EP1068237A1 - T-zellrezeptor-expressionskassette - Google Patents

T-zellrezeptor-expressionskassette

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Publication number
EP1068237A1
EP1068237A1 EP99917915A EP99917915A EP1068237A1 EP 1068237 A1 EP1068237 A1 EP 1068237A1 EP 99917915 A EP99917915 A EP 99917915A EP 99917915 A EP99917915 A EP 99917915A EP 1068237 A1 EP1068237 A1 EP 1068237A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
region
cell
expression
regions
tcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99917915A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dolores Schendel
Petra Jantzer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Original Assignee
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH filed Critical Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Publication of EP1068237A1 publication Critical patent/EP1068237A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex

Definitions

  • the invention relates to a method for the expression of T-cell receptors and "therefor suitable vectors. Further disclosed with the vectors transfected cells which are capable of respectively desired to express T-cell receptors.
  • T lymphocytes are responsible for the cellular immune response.
  • Diseased body cells or tumor cells are identified by the so-called T cell receptor (TCR), which binds an antigen specific for the diseased cell in the form of short peptide fragments. These peptide fragments are presented by MHC molecules on the cell surface.
  • TCR T cell receptor
  • T cell receptors consist of two different polypeptide subunits, usually the so-called T cell receptor ⁇ or ß chains, which are connected to each other by a disulfide bridge.
  • the a and ß chains are composed of variable and constant regions.
  • the variable regions of the ⁇ chain include V and J gene segments, while the variable regions of the ⁇ chain include V, D and J gene segments.
  • the chromosomal TCR ⁇ chain gene consists of approx. 50 to 60 variable segments, each of which contains an exon for a V ⁇ gene segment, which is preceded by another exon, which codes for a leather sequence that imports the protein into the endoplasmic reticulum and the Allows transport to the cell surface.
  • a group of 61 J segments is located a considerable distance from the V ⁇ segments. The J segments are in turn followed by a single C ⁇ segment for the constant range, the - 2 - again contains separate exons for the constant region and the hinge region and one exon for the transmembrane and cytoplasmic regions.
  • the chromosomal TCRß chain locus contains a group of approx. 65 Vß gene segments, which are at a distance from two separate clusters, each containing a single Dß segment and 6 or 7 Jß segments and a single Cß segment.
  • Each constant segment of the ß chain has separate exons for the constant region, the hinge, the transmembrane and the cytoplasmic region.
  • a V ⁇ gene segment comes next to a J ⁇ gene segment. This creates a functional exon.
  • the mRNA is formed by transcription and splicing of the VJ ⁇ exon to the constant region, which is translated into the TCR ⁇ chain.
  • the rearrangement of the V ⁇ , Dß and Jß gene segments coding for the variable domain of the ⁇ chain creates a functional exon which is transcribed and added to Cß by splicing.
  • the resulting mRNA is translated into the TCRß chain.
  • the a and ß chains combine to form the a: ß TCR heterodimer.
  • the hypervariable region of the TCR which is responsible for the specificity of antigen recognition and which lies in the region of the linking of V, (D) and J gene segments is referred to as CDR3.
  • T cell receptors The limited availability of native T cells frequently represents a considerable restriction for immunological studies of the T cell receptors expressed by these cells on a functional and molecular level.
  • the complex structure of the T cell receptor described above it can be composed of two genes, which in turn consist of one Numerous segments are composed, complete T cell receptors in foreign cells cannot easily be produced recombinantly.
  • the object on which the present invention is based was therefore to provide a new system for the recombinant expression of T cell receptors which allows the expression of defined MHC-restricted T cell receptors and thus their investigation at a functional and molecular level.
  • an expression unit which contains expression cassettes for TCR ⁇ or TCR ⁇ chains.
  • These expression cassettes each contain at least the 3 'side section of the constant portions of the TCR ⁇ or ⁇ chain genes, with artificially inserted restriction sites, in particular multiple cloning sites with several restriction sites, being present in the 5' area of these sections, preferably at least one of the sites is a singular interface. If there are multiple interfaces, the most 3'-sided interface is of particular importance, since the 5'-side interfaces are omitted when the V-gene is cloned. By exploiting the degeneration of the genetic code, the introduction of these interfaces does not result in an amino acid exchange in the TCR chains.
  • variable TCR domains must be cloned before the constant domains already contained in the base vector. If required for a specific V gene segment, the artificially inserted restriction sites can be inactivated using restriction endonucleases of partially identical recognition sequences when cloning the variable portion.
  • the expression vectors according to the invention enable the simple expression of TCR sequences, in particular human TCR sequences, in eukaryotic cells. In particular, three advantages are achieved: - 4 -
  • the expression cassettes can essentially be used for any TCR sequences and are therefore independent of the rearranged V region genes.
  • the artificial restriction sites for cloning the V regions are therefore preferably in the 5 'region of the C regions.
  • restriction sites inserted by mutagenesis result in neither a reading frame shift nor an amino acid exchange in the finished polypeptide. It is further preferred that there are no identical endogenous cleavage sites within the corresponding fragments, which results in a cloning
  • a first aspect of the present invention relates to a base vector for producing a TCR expression vector which has an expression control sequence in operative linkage with a polycistronic, preferably bicistronic, expression unit, comprising:
  • the base vector can be a prokaryotic or a eukaryotic vector. It is preferably in eukaryotic cells, in particular in - 5 -
  • Mammalian cells such as human propagable vector. Examples of eukaryotic vectors are described in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition (1998), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chapter 16, and Winnacker, Genes and Clones, "An Introduction to Gene Technology” (1985) , VCH publishing company, especially in chapters 5, 8 and 10.
  • the base vector can be a chromosomal or episomal vector.
  • the vector is particularly preferably an episomally replicable vector, in particular a plasmid.
  • the base vector according to the invention contains further sequence elements customary for expression vectors, e.g. one or more selection marker genes, such as antibiotic resistance genes, one or more origins of replication and the expression control sequence required for transcription of the expression cassette.
  • This expression control sequence can be a prokaryotic or eukaryotic expression control sequence.
  • This expression control sequence contains a promoter and optionally transcription regulation and / or activation sequences such as enhancers.
  • the polycistronic expression unit according to the invention contains two nucleotide sequences, one of which codes for at least part of the C region of a TCR ⁇ chain and the second codes for at least part of the C region of a TCR ⁇ chain.
  • the C region is preferably a human C ⁇ r or Cß region.
  • These nucleotide sequences advantageously contain the complete 3 ′ region of the respective C regions. However, the presence of a complete 5 'region is not absolutely necessary since, as explained below, it can be cloned into the base vector together with the respective V region at a later point in time.
  • At least one restriction site is located in the 5 'region of the nucleotide sequences coding for the C regions. This - 6 -
  • Restriction interfaces are preferably different for the TCR ⁇ chain and for the TCR ⁇ chain. It is particularly preferred that the restriction sites are singular, i.e. restriction sites that occur only once in the entire vector. The introduction of these restriction sites may result in a mutation in the nucleotide sequence coding for the C region. However, this mutation is preferably a "silent" mutation, i.e. a mutation that does not result in an amino acid exchange in the C region. Examples of suitable restriction cleavage sites that can be inserted into the 5 ′ region of the nucleotide sequence coding for the C region of the TCR ⁇ chain are BamHI and / or Xmal cleavage sites.
  • restriction sites can easily be introduced by mutations in codons 5 and 6 of exon 1 of the C region of the TCR ⁇ chain (see e.g. Fig. 6).
  • the cassette interface is particularly preferably a BamHI site in codon 6 of the C ⁇ gene.
  • restriction sites for the C region of the TCR ⁇ chain are Spei and / or Sall sites which are introduced by mutations in codons 28 and 29 of the nucleotide sequence coding for the C ⁇ region (cf. FIG. 7).
  • the cassette interface is particularly preferably a Spel site in codon 29 of the Cß gene.
  • Restriction sites are particularly preferably introduced into a region which codes for the first fifty amino acids of the respective C region of the TCR chain gene.
  • the TCR ⁇ and TCR ⁇ chain genes of human origin the sequences of which are described by Yoshikai et al. (Nature 316 (1985), 837-840) and Toyonaga et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 8624-8628).
  • the expression unit of the base vector according to the invention preferably contains a sequence which allows a "capping" independent translation of the polycistronic mRNA molecule resulting from transcription of the expression unit.
  • a sequence which allows a "capping" independent translation of the polycistronic mRNA molecule resulting from transcription of the expression unit is an IRES sequence as used in a variety of different ways - 7 -
  • Organisms for example viruses.
  • IRES sequences can be found in the Picornaviridae, e.g. B. cardioviruses such as encephalomyocarditis virus, enteroviruses such as poliovirus, rhinoviruses such as human rhinovirus, hepatoviruses such as human hepatitis A virus (Fields et. Al., Virology, 3rd Edition (1996), Lipincott-Raven Publishers, Philadelphia), in Flaviridae , e.g. Pestiviruses such as Bovine Viral Diarrhea Virus (Vassiler et al., J. Virol.
  • Retroviruses such as HTLV-1 (Attal et al., FEBS Lett. 392 (1996), 220-224) or Moloney-Murine Leukemia Virus (Vagner et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 20376-20383), Leishmania RNA Virus 1 (Maga et al., Mol. Cell. Biol. 15 (1995), 4884-4889), or in humans, e.g. in the BiP gene (Yang and Sarnow, Nucleic Acids Res.
  • the expression unit contains a ribosomal translation initiation site directly on the 5 'side of each TCR chain sequence, e.g. the so-called Kozak sequence.
  • the expression of the TCR ⁇ chain and the TCR ⁇ chain is preferred.
  • the expression of the TCR ⁇ chain can also be limited in comparison to the expression of the TCR ⁇ chain.
  • the expression cassette according to the invention can be constructed in the 5'-3 'direction as follows: TCR ⁇ chain gene; IRES sequence; TCR ⁇ chain gene.
  • the ribosomal initiation sequence for the TCR ⁇ chain gene can be modified so that the translation initiation is somewhat weaker than for the TCR ⁇ chain gene.
  • Another aspect of the present invention relates to a TCR expression vector that an expression control sequence in operative - 8th -
  • nucleotide sequence coding for a complete TCR ⁇ chain (a) a nucleotide sequence coding for a complete TCR ⁇ chain and (b) a nucleotide sequence coding for a complete TCR ⁇ chain, the nucleotide sequences coding for the V regions and C regions of the TCR chains via restriction sites in the 5 'region the C regions are linked.
  • the nucleotide sequences coding for the TCR chains preferably have at least one base exchange in the region of the restriction cleavage sites compared to the natural TCR sequence, the base exchanges being selected in the context of the degeneration of the genetic code, i.e. lead to a "silent mutation".
  • the TCR expression vector according to the invention can in principle be produced by two different methods, namely by first producing a base vector and inserting therein the nucleotide sequences coding for a desired V region, or by dividing the nucleotide sequences coding for the desired V regions in two separate vectors combined with the corresponding C regions and then forms the expression vector from these two vectors.
  • Another aspect of the present invention is thus a method for producing a TCR expression vector comprising the steps:
  • Yet another aspect of the present invention is a cell transformed with a base vector or with a TCR expression vector as before.
  • the cell can be a prokaryotic cell, e.g. be a gram-negative bacterial cell, especially E. coli.
  • a cell used for TCR expression is preferably a eukaryotic cell, a mammalian cell, in particular a human cell. Examples of methods for introducing the vectors according to the invention into such cells can be found in Sambrook et al., Supra, and Winnacker, supra.
  • a recipient cell for the transformation which is used to express one or more accessory molecules, i.e. capable of carrying out the T cell function of necessary molecules.
  • accessory molecules are the cell surface markers
  • the recipient cell is therefore a human T cell.
  • suitable human T cells are the T cell clones and lines such as 234 (Prof.
  • T cells that express a TCR with the desired specificity is to insert a TCR expression vector of the invention into an animal's germline and to recover the T cells from the resulting transgenic animal or progeny thereof.
  • Transgenic mice are preferably produced. It is further preferred that the transgenic mice, in addition to the TCR, also express accessory molecules such as the human CD8 molecule and / or the human HLA-A * 0201 molecule.
  • the invention thus also relates to a method for expressing a TCR, in which a suitable host cell is transformed with a TCR expression vector and the cell is cultivated under conditions which lead to TCR expression, preferably to expression as a membrane-bound TCR heterodimer.
  • the reagent kit for producing a TCR expression vector.
  • the reagent kit contains a base vector as previously defined and primers for the amplification of V regions of the TCR ⁇ and TCRß chain genes.
  • the reagent kit contains two separate vectors, which contain elements of the expression unit separated from the base vector, and suitable primers for the amplification of V regions.
  • the reagent kit can also contain a recipient cell suitable for TCR expression, in particular a human T cell, as explained above. - 1 1 -
  • Fig. 1 The production of the TCR ⁇ expression cassette. A TCR ⁇ -specific cDNA was generated using the primers
  • 5'C ⁇ EXPs and 3'C ⁇ EXP produced an amplificate of the TCR ⁇ -C region, which ranged from the third codon to the stop codon.
  • the oligonucleotide 5'C ⁇ EXPs enabled recognition sequences for the Xmal and Bam HI and the oligonucleotide 3'C ⁇ EXP an interface for the Sal I-
  • SV40pA polyandenylation signal from SV40).
  • Fig. 2 Cloning of the V ⁇ 20 domain of the T cell clone 26 / B into the
  • RNA of the RCC-specific clone 26 / B was reverse-transcribed in a TCR-specific manner and the resulting cDNA was amplified using the oligonucleotides TCRAV20EXP and 5'C ⁇ EXPas.
  • the amplificate comprised the entire V ⁇ 20 region (starting at the start codon) and the first nine codons of the C ⁇ region.
  • TCRAV20EXP an Eco Rl interface and the optimal Kozak sequence at the 5'-end and with the oligonucleotide 5'-C ⁇ EXPas a Bam HI interface at the 3'- - 12 -
  • the DNA molecules were cloned into the vector pBSCIISK + via the Eco R1 and Bam HI interfaces. After sequencing, an error-free subclone was selected and the V ⁇ 20 domain via Eco Rl and Bam Hl in the TCR ⁇
  • Fig. 3 Production of the TCRß expression cassette. From a TCRß-specific cDNA using the primers 5'CßEXPs and 3'CßEXP an amplificate of the TCRß-C region was produced, which ranged from the 26th codon to the stop codon.
  • the oligonucleotide 5'CßEXPs were used to add recognition sequences for Sal I and Spe I and the oligonucleotide 3'CßEXP an interface for the Hind III restriction endonuclease to the 5 'and 3' ends of the amplified DNA molecules.
  • the DNA strands were cloned into pBSCIISK + via the Sal I and Hind III interfaces. After the sequencing, an error-free subclone was selected and the C ⁇ region was cloned into the expression vector pSBC I via the Sal I and Hind III interfaces.
  • the vector pSBC I contains two unique restriction sites Ase I and Not I, which allow the fusion with the vector pSBC II, and also an IRES (internal ribosomal entry site) element.
  • RNA of the RCC-specific clone RNA of the RCC-specific clone
  • Fig. 5 Fusion of the vectors pSBC I and pSBC II to the bicistronic
  • the vector pSBC I which contained the TCR ⁇ chain of clone 26 / B
  • the vector pSBCII which contained the TCR ⁇ chain of clone 26 / B
  • the two halves, each coding for a TCR chain, were then ligated again via the same interfaces, so that both TCR chains of clone 26 / B were coded on the fused expression vector pSBCI / II.
  • Fig. 6 TCR ⁇ expression cassette.
  • the cDNA sequence is listed centrally in the 5 'region of the C ⁇ region, the triplets corresponding to the actual reading frame. The triplets in bold correspond to codons 5 and 6 in exon 1.
  • the primer 5'C ⁇ EXPs (shown above the cDNA sequence) leads to an Xma I in the 5 'region of the C ⁇ amplificate and, using the degenerate code at position 3 in the codon
  • the nucleotide exchanges which only produce silent mutations in these two codons, and the corresponding amino acids (proline and aspartic acid) are listed at the bottom of the picture.
  • the 3 'regions of the V ⁇ amplificates are modified identically by the 5'C ⁇ EXPas primers (shown under the cDNA sequence) and a Bam HI recognition sequence is thus created again.
  • a hypothetical primer is shown, which carries a Bgl II recognition sequence and can inactivate the Bam HI site when the V ⁇ segment is cloned, as described in the text.
  • Fig. 7 TCRß expression cassette.
  • the cDNA sequence is central in the
  • Triplets correspond to codons 28 and 29 in exon 1.
  • the primer 5'CßEXPs (shown above the cDNA sequence) introduces a Sal I into the 5 'region of the Cß amplificate and, using the degenerate code at position 3 in codon 29 (G to A transition), introduces a Spe I interface ( shown at the top).
  • the nucleotide exchanges, which only cause silent mutations in codons 28 and 29, and the corresponding amino acids (threonine and aspartic acid) are listed at the bottom of the picture.
  • the 3 'regions of the V ⁇ amplificates are generated by the 5'CßEXPas primers
  • Oligonucleotides 5'CßEXPs and 5'CßEXPas are identical in Cß1 and Cß2.
  • Fig. 8 Model of the "synthetic" T cell.
  • the cell line Jurkat 9-5 (middle) carries the gene for the ⁇ -galactosidase (lacZ), which is under the control of the IL-2 promoter, stably integrated into the genome.
  • lacZ ⁇ -galactosidase
  • the successful transfection of this cell with the pSBC l / ll fusion vector leads to the expression of the TCR chains encoded by it on the cell surface.
  • the interaction of the expressed TCR with its specific ligand leads to the activation of the IL-2 promoter and thus to the intracellular production of ⁇ -galactosidase.
  • the ⁇ -galactosidase is released and can convert a substrate, which leads to the coloration of the reaction solution.
  • SEQ ID NO. 1 to 8 oligonucleotides for the TCR expression cassettes
  • the TCR of the RCC-specific cytotoxic clone 26 / B was chosen to produce a TCR expression system.
  • the ⁇ chain gene of this TCR consists of the variable region V ⁇ 20 and the constant region C ⁇ .
  • the TCRß chain gene consists of the variable region Vß22 and the constant region Cß. The sequences of these and all other known V gene segments are described in Arden et al. (Immunogenetics 42 (1995), 455-500). - 16 -
  • the TCR chains were cloned in two stages: In the first step, the C regions were cloned ( Figures 1 and 3), i.e. the actual cassettes are completed and in a second step the corresponding V regions are inserted into the expression cassettes ( Figures 2 and 4).
  • PSBCI and pSBCII were used as base vectors. These are so-called low copy plasmids, so that all fragments in pBSC II SK + (Stratagene, catalog number 21 22 05) have been cloned in between. This vector replicated in bacteria to a high copy number and also proved to be particularly compatible with the pBSC vectors with regard to the restriction sites.
  • the fragments in pBSCMSK - were sequenced and the DNA from error-free subclones was recloned into the expression vectors.
  • primers were used which inserted various modifications into the corresponding DNA regions.
  • the 5 'primers for the amplification of the C region (5'C ⁇ EXPs and 5'CßEXPs see Fig. 9 and SEQ ID NO. 3 and 7) each carried two recognition sequences for restriction endonucleases, the first of these recognition sequences being freely selectable and used for this purpose to clone the cassette into the expression vector.
  • the second recognition sequence was the actual cassette interface and allowed later cloning of the V region (see below).
  • the oligonucleotides 3'C ⁇ EXP and 3'CßEXP were used as 3 'primers.
  • a PCR protocol: predaturation 94 ° C, 2 min, 1 cycle; denaturation 94 ° C, 30 sec, 30 cycles; annealing 63 ° C, 30 sec, 30 cycles; extension 72 ° C, 1 min, 30 cycles and Final polymerization 72 ° C, 10 min, 1 cycle
  • the coding section of the respective C gene segment including the stop codon was amplified.
  • an interface for cloning was inserted (Fig. 1 and 3). - 17 -
  • the primers TCRAV20EXP and TCRBV22EXP (Fig. 9 and SEQ ID NO. 1 and 5) specific for the V gene segment were used. These primers bind to the V gene sequence in the area of the start codon and simultaneously code for the optimal Kozak sequence and a restriction site.
  • the 3 'primers, 5'C ⁇ EXPas and 5'CßEXPas (Fig. 9, SEQ ID NO. 2 and 6) hybridize in the 5' area of the respective C gene segment and introduced mutations according to the cassette interfaces used in each case (Fig. 2 and 4).
  • the bicistronic expression unit was produced by fusing the two vectors pSBCI and pSBCII using two singular restriction sites (Ase I and Not I, Fig. 5).
  • the two TCR chains flank an IRES element, which leads to "capping" -related translation initiation and thus enables efficient protein synthesis of both TCR chains.
  • the capping-dependent translation of the gene located on the 5 'side of the IRES element functions somewhat more efficiently than that of the gene on the 3' side, the TCR ⁇ chain was cloned in pSBC I and the TCR ⁇ chain in pSBC II. In this way, in order to prevent the formation of TCR ⁇ homodimers, a limitation of the ⁇ chain expression compared to the ß chain expression was achieved.
  • Sfil interfaces were built in before the TCRß and after the TCR ⁇ chain to allow the two chains to be recloned with the IRES element in between.
  • the same Sfil interface is also located in the multiple cloning site of the vector pHEBNA-1 (Mautner et al., Oncogene 12 (1996), 1299-1307 and Mucke et al., Gene Ther. 4 (1997), - 18 -
  • Fig. 6 and 7 schematically show the structure and functioning of the TCR ⁇ and ß expression cassettes.
  • the 5 'region of the respective C gene segments is shown, in which the V region and C region amplificates overlap.
  • the restriction sites listed were inserted by mutations in the oligonucleotides used.
  • the first interface was used to clone the C gene segment into the expression vectors (TCR ⁇ : Xmal, TCRß: Sall).
  • the V gene segments were cloned in via the respective second interface (TCR ⁇ : Bam HI, TCR ⁇ : Spel). Since the first cleavage sites were removed by cloning the V-gene segments, no consideration had to be given to reading frame shifts and / or amino acid changes when selecting them.
  • restriction sites in the expression cassette can be inactivated if necessary, which is necessary if a V ⁇ domain is an endogenous BamHI - 19 - or a Vß domain has an endogenous Spei interface.
  • any restriction sites can be inserted through the 3 'primers used for the amplification of the V region, whose core sequences, ie the central four bases of the recognition sequence, are identical to the corresponding sequences of the BamHI or Spei interface (Table 1).
  • restriction endonucleases listed in the second column of Table 1 produce cohesive ends which are identical to the restriction sites of the expression cassette part i indicated in the first column.
  • the cassettes for the starting enzymes can be inactivated by using these enzymes, but can be cut again by the enzymes listed in the third column.
  • the enzymes listed in the brackets represent isoschizomers.
  • Fig. 6 and 7 show Bgl II for the TCR ⁇ chain and Xbal for the TCRß chain. It is important that the enzymes used cut asymmetrically. The inactivation is based on the fact that the two "wrong" nucleotides have no effect on the finished polypeptide chains. For both TCR chains, the first nucleotide does not result in an amino acid exchange, since all four possible bases at these positions code for identical amino acids (Figs. 6 and 7). Due to the asymmetrical cut of the restriction - 20 - endonucleases, the second wrong nucleotide is inserted into the opposite strand and therefore has no effect on the translated mRNA.
  • the cloned TCR is preferably expressed in a human T cell.
  • the recipient cell should have a large proliferation potential in order to have a sufficient number of cells available for the transfection experiments in a relatively short time, but also in order to be able to greatly expand successfully transfected clones, even after a large loss of cell number due to the transfection as such.
  • the recipient cell should perform a clear and measurable biological function after specific stimulation via the transfected TCR.
  • T cell clones and T cell lines are briefly described below, which are suitable in principle as recipient cells due to their growth and other properties.
  • T-cell con 234 An example of a suitable recipient cell is the human T-cell con 234.
  • This clone has some special properties: a high growth potential, cytotoxicity and an endogenous receptor that does not recognize any determinant on the RCC-26 tumor cells. This non-recognition is particularly important since this clone is not a transformed cell and therefore requires regular restimulation via its endogenous TCR. The greatest advantage lies in the cytotoxicity of the cell, which is clear and easy to measure as proof of the specific T cell activation. - 21 -
  • Established human cell lines come into consideration as further recipient cells, e.g. Molt-4, Peer, Jurkat and various Jurkat variants. These lines offer the advantage of rapid growth and can also be transfected with high efficiency. However, it is disadvantageous for certain applications that they are transformed cell lines which are unsuitable for therapeutic use and have no cytotoxicity.
  • the specific activation of these T cells can be demonstrated using secreted cytokines such as interleukin 2 (IL-2) and tumor necrosis factor (TNF).
  • IL-2 interleukin 2
  • TNF tumor necrosis factor
  • the detection of the activation can be carried out particularly easily.
  • stimulation of the transfectant via its endogenous or transfected TCR leads to activation of the IL-2 promoter, thus to transcription of the LacZ gene and accumulation of ⁇ -galactosidase in the cytosol.
  • the addition of a buffer, which contains a detergent and a substrate for the ⁇ -galactosidase, leads to the lysis of the cells and subsequently the presence of the indicator enzyme can be demonstrated by coloring the reaction buffer.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression von T-Zellrezeptoren und hierfür geeignete Vektoren. Weiterhin werden mit den Vektoren transfizierte Zellen offenbart, welche in der Lage sind, jeweils gewünschte T-Zellrezeptoren zu exprimieren.

Description

T-Zellrezeptor-Expressionskassette
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression von T-Zellrezeptoren und" hierfür geeignete Vektoren. Weiterhin werden mit den Vektoren transfizierte Zellen offenbart, welche in der Lage sind, jeweils gewünschte T-Zellrezeptoren zu exprimieren.
Die T-Lymphozyten des Immunsystems sind für die zelluläre Immunantwort verantwortlich. Die Erkennung erkrankter Körperzellen oder Tumorzellen erfolgt dabei durch den sog. T-Zellrezeptor (TCR), der ein für die erkrankte Zelle spezifisches Antigen in Form von kurzen Peptidfragmenten bindet. Diese Peptidfragmente werden von MHC-Molekühlen an der Zelloberfläche präsentiert.
T-Zellrezeptoren bestehen aus zwei verschiedenen Polypeptiduntereinheiten, üblicherweise den sog. T-Zellrezeptor-σ- oder ß-Ketten, die miteinander durch eine Disulfidbrücke verbunden sind. Die a- und ß-Ketten sind wiederum aus variablen und konstanten Regionen zusammengesetzt. Die variablen Regionen der σ-Kette umfassen V- und J-Gensegmente, während die variablen Regionen der ß-Kette V-, D- und J-Gensegmente umfassen.
Das chromosomale TCRσ-Kettengen besteht aus ca. 50 bis 60 variablen Segmenten, von denen jedes ein Exon für ein Vσ-Gensegment enthält, dem ein anderes Exon voransteht, das für eine Ledersequenz kodiert, die einen Import des Proteins in das endoplasmatische Reticulum und den Transport an die Zelloberfläche ermöglicht. Eine Gruppe von 61 J-Segmenten liegt in beträchtlicher Entfernung von den Vσ-Segmenten. Den J-Segmenten folgt wiederum ein einzelnes Cσ-Segment für den konstanten Bereich, das - 2 - wiederum getrennte Exons für die konstante Region und die Hinge-Region sowie ein Exon für die Transmembran- und Cytoplasmaregionen enthält.
Der chromosomale TCRß-Kettenlocus enthält eine Gruppe von ca. 65 Vß- Gensegmenten, die in einiger Entfernung von zwei getrennten Clustern liegen, die jeweils ein einzelnes Dß-Segment und 6 bzw. 7 Jß-Segmente sowie ein einzelnes Cß-Segment enthalten. Jedes konstante Segment der ß-Kette besitzt separate Exons für die konstante Region, die Hinge-, die Transmembran- und die Cytoplasmaregion.
Während der Entwicklung und Reifung der T-Zelle werden die getrennten Gensegmente durch somatische Rekombination verknüpft. Für die σ-Kette gelangt ein Vσ-Gensegment neben ein Jσ-Gensegment. Damit entsteht ein funktionelles Exon. Durch Transkription und Splicing des VJσ-Exon an die konstante Region wird die mRNA gebildet, die zur TCRσ-Kette translatiert wird. Die Umordnung der für die variable Domäne der ß-Kette kodierenden Gensegmente Vß, Dß und Jß schafft ein funktionelles Exon, das transkribiert und durch Splicing an Cß angefügt wird. Die entstandene mRNA wird zur TCRß-Kette translatiert. Die a- und ß-Ketten verbinden sich nach ihrer Biosynthese zum a : ß TCR Heterodimer. Der für die Spezifität der Antigenerkennung verantwortliche hypervariable Bereich des TCR, der im Bereich der Verknüpfung von V-, (D-) und J-Gensegmenten liegt, wird als CDR3 bezeichnet.
Häufig stellt die begrenzte Verfügbarkeit nativer T-Zellen eine erhebliche Beschränkung für immunologische Untersuchungen der von diesen Zellen exprimierten T-Zellrezeptoren auf funktioneller und molekularer Ebene dar. Andererseits können aufgrund des oben geschilderten komplexen Aufbaus des T-Zellrezeptors aus zwei Genen, die wiederum aus einer Vielzahl von Segmenten zusammengesetzt sind, komplette T-Zellrezeptoren in fremden Zellen nicht ohne weiteres rekombinant hergestellt werden. Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, ein neues System zur rekombinanten Expression von T-Zellrezeptoren bereitzustellen, welches die Expression definierter MHC-restringierter T- Zellrezeptoren und damit deren Untersuchung auf funktioneller und molekularer Ebene erlaubt.
Diese Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellung einer Expressionseinheit, die Expressionskassetten für TCRσ- bzw. TCRß-Ketten enthält. Diese Expressionskassetten enthalten zumindest jeweils den 3'-seitigen Abschnitt der konstanten Anteile der TCRσ- bzw. ß-Kettengene, wobei im 5'-Bereich dieser Abschnitte künstlich eingefügte Restriktionsschnittstellen, insbesondere multiple Klonierungsstellen mit mehreren Restriktionsschnittstellen vorhanden sind, wobei vorzugsweise mindestens eine der Schnittstellen eine singuläre Schnittstelle ist. Wenn mehrere Schnittstellen vorhanden sind, ist die am weitesten 3'-seitig gelegene Schnittstelle von besonderer Bedeutung, da die 5'-seitig davon gelegenen Schnittstellen bei der Klonierung des V-Gens wegfallen. Durch Ausnutzung der Degeneration des genetischen Codes hat die Einführung dieser Schnittstellen keinen Aminosäureaustausch in den TCR-Ketten zur Folge. Zur Komplettierung der TCR-Ketten müssen noch die variablen TCR- Domänen vor die bereits im Basisvektor enthaltenen konstanten Domänen kloniert werden. Falls für ein spezielles V-Gensegment erforderlich, können die künstlich eingefügten Restriktionsschnittstellen unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen partiell identischer Erkennungssequenz bei der Klonierung des variablen Anteils inaktiviert werden.
Durch die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren wird die einfache Expression von TCR-Sequenzen, insbesondere humanen TCR-Sequenzen in eukaryontischen Zellen ermöglicht. Dabei werden insbesondere drei Vorteile erreicht: - 4 -
1 . Die Expressionskassetten sind im wesentlichen für beliebige TCR- Sequenzen verwendbar und damit unabhängig von den umgelagerten V-Regiongenen.
2. Die in die erfindungsgemäßen Expressionskassetten einzuklonieren- den DNA-Fragmente, bei denen es sich beispielsweise um PCR-
Produkte handelt, sind nur kurz, so daß die Kontrollsequenzierung vereinfacht oder/und die Fehlerquote bei der Amplifikation minimiert werden kann. Vorzugsweise liegen daher die künstlichen Restriktionsschnittstellen zur Klonierung der V-Regionen möglichst im 5'-Bereich der C-Regionen.
3. Die durch Mutagenese eingefügten Restriktionsschnittstellen haben weder eine Leserahmenverschiebung noch einen Aminosäureaustausch im fertigen Polypeptid zur Folge. Weiterhin ist bevorzugt, daß sich keine identischen endogenen Schnittstellen innerhalb der entsprechenden Fragmente befinden, wodurch bei der Klonierung ein
Partialverdau vermieden werden kann.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Basisvektor zur Herstellung eines TCR-Expressionsvektors, der eine Expressions- kontrollsequenz in operativer Verknüpfung mit einer polycistronischen, vorzugsweise bicistronischen Expressionseinheit aufweist, umfassend:
(a) zumindest einen Teil der für eine C-Region der TCRσ-Kette kodierenden Nukleotidsequenz, wobei im 5'-Bereich der Nukleotidsequenz mindestens eine Restriktionsschnittstelle lokalisiert ist, und
(b) zumindest einen Teil der für eine C-Region der TCRß-Kette kodierenden Nukleotidsequenz, wobei im 5'-Bereich der Nukleotidsequenz mindestens eine Restriktionsschnittstelle lokalisiert ist.
Der Basisvektor kann ein prokaryontischer oder ein eukaryontischer Vektor sein. Vorzugsweise ist er ein in eukaryontischen Zellen, insbesondere in - 5 -
Säugerzellen wie etwa humanen Zellen propagierbarer Vektor. Beispiele für eukaryontische Vektoren sind bei Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition (1998), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kapitel 16, und Winnacker, Gene und Klone, "Eine Einführung in die Gentechnologie" (1985), VCH Verlagsgesellschaft, insbesondere in den Kapiteln 5, 8 und 10, beschrieben. Der Basisvektor kann ein chromosomaler oder episomaler Vektor sein. Besonders bevorzugt ist der Vektor ein episomal replizierbarer Vektor, insbesondere ein Plasmid.
Neben der polycistronischen Expressionseinheit enthält der erfindungsgemäße Basisvektor weitere für Expressionsvektoren übliche Sequenzelemente, z.B. ein oder mehrere Selektionsmarkergene, wie etwa Antibiotikum-Resistenzgene, einen oder mehrere Replikationsursprünge sowie die zur Transkription der Expressionskassette erforderliche Expressionskontrollsequenz. Diese Expressionskontrollsequenz kann eine prokaryontische oder eukaryontische Expressionskontrollsequenz sein. Besonders bevorzugt ist eine in eukaryontischen Zellen insbesondere in Säugerzellen aktive Expressionskontrollsequenz. Diese Expressionskontrollsequenz enthält einen Promotor und gegebenenfalls Trans- kriptionsregulations- oder/und Aktivierungssequenzen wie Enhancer.
Die erfindungsgemäße polycistronische Expressionseinheit enthält zwei Nukleotidsequenzen, wovon eine für zumindest einen Teil der C-Region einer TCRσ-Kette kodiert und die zweite für zumindest einen Teil der C-Region einer TCRß-Kette kodiert. Die C-Region ist vorzugsweise eine humane Cαr- bzw. Cß-Region. Günstigerweise enthalten diese Nukleotidsequenzen den vollständigen 3'-Bereich der jeweiligen C-Regionen. Das Vorliegen eines vollständigen 5'-Bereichs ist hingegen nicht unbedingt erforderlich, da dieser - wie im folgenden erläutert - zu einem späteren Zeitpunkt zusammen mit der jeweiligen V-Region in den Basisvektor einkloniert werden kann. Im 5'- Bereich der für die C-Regionen kodierenden Nukleotidsequenzen befindet sich jeweils mindestens eine Restriktionsschnittstelle. Diese - 6 -
Restriktionsschnittstellen sind vorzugsweise für die TCRσ-Kette und für die TCRß-Kette jeweils verschieden. Besonders bevorzugt handelt es sich um singuläre Restriktionsschnittstellen, d.h. um Restriktionsschnittstellen, die im gesamten Vektor nur einmal vorkommen. Die Einführung dieser Restriktionsschnittstellen hat möglicherweise eine Mutation in der für die C- Region kodierenden Nukleotidsequenz zur Folge. Diese Mutation ist jedoch vorzugsweise eine "stille" Mutation, d.h. eine Mutation, die keinen Aminosäureaustausch in der C-Region zur Folge hat. Beispiele für geeignete Restriktionsschnittstellen, die in den 5'-Bereich der für die C-Region der TCRσ-Kette kodierenden Nukleotidsequenz eingefügt werden können, sind BamHI oder/und Xmal-Schnittstellen. Diese Restriktionsstellen können auf einfache Weise durch Mutationen in den Kodons 5 und 6 von Exon 1 der C- Region der TCRσ-Kette eingeführt werden (vgl. z.B. Abb. 6). Besonders bevorzugt ist die Kassettenschnittstelle eine BamHI-Stelle im Kodon 6 des Cσ-Gens. Beispiele von Restriktionsschnittstellen für die C-Region der TCRß- Kette sind Spei oder/und Sall-Schnittstellen, die durch Mutationen in den Kodons 28 und 29 der für die Cß-Region kodierenden Nukleotidsequenz eingeführt werden (vgl. Abb. 7). Besonders bevorzugt ist die Kassettenschnittstelle eine Spel-Stelle im Kodon 29 des Cß-Gens.
Besonders bevorzugt werden Restriktionsschnittstellen in einen Bereich eingeführt, der für die ersten fünfzig Aminosäuren der jeweiligen C-Region des TCR-Kettengens kodiert. Besonders bevorzugt sind die TCRσ- und TCRß-Kettengene humanen Ursprungs, deren Sequenzen bei Yoshikai et al. (Nature 316 (1985), 837-840) und Toyonaga et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 (1985), 8624-8628) beschrieben sind.
Weiterhin enthält die Expressionseinheit des erfindungsgemäßen Basisvektors vorzugsweise eine Sequenz, die eine "Capping" unabhängige Translation des durch Transkription der Expressionseinheit entstehenden polycistronischen mRNA-Moleküls erlaubt. Ein Beispiel für eine solche Sequenz ist eine IRES-Sequenz, wie sie in einer Vielzahl verschiedener - 7 -
Organismen, beispielsweise Viren, vorkommt. So finden sich IRES- Sequenzen in dem Picornaviridae, z. B. Cardioviren wie Encephalo- myocarditisvirus, Enteroviren wie Poliovirus, Rhinoviren wie humanes Rhinovirus, Hepatoviren wie humanes Hepatitis-A-Virus (Fields et. al., Virology, 3rd Edition (1996), Lipincott-Raven Publishers, Philadelphia), in Flaviridae, z.B. Pestiviren wie Bovine Viral Diarrhea Virus (Vassiler et al., J. Virol. 71 (1997), 471 -478) oder Classical Swine Fever Virus (Rijnbrand et al., J. Virol. 71 (1997), 451 -457), Retroviren wie z.B. HTLV-1 (Attal et al., FEBS Lett. 392 (1996), 220-224) oder Moloney-Murine Leukemia Virus (Vagner et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 20376-20383), Leishmania RNA Virus 1 (Maga et al., Mol. Cell. Biol. 15 (1995), 4884-4889), oder beim Menschen, z.B. im BiP-Gen (Yang und Sarnow, Nucleic Acids Res. 25 (1997), 2800-2807) oder im humanen Fibroblastenwachstumsfaktor 2 Gen (Vagner et al., Mol. Cell. Biol. 15 (1995), 35-44) oder bei Drosophila, z.B. im E74A-Gen (Jones et al., Insect. Biochem. Mol. Biol. 24 (1994), 875- 882) . Um eine möglichst hohe und ausgeglichene Expression des TCRσ- und TCRß-Kettengens zu ermöglichen, enthält die Expressionseinheit direkt 5'- seitig von jeder TCR-Kettensequenz eine ribosomale Translations- initiationsstelle, z.B. die sog. Kozak-Sequenz.
Eine möglichst stöchiometrische Expression der TCRσ-Kette und der TCRß- Kette ist bevorzugt. Darüber hinaus kann auch die Expression der TCRσ- Kette im Vergleich zur Expression der TCRß-Kette limitiert sein. Hierzu kann beispielsweise die erfindungsgemäße Expressionskassette in 5'-3'-Richtung wie folgt aufgebaut sein: TCRß-Kettengen; IRES-Sequenz; TCRσ-Kettengen. Alternativ kann beispielsweise die ribosomale Initiationssequenz für das TCRσ-Kettengen so modifiziert werden, daß die Translationsinitiaton etwas schwächer als beim TCRß-Kettengen ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen TCR- Expressionsvektor, der eine Expressionskontrollsequenz in operativer - 8 -
Verknüpfung mit einer polycistronischen, vorzugsweise bicistronischen Expressionseinheit aufweist, umfassend:
(a) eine für eine vollständige TCRσ-Kette kodierende Nukleotidsequenz und (b) eine für eine vollständige TCRß-Kette kodierende Nukleotidsequenz, wobei die für die V-Regionen und C-Regionen der TCR-Ketten kodierenden Nukleotidsequenzen über Restriktionsschnittstellen im 5'-Bereich der C- Regionen miteinander verknüpft sind. Vorzugsweise weisen die für die TCR- Ketten kodierenden Nukleotidsequenzen im Bereich der Restriktions- Schnittstellen mindestens einen Basenaustausch gegenüber der natürlichen TCR-Sequenz auf, wobei die Basenaustausche im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes gewählt sind, d.h. zu einer "stillen Mutation" führen.
Der erfindungsgemäße TCR-Expressionsvektor kann grundsätzlich durch zwei verschiedene Verfahren hergestellt werden, nämlich indem man zuerst einen Basisvektor herstellt und darin die für eine gewünschte V-Region kodierenden Nukleotidsequenzen inseriert, oder indem man die für die gewünschten V-Regionen kodierenden Nukleotidsequenzen in zwei separaten Vektoren mit den entsprechenden C-Regionen kombiniert und dann aus diesen beiden Vektoren den Expressionsvektor bildet. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines TCR-Expressionsvektors umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Basisvektors wie zuvor angegeben und
(b) Inserieren von Nukleotidsequenzen, welche die für eine gewünschte V-Region einer TCRσ- oder TCRß-kodierenden Bereiche enthält, in die
Restriktionsschnittstellen, die in den 5'-Bereichen der für die C- Regionen kodierenden Nukleotidsequenzen lokalisiert sind, oder (a') Bereitstellen von zwei Vektoren, die jeweils zumindest einen Teil der für die C-Region der TCRσ- bzw. der TCRß-Kette kodierenden Nukleotidsequenz enthalten, wobei im 5'-Bereich der Nukleotidsequenz jeweils mindestens eine Restriktionsschnittstelle lokalisiert ist, (b') Inserieren von Nukleotidsequenzen, welche die für eine gewünschte
V-Region einer TCRσ- oder einer TCRß-Kette kodierenden Bereiche enthalten, in die Restriktionsschnittstellen, die in den 5'-Bereichen der für die C-Regionen kodierenden Nukleotidsequenzen lokalisiert sind und
(c') Zusammensetzen der für die TCR-Ketten kodierenden Nukleotidsequenzen zu einer Expressionseinheit, um einen TCR-Expressions- vektor zu erhalten.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mit einem Basisvektor oder mit einem TCR-Expressionsvektor wie zuvor transformiert ist. Die Zelle kann eine prokaryontische Zelle, z.B. eine gramnegative Bakterienzelle, insbesondere E.coli sein. Eine für die TCR- Expression verwendete Zelle ist jedoch vorzugsweise eine eukaryontische Zelle, eine Säugerzelle, insbesondere eine humane Zelle. Beispiele für Verfahren zum Einführen der erfindungsgemäßen Vektoren in derartige Zellen finden sich bei Sambrook et al., supra, und Winnacker, supra.
Besonders bevorzugt wird zur Transformation eine Empfängerzelle verwendet, die zur Expression eines oder mehrerer akzessorischer Moleküle, d.h. zur Ausübung der T-Zellfunktion notwendiger Moleküle, in der Lage ist.
Beispiele für solche akzessorischen Moleküle sind die Zelloberflächenmarker
CD3, CD4, CD8 und Cytokine wie etwa IL-2 oder/und TNF. Am meisten bevorzugt ist die Empfängerzelle daher eine humane T-Zelle. Beispiele für geeignete humane T-Zellen sind die T-Zell-Klone und -Linien wie 234 (Prof.
Wank, Institut für Immunologie, LMU München, Goethestr. 31 , 80336
München), Molt-4 (ATCC CRL 1582), Peer (Schlesinger et al., Thymus. 2
(1981 ), 235-243), Jurkat (ATCC TIB-152) und Varianten davon wie Jurkat
9-5 (Boehringer Mannheim GmbH). Besonders bevorzugt werden cyto- toxische T-Zellen verwendet. - 10 -
Noch eine andere Möglichkeit zur Gewinnung von T-Zellen, die einen TCR mit gewünschter Spezifität exprimieren, besteht darin, daß man einen erfindungsgemäßen TCR-Expressionsvektor in die Keimbahn eines Tieres einführt und die T-Zellen aus dem resultierenden transgenen Tier oder Nachkommen davon gewinnt. Vorzugsweise werden transgene Mäuse hergestellt. Weiterhin ist es bevorzugt, daß die transgenen Mäuse neben dem TCR auch akzessorische Moleküle wie das humane CD8 Molekül oder/und das humane HLA-A*0201 -Molekül exprimieren.
Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Expression eines TCR, wobei man eine geeignete Wirtszelle mit einem TCR-Expressionsvektor transformiert und die Zelle unter Bedingungen kultiviert, die zu einer TCR- Expression, vorzugsweise zu einer Expression als membranständiges TCR- Heterodimer führen.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Reagenzienkit zur Herstellung eines TCR-Expressionsvektors. In einer ersten Ausführungsform enthält der Reagenzienkit einen Basisvektor wie zuvor definiert und Primer zur Amplifikation von V-Regionen der TCRσ und TCRß- Kettengene. In einer zweiten Ausführungsform enthält der Reagenzienkit zwei separate Vektoren, die Elemente der Expressionseinheit aus dem Basisvektor getrennt enthalten, sowie geeignete Primer zur Amplifikation von V-Regionen.
Darüber hinaus kann der Reagenzienkit noch eine für die TCR-Expression geeignete Empfängerzelle, insbesondere eine humane T-Zelle, wie zuvor erläutert, enthalten. - 1 1 -
Die Anmeldung wird weiterhin durch nachfolgende Figuren, Sequenzprotokolle und Beispiele erläutert. Es zeigen:
Abb. 1 : Die Herstellung der TCRσ Expressionskassette. Von einer TCRσ-spezifischen cDNA wurde unter Verwendung der Primer
5'CσEXPs und 3'CσEXP ein Amplifikat der TCRσ-C-Region hergestellt, welches vom dritten Kodon bis zum Stopkodon reichte. Durch das Oligonukleotid 5'CσEXPs wurden Erkennungssequenzen für die Xmal- und Bam Hl- und durch das Oligonukleotid 3'CσEXP eine Schnittstelle für die Sal I-
Restriktionsendonuklease an die 5'- bzw. 3'-Enden der amplifizierten DNA-Moleküle angefügt. Die Klonierung der DNA-Stränge in pBSCIISK + erfolgte über die Xmal und Sal I Schnittstellen. Nach der Sequenzierung wurde ein fehlerfreier Subklon ausgewählt und die Cσ-Region über die Xma I und
Sal I Schnittstellen in den Expressionsvektor pSBC II umkloniert. Der Vektor pSBC II enthält zwei singuläre Restriktionsschnittstellen Ase I und Not I, die die Fusion mit dem Vektor pSBC I ermöglichen (AmpR-Ampicillinresistenzgen, SV40P/E = Promotor- und Enhancersequenzen aus SV40,
SV40pA = Polyandenylierungssignal aus SV40).
Abb. 2: Klonierung der Vσ20 Domäne des T-Zell-Klons 26/B in die
TCRσ Expressionskassette. RNA des RCC-spezifischen Klons 26/B wurde TCR-spezifisch revers transkribiert und die resultierende cDNA unter Verwendung der Oligonukleotide TCRAV20EXP und 5'CσEXPas amplifiziert. Das Amplifikat umfaßte die gesamte Vσ20 Region (beginnend am Startkodon) und die ersten neun Kodons der Cσ-Region. Durch das Oligonukleotid TCRAV20EXP wurde eine Eco Rl Schnittstelle und die optimale Kozak-Sequenz an das 5'-Ende und durch das Oligonukleotid 5'-CσEXPas eine Bam Hl Schnittstelle an das 3'- - 12 -
Ende der amplifizierten DNA-Moleküle angefügt. Die Klonierung der DNA-Moleküle in den Vektor pBSCIISK + wurde über die Eco Rl und Bam Hl Schnittstellen vollzogen. Nach der Sequenzierung wurde ein fehlerfreier Subklon ausgewählt und die Vσ20-Domäne über Eco Rl und Bam Hl in die TCRσ
Expressionskassette (in pSBC II) einkloniert.
Abb. 3: Herstellung der TCRß Expressionskassette. Von einer TCRß- spezifischen cDNA wurde unter Verwendung der Primer 5'CßEXPs und 3'CßEXP ein Amplifikat der TCRß-C-Region hergestellt, welches vom 26. Kodon bis zum Stopkodon reichte. Durch das Oligonukleotid 5'CßEXPs wurden Erkennungssequenzen für Sal I- und Spe I- und durch das Oligonukleotid 3'CßEXP eine Schnittstelle für die Hind III- Restriktionsendonuklease an die 5'- bzw. 3'-Enden der amplifizierten DNA-Moleküle angefügt. Die Klonierung der DNA-Stränge in pBSCIISK + erfolgte über die Sal I und Hind III Schnittstellen. Nach der Sequenzierung wurde ein fehlerfreier Subklon ausgewählt und die Cß-Region über die Sal I und Hind III Schnittstellen in den Expressionsvektor pSBC I umkloniert.
Der Vektor pSBC I enthält zwei singuläre Restriktionsschnittstellen Ase I und Not I, die die Fusion mit dem Vektor pSBC II ermöglichen, und außerdem ein IRES (internal ribosomal entry site) Element.
Abb. 4. Klonierung der Vß22 Domäne des T-Zell-Klons 26/B in die
TCRß Expressionskassette. RNA des RCC-spezifischen Klons
26/B wurde TCR-spezifisch revers transkribiert und die resultierende cDNA unter Verwendung der Oligonukleotide TCRBV22EXP und 5'CßEXPas amplifiziert. Das Amplifikat umfaßte die gesamte Vß22 Region. Durch das Oligonukleotid TCRBV22EXP wurde eine Eco Rl Schnittstelle und die optimale - 1 3 -
Kozak-Sequenz an das 5'-Ende und durch das Oligonukleotid 5'CßEXPas eine Spe I Schnittstelle an das 3'Ende der amplifizierten DNA-Moleküle angefügt. Die Klonierung der DNA-Moleküle in den Vektor pBSCIISK + wurde über die Eco Rl und Spe I Schnittstellen vollzogen. Nach der Sequenzierung wurde ein fehlerfreier Subklon ausgewählt und die Vß22- Domäne über die Eco Rl und Spe I in die TCRß Expressionskassette (in pSBC I) einkloniert.
Abb. 5: Fusion der Vektoren pSBC I und pSBC II zur bicistronischen
TCR Expressionseinheit. Der Vektor pSBC I, der die TCRß Kette des Klons 26/B enthielt, und der Vektor pSBCII, der die TCRσ Kette des Klons 26/B enthielt, wurden mit den Restriktionsenzymen Ase I und Not I verdaut. Anschließend wurden die beiden Hälften, welche jeweils für eine TCR Kette kodierten, über dieselben Schnittstellen wieder ligiert, so daß auf dem fusionierten Expressionsvektor pSBCI/ll beide TCR Ketten des Klons 26/B kodiert waren. Die Lage der Not I Schnittstelle führte dazu, daß das IRES Element des Vektors pSBC I im Fusionsvektor zwischen den beiden TCR-Genen zu liegen kam, was die Capping-unabhängige Translation der Vσ- Kette ermöglichen sollte (MCS = multiple cloning site).
Abb. 6: TCRσ Expressionskassette. Zentral ist die cDNA Sequenz im 5'-Bereich der Cσ-Region aufgeführt, wobei die Tripletts dem tatsächlichen Leserahmen entsprechen. Die fettgedruckten Tripletts entsprechen den Kodons 5 und 6 im Exon 1 . Der Primer 5'CσEXPs (über der cDNA Sequenz eingezeichnet) führt in den 5'-Bereich des Cσ-Amplifikats eine Xma I und unter Ausnutzung des degenerierten Kodes an Position 3 im Kodon
5 (T nach G Transversion) und Position 3 im Kodon 6 (C nach T Transition) eine Bam Hl Schnittstelle ein (ganz oben gezeigt) . - 14 -
Die Nukleotidaustausche, die in diesen beiden Kodons nur stille Mutationen hervorrufen, und die entsprechenden Aminosäuren (Prolin und Asparaginsäure) sind am unteren Bildrand aufgeführt. An denselben Positionen werden die 3'-Bereiche der Vσ-Amplifikate durch die 5'CσEXPas Primer (unter der cDNA Sequenz gezeigt) identisch modifiziert und damit erneut eine Bam Hl Erkennungssequenz geschaffen. Unter der 5'CσEXPas Sequenz ist ein hypothetischer Primer dargestellt, der eine Bgl II Erkennungssequenz trägt und bei der Klonierung des Vσ-Segments die Bam Hl Stelle, wie im Text beschrieben, inaktivieren kann.
Abb. 7: TCRß Expressionskassette. Zentral ist die cDNA Sequenz im
5'-Bereich der Cß-Region aufgeführt, wobei die Tripletts dem tatsächlichen Leserahmen entsprechen. Die fettgedruckten
Tripletts entsprechen den Kodons 28 und 29 im Exon 1 . Der Primer 5'CßEXPs (über der cDNA Sequenz eingezeichnet) führt in den 5'-Bereich des Cß-Amplifikats eine Sal I und unter Ausnutzung des degenierten Kodes an Position 3 im Kodon 29 (G nach A Transition) eine Spe I Schnittstelle ein (ganz oben gezeigt) . Die Nukleotidaustausche, die in Kodons 28 und 29 nur stille Mutationen hervorrufen, und die ensprechenden Aminosäuren (Threonin und Asparaginsäure) sind am unteren Bildrand aufgeführt. An denselben Positionen werden die 3'- Bereiche der Vß-Amplifikate durch die 5'CßEXPas Primer
(unter der cDNA Sequenz gezeigt) identisch modifiziert und damit erneut eine Spe I Erkennungssequenz geschaffen. Unter der 5'CßEXPas Sequenz ist ein hypothetischer Primer dargestellt, der eine Xba I Erkennungssequenz trägt und bei der Klonierung des Vß-Segments die Spe I Stelle, wie im Text beschrieben, inaktivieren kann. Die Hybridisierungsorte der - 15 -
Oligonukleotide 5'CßEXPs und 5'CßEXPas sind in Cß1 und Cß2 identisch.
Abb. 8: Modell der "synthetischen" T-Zelle. Die Zellinie Jurkat 9-5 (Mitte) trägt das Gen für die ß-Galaktosidase (lacZ), welches unter der Kontrolle des IL-2 Promotors steht, stabil in das Genom integriert. Die erfolgreiche Transfektion dieser Zelle mit dem pSBC l/ll Fusionsvektor führt zur Expression der davon kodierten TCR Ketten auf der Zelloberfläche. Die Interaktion des exprimierten TCR mit seinem spezifischen Liganden führt zur Aktivierung des IL-2 Promotors und damit zur intrazellulären Produktion von ß-Galaktosidase. Durch die Lyse der Jurkat-Zellen wird die ß-Galaktosidase frei und kann ein Substrat umsetzen, welches zur Färbung der Reaktionslösung führt.
Abb. 9 und
SEQ ID NO. 1 bis 8: Oligonukleotide für die TCR-Expressionskassetten
Beispiele
Beispiel 1 Herstellung einer bicistronischen TCR-Expressionseinheit
Für die Herstellung eines TCR-Expressionssystems wurde der TCR des RCC- spezifischen zytotoxischen Klons 26/B gewählt. Das σ-Kettengen dieses TCR besteht aus der variablen Region Vσ20 und der konstanten Region Cσ. Das TCRß-Kettengen besteht aus der variablen Region Vß22 und der konstanten Region Cß. Die Sequenzen dieser und aller anderen bekannten V-Gensegmente sind bei Arden et al. (lmmunogenetics 42 (1995), 455-500) publiziert. - 16 -
Wie in den Abbildungen 1 bis 4 erläutert, erfolgte die Klonierung der TCR- Ketten in zwei Stufen: Im ersten Schritt wurden die C-Regionen kloniert (Abbildungen 1 und 3) d.h. die eigentlichen Kassetten fertiggestellt und im zweiten Schritt die entsprechenden V-Regionen in die Expressionskassetten eingefügt (Abbildungen 2 und 4). Als Basisvektoren wurden pSBCI und pSBCII (Dirks et al., Gene 128 (1993), 247-249) verwendet. Dabei handelt es sich um sog. Low Copy-Plasmide, so daß alle Fragmente in pBSC II SK + (Fa. Stratagene, Katalognr. 21 22 05) zwischenkloniert wurden. Dieser Vektor repliziert in Bakterien zur hohen Kopienzahl und erwies sich außerdem bezüglich der Restriktionsschnittstellen als besonders kompatibel zu den pBSC Vektoren.
Die Fragmente in pBSCMSK -- wurden sequenziert und die DNA aus fehlerfreien Subklonen in die Expressionsvektoren umkloniert. Zur Amplifikation der TCR-spezif ischen cDNA wurden Primer eingesetzt, welche verschiedene Modifikationen in die entsprechenden DNA-Bereiche einfügten. Die 5'-Primer zur Amplifikation der C-Region (5'CσEXPs und 5'CßEXPs vgl. Abb. 9 und SEQ ID NO. 3 und 7) trugen jeweils zwei Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen, wobei die erstedieser Erkennungssequenzen frei wählbar war und dazu diente, die Kassette in den Expressionsvektor zu klonieren. Die zweite Erkennungssequenz stellte die eigentliche Kassettenschnittstelle dar und erlaubte die spätere Einklonierung der V-Region (siehe unten). Als 3'-Primer wurden die Oligonukleotide 3'CσEXP und 3'CßEXP (Abb. 9 und SEQ ID NO. 4 und 8) verwendet. Durch eine PCR (Protokoll: Prädenaturierung 94°C, 2 min, 1 Zyklus; Denaturierung 94°C, 30 sec, 30 Zyklen; Annealing 63°C, 30 sec, 30 Zyklen; Extension 72°C, 1 min, 30 Zyklen und Endpolymerisation 72°C, 10 min, 1 Zyklus) unter Verwendung der jeweiligen σ-ß-Primer-Kombination wurde der kodierende Abschnitt des jeweiligen C-Gensegments einschließlich des Stopkodons amplifiziert. Außerdem wurde jeweils eine Schnittstelle zur Klonierung eingefügt (Abb. 1 und 3). - 17 -
Für die Klonierung der V-Regionen des Klon 26/B wurden die für das V- Gensegment spezifischen Primer TCRAV20EXP und TCRBV22EXP (Abb. 9 und SEQ ID NO. 1 und 5) verwendet. Diese Primer binden im Bereich des Startkodons an die V-Gensequenz und kodieren gleichzeitig für die optimale Kozak-Sequenz und eine Restriktionsschnittstelle. Die Kozak-Sequenz (CCR CCAUG (G), R = A oder G) beschreibt die optimale Sequenzumgebung für das Initiationskodon AUG, die für eine effiziente Translationsinitiation an diesem Startkodon wichtig ist. Die 3'-Primer, 5'CσEXPas und 5'CßEXPas (Abb. 9, SEQ ID NO. 2 und 6) hybridisieren im 5'-Bereich des jeweiligen C- Gensegments und führten Mutationen entsprechend den jeweils verwendeten Kassettenschnittstellen ein (Abb. 2 und 4).
Die Herstellung der bicistronischen Expressionseinheit erfolgte durch Fusion der beiden Vektoren pSBCI und pSBCII anhand zwei singulärer Restriktionsschnittstellen (Ase I und Not I, Abb. 5). Im resultierenden Fusionsvektor pSBC l/ll flankieren die beiden TCR-Ketten ein IRES-Element, welches zur "Capping"-unabhängigen Translationsinitiation führt und damit eine effiziente Proteinsynthese beider TCR-Ketten ermöglicht. Da die Capping-abhängige Translation des 5'-seitig des IRES-Elements liegenden Gens etwas effizienter funktioniert als die des 3'-seitig liegenden Gens, wurde die TCRß-Kette in pSBC I und TCRσ-Kette in pSBC II kloniert. Auf diese Weise wurde - um die Ausbildung von TCRσ-Homodimeren zu verhindern - eine Limitierung der σ-Kettenexpression gegenüber der ß- Kettenexpression erreicht.
Wie bereits oben erwähnt und in Abb. 5 dargestellt, wurden vor der TCRß- und nach der TCRσ-Kette Sfil Schnittstellen eingebaut, um eine Umklonierung der beiden Ketten mit dem dazwischenliegenden IRES- Element zu erlauben. Dieselbe Sfil Schnittstelle befindet sich auch in der multiplen Klonierungsstelle des Vektors pHEBNA-1 (Mautner et al., Oncogene 12 (1996), 1299-1307 und Mucke et al., Gene Ther. 4 (1997), - 18 -
82-92), welcher die Fähigkeit zur episomalen Replikation besitzt und deshalb eine stabile Transfektion überflüssig macht.
Beispiel 2 Restriktionsschnittstellen der Expressionskassette
Einen zentralen Punkt bei der Herstellung von "synthetischen T-Zellen" stellen die Restriktionsschnittstellen in den Expressionskassetten dar, welche die Einklonierung beliebiger TCR V-Domänen vor bereits fertiggestellten C-Domänen bei unveränderter TCR-Aminosäuresequenz ermöglichen. Die Abb. 6 und 7 zeigen schematisch den Aufbau und die Funktionsweise der TCRσ- und ß-Expressionskassetten.
Insbesondere ist der 5'-Bereich der jeweiligen C-Gensegmente dargestellt, in welchen sich die V-Region- und C-Regionamplifikate überschneiden. Wie im Detail den Abbildungen zu entnehmen ist, wurden durch Mutationen in den verwendeten Oligonukleotiden die aufgelisteten Restriktionsschnittstellen eingefügt. Dabei diente die jeweils erste Schnittstelle der Klonierung des C-Gensegments in die Expressionsvektoren (TCRσ:Xmal, TCRß:Sall). Die Einklonierung der V-Gensegmente erfolgte über die jeweils zweite Schnittstelle (TCRσ:Bam Hl, TCRß:Spel). Da durch das Einklonieren der V-Gensegmente die ersten Schnittstellen entfernt wurden, mußte bei deren Auswahl keine Rücksicht auf Leserahmenverschiebungen oder/und Aminosäureaustausche genommen werden.
Bei einer Untersuchung der zu klonierenden Regionen fanden sich endogene Restriktionsschnittstellen für Xmal im kodierenden Bereich von Vσ20 und für BamHI im 3'-untranslatierten Bereich von Cσ. Da jedoch die V- und C- Segmente unabhängig voneinander und darüber hinaus die C-Regionen nur bis zum Startkodon kloniert wurden, konnten die beiden endogenen Erkennungssequenzen vernachlässigt werden. Wie zuvor erwähnt, können Restriktionsschnittstellen in der Expressionskassette bei Bedarf inaktiviert werden, was dann nötig ist, wenn eine Vσ-Domäne eine endogene BamHI - 19 - bzw. eine Vß-Domäne eine endogene Spei Schnittstelle aufweist. Dazu können durch die für die Amplifikation der V-Region verwendeten 3'-Primer beliebige Restriktionsschnittstellen eingefügt werden, deren Kernsequenzen, d.h. die zentralen vier Basen der Erkennungssequenz, mit den entsprechenden Sequenzen der BamHI bzw. Spei Schnittstelle identisch sind (Tabelle 1 ).
Tabelle 1
TCR-Kassette Kompatible wiederschneidbar Restriktionsendonukleasen mit
σ: Bam Hl Bei 1, Bgl II, Bst Yl ( = Mfl 1, Xho II), Bst Yl, Mbo 1 ( = Bst l) Mbo 1 ( = Dpn II, Sau3A 1)
ß: Spe 1 Avr II, Nhe 1 Sty 1, Xba 1 Bfa l
Die in der zweiten Spalte von Tabelle 1 aufgeführten Restriktionsendonukleasen erzeugen kohäsive Enden, welche mit den in der ersten Spalte angegebenen Restriktionsschnittstellen der Expressionskassette partie i identisch sind. Durch Anwendung dieser Enzyme können die Kassetten für die Ausgangsenzyme inaktiviert, jedoch durch die in der dritten Spalte aufgelisteten Enzyme wieder geschnitten werden. Die in den Klammern aufgeführten Enzyme stellen Isoschizomere dar.
Als Bespiel für die in der zweiten Spalte von Tabelle I aufgelisteten kompatiblen Restriktionsenzyme sind in Abb. 6 und 7 Bgl II für die TCRσ- Kette und Xbal für die TCRß-Kette angegeben. Wichtig ist dabei, daß die verwendeten Enzyme asymmetrisch schneiden. Die Inaktivierung beruht darauf, daß die beiden "falschen" Nukleotide keine Auswirkung auf die fertigen Polypeptidketten haben. Für beide TCR-Ketten hat das erste Nukleotid keinen Aminosäurenaustausch zur Folge, da alle vier möglichen Basen an diesen Positionen für identische Aminosäuren kodieren (Abb. 6 und 7). Bedingt durch den asymmetrischen Schnitt der Restriktions- - 20 - endonukleasen wird das zweite falsche Nukleotid in den Gegensinnstrang eingebaut und hat deshalb keinen Effekt auf die translatierte mRNA.
Beispiel 3 Expression des T-Zellrezeptors in eukaryontischen Zellen
Um die Transfektion weiterer akzessorischer Moleküle wie z.B. CD3, CD4 oder/und CD8 überflüssig zu machen, wird der klonierte TCR vorzugsweise in einer humanen T-Zelle exprimiert. Bei der Auswahl der Empfängerzellen standen im wesentlichen zwei Aspekte im Vordergrund. Einerseits sollte die Empfängerzelle ein großes Proliferationspotential aufweisen, um ausreichend viele Zellen in relativ kurzer Zeit für die Transfektionsexperimente zur Verfügung zu haben, aber auch um erfolgreich transfizierte Klone, selbst nach großem Zellzahlverlust durch die Transfektion als solche, stark expandieren zu können. Darüber hinaus sollte die Empfängerzelle nach spezifischer Stimulierung über den transfizierten TCR eine eindeutige und messbare biologische Funktion ausüben.
Im folgenden werden kurz verschiedene humane T-Zellklone und T-Zellinien beschrieben, die aufgrund ihrer Wachstums- und anderer Eigenschaften prinzipiell als Empfängerzellen geeignet sind.
Ein Beispiel für eine geeignete Empfängerzelle ist der humane T-Zellkon 234. Diesen Klon zeichnen einige besondere Eigenschaften aus: Ein hohes Wachstumspotential, Cytotoxizität und ein endogener Rezeptor, der keine Determinante auf den RCC-26 Tumorzellen erkennt. Diese Nichterkennung ist besonders wichtig, da es sich bei diesem Klon um keine transformierte Zelle handelt, die deshalb einer regelmäßigen Restimulation über ihren endogenen TCR bedarf. Der größte Vorteil liegt in der Cytotoxizität der Zelle, welche als Nachweis der spezifischen T-Zellaktivierung eindeutig und leicht meßbar ist. - 21 -
Als weitere Empfängerzellen kommen etablierte humane Zelllinien in Betracht, z.B. Molt-4, Peer, Jurkat und verschiedene Jurkatvarianten. Diese Linien bieten den Vorteil eines schnellen Wachstums und sind darüber hinaus mit hoher Effizienz transfizierbar. Nachteilig für bestimmte Anwendungen ist jedoch, daß es sich um transformierte Zellinien handelt, die für einen therapeutischen Einsatz ungeeignet sind und keine Cytotoxizität aufweisen. Die spezifische Aktivierung dieser T-Zellen kann anhand sezernierter Cytokine wie Interleukin 2 (IL-2) und Tumornekrose- faktor (TNF) nachgewiesen werden.
Mit einer besonderen Variante der Jurkat-Zelle (Jurkat 9-5) die das ß- Galaktosidasegen (LacZ) unter Kontrolle des IL-2 Promotors stabil in das Genom integriert trägt, kann der Nachweis der Aktivierung besonders leicht geführt werden. Wie in Abbildung 8 dargestellt, führt die Stimulierung der Transfektante über deren endogene oder transfizierte TCR zur Aktivierung des IL-2 Promotors, damit zur Transkription des LacZ-Gens und Akkumulation von ß-Galaktosidase im Cytosol. Die Zugabe eines Puffers, welcher ein Detergens und ein Subtrat für die ß-Galaktosidase enthält, führt zur Lyse der Zellen und nachfolgend kann das Vorhandensein des Indikatorenzyms anhand einer Färbung des Reaktionspuffers nachgewiesen werden.

Claims

- 22 -Ansprüche
1 . Basisvektor zur Herstellung eines TCR-Expressionsvektors, der eine Expressionskontrollsequenz in operativer Verknüpfung mit einer polycistronischen Expressionseinheit aufweist, umfassend:
(a) zumindest einen Teil der für eine C-Region der TCRσ-Kette kodierenden Nukleotidsequenz, wobei im 5'-Bereich der Nukleotidsequenz mindestens ein Restriktionsschnittstelle lokalisiert ist, und
(b) zumindest einen Teil der für eine C-Region der TCRß-Kette kodierenden Nukleotidsequenz, wobei im 5'-Bereich der Nukleotidsequenz mindestens eine Restriktionsschnittstelle lokalisiert ist.
2. Vektor nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß er in eukaryontischen Zellen propagierbar ist.
3. Vektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Plasmid ist.
4. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er ein episomal replizierbarer Vektor ist.
5. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionseinheit weiterhin eine Sequenz enthält, die eine
"Capping"-unabhängige Translation des polycistronischen Transkriptionsprodukts erlaubt. - 23 -
6. Vektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionseinheit eine IRES-Sequenz enthält.
7. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionseinheit eine limitierte Expression der TCRσ-Kette im Vergleich zur Expression der TCRß-Kette erlaubt.
8. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die C-Regionen der TCRσ- und TCRß-Ketten humanen Ursprungs sind.
9. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der im 5'-Bereich der für die C-Regionen der TCRσ- und TCRß-Ketten kodierenden Nukleotidsequenzen lokalisierten Restriktionsschnittstellen singulär sind.
10. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daßdie Restriktionsschnittstellen keinen Aminosäureaustausch in den C-Regionen zur Folge haben.
1 1 . Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im 5'-Bereich der für die C-Region der TCRσ-Kette kodierenden DNA-Sequenz eine BamHI- oder/und eine Xmal-Schnittstelle lokalisiert ist. - 24 -
1 2. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im 5'-Bereich der für die C-Region der, TCRß-Kette kodierenden DNA-Sequenz eine Spe-I- oder/und eine Sall Schnittstelle lokalisiert ist.
1 3. TCR-Expressionsvektor, der eine Expressionskontrolisequenz in operativer Verknüpfung mit einer polycistronischen Expressionseinheit aufweist, umfassend: (a) eine für eine vollständige TCRσ-Kette kodierende
Nukleotidsequenz, und (b) eine für eine vollständige TCRß-Kette kodierende
Nukleotidsequenz, wobei die für die V-Regionen und C-Regionen der TCR-Ketten kodierenden Nukleotidsequenzen über Restriktionsschnittstellen im δ'-Bereich der C-Regionen miteinander verknüpft sind.
14. TCR-Expression vektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die für die TCR-Ketten kodierenden Nukleotidsequenzen im
Bereich der Restriktionsschnittstellen mindestens einen Basenaustausch gegenüber der natürlichen TCR-Sequenz aufweisen, wobei die Basenaustausche im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes gewählt sind.
1 5. Verfahren zur Herstellung eines TCR-Expressionsvektors nach Anspruch 1 3 oder 14, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Basisvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 1 2 und (b) Inserieren von Nukleotidsequenzen, welche die für eine gewünschte V-Region einer TCRσ- oder TCRß-Kette kodierenden Bereiche enthält, in die Restriktionsschnittstellen, - 25 -
die in den 5'-Bereichen der für die C-Regionen kodierenden Nukleotidsequenzen lokalisiert sind, oder (a') Bereitstellen von zwei Vektoren, die jeweils zumindest einen Teil der für die C-Region der TCRσ- bzw. der TCRß-Kette kodierenden Nukleotidsequenz enthalten, wobei im 5'-Bereich der Nukleotidsequenz mindestens eine Restriktionsschnittstelle lokalisiert ist,
(b') Inserieren von Nukleotidsequenzen, welche die für eine gewünschte V-Region einer TCRσ- oder TCRß-Kette kodierenden Bereiche enthalten, in die Restriktionsschnittstellen, die in den 5'-Bereichen der für die C-Regionen kodierenden Nukleotidsequenzen lokalisiert sind, oder (c') Zusammensetzen der für die TCR-Ketten kodierenden Nukleotidsequenzen, um einen TCR-Expressionsvektor zu erhalten.
16. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Basisvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 1 3 transformiert ist.
17. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem TCR-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 13 bis 14 transformiert ist.
18. Zelle nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Säugerzelle ist. - 26 -
19. Zelle nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur Expression eines oder mehrerer akzessorischer Moleküle in der Lage ist.
20. Zelle nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die akzessorischen Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus CD3, CD4, CD8 und Cytokinen wie IL-2 oder/und TNF.
21 . Zelle nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine humane T-Zelle ist.
22. Zelle nach einem der Ansprüche 17 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus den T-Zell-Klonen und -Linien 234, Molt-4, Peer, Jurkat und Varianten davon.
23. Verfahren zur Expression eines T-Zellrezeptors, dadurch gekennzeichnet, daß man eine geeignete Wirtszelle mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 13 oder 14 transformiert und die Zelle unter Bedingungen kultiviert, die zu einer Expression des T-Zellrezeptors führen.
24. Reagenzienkit zur Herstellung eines TCR-Expressionsvektors umfassend
(a) einen Basisvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und (b) Primer zur Amplifikation von V-Regionen der TCRσ- und TCRß-
Kettengene. - 27 -
25. Reagenzienkit zur Herstellung eines TCR-Expressionsvektors umfassend
(a) zwei separate Vektoren enthaltend die Elemente der Expressionseinheit aus einem Basisvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und
(b) Primer zur Amplifikation von V-Regionen der TCRσ- und TCRß- Kettengene.
26. Reagenzienkit nach Anspruch 24 oder 25, weiterhin umfassend eine zur TCR-Expression geeignete Empfängerzelle.
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