DE19816129A1 - T-Zellrezeptor-Expressionskassette - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression von T-Zellrezeptoren und hierfür geeignete Vektoren. Weiterhin werden mit den Vektoren transfizierte Zellen offenbart, welche in der Lage sind, jeweils gewünschte T-Zellrezeptoren zu exprimieren.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression von T-Zellrezeptoren und hierfür geeignete Vektoren. Weiterhin werden mit den Vektoren transfizierte Zellen offenbart, welche in der Lage sind, jeweils gewünschte T-Zell­ rezeptoren zu exprimieren.

Die T-Lymphozyten des Immunsystems sind für die zelluläre Immunantwort verantwortlich. Die Erkennung erkrankter Körperzellen oder Tumorzellen erfolgt dabei durch den sog. T-Zellrezeptor (TCR), der ein für die erkrankte Zelle spezifisches Antigen in Form von kurzen Peptidfragmenten bindet. Diese Peptidfragmente werden von MHC-Molekülen an der Zelloberfläche präsentiert.

T-Zellrezeptoren bestehen aus zwei verschiedenen Polypeptiduntereinheiten, üblicherweise den sog. T-Zellrezeptor-α- oder β-Ketten, die miteinander durch eine Disulfidbrücke verbunden sind. Die α- und β-Ketten sind wiederum aus variablen und konstanten Regionen zusammengesetzt. Die variablen Regionen der α-Kette umfassen V- und J-Gensegmente, während die variablen Regionen der β-Kette V-, D- und J-Gensegmente umfassen.

Das chromosomale TCRα-Kettengen besteht aus ca. 50 bis 60 variablen Segmenten, von denen jedes ein Exon für ein Vα-Gensegment enthält, dem ein anderes Exon voransteht, das für eine Ledersequenz kodiert, die einen Import des Proteins in das endoplasmatische Reticulum und den Transport an die Zelloberfläche ermöglicht. Eine Gruppe von 61 J-Segmenten liegt in beträchtlicher Entfernung von den Vα-Segmenten. Den J-Segmenten folgt wiederum ein einzelnes Cα-Segment für den konstanten Bereich, das wiederum getrennte Exons für die konstante Region und die Hinge-Region sowie ein Exon für die Transmembran- und Cytoplasmaregionen enthält.

Der chromosomale TCRβ-Kettenlocus enthält eine Gruppe von ca. 65 Vβ-Gen­ segmenten, die in einiger Entfernung von zwei getrennten Clustern liegen, die jeweils ein einzelnes Dβ-Segment und 6 bzw. 7 Jβ-Segmente sowie ein einzelnes Cβ-Segment enthalten. Jedes konstante Segment der β-Kette besitzt separate Exons für die konstante Region, die Hinge-, die Transmembran- und die Cytoplasmaregion.

Während der Entwicklung und Reifung der T-Zelle werden die getrennten Gensegmente durch somatische Rekombination verknüpft. Für die α-Kette gelangt ein Vα-Gensegment neben ein Jα-Gensegment. Damit entsteht ein funktionelles Exon. Durch Transkription und Splicing des VJα-Exon an die konstante Region wird die mRNA gebildet, die zur TCRα-Kette translatiert wird. Die Umordnung der für die variable Domäne der β-Kette kodierenden Gensegmente Vβ, Dβ und Jβ schafft ein funktionelles Exon, das transkribiert und durch Splicing an Cβ angefügt wird. Die entstandene mRNA wird zur TCRβ-Kette translatiert. Die α- und β-Ketten verbinden sich nach ihrer Biosynthese zum α : β TCR Heterodimer. Der für die Spezifität der Antigenerkennung verantwortliche hypervariable Bereich des TCR, der im Bereich der Verknüpfung von V-, (D-) und J-Gensegmenten liegt, wird als CDR3 bezeichnet.

Häufig stellt die begrenzte Verfügbarkeit nativer T-Zellen eine erhebliche Beschränkung für immunologische Untersuchungen der von diesen Zellen exprimierten T-Zellrezeptoren auf funktioneller und molekularer Ebene dar. Andererseits können aufgrund des oben geschilderten komplexen Aufbaus des T-Zellrezeptors aus zwei Genen, die wiederum aus einer Vielzahl von Segmenten zusammengesetzt sind, komplette T-Zellrezeptoren in fremden Zellen nicht ohne weiteres rekombinant hergestellt werden.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, ein neues System zur rekombinanten Expression von T-Zellrezeptoren bereitzustellen, welches die Expression definierter MHC-restringierter T-Zellrezeptoren und damit deren Untersuchung auf funktioneller und molekularer Ebene erlaubt.

Diese Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellung einer Expressionseinheit, die Expressionskassetten für TCRα- bzw. TCRβ-Ketten enthält. Diese Expressionskassetten enthalten zumindest jeweils den 3'-seitigen Abschnitt der konstanten Anteile der TCRα- bzw. β-Kettengene, wobei im 5'-Bereich dieser Abschnitte künstlich eingefügte Restriktionsschnittstellen, insbesondere multiple Klonierungsstellen mit mehreren Restriktionsschnittstellen vorhanden sind, wobei vorzugsweise mindestens eine der Schnittstellen eine singuläre Schnittstelle ist. Wenn mehrere Schnittstellen vorhanden sind, ist die am weitesten 3'-seitig gelegene Schnittstelle von besonderer Bedeutung, da die 5'-seitig davon gelegenen Schnittstellen bei der Klonierung des V-Gens wegfallen. Durch Ausnutzung der Degeneration des genetischen Codes hat die Einführung dieser Schnittstellen keinen Aminosäureaustausch in den TCR-Ketten zur Folge. Zur Komplettierung der TCR-Ketten müssen noch die variablen TCR-Do­ mänen vor die bereits im Basisvektor enthaltenen konstanten Domänen kloniert werden. Falls für ein spezielles V-Gensegment erforderlich, können die künstlich eingefügten Restriktionsschnittstellen unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen partiell identischer Erkennungssequenz bei der Klonierung des variablen Anteils inaktiviert werden.

Durch die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren wird die einfache Expression von TCR-Sequenzen, insbesondere humanen TCR-Sequenzen in eukaryontischen Zellen ermöglicht. Dabei werden insbesondere drei Vorteile erreicht:

• 1. Die Expressionskassetten sind im wesentlichen für beliebige TCR-Sequenzen verwendbar und damit unabhängig von den umgelagerten V-Regiongenen.
• 2. Die in die erfindungsgemäßen Expressionskassetten einzuklonieren­ den DNA-Fragmente, bei denen es sich beispielsweise um PCR-Produkte handelt, sind nur kurz, so daß die Kontrollsequenzierung vereinfacht oder/und die Fehlerquote bei der Amplifikation minimiert werden kann. Vorzugsweise liegen daher die künstlichen Restriktions­ schnittstellen zur Klonierung der V-Regionen möglichst im 5'-Bereich der C-Regionen.
• 3. Die durch Mutagenese eingefügten Restriktionsschnittstellen haben weder eine Leserahmenverschiebung noch einen Aminosäureaus­ tausch im fertigen Polypeptid zur Folge. Weiterhin ist bevorzugt, daß sich keine identischen endogenen Schnittstellen innerhalb der entsprechenden Fragmente befinden, wodurch bei der Klonierung ein Partialverdau vermieden werden kann.

Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Basisvektor zur Herstellung eines TCR-Expressionsvektors, der eine Expressions­ kontrollsequenz in operativer Verknüpfung mit einer polycistronischen, vorzugsweise bicistronischen Expressionseinheit aufweist, umfassend:

• (a) zumindest einen Teil der für eine C-Region der TCRα-Kette kodierenden Nukleotidsequenz, wobei im 5'-Bereich der Nukleotidsequenz mindestens eine Restriktionsschnittstelle lokalisiert ist, und
• (b) zumindest einen Teil der für eine C-Region der TCRβ-Kette kodierenden Nukleotidsequenz, wobei im 5'-Bereich der Nukleotidsequenz mindestens eine Restriktionsschnittstelle lokalisiert ist.

Der Basisvektor kann ein prokaryontischer oder ein eukaryontischer Vektor sein. Vorzugsweise ist er ein in eukaryontischen Zellen, insbesondere in Säugerzellen wie etwa humanen Zellen propagierbarer Vektor. Beispiele für eukaryontische Vektoren sind bei Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition (1998), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kapitel 16, und Winnacker, Gene und Klone, "Eine Einführung in die Gentechnologie" (1985), VCH Verlagsgesellschaft, insbesondere in den Kapiteln 5, 8 und 10, beschrieben. Der Basisvektor kann ein chromosomaler oder episomaler Vektor sein. Besonders bevorzugt ist der Vektor ein episomal replizierbarer Vektor, insbesondere ein Plasmid.

Neben der polycistronischen Expressionseinheit enthält der erfindungs­ gemäße Basisvektor weitere für Expressionsvektoren übliche Sequenz­ elemente, z. B. ein oder mehrere Selektionsmarkergene, wie etwa Antibiotikum-Resistenzgene, einen oder mehrere Replikationsursprünge sowie die zur Transkription der Expressionskassette erforderliche Expressionskontrollsequenz. Diese Expressionskontrollsequenz kann eine prokaryontische oder eukaryontische Expressionskontrollsequenz sein. Besonders bevorzugt ist eine in eukaryontischen Zellen insbesondere in Säugerzellen aktive Expressionskontrollsequenz. Diese Expressions­ kontrollsequenz enthält einen Promotor und gegebenenfalls Trans­ kriptionsregulations- oder/und Aktivierungssequenzen wie Enhancer.

Die erfindungsgemäße polycistronische Expressionseinheit enthält zwei Nukleotidsequenzen, wovon eine für zumindest einen Teil der C-Region einer TCRα-Kette kodiert und die zweite für zumindest einen Teil der C-Region einer TCRβ-Kette kodiert. Die C-Region ist vorzugsweise eine humane Cα- bzw. Cβ-Region. Günstigerweise enthalten diese Nukleotidsequenzen den vollständigen 3'-Bereich der jeweiligen C-Regionen. Das Vorliegen eines vollständigen 5'-Bereichs ist hingegen nicht unbedingt erforderlich, da dieser - wie im folgenden erläutert - zu einem späteren Zeitpunkt zusammen mit der jeweiligen V-Region in den Basisvektor einkloniert werden kann. Im 5'-Bereich der für die C-Regionen kodierenden Nukleotidsequenzen befindet sich jeweils mindestens eine Restriktionsschnittstelle. Diese Restriktionsschnittstellen sind vorzugsweise für die TCRα-Kette und für die TCRβ-Kette jeweils verschieden. Besonders bevorzugt handelt es sich um singuläre Restriktionsschnittstellen, d. h. um Restriktionsschnittstellen, die im gesamten Vektor nur einmal vorkommen. Die Einführung dieser Restriktionsschnittstellen hat möglicherweise eine Mutation in der für die C-Region kodierenden Nukleotidsequenz zur Folge. Diese Mutation ist jedoch vorzugsweise eine "stille" Mutation, d. h. eine Mutation, die keinen Aminosäureaustausch in der C-Region zur Folge hat. Beispiele für geeignete Restriktionsschnittstellen, die in den 5'-Bereich der für die C-Region der TCRα-Kette kodierenden Nukleotidsequenz eingefügt werden können, sind Bam HI oder/und Xma I-Schnittstellen. Diese Restriktionsstellen können auf einfache Weise durch Mutationen in den Kodons 5 und 6 von Exon 1 der C- Region der TCRα-Kette eingeführt werden (vgl. z. B. Abb. 6). Besonders bevorzugt ist die Kassettenschnittstelle eine Bam HI-Stelle im Kodon 6 des Cα-Gens. Beispiele von Restriktionsschnittstellen für die C-Region der TCRβ- Kette sind Spe I oder/und Sa II-Schnittstellen, die durch Mutationen in den Kodons 28 und 29 der für die Cβ-Region kodierenden Nukleotidsequenz eingeführt werden (vgl. Abb. 7). Besonders bevorzugt ist die Kassettenschnittstelle eine Spe I-Stelle im Kodon 29 des Cβ-Gens.

Besonders bevorzugt werden Restriktionsschnittstellen in einen Bereich eingeführt, der für die ersten fünfzig Aminosäuren der jeweiligen C-Region des TCR-Kettengens kodiert. Besonders bevorzugt sind die TCRα- und TCRβ-Kettengene humanen Ursprungs, deren Sequenzen bei Yoshikai et al. (Nature 316 (1985), 837-840) und Toyonaga et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 8624-8628) beschrieben sind.

Weiterhin enthält die Expressionseinheit des erfindungsgemäßen Basisvektors vorzugsweise eine Sequenz, die eine "Capping" unabhängige Translation des durch Transkription der Expressionseinheit entstehenden polycistronischen mRNA-Moleküls erlaubt. Ein Beispiel für eine solche Sequenz ist eine IRES-Sequenz, wie sie in einer Vielzahl verschiedener Organismen, beispielsweise Viren, vorkommt. So finden sich IRES-Se­ quenzen in dem Picornaviridae, z. B. Cardioviren wie Encephalo­ myocarditisvirus, Enteroviren wie Poliovirus, Rhinoviren wie humanes Rhinovirus, Hepatoviren wie humanes Hepatitis-A-Virus (Fields et. al., Virology, 3rd Edition (1996), Lipincott-Raven Publishers, Philadelphia), in Flaviridae, z. B. Pestiviren wie Bovine Viral Diarrhea Virus (Vassiler et al., J. Virol. 71 (1997), 471-478) oder Classical Swine Fever Virus (Rijnbrand et al., J. Virol. 71(1997), 451-457), Retroviren wie z. B. HTLV-1 (Attal et al., FEBS Lett. 392 (1996), 220-224) oder Moloney-Murine Leukemia Virus (Vagner et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 20 376-20 383), Leishmania RNA Virus 1 (Maga et al., Mol. Cell. Biol. 15 (1995), 4884-4889), oder beim Menschen, z. B. im BiP-Gen (Yang und Sarnow, Nucleic Acids Res. 25 (1997), 2800-2807) oder im humanen Fibroblastenwachstumsfaktor 2 Gen (Vagner et al., Mol. Cell. Biol. 15 (1995), 35-44) oder bei Drosophila, z. B. im E74A-Gen (Jones et al., Insect. Biochem. Mol. Biol. 24 (1994), 875-882). Um eine möglichst hohe und ausgeglichene Expression des TCRα- und TCRβ-Kettengens zu ermöglichen, enthält die Expressionseinheit direkt 5'-seitig von jeder TCR-Kettensequenz eine ribosomale Translations­ initiationsstelle, z. B. die sog. Kozak-Sequenz.

Eine möglichst stöchiometrische Expression der TCRα-Kette und der TCRβ-Ket­ te ist bevorzugt. Darüber hinaus kann auch die Expression der TCRα-Ket­ te im Vergleich zur Expression der TCRβ-Kette limitiert sein. Hierzu kann beispielsweise die erfindungsgemäße Expressionskassette in 5'-3'-Richtung wie folgt aufgebaut sein: TCRβ-Kettengen; IRES-Sequenz; TCRα-Kettengen. Alternativ kann beispielsweise die ribosomale Initiationssequenz für das TCRα-Kettengen so modifiziert werden, daß die Translationsinitiatoren etwas schwächer als beim TCRβ-Kettengen ist.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen TCR-Expressionsvektor, der eine Expressionskontrollsequenz in operativer Verknüpfung mit einer polycistronischen, vorzugsweise bicistronischen Expressionseinheit aufweist, umfassend:

• (a) eine für eine vollständige TCRα-Kette kodierende Nukleotidsequenz und
• (b) eine für eine vollständige TCRβ-Kette kodierende Nukleotidsequenz, wobei die für die V-Regionen und C-Regionen der TCR-Ketten kodierenden Nukleotidsequenzen über Restriktionsschnittstellen im 5'-Bereich der C-Regionen miteinander verknüpft sind. Vorzugsweise weisen die für die TCR-Ketten kodierenden Nukleotidsequenzen im Bereich der Restriktions­ schnittstellen mindestens einen Basenaustausch gegenüber der natürlichen TCR-Sequenz auf, wobei die Basenaustausche im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes gewählt sind, d. h. zu einer "stillen Mutation" führen.

Der erfindungsgemäße TCR-Expressionsvektor kann grundsätzlich durch zwei verschiedene Verfahren hergestellt werden, nämlich indem man zuerst einen Basisvektor herstellt und darin die für eine gewünschte V-Region kodierenden Nukleotidsequenzen inseriert, oder indem man die für die gewünschten V-Regionen kodierenden Nukleotidsequenzen in zwei separaten Vektoren mit den entsprechenden C-Regionen kombiniert und dann aus diesen beiden Vektoren den Expressionsvektor bildet. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines TCR-Expressionsvektors umfassend die Schritte:

• (a) Bereitstellen eines Basisvektors wie zuvor angegeben und
• (b) Inserieren von Nukleotidsequenzen, welche die für eine gewünschte V-Region einer TCRα- oder TCRβ-kodierenden Bereiche enthält, in die Restriktionsschnittstellen, die in den 5'-Bereichen der für die C-Regionen kodierenden Nukleotidsequenzen lokalisiert sind, oder
  • (a') Bereitstellen von zwei Vektoren, die jeweils zumindest einen Teil der für die C-Region der TCRα- bzw. der TCRβ-Kette kodierenden Nukleotidsequenz enthalten, wobei im 5'-Bereich der Nukleotid­ sequenz jeweils mindestens eine Restriktionsschnittstelle lokalisiert ist,
  • (b') Inserieren von Nukleotidsequenzen, welche die für eine gewünschte V-Region einer TCRα- oder einer TCRβ-Kette kodierenden Bereiche enthalten, in die Restriktionsschnittstellen, die in den 5'-Bereichen der für die C-Regionen kodierenden Nukleotidsequenzen lokalisiert sind und
  • (c') Zusammensetzen der für die TCR-Ketten kodierenden Nukleotid­ sequenzen zu einer Expressionseinheit, um einen TCR-Expressions­ vektor zu erhalten.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mit einem Basisvektor oder mit einem TCR-Expressionsvektor wie zuvor trans­ formiert ist. Die Zelle kann eine prokaryontische Zelle, z. B. eine gramnegative Bakterienzelle, insbesondere E.coli sein. Eine für die TCR- Expression verwendete Zelle ist jedoch vorzugsweise eine eukaryontische Zelle, eine Säugerzelle, insbesondere eine humane Zelle. Beispiele für Verfahren zum Einführen der erfindungsgemäßen Vektoren in derartige Zellen finden sich bei Sambrook et al., supra, und Winnacker, supra.

Besonders bevorzugt wird zur Transformation eine Empfängerzelle verwendet, die zur Expression eines oder mehrerer akzessorischer Moleküle, d. h. zur Ausübung der T-Zellfunktion notwendiger Moleküle, in der Lage ist. Beispiele für solche akzessorischen Moleküle sind die Zelloberflächenmarker CD3, CD4, CD8 und Cytokine wie etwa IL-2 oder/und TNF. Am meisten bevorzugt ist die Empfängerzelle daher eine humane T-Zelle. Beispiele für geeignete humane T-Zellen sind die T-Zell-Klone und -Linien wie 234 (Prof. Wank, Institut für Immunologie, LMU München, Goethestr. 31, 80336 München), Molt-4 (ATCC CRL 1582), Peer (Schlesinger et al., Thymus. 2 (1981), 235-243), Jurkat (ATCC TIB-152) und Varianten davon wie Jurkat 9-5 (Boehringer Mannheim GmbH). Besonders bevorzugt werden cyto­ toxische T-Zellen verwendet.

Noch eine andere Möglichkeit zur Gewinnung von T-Zellen, die einen TCR mit gewünschter Spezifität exprimieren, besteht darin, daß man einen erfindungsgemäßen TCR-Expressionsvektor in die Keimbahn eines Tieres einführt und die T-Zellen aus dem resultierenden transgenen Tier oder Nachkommen davon gewinnt. Vorzugsweise werden transgene Mäuse her­ gestellt. Weiterhin ist es bevorzugt, daß die transgenen Mäuse neben dem TCR auch akzessorische Moleküle wie das humane CD8 Molekül oder/und das humane HLA-A*0201-Molekül exprimieren.

Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Expression eines TCR, wobei man eine geeignete Wirtszelle mit einem TCR-Expressionsvektor transformiert und die Zelle unter Bedingungen kultiviert, die zu einer TCR-Expression, vorzugsweise zu einer Expression als membranständiges TCR-Heterodimer führen.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Reagenzienkit zur Herstellung eines TCR-Expressionsvektors. In einer ersten Ausführungsform enthält der Reagenzienkit einen Basisvektor wie zuvor definiert und Primer zur Amplifikation von V-Regionen der TCRα und TCRβ-Kettengene. In einer zweiten Ausführungsform enthält der Reagenzienkit zwei separate Vektoren, die Elemente der Expressionseinheit aus dem Basisvektor getrennt enthalten, sowie geeignete Primer zur Amplifikation von V-Regionen.

Darüber hinaus kann der Reagenzienkit noch eine für die TCR-Expression geeignete Empfängerzelle, insbesondere eine humane T-Zelle, wie zuvor erläutert, enthalten.

Die Anmeldung wird weiterhin durch nachfolgende Figuren, Sequenz­ protokolle und Beispiele erläutert. Es zeigen:

Abb. 1: Die Herstellung der TCRα Expressionskassette. Von einer TCRα-spezifischen cDNA wurde unter Verwendung der Primer 5'CαEXPs und 3'CαEXP ein Amplifikat der TCRα-C-Region hergestellt, welches vom dritten Kodon bis zum Stopkodon reichte. Durch das Oligonukleotid 5'CαEXPs wurden Erkennungssequenzen für die Xma I- und Bam HI- und durch das Oligonukleotid 3'CαEXP eine Schnittstelle für die Sal I-Restriktionsendonuklease an die 5,- bzw. 3'-Enden der amplifizierten DNA-Moleküle angefügt. Die Klonierung der DNA-Stränge in pBSC II SK+ erfolgte über die Xma I und Sal I Schnittstellen. Nach der Sequenzierung wurde ein fehlerfreier Subklon ausgewählt und die Cα-Region über die Xma I und Sal I Schnittstellen in den Expressionsvektor pSBC II umkloniert. Der Vektor pSBC II enthält zwei singuläre Restriktionsschnittstellen Ase I und Not I, die die Fusion mit dem Vektor pSBC I ermöglichen (AmpR-Ampicillinresistenzgen, SV40P/E = Promotor- und Enhancersequenzen aus SV40, SV40pA = Polyandenylierungssignal aus SV40).

Abb. 2: Klonierung der Vα20 Domäne des T-Zell-Klons 26/B in die TCRα Expressionskassette. RNA des RCC-spezifischen Klons 26/B wurde TCR-spezifisch revers transkribiert und die resultierende cDNA unter Verwendung der Oligonukleotide TCRAV20EXP und 5'CαEXPas amplifiziert. Das Amplifikat umfaßte die gesamte Vα20 Region (beginnend am Startkodon) und die ersten neun Kodons der Cα-Region. Durch das Oligonukleotid TCRAV20EXP wurde eine Eco RI Schnittstelle und die optimale Kozak-Sequenz an das 5'-Ende und durch das Oligonukleotid 5'-CαEXPas eine Bam HI Schnittstelle an das 3'-Ende der amplifizierten DNA-Moleküle angefügt. Die Klonierung der DNA-Moleküle in den Vektor pBSC II SK+ wurde über die Eco RI und Bam HI Schnittstellen vollzogen. Nach der Sequenzierung wurde ein fehlerfreier Subklon ausgewählt und die Vα20-Domäne über Eco RI und Bam HI in die TCRα Expressionskassette (in pSBC II) einkloniert.

Abb. 3: Herstellung der TCRβ Expressionskassette. Von einer TCRβ-spe­ zifischen cDNA wurde unter Verwendung der Primer 5'CβEXPs und 3'CβEXP ein Amplifikat der TCRβ-C-Region hergestellt, welches vom 26. Kodon bis zum Stopkodon reichte. Durch das Oligonukleotid 5'CβEXPs wurden Erkennungssequenzen für Sal I- und Spe I- und durch das Oligonukleotid 3'CβEXP eine Schnittstelle für die Hind III-Re­ striktionsendonuklease an die 5,- bzw. 3'-Enden der amplifizierten DNA-Moleküle angefügt. Die Klonierung der DNA-Stränge in pBSC II SK+ erfolgte über die Sal I und Hind III Schnittstellen. Nach der Sequenzierung wurde ein fehlerfreier Subklon ausgewählt und die Cβ-Region über die Sal I und Hind III Schnittstellen in den Expressionsvektor pSBC I umkloniert. Der Vektor pSBC I enthält zwei singuläre Restriktions­ schnittstellen Ase I und Not I, die die Fusion mit dem Vektor pSBC II ermöglichen, und außerdem ein IRES (internal ribosomal entry site) Element.

Abb. 4. Klonierung der Vβ22 Domäne des T-Zell-Klons 26/B in die TCRβ Expressionskassette. RNA des RCC-spezifischen Klons 26/B wurde TCR-spezifisch revers transkribiert und die resultierende cDNA unter Verwendung der Oligonukleotide TCRBV22EXP und 5'CβEXPas amplifiziert. Das Amplifikat umfaßte die gesamte Vβ22 Region. Durch das Oligonukleotid TCRBV22EXP wurde eine Eco RI Schnittstelle und die optimale Kozak-Sequenz an das 5'-Ende und durch das Oligonukleotid 5'CβEXPas eine Spe I Schnittstelle an das 3'-Ende der amplifizierten DNA-Moleküle angefügt. Die Klonierung der DNA-Moleküle in den Vektor pBSC II SK+ wurde über die Eco RI und Spe I Schnittstellen vollzogen. Nach der Sequenzierung wurde ein fehlerfreier Subklon ausgewählt und die Vβ22-Domäne über die Eco RI und Spe I in die TCRβ Expressionskassette (in pSBC I) einkloniert.

Abb. 5: Fusion der Vektoren pSBC I und pSBC II zur bicistronischen TCR Expressionseinheit. Der Vektor pSBC I, der die TCRβ Kette des Klons 26/B enthielt, und der Vektor pSBC II, der die TCRα Kette des Klons 26/B enthielt, wurden mit den Restriktionsenzymen Ase I und Not I verdaut. Anschließend wurden die beiden Hälften, welche jeweils für eine TCR Kette kodierten, über dieselben Schnittstellen wieder ligiert, so daß auf dem fusionierten Expressionsvektor pSBC I/II beide TCR Ketten des Klons 26/B kodiert waren. Die Lage der Not I Schnittstelle führte dazu, daß das IRES Element des Vektors pSBC I im Fusionsvektor zwischen den beiden TCR-Genen zu liegen kam, was die Capping-unabhängige Translation der Vα-Kette ermöglichen sollte (MCS = multiple cloning site).

Abb. 6: TCRα Expressionskassette. Zentral ist die cDNA Sequenz im 5'-Bereich der Cα-Region aufgeführt, wobei die Tripletts dem tatsächlichen Leserahmen entsprechen. Die fettgedruckten Tripletts entsprechen den Kodons 5 und 6 im Exon 1. Der Primer 5'CαEXPs (über der cDNA Sequenz eingezeichnet) führt in den 5'-Bereich des Cα-Amplifikats eine Xma I und unter Ausnutzung des degenerierten Kodes an Position 3 im Kodon 5 (T nach G Transversion) und Position 3 im Kodon 6 (C nach T Transition) eine Bam HI Schnittstelle ein (ganz oben gezeigt).

Die Nukleotidaustausche, die in diesen beiden Kodons nur stille Mutationen hervorrufen, und die entsprechenden Aminosäuren (Prolin und Asparaginsäure) sind am unteren Bildrand aufgeführt. An denselben Positionen werden die 3'-Bereiche der Vα-Amplifikate durch die 5'CαEXPas Primer (unter der cDNA Sequenz gezeigt) identisch modifiziert und damit erneut eine Bam HI Erkennungssequenz geschaffen. Unter der 5'CαEXPas Sequenz ist ein hypothetischer Primer dargestellt, der eine Bgl II Erkennungssequenz trägt und bei der Klonierung des Vα-Segments die Bam HI Stelle, wie im Text beschrieben, inaktivieren kann.

Abb. 7: TCRβ Expressionskassette. Zentral ist die cDNA Sequenz im 5'-Bereich der Cβ-Region aufgeführt, wobei die Tripletts dem tatsächlichen Leserahmen entsprechen. Die fettgedruckten Tripletts entsprechen den Kodons 28 und 29 im Exon 1. Der Primer 5'CβEXPs (über der cDNA Sequenz eingezeichnet) führt in den 5'-Bereich des Cβ-Amplifikats eine Sal I und unter Ausnutzung des degenierten Kodes an Position 3 im Kodon 29 (G nach A Transition) eine Spe I Schnittstelle ein (ganz oben gezeigt). Die Nukleotidaustausche, die in Kodons 28 und 29 nur stille Mutationen hervorrufen, und die entsprechenden Aminosäuren (Threonin und Asparaginsäure) sind am unteren Bildrand aufgeführt. An denselben Positionen werden die 3'-Be­ reiche der Vβ-Amplifikate durch die 5'CβEXPas Primer (unter der cDNA Sequenz gezeigt) identisch modifiziert und damit erneut eine Spe I Erkennungssequenz geschaffen. Unter der 5'CβEXPas Sequenz ist ein hypothetischer Primer dargestellt, der eine Xba I Erkennungssequenz trägt und bei der Klonierung des Vβ-Segments die Spe I Stelle, wie im Text beschrieben, inaktivieren kann. Die Hybridisierungsorte der Oligonukleotide 5'CβEXPs und 5'CβEXPas sind in Cβ1 und Cβ2 identisch.

Abb. 8: Modell der "synthetischen" T-Zelle. Die Zellinie Jurkat 9-5 (Mitte) trägt das Gen für die β-Galaktosidase (lacZ), welches unter der Kontrolle des IL-2 Promotors steht, stabil in das Genom integriert. Die erfolgreiche Transfektion dieser Zelle mit dem pSBC I/II Fusionsvektor führt zur Expression der davon kodierten TCR Ketten auf der Zelloberfläche. Die Interaktion des exprimierten TCR mit seinem spezifischen Liganden führt zur Aktivierung des IL-2 Promotors und damit zur intrazellu­ lären Produktion von β-Galaktosidase. Durch die Lyse der Jurkat-Zellen wird die β-Galaktosidase frei und kann ein Substrat umsetzen, welches zur Färbung der Reaktionslösung führt.

Abb. 9 und SEQ ID NO. 1 bis 8: Oligonukleotide für die TCR-Expressionskassetten.

Beispiele Beispiel 1 Herstellung einer bicistronischen TCR-Expressionseinheit

Für die Herstellung eines TCR-Expressionssystems wurde der TCR des RCC-spezifischen zytotoxischen Klons 26/B gewählt. Das α-Kettengen dieses TCR besteht aus der variablen Region Vα20 und der konstanten Region Cα. Das TCRβ-Kettengen besteht aus der variablen Region Vβ22 und der konstanten Region Cβ. Die Sequenzen dieser und aller anderen bekannten V-Gensegmente sind bei Arden et al. (Immunogenetics 42 (1995), 455-500) publiziert.

Wie in den Abb. 1 bis 4 erläutert, erfolgte die Klonierung der TCR-Ketten in zwei Stufen: Im ersten Schritt wurden die C-Regionen kloniert (Abb. 1 und 3) d. h. die eigentlichen Kassetten fertiggestellt und im zweiten Schritt die entsprechenden V-Regionen in die Expressionskassetten eingefügt (Abb. 2 und 4). Als Basisvektoren wurden pSBC I und pSBC II (Dirks et al., Gene 128 (1993), 247-249) verwendet. Dabei handelt es sich um sog. Low Copy-Plasmide, so daß alle Fragmente in pBSC II SK + (Fa. Stratagene, Katalognr. 21 22 05) zwischenkloniert wurden. Dieser Vektor repliziert in Bakterien zur hohen Kopienzahl und erwies sich außerdem bezüglich der Restriktionsschnittstellen als besonders kompatibel zu den pBSC Vektoren.

Die Fragmente in pBSC II SK+ wurden sequenziert und die DNA aus fehlerfreien Subklonen in die Expressionsvektoren umkloniert. Zur Amplifikation der TCR-spezifischen cDNA wurden Primer eingesetzt, welche verschiedene Modifikationen in die entsprechenden DNA-Bereiche einfügten. Die 5'-Primer zur Amplifikation der C-Region (5'CαEXPs und 5'CβEXPs vgl. Abb. 9 und SEQ ID NO. 3 und 7) trugen jeweils zwei Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen, wobei die erste dieser Erkennungssequenzen frei wählbar war und dazu diente, die Kassette in den Expressionsvektor zu klonieren. Die zweite Erkennungssequenz stellte die eigentliche Kassetten­ schnittstelle dar und erlaubte die spätere Einklonierung der V-Region (siehe unten). Als 3'-Primer wurden die Oligonukleotide 3'CαEXP und 3'CβEXP (Abb. 9 und SEQ ID NO. 4 und 8) verwendet. Durch eine PCR (Protokoll: Prädenaturierung 94°C, 2 min, 1 Zyklus; Denaturierung 94°C, 30 sec, 30 Zyklen; Annealing 63°C, 30 sec, 30 Zyklen; Extension 72°C, 1 min, 30 Zyklen und Endpolymerisation 72°C, 10 min, 1 Zyklus) unter Verwendung der jeweiligen α-β-Primer-Kombination wurde der kodierende Abschnitt des jeweiligen C-Gensegments einschließlich des Stopkodons amplifiziert. Außerdem wurde jeweils eine Schnittstelle zur Klonierung eingefügt (Abb. 1 und 3).

Für die Klonierung der V-Regionen des Klon 26/B wurden die für das V-Gensegment spezifischen Primer TCRAV20EXP und TCRBV22EXP (Abb. 9 und SEQ ID NO. 1 und 5) verwendet. Diese Primer binden im Bereich des Startkodons an die V-Gensequenz und kodieren gleichzeitig für die optimale Kozak-Sequenz und eine Restriktionsschnittstelle. Die Kozak-Sequenz (CCR CCAUG (G), R = A oder G) beschreibt die optimale Sequenzumgebung für das Initiationskodon AUG, die für eine effiziente Translationsinitiation an diesem Startkodon wichtig ist. Die 3'-Primer, 5'CαEXPas und 5'CβEXPas (Abb. 9, SEQ ID NO. 2 und 6) hybridisieren im 5'-Bereich des jeweiligen C-Gensegments und führten Mutationen entsprechend den jeweils verwendeten Kassettenschnittstellen ein (Abb. 2 und 4).

Die Herstellung der bicistronischen Expressionseinheit erfolgte durch Fusion der beiden Vektoren pSBC I und pSBC II anhand zwei singulärer Restriktionsschnittstellen (Ase I und Not I, Abb. 5). Im resultierenden Fusionsvektor pSBC I/II flankieren die beiden TCR-Ketten ein IRES-Element, welches zur "Capping"-unabhängigen Translationsinitiation führt und damit eine effiziente Proteinsynthese beider TCR-Ketten ermöglicht. Da die Capping-abhängige Translation des 5'-seitig des IRES-Elements liegenden Gens etwas effizienter funktioniert als die des 3'-seitig liegenden Gens, wurde die TCRβ-Kette in pSBC I und TCRα-Kette in pSBC II kloniert. Auf diese Weise wurde - um die Ausbildung von TCRα-Homodimeren zu verhindern - eine Limitierung der α-Kettenexpression gegenüber der β-Kettenexpression erreicht.

Wie bereits oben erwähnt und in Abb. 5 dargestellt, wurden vor der TCRβ- und nach der TCRα-Kette Sfil Schnittstellen eingebaut, um eine Umklonierung der beiden Ketten mit dem dazwischenliegenden IRES-Ele­ ment zu erlauben. Dieselbe Sfil Schnittstelle befindet sich auch in der multiplen Klonierungsstelle des Vektors pHEBNA-1 (Mautner et al., Oncogene 12 (1996), 1299-1307 und Mucke et al., Gene Ther. 4 (1997), 82-92), welcher die Fähigkeit zur episomalen Replikation besitzt und deshalb eine stabile Transfektion überflüssig macht.

Beispiel 2 Restriktionsschnittstellen der Expressionskassette

Einen zentralen Punkt bei der Herstellung von "synthetischen T-Zellen" stellen die Restriktionsschnittstellen in den Expressionskassetten dar, welche die Einklonierung beliebiger TCR V-Domänen vor bereits fertig­ gestellten C-Domänen bei unveränderter TCR-Aminosäuresequenz ermöglichen. Die Abb. 6 und 7 zeigen schematisch den Aufbau und die Funktionsweise der TCRα- und β-Expressionskassetten.

Insbesondere ist der 5'-Bereich der jeweiligen C-Gensegmente dargestellt, in welchen sich die V-Region- und C-Regionamplifikate überschneiden. Wie im Detail den Abbildungen zu entnehmen ist, wurden durch Mutationen in den verwendeten Oligonukleotiden die aufgelisteten Restriktions­ schnittstellen eingefügt. Dabei diente die jeweils erste Schnittstelle der Klonierung des C-Gensegments in die Expressionsvektoren (TCRα : Xma I, TCRβ : Sa II). Die Einklonierung der V-Gensegmente erfolgte über die jeweils zweite Schnittstelle (TCRα : Bam HI, TCRβ : Spe I). Da durch das Einklonieren der V-Gensegmente die ersten Schnittstellen entfernt wurden, mußte bei deren Auswahl keine Rücksicht auf Leserahmenverschiebungen oder/und Aminosäureaustausche genommen werden.

Bei einer Untersuchung der zu klonierenden Regionen fanden sich endogene Restriktionsschnittstellen für Xma I im kodierenden Bereich von Vα20 und für Bam HI im 3'-untranslatierten Bereich von Cα. Da jedoch die V- und C-Segmente unabhängig voneinander und darüber hinaus die C-Regionen nur bis zum Startkodon kloniert wurden, konnten die beiden endogenen Erkennungssequenzen vernachlässigt werden. Wie zuvor erwähnt, können Restriktionsschnittstellen in der Expressionskassette bei Bedarf inaktiviert werden, was dann nötig ist, wenn eine Vα-Domäne eine endogene Bam HI bzw. eine Vβ-Domäne eine endogene Spe I Schnittstelle aufweist. Dazu können durch die für die Amplifikation der V-Region verwendeten 3'-Primer beliebige Restriktionsschnittstellen eingefügt werden, deren Kernsequenzen, d. h. die zentralen vier Basen der Erkennungssequenz, mit den entsprechen­ den Sequenzen der Bam HI bzw. Spe I Schnittstelle identisch sind (Tabelle 1).

Tabelle 1

Die in der zweiten Spalte von Tabelle 1 aufgeführten Restriktions­ endonukleasen erzeugen kohäsive Enden, welche mit den in der ersten Spalte angegebenen Restriktionsschnittstellen der Expressionskassette partiell identisch sind. Durch Anwendung dieser Enzyme können die Kassetten für die Ausgangsenzyme inaktiviert, jedoch durch die in der dritten Spalte aufgelisteten Enzyme wieder geschnitten werden. Die in den Klammern aufgeführten Enzyme stellen Isoschizomere dar.

Als Bespiel für die in der zweiten Spalte von Tabelle I aufgelisteten kompatiblen Restriktionsenzyme sind in Abb. 6 und 7 Bgl II für die TCRα-Ket­ te und Xba I für die TCRβ-Kette angegeben. Wichtig ist dabei, daß die verwendeten Enzyme asymmetrisch schneiden. Die Inaktivierung beruht darauf, daß die beiden "falschen" Nukleotide keine Auswirkung auf die fertigen Polypeptidketten haben. Für beide TCR-Ketten hat das erste Nukleotid keinen Aminosäurenaustausch zur Folge, da alle vier möglichen Basen an diesen Positionen für identische Aminosäuren kodieren (Abb. 6 und 7). Bedingt durch den asymmetrischen Schnitt der Restriktions­ endonukleasen wird das zweite falsche Nukleotid in den Gegensinnstrang eingebaut und hat deshalb keinen Effekt auf die translatierte mRNA.

Beispiel 3 Expression des T-Zellrezeptors in eukaryontischen Zellen

Um die Transfektion weiterer akzessorischer Moleküle wie z. B. CD3, CD4 oder/und CD8 überflüssig zu machen, wird der klonierte TCR vorzugsweise in einer humanen T-Zelle exprimiert. Bei der Auswahl der Empfängerzellen standen im wesentlichen zwei Aspekte im Vordergrund. Einerseits sollte die Empfängerzelle ein großes Proliferationspotential aufweisen, um ausreichend viele Zellen in relativ kurzer Zeit für die Transfektionsexperimente zur Verfügung zu haben, aber auch um erfolgreich transfizierte Klone, selbst nach großem Zellzahlverlust durch die Transfektion als solche, stark expandieren zu können. Darüber hinaus sollte die Empfängerzelle nach spezifischer Stimulierung über den transfizierten TCR eine eindeutige und messbare biologische Funktion ausüben.

Im folgenden werden kurz verschiedene humane T-Zellklone und T-Zellinien beschrieben, die aufgrund ihrer Wachstums- und anderer Eigenschaften prinzipiell als Empfängerzellen geeignet sind.

Ein Beispiel für eine geeignete Empfängerzelle ist der humane T-Zellkon 234. Diesen Klon zeichnen einige besondere Eigenschaften aus: Ein hohes Wachstumspotential, Cytotoxizität und ein endogener Rezeptor, der keine Determinante auf den RCC-26 Tumorzellen erkennt. Diese Nichterkennung ist besonders wichtig, da es sich bei diesem Klon um keine transformierte Zelle handelt, die deshalb einer regelmäßigen Restimulation über ihren endogenen TCR bedarf. Der größte Vorteil liegt in der Cytotoxizität der Zelle, welche als Nachweis der spezifischen T-Zellaktivierung eindeutig und leicht meßbar ist.

Als weitere Empfängerzellen kommen etablierte humane Zellinien in Betracht, z. B. Molt-4, Peer, Jurkat und verschiedene Jurkatvarianten. Diese Linien bieten den Vorteil eines schnellen Wachstums und sind darüber hinaus mit hoher Effizienz transfizierbar. Nachteilig für bestimmte Anwendungen ist jedoch, daß es sich um transformierte Zellinien handelt, die für einen therapeutischen Einsatz ungeeignet sind und keine Cytotoxizität aufweisen. Die spezifische Aktivierung dieser T-Zellen kann anhand sezernierter Cytokine wie Interleukin 2 (IL-2) und Tumornekrose­ faktor (TNF) nachgewiesen werden.

Mit einer besonderen Variante der Jurkat-Zelle (Jurkat 9-5) die das β-Galaktosidasegen (LacZ) unter Kontrolle des IL-2 Promotors stabil in das Genom integriert trägt, kann der Nachweis der Aktivierung besonders leicht geführt werden. Wie in Abb. 8 dargestellt, führt die Stimulierung der Transfektante über deren endogene oder transfizierte TCR zur Aktivierung des IL-2 Promotors, damit zur Transkription des LacZ-Gens und Akkumulation von β-Galaktosidase im Cytosol. Die Zugabe eines Puffers, welcher ein Detergens und ein Substrat für die β-Galaktosidase enthält, führt zur Lyse der Zellen und nachfolgend kann das Vorhandensein des Indikatorenzyms anhand einer Färbung des Reaktionspuffers nachgewiesen werden.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (26)

1. Basisvektor zur Herstellung eines TCR-Expressionsvektors, der eine Expressionskontrollsequenz in operativer Verknüpfung mit einer polycistronischen Expressionseinheit aufweist, umfassend:

• (a) zumindest einen Teil der für eine C-Region der TCRα-Kette kodierenden Nukleotidsequenz, wobei im 5'-Bereich der Nukleotidsequenz mindestens ein Restriktionsschnittstelle lokalisiert ist, und
• (b) zumindest einen Teil der für eine C-Region der TCRβ-Kette kodierenden Nukleotidsequenz, wobei im 5'-Bereich der Nukleotidsequenz mindestens eine Restriktionsschnittstelle lokalisiert ist.

2. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er in eukaryontischen Zellen propagierbar ist.

3. Vektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Plasmid ist.

4. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er ein episomal replizierbarer Vektor ist.

5. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionseinheit weiterhin eine Sequenz enthält, die eine "Capping"-unabhängige Translation des polycistronischen Transkriptionsprodukts erlaubt.

6. Vektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionseinheit eine IRES-Sequenz enthält.

7. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionseinheit eine limitierte Expression der TCRα-Kette im Vergleich zur Expression der TCRβ-Kette erlaubt.

8. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die C-Regionen der TCRα- und TCRβ-Ketten humanen Ursprungs sind.

9. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der im 5'-Bereich der für die C-Regionen der TCRα- und TCRβ-Ketten kodierenden Nukleotidsequenzen lokalisierten Restriktionsschnittstellen singulär sind.

10. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Restriktionsschnittstellen keinen Aminosäureaustausch in den C-Regionen zur Folge haben.

11. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im 5'-Bereich der für die C-Region der TCRα-Kette kodierenden DNA-Sequenz eine Bam HI- oder/und eine Xma I-Schnittstelle lokalisiert ist.

12. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im 5'-Bereich der für die C-Region der TCRβ-Kette kodierenden DNA-Sequenz eine Spe-I- oder/und eine Sa II Schnittstelle lokalisiert ist.

13. TCR-Expressionsvektor, der eine Expressionskontrollsequenz in operativer Verknüpfung mit einer polycistronischen Expressions­ einheit aufweist, umfassend:

• (a) eine für eine vollständige TCRα-Kette kodierende Nukleotidsequenz, und
• (b) eine für eine vollständige TCRβ-Kette kodierende Nukleotidsequenz,

wobei die für die V-Regionen und C-Regionen der TCR-Ketten kodierenden Nukleotidsequenzen über Restriktionsschnittstellen im 5'-Bereich der C-Regionen miteinander verknüpft sind.

14. TCR-Expressionsvektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die für die TCR-Ketten kodierenden Nukleotidsequenzen im Bereich der Restriktionsschnittstellen mindestens einen Basenaustausch gegenüber der natürlichen TCR-Sequenz aufweisen, wobei die Basenaustausche im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes gewählt sind.

15. Verfahren zur Herstellung eines TCR-Expressionsvektors nach Anspruch 13 oder 14, umfassend die Schritte:

• (a) Bereitstellen eines Basisvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und
• (b) Inserieren von Nukleotidsequenzen, welche die für eine gewünschte V-Region einer TCRα- oder TCRβ-Kette kodierenden Bereiche enthält, in die Restriktionsschnittstellen, die in den 5'-Bereichen der für die C-Regionen kodierenden Nukleotidsequenzen lokalisiert sind, oder
  • (a') Bereitstellen von zwei Vektoren, die jeweils zumindest einen Teil der für die C-Region der TCRα- bzw. der TCRβ-Kette kodierenden Nukleotidsequenz enthalten, wobei im 5'-Bereich der Nukleotidsequenz mindestens eine Restriktionsschnittstelle lokalisiert ist,
  • (b') Inserieren von Nukleotidsequenzen, welche die für eine gewünschte V-Region einer TCRα- oder TCRβ-Kette kodierenden Bereiche enthalten, in die Restriktions­ schnittstellen, die in den 5'-Bereichen der für die C-Regionen kodierenden Nukleotidsequenzen lokalisiert sind, oder
  • (c') Zusammensetzen der für die TCR-Ketten kodierenden Nukleotidsequenzen, um einen TCR-Expressionsvektor zu erhalten.

16. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Basisvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 13 transformiert ist.

17. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem TCR-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 13 bis 14 transformiert ist.

18. Zelle nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Säugerzelle ist.

19. Zelle nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur Expression eines oder mehrerer akzessorischer Moleküle in der Lage ist.

20. Zelle nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die akzessorischen Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus CD3, CD4, CD8 und Cytokinen wie IL-2 oder/und TNF.

21. Zelle nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine humane T-Zelle ist.

22. Zelle nach einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus den T-Zell-Klonen und -Linien 234, Molt-4, Peer, Jurkat und Varianten davon.

23. Verfahren zur Expression eines T-Zellrezeptors, dadurch gekennzeichnet, daß man eine geeignete Wirtszelle mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 13 oder 14 transformiert und die Zelle unter Bedingungen kultiviert, die zu einer Expression des T-Zellrezeptors führen.

24. Reagenzienkit zur Herstellung eines TCR-Expressionsvektors umfassend

• (a) einen Basisvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und
• (b) Primer zur Amplifikation von V-Regionen der TCRα- und TCRβ-Kettengene.

25. Reagenzienkit zur Herstellung eines TCR-Expressionsvektors umfassend

• (a) zwei separate Vektoren enthaltend die Elemente der Expressionseinheit aus einem Basisvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und
• (b) Primer zur Amplifikation von V-Regionen der TCRα- und TCRβ-Kettengene.

26. Reagenzienkit nach Anspruch 24 oder 25, weiterhin umfassend eine zur TCR-Expression geeignete Empfängerzelle.