielle Reparatur mit T4-DNS-Polymerase und dATP sowie ein Abbau mit S1-Nuklease vorgenommen. Das synthetisierte Produkt wird nicht in den periplasmatischen Raum transportiert und besteht aus MetArgMet-Human-Proinsulin, das durch Bromcyan-Spaltung in Proinsulin umgewandelt werden muß.

Als Alternative zu dieser Variante kann auch das eukaryontische Signal, d.h. die Präsequenz von Human-Präproinsulin, für den Transport in vivo und die exakte Abspaltung des Proinsulins genutzt werden.

Einführung von Methionin zwischen der B- und Α-Kette von Human-Insulin

Unter Umständen könnte es sich erweisen, daß die Umwandlung von Proinsulin in Insulin in vitro nicht mittryptischer Spaltung, sondern durch chemische Spaltung mit Bromcyan vorteilhafter ist.

Aus diesem Grund ist es notwendig, in die B- und Α-Kette C- bzw. N-terminal Methionin einzuführen (Teil VII) (Abb. 10). Die Aminosäuresequenzen im Übergang von B nach C bzw. C nach A der Insulinketten sind jedoch außerordentlich ungünstig, um die Codierung so abwandeln zu können, daß Tripletts für Methionin entstehen. Mit einem spezifischen Oligonukleotid, das partiell dem C-Terminus der B-Kette und partiell dem N-Terminus der Α-Kette entspricht, wird eine vollständige Deletion der Codierung für die C-Kette einschließlich der Arg-und Lys-Resteim Übergang von „B-C" und „C-A" erreicht. Außerdem werden zwei Methionin-Tripletts zwischen den B- und A-Ketten-Bereich im synthetischen Oligonukleotid geschaltet. Gegenüber den bisher erwähnten Konstruktionen handelt es sich hier aber um ein erheblich längeres Einstrang-Oligonukleötid (n = 30) mit der Codierung 3'TGTGGGTTCTGGTACTACCCGTAACACCTt. Bei der Durchführung dieser Variante ist zunächst von der Abwandlung der natürlichen Codierung für Human-Proinsulin ausgegangen worden. Bei Verwendung der natürlichen Codierung von Proinsulin des Schweins müßten zuvor die Nukleotidsequenzen des betreffenden Bereichs ermittelt und danach die Synthese des Oligonukleotids mit entsprechend veränderter Sequenz erfolgen.

Die Einführung einer Addition (MetMet) bei gleichzeitiger Deletion (C-Kette) (s. Abb. 10) mittels dieser in vitro-Mutagenese-Methode ist ebenfalls durchführbar. Für diesen neuen Weg der in-vitro-Mutagenese sind Schleifenbildung der hybridisierenden DNS-Stränge und in-vivo-Abbau der Einstrangbereiche in gleichzeitiger „Rettung" eines bestimmten Einstrangbereiches („MetMet") von entscheidender Bedeutung. Die Prüfung erfolgt auf Abwesenheit der Pstl-Orte in der Human-„Proinsulin"-Sequenz.

Abb. Ί : Konstruktion eines exakten Übergangs der bla-Signalsequenz in die Sequenz von Human-Proinsulin

natürlicher Übergang (Prä-ß-Lactamase)

XmaL /. Smal

Ir i

CiCG

D

• ·

23. .Ala

24. His

Pro

GIu

Thr

23. ♦ Ala

Bi Phe

B2 YaI

Iaaa

CAA

Asn

GIa

2)

5·

GCH

"S

CCH

GAA

ACN

GCH

T fp/π G

GTH

T AAi

CAA G

3)

51

GCT

CAG

CGA

GAA

ACG

GGT

TTT

GTG

AAG

GAA

artifizi eller

Übergang (Prä(bla)—»B-Kette)

01 ip;onukl eo t id

4)

Patl

5)

5'

TTG

TGCA

6)

5f

synthetisches

5' 31

7)

Hpal

Hpal

1) und 4) Annn,osauresequenzen der ß.-Lactamase uad des

ing

2) und 5) Godieruagamöglichkeitea

3) poteatieller Xmal- oder Smal-Restrüctionsort in der

Nähe des C-Terminus der Signalsequenz (bla)

— notwendige Basenaustauscae

6) potentieller Hpal-Reatriktionsort ia der Hähe des

S-Terminus der B-Kette von ffnmfln^TVninBiii ^n

— notwendiger Baaenaustauaca

7) aus 5) abgeleitetes, chemisah. zu synthetisierendes ds-Qligonukleotid

kohäsives Pstl—Ende (.notwendig aus gentechnischen

Gründen, um die Kopplung zu erleichtern)

_mm__mm Hpal-Ort dient als spätere Insert ions st eile für die —— Nukleotidsequenz von Human-Proinsulin

ι basengepaartes Ende, zur Kopplung an ein "terminal ver-I kürztea bla-Gen

Abb. 2 : Konstruktion des Fuman-Prolnsiii in-Bxpreaaionavektors Teil I - Klonterung von ds-cDSA

1) Reinigung van paly(A)⁺-KHA aus Human-Pankreas Coder aua Schweine- bzw. Hunde-Pankreas)

2) ds-cDHA-Synthese

3). Anwendung dea entwickelten Yerfahrena: zur Anreicherung langer da-cBHA-Moleküle und Klonierung im

Pstl-Qrt von pBR322 mittela der Eomopolymeren-Technik

4) Selektion und Charakterisierung des apezlflachen Wi,ons (u.U. Charakterisierung durch. Doppelspaltung mit Hhal und PvuIX C35. bsrai. 312. Hukleotidposition der Sequeoz für Human-Präproinsulin), wodurch, ein speziflaches ZTT Bp Fragment entsteht) Bedingung^ Codierung ab der 1. Aminosäure des Proinsulins

AlaLeo. GlnLeu

-13-12 277 Bp A15A16

GCGC,,CAGgIG

CiICG t

5) u.U. Änderung der Orientierung mit Hilfe des beschriebenen Rekl oni erung s ν erf ahr ens

korrekte Orientierung:

PruII-Spaltung: asymmetrisch, in der HPPI-Saquenz,

2067. Position im pBR322 Z Fragmente ca. I.400 Bp + ca. 3100 Bp Cfalsciie Orientierung: ca. 1600 + ca. 2900 Bp)

Abb. 3 : Konstruktion des Human-Proinsulin-Expresaionsvektors Teil .11 - Einführung, eines Hpal-Qrtes in die HPPI-Sequenz

1) Synthese des spezifischen "mutagenen" ss-Oligonukleatids:

3· AAA GAA TTG GTT 5'

(s. Abb. Λ )

2) Pvul-Spaltung, des Rekombinantenplaemida

(kein Pvul-Qrt im HPPI-Gen.) in Gegenwart von Äthidiumbromid —►Einatrangbrueh

5·CGAICG

EaoRI BmI HPPI 0. -626. -752..

3) partielle Entfernung, des 3 '-Stranges mit Exonukleaselll 4). Hybridisation mit dan. spezifischen Oligonukleotid

EcoRI PtuI HPPI

0.

5) Reparatur sy η these mit DÜA-Polymerasel oder T4-DHA-Polymerase sowie T4-Ligase

6) Transfer, Klonierung "n^ Reinigung mehrerer Pia ami de

7) präparative Hpal-Spaltung (der ivm-Hpal-Ort ist einmalig.) und Reinigung, der linearen Bgicrnnhinantenplq^gm"' fl-Moi filciile

8) Kopplung der linearen Moleküle (Ringachluß) mit Ligase (T4-), Transfer und Reklonierung

9) Charakterisierung einzelner Egal-Plasmide und Scchareia der Integrität der HPPI-Sequenz im übrigen Bereich mittels Restriktions— und Nukleotidsequenzanalyse

Abb. Ψ : Konstruktion dea Human-ProixLsulin-EzpreeaionavekLtora Teil III - Partielle C-Peptid-Deletionamutante

HPPI-Insertlon im. Plasmxd PBR322

bla P₈ti a)

Patl ^bla ivmBpal Patl Patl Patl PvuII b)

N>69

C-Peptld-codierea.de: Sequenz. CPstl-Orte) ^

LeuGln C5 S

5'

LeuGln G21C22

LeuGln\

C3oc;

CTG

1) Pstl-Spaltung des HPPI-Rekombinantenplasmida

2) Reinigung aller DHA-Fragmente ia. Läng enb er eich, znsischen 60 und 200 Bp (äußere Pstl-gragmente der spezi.fIschen 2PPI-Sequenz.).

3) Pstl-Spaltung von pBR322 und Behandlung der Spaltstücke mit alkalischer Phosphatase

4) Kopplung des vorbehandelten Vektors mit den gereinigten Pstl-Pragmenten aus. Schritt 2) durch 14-Ligase

5') Transfer und Klonierung

6) Charakterisierung der Pia amide einzelner Rekombinantenklone mittels ^al-Restriktionaendonuklease CB-Ketten-spezifisch) und ΡνΛΐΙΙ-Reatriktionsendonukleaae (A-Ketten-spezifisch sowie pBR322-0rt, 20β7. Position) zur Identifizierung und zur Bestimmung der Orientierung

Die gewünschte Deletionsmutante enthält noch 6 Aminosäuren im C-Peptid.

Abb. 5 : Konstruktion des Humanr-Proinsulin-Expreaaiaaavektora Teil IY - In—vitro-Mutagenese von Schweine— oder

zur Umwandlung i π

Ηπιπαιτϊπ pin ~\ A n—

Grundlage

Vergleich von Human— mit Schweineinaulin (AS-Austausch B3Q)

Mensch Thr ACC

Schwein AT» GCH Annahmet GCC

Rattel Ser T.CC Rattell " "

Vergleich der Hachbarregion

B2S Mensch. Ετόΐφ slThrArgArg

5 · CCCAAG Ä.CCCGCCGG Eattel t

Eattell T ff

Met S er

Schwein

mutagenes ss-Oligo- _{t ΦΦΓΤΓΐΓΐβΓ}

T T C

(nur die Änderungen angegeben)

Cdie angenommene Sequenz enthält einen zusätzlichen HaeilI-Ort)

1) notwendige Schritte wie zur Einführung dea Hpal-Ortes (Teil II

2) Syntheee des genannten, spezifischen ^wmutagenen" Qligonnkleotids y _ITGTGGGG ^t

3) Nachweis der Ab-säesenneit des zusätzlichen HaeJLLL-Ort es im. ivmHiman—Pl-Tek±or odear

Bestimmung der Hukleotidaeq.uens im entsprechenden Bereich oder Bestimmung der Aminosäure am. C—Terminus der B—Kette

Abb. 6: Konstruktion des bla-Sigaal3eq.ueaz-Vek.tor3

Variante "Human.-Proinaulin-Verbindung3sequenz"/HpaI-0rt

Spezifische

1) Chemische Synthese der partiell doppelst rängigen Verbindungssequenz

5' TTT GTT AAG TGGA 3' AAA GAA TTG Phe VaI Asn B1 B2 B3

Hp al

Patl

2) Kopplung des Hindlll-Ala23-Fragments . ) mit dem

synthetischen ds-Oligonukleotid durch T4-Ligaae

HindlII 23 BI ^PstI

^^'^!!llSgSF^ (315 Bp)

"übergang

3) Spaltung von pBR322 mittels HindlH- und Pstl-Endonuklease

4) Reinigung des großen Fragments (3578 Bp)

5) Kopplung der Produkte der Schritte 2) und 4) mittels 24-Ligase

6) Transfer und Klonierung: die Mehrzahl der Recombinant en-Plaamide enthält die gewünschte Kombination: ^_p ^sQj_c ^r

7) Charakteriaierung der Plasmide durch Längenbestimmung und Reatriktionaanalyse

pBR322ivmHpaI( Ap^-Tc⁺ ).bla"

AlaPheHpalPstl HindlII 3609. 31.

315 Δ Μα

3578

Weiterführende Variante: Klonierung anderer ds-cDIIA im Hpal-

vektor

a). Spaltung von pBR322ivmHpaIbla~ mit Hpal-Endonuklease

b) exakter terminaler Abbau mit T4-DNA-Polymerase und dCTP bis zur 2. Base des Ala23-Tripletts (bei gleichzeitiger Zerstörung des Pstl-Ortea), anschließend S1-Huklease-Behandlung

Abb. 7: Übersicht der Strukturen des Expressionsvektors la Kombination mit dem Slgnalsequenz-Yektor .

DSYT7A3blaHPivm£coRI (4336 Bp) (Ecofil) Hhal O. -104.

Rs al

(ivmpblai) -.184.

ivmEcoRI Raal PatI..(EcoRI -215. -51,5.-752. 0.

bla. ,'"-10"

SD ATQ Signal

ß-Lactamsse

aase I 286 J

104

55

31 5'37

3609 Bp

pE7T7A3blaHPlvmEcoRllvmHDaIbla" (3872 Bp)

Rs al ivmEcoRI (ivmpblai) -184. -215.

Hpal Psti (BcoRI) 0.

bla SD ATG "-10"

AlapheVal

CGlkAACAA

31

68

5.

3609

159

I ΛΛ VS ιpEYT7A3bIaHPivmEcoRIivmSmalbla⁴' (4336 Bp)

Rs al ivmEcoRI (Ivmpblal) -184. -215.

ivmSmal

ivmXmal -282L (EcoRI) 0

Rsal Pstl Rsal Rsal} RsaJ

3609.2282. 165.· -515. -752. I I '-184

bla-Kontrolls equeiiz

YS = Yerbindiingssequenz

3 codierende Sequenz für Prä(1-23)ß-Lactamase 3] übrige ρBR322-Sequenz T7A3-Kontrollsequenz

a νψ / ^

Abb.

,. Konstruktion des Human-Proinsulin-Expressionavektors Tell Y - Kopplung dee Expressions- und dea HPPI-Yektore

1) Doppelspaltung des Expressionsvektors (s* Abb. T)

pEYT7A3blaHPivmEcoHIivmHpaIbla~ mit Sail- und Epal-Restriid;ionsendanuld.ease

(EcoHI)

ivm. EcoEl

ivm _YS Pail --752.

Sail

652.

-3709.

2) Reinigung des kleinen Fragments (910 Bp)

3) Sall-Hpal-Dopp el spaltung, des pBR322-HPPIiviaHpaX-Yeictors

4) Reinigung des größeren Fragments (ca. 33QQ Bp);

5), Kopplung der Spaltstücke mittels I^-Ligase; ricntungsapezifisx SaIX Epal Hp_al Sail

tet

tet

G) Transfer, Klonierung und Gnaraktexisierung der Rekombinanten:

Tc^r, ca. 4200 Bp

Ergebnis pOT^A3^1aS

Abb. S : Konstruktion dee Euman-Proinaulin-Expressionsvektora Teil VI - Einführung voa Methionin am N-Terminus von Human-^roinsulin (direkte Synthese)

1) Verwendung dea EPI-Expressionsvektors Cs. Teil V) bzw. aea ρ EVT7A3blaHPivmEcoRI-Vektors

Z) Spaltung de3 Plasmlds am. ivmEcoRI-Qrt mittels EcoRI-Endonukleaae

ß-Lactamase (Signal)

5 · AIGAGAATJGAA ivniEcoHI

MetArglleGln 12 3 4

3» _

-TACTGTTAA

3) partielle Reparatur mit T4-DHA—Polymeraae und dATi sowie anschließende S1-Huklease-Behandlung

5'

3'

riTGAGAA

-2ACTCIT

MetArgli

4) Synthese eines spezifischen ds-Qligpnukleotida zur Rekonstruktion eines Met-Cadons und des Hpal-Qrtes sowie der B1B2-Reate

5^f 3¹

EGTTTGTT A.GAAACAA

atPneVal Hpal

5) Behandlung, des da-Oligonukleotids mit alkalischer Phosphatase zur Verhinderung der Selbstkopplung

6) Kopplung der Produkte aus Schritt 3) und Schritt 5) mittels T4-Ligase

7) Spaltung des Gemische mit ^al-Endonuklease

(EcoRI) (ivm ^ 0. EcoRI)

EcoRI)

Hd al

bla-Signa

HPI-Sequenz

8) präparative Reinigung des großen'Pragments, Ringschluß mit T4-Ligase, Transfer, Klonierung, Identifizierung anhand dea rekonstruierten Hpal-Ortes

Abb. 10: Konstruktion des Human.-ProixLBulia1-Expre3sion3Yek.tor3 Teil VTI - Einführung von Methioninresten zwischen der B- und der Α-Kette von Eumaninsulin

1) Spaltung des HPI-Expressioaavektors Cs. Teil Y), mittels Hpal-Restriktianaendonuki eaae in Gegenwart von Äthidiumbromid —^fiina trangbruch

2) partieller Abbau des 3^t'-Strangea mit Exonukleaaelll

i-vm

Hpal

Prä B ₁ C A

3) Synthese eines spezifischen. aa-011 ganukT eotids» daa 3^Γ" l 'til till ΑC

y p

partiell zur B-Codierung, 5'-terminal partiell zur Α-Codierung zentral zu einer Mivfchi nni npo^i ATnng komplementär ist:

B30 A1 ThrProLy aThr/M&tMet/Gly Il eYalGlu

5¹ ACACCCAAGACC GGCATTGTGGAA

3' TGTGGGIT.CT.GG/TACTAC/CCGTAACACCTT. (30 Hukleotide)

4) Hybridisation des spezifischen Oligonukleotida mit dem freigelegten, komplementären Einstrangbereich, des Yektora

grbridiaationsatruktur (u.a.)

Schleifenbildung ^ji-vivo-Reparatur )

^v _x aa-Oligonukleotid ' in-vitro-Reparatur ^

5) in-vitro-Eeparatur mit T^MA-Eolymerase und T4-Ligase

6) Transfer, Klonierung, gemeinsame Reinigung mehrerer Plasmide und Selektion von. Plasmiden, die in. ihrer Größe einer Deletioj

. von. 39 Bp (Abwesenheit der inneren Patl-Orte> entsprechen

7) Charakterisierung einzelner Plasmide und Nachweis der Integrität der B- und A-Ketten—Codierung

Claims (6)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Biosynthese von Human-Präproinsulin, Human-Proinsulin oder Human-Proinsulin-Derivaten unter der Kontrolle einer prokaryontischen Kontrollsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Längen-heterogene doppelsträngige, komplementäre Desoxyribonukleinsäure (ds-cDNS), die durch Umkehrtranskription von polyA⁺-RNS aus Pankreas des Menschen, des Schweins, des Hundes oder anderer Spezies, deren Aminosäuresequenzen der A- und B-Kette von Insulin nur wenige Austausche, vorzugsweise nur einen Austausch, im Vergleich mit der Aminosäuresequenz der A- und B-Kette des Humanismus aufweisen, mit einem Vektor durch Synthese homopolymerer Einstrangenden (terminale Transferase-Reaktion) koppelt, die Hybridmoleküle in einen Wirt transferiert, die klonierten Insulin-DNS-Sequenzen durch invitro-Mutagenese in DNS-Sequenzen überführt, die sowohl mindestens für die A- und B-Kette von Humaninsulin codieren als auch einen exakten Übergang von dem als prokaryontische Kontrollsequenz verwendeten Hybrid-Promotor in die codierende Sequenz für die B-Kette, die dem N-Terminus von Proinsulin entspricht, besitzen, die Expressionsstruktur gegebenenfalls weiter optimiert, mit einem replikationsfähigen Vektor verbindet, in einem Wirt transferiert, den transformierten Wirt in eine für sein Wachstum geeignetes Medium gibt und das entstandene Polypeptid nach in-vivo-Abspaltung der prokaryontischen Signalsequenz oder nach in-vitro-Spaltung mit Bromcyan isoliert.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß man an die ds-cDNS homopolymere Einstrangenden mit durchschnittlichen Längen von 30 bis 60 Nukleotiden enzymatisch anhängt, diese Moleküle mit einem linearen Plasmidvektor, der nur kurze homopolymere Einstrangenden mit einer durchschnittlichen Länge von 8 bis 16 Nukleotiden besitzt, über die Enden aneinander lagert und in kompetente Wirte, vorzugsweise in mit CaCI₂-behandelte E.coli-Bakterien, transferiert.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man durch in-vitro-Mutagenese einen einmaligen Hpal-Restriktionsortim DNS-Bereich der 2. und 3. Aminosäure der B-Kette eingeführt, vorzugsweise unter Verwendung des spezifischen Oligonukleotrids 3ΆΑΑ CAA TTG GTT 5'.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die prokaryontische Signalsequenz, die dem Präabschnitt der /3-Lactamase entspricht, dem Human-Proinsulin unmittelbar vorgeschaltet wird, indem die Codierung der/3-Lactamase vom C-terminalen Bereich aus durch enzymatische terminale Kürzungsverfahren so verkürzt wird, daß nur noch die Codierung für den Präabschnitt (1.-23. Aminosäure der /3-Lactamasse) übrig bleibt.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß ein spezifisches doppelsträngiges Oligonukleotid mit der Sequenz

   5'TTT GTT AAC TGSA '

   3'AAA CAA TTG

   chemisch synthetisiert wird, das für die ersten drei N-terminalen Aminosäuren der B-Kette von Humaninsulin codiert, gleichzeitig einen Hpal-Ort enthält und als Übergangsstück zwischen die codierende Sequenz für den Präabschnitt der /3-Lactamase auf der einen Seite und die cordierende Sequenz für die Humaninsulin-B-Kette, beginnend an der in-vitromutagenisierten Hpal-Position, geschaltet wird.
6. 6. Verfahren nach Punkt 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß das C-Peptid durch in-vitro-Mutagenese auf 4-8 Aminosäuren verkleinert wird, indem die DNS-Fragmente zwischen den Pstl-Orten, die in der codierenden Sequenz für Proinsulin vorliegen, entfernt werden.