DE4021917A1 - Glykosyliertes ifnalpha - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von O-glykosyliertem Interferon alpha, das O-glykosylierte Interferon alpha selbst, sowie dessen Verwendung. Besonders bevorzugt ist das O-glykosylierte humane Interferon alpha 2, insbesondere Interferon alpha 2C sowie dessen Verwendung als Arzneimittel.

Hergestellt werden können diese Interferone durch Insertion der entsprechenden DNA-Moleküle in geeignete, vorzugsweise in die erfindungsgemäßen Expressionsplasmide und Transfektion geeigneter Säugetierzellen mit diesen Plasmiden, Kultivierung, Ernten des Zellüberstandes und Isolierung und Reinigung des O-glykosylierten IFN alpha.

Aufgrund ihrer Eigenschaften sind die sekretierten O-glykosylierten Interferone geeignet, als Arzneimittel bzw. in Arzneimitteln Verwendung zu finden.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung lediglich erläutern ohne sie zu beschränken.

Beispiele für die Konstruktion eines eukaryotischen Expressionsplasmides für sekretiertes huIFNa2C Beispiel 1 Konstruktion der Expressionsplasmide pAD-CMV13, pAD-CMV15 und pAD-CMV19

Aus Teilen von Expressionsplasmiden (pCDM8, Seed & Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 8573-8577; B. Seed, Nature 329 (1987) 840-842); Invitrogen, Inc., San Diego, CA; pSV2gptDHFR20, EP-A1 03 21 842) und dem Plasmid pBluescript KS- (Short et al., Nucleic Acids Res., 11 (1988) 5521-5540; Stratagene, La Jolla, CA)) wurden neue Plasmide konstruiert, die eine Multiklonierstelle für die gerichtete Insertion heterologer DNA-Sequenzen aufweisen und sich in E. coli mittels Ampicillinresistenz mit hoher Kopienzahl vermehren lassen. Die intergenische Region von M13 ermöglicht die Herstellung einzelsträngiger Plasmid-DNA nach Superinfektion der transformierten Bakterien mit einem Helferphagen (z. B. R408 oder M13K07), zur erleichterten Sequenzierung und Mutagenese der Plasmid-DNA. Der T7 Promoter der der Multiklonierstelle vorangeht ermöglicht in vitro die Herstellung von RNA Transkripten. In Säugetierzellen erfolgt die Expression heterologer Gene getrieben vom Cytomegalovirus (CMV) Promotor/Enhancer (M. Boshart et al., Cell 41 (1985) 521-530). Der SV40 Replikationsursprung ermöglicht in geeigneten Zellinien (z. B. SV40 transformierte Zellen wie COS-7, Adenovirus transformierte Zellinie 293 (ATCC CRL1573) die autonome Replikation des Expressionsplasmides zu hohen Kopienzahlen und damit hohe Raten in transienter Expression. Für die Herstellung permanent transformierter Zellinien und die nachfolgende Amplifikation der Expressionskassette mittels Methotrexat dient ein modifiziertes Hamster Minigen (Promoter mit kodierendem Bereich und dem ersten Intron) für Dihydrofolatreduktase (DHFR) als Selektionsmarker.

Herstellung der Vektor- und Promoteranteile durch Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR)

Das Plasmid pBluescript KS- wurde mit HindIII linearisiert und 100 ng DNA in einem 100 µl PCR (Saiki et al., Science 239 (1988) 487-491) Ansatz eingesetzt (Reaktionsmedium: 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% (w/v) Gelatine, 0,2 mM jeder der vier Desoxynukleosidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 2,5 units Taq Polymerase pro 100 µl). Als Primer wurden je 50 pmol der synthetischen Oligonukleotide EBI-1786 (5′-GGAATTCAGCCTGAA­ TGGCGAATGGG-3′) und EBI-2134 (5′-CACTGAACTCGAGCAGC­ TGCGTTGCTGGCGTTTTTCC-3′) eingesetzt. Nach 5 Minuten Denaturieren bei 94°C erfolgte die PCR über 10 Zyklen (Zyklusbedingungen: 40 sec bei 94°C, 45 sec bei 55°C, 5 Min bei 72°C, Perkin Elmer Cetus Thermal Cycler). Die Oligonukleotide flankieren die intergenische Region von M13 bzw. den Replikationsursprung (ori) mit dem dazwischenliegenden Gen für die β-Lactamase. Gleichzeitig wird am Ende des ori eine XhoI- und eine PvuII- und am anderen Ende eine EcoRI-Schnittstelle erzeugt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Extraktion mit Phenol-Chloroform von Protein befreit und die DNA mit Äthanol präzipitiert. Die erhaltene DNA wurde mit XhoI und EcoRI geschnitten und nach Elektrophorese in einem Agarosegel ein Fragment mit 2,3 kb isoliert.

50 ng mit SacII linearisiertes Plasmid pCDM8 wurde mit den Oligonukleotiden EBI-2133 (5′-GGTCACTGTCGACAT­ TGATTATTGACTAG-3′) und EBI-1734 (5′-GGAATTCCCT­ AGGAATACAGCGG-3′) unter identischen Bedingungen wie zuvor beschrieben durch PCR amplifiziert. Die Oligonukleotide binden am Beginn der CMV-Promoter/Enhancer Sequenz und erzeugen eine SalI Schnittstelle (EBI-2133), bzw. binden am Ende der SV40 poly-Adenylierungstelle und erzeugen eine EcoRI Schnittstelle (EBI-1734). Das PCR Produkt wurde mit SalI und EcoRI geschnitten und ein DNA Fragment von 1,8 kb aus einem Agarosegel isoliert.

Die beiden nachgeschnittenen PCR Produkte wurden mit T4 DNA-Ligase ligiert und E.coli HB101 transformiert. Ein Plasmid der gewünschten Struktur (siehe Fig. 1) wurde pCMV+M13 benannt.

Der SV40 Replikationsursprung (SV40 ori) wurde aus dem Plasmid pSV2gptDHFR20 (EP-A1 03 21 842) isoliert. Dazu wurde dieses Plasmid mit HindIII und PvuII doppelt geschnitten und die DNA-Enden durch nachfolgende Behandlung mit dem großen Fragment der E.coli DNA Polymerase (Klenow Enzym) in Gegenwart der vier Desoxynukleotidtriphosphate stumpf gemacht. Ein entstandenes 0,36 kb DNA Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert und in mit EcoRI linearisiertem Plasmidvektor pCMV+M13 ligiert. Ein nach Transformation von E.coli HB101 erhaltenes Plasmid, das den SV40 ori in gleicher Orientierung wie β-Lactamase Gen und CMV-Promoter enthielt, wurde pCMV+SV40 benannt (Fig. 1).

Plasmid pCMV+SV40 wurde mit EcoRI und BamHI doppelt geschnitten und die DNA-Enden anschließend mit Klenow-Enzym stumpf gemacht. Die DNA wurde durch Extraktion mit Phenol-Chloroform und Äthanolfällung gereinigt. Ein Teil der DNA wurde mit T4 DNA Ligase zirkularisiert und ein nach Transformation von E.coli erhaltenes Plasmid pAD-CMV10 benannt (Fig. 2). Der Rest der pCMV+SV40 DNA wurde durch Inkubation mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und der 4,4 kb lange Vektor aus einem Agarosegel isoliert.

Plasmid pSV2gptDHFR-Mut2 (siehe Beispiel 4, Fig. 9), das ein modifiziertes Hamster Dihydrofolatreduktase (DHFR) Minigen enthält, aus dem durch gerichtete Mutagenese die Restriktionsenzymschnittstellen für EcoRI, PstI, BglII, BamHI und KpnI entfernt wurden, wurde mit EcoRI und PstI doppelt geschnitten und die DNA-Enden durch 20 Minuten Inkubation bei 11°C mit 5 units T4 DNA-Polymerase (Reaktionsmedium: 50 mM Tris-Cl pH 8,0, 5 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreit, 0,1 mM jedes der vier Desoxynukleotidtriphosphate, 50 µg/ml Rinderserumalbumin) stumpf gemacht. Das 2,4 kb lange DNA-Fragment mit dem mutierten DHFR-Gen wurde aus einem Agarosegel isoliert und mit dem wie oben beschriebenen präparierten pCMV+SV40 ligiert. Ein nach Transformation von E.coli erhaltenes Plasmid, in dem das DHFR-Gen in derselben Orientierung wie der CMV-Promoter enthalten war, wurden pAD-CMV10A benannt (Fig. 2).

Ausgehend vom Expressionsplasmid pAD-CMV1 (siehe Beispiel 4, Fig. 10), das zwischen Multiklonierstelle und poly-Adenylierungssignal eine Intronsequenz enthält, wurden mehrere Varianten hergestellt, die sich durch die Anzahl und Lage der Introns relativ zur Multiklonierstelle unterscheiden. In pAD-CMV13 (Fig. 4) wurde das SV40 t Antigen Intron zwischen Multiklonierstelle und poly-Adenylierungstelle deletiert; pAD-CMV15 (Fig. 3) enthält ein synthetisches Intron zwischen CMV Promotor und Multiklonierstelle und das SV40 t Antigen Intron zwischen Multiklonierstelle und poly-Adenylierungssignal; pAD-CMV19 (Fig. 4) enthält nur ein Intron zwischen CMV Promoter und Multiklonierstelle.

100 ng mit HindIII linearisiertes Plasmid pAD-CMV1 wurde mit je 50 pMol der Oligonukleotide EBI-2625 (5′-CACTGATCTAGAGATATCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGG-3′) und EBI-1857 (5′-GGCAAGGGCAGCAGCCGG-3′) in 100 µl PCR Ansatz (siehe oben) in 10 PCR Zyklen (40 sec 94°C, 45 sec 55°C, 90 sec 72°C) ein 1,26 kb langes DNA Fragment amplifiziert. EBI-2625 bindet kurz vor dem SV40 poly-Adenylierungssignal (Position 1280 in pAD-CMV1) und enthält zusätzliche Restriktionsschnittstellen für XbaI und EcoRV. EBI-1857 bindet am komplementären DNA Strang im ersten Intron des nachfolgenden DHFR Minigens (Position 2525 in pAD-CMV1). Das PCR Produkt wurde durch Extraktion mit Phenol und Chloroform von Protein befreit und die DNA mit Äthanol gefällt. Die DNA wurde mit XbaI und BglII doppelt geschnitten, ein 0,32 kb langes DNA Fragment aus einem Agarosegel isoliert und in mit den gleichen Enzymen doppelt geschnittenen Plasmidvektor (5,8 kb) pAD-CMV1 ligiert. Ein nach Transformation von E.coli HB101 erhaltenes Plasmid der gewünschten Beschaffenheit (siehe Fig. 4) wurde pAD-CMV13 benannt.

Die dem CMV Promoter folgende Spleiß-Donor Sequenz (M. Boshart et al., Cell 41 (1985) 521-530) wurde durch SOE-PCR (splicing by overlap extension; S.N. Ho et al., Gene 77 (1989) 51-59) mit der Spleiß-Acceptorstelle des ersten Introns des humanen β-Globin Gens (Lawn et al., Cell 21 (1980) 647-651) gefolgt von der Multiklonierstelle von Plasmid pAD-CMV1 verbunden. Dazu wurden 100 ng Plasmid pGJ7 (G. Jahn et al., J. Virology 49 (1984) 363-370) enthaltend die Promoter und Enhancer Sequenz von humanem Cytomegalovirus Stamm AD169 (Boshart et al., Cell 41 (1985) 521-530) mit je 50 pMol der Oligonukleotide EBI-2133 (siehe oben) und EBI-2586 (5′-GCAGAGAGAGTCAGTGCCTATCA­ GAAACCCAAGAGTCTTCTCTATAGGCGGTACTTACCTGACTCTTG-3′) in 100 µl PCR Reaktionsgemisch über 30 Zyklen amplifiziert (Zyklusbedingungen: 40 sec 94°C, 45 sec 45°C, 90 sec 72°C). Die letzten 24 Basen von EBI-2586 passen perfekt an die CMV-Sequenz (in antisense Orientierung) und die vorangehenden Basen entsprechen der β-Globin Intron Sequenz, wobei 18 Basen perfekt zur revers komplementären Sequenz von Oligonukleotid EBI-2585 passen und die überlappende DNA-Sequenz für die SOE-PCR bilden. Die PCR Produkte wurden in einem Agarosegel aufgetrennt und ein 0,8 kb DNA Fragment isoliert (Fig. 3). 100 ng Plasmid pAD-CMV1 wurden in gleicher Weise mit den Oligonukleotiden EBI-2585 (5′-GCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCT­ GGTGCTTAACTGGCTTATCG-3′) und EBI-2112 (5′-GTCCAATTATGTCACACC-3′) durch PCR amplifiziert und ein 0,2 kb DNA Fragment aus einem Agarosegel isoliert. EBI-2585 enthält die letzten 45 Basen des β-Globin Introns und die fünf darauf folgenden Basen, sowie 17 Basen am 3′-Ende, die perfekt an Position 611-627 der pAD-CMV1 Sequenz hybridisieren können. EBI-2112 bindet am komplementären DNA Strang an Position 743-760 an die pAD-CMV1 Sequenz. 1/10 des isolierten 0,8 kb DNA Fragments und 1/30 des 0,2 kb DNA Fragments wurden in einem neuen 100µl PCR Ansatz (SOE-PCR) gemischt und mit je 50 pMol der Oligonukleotide EBI-2133 und EBI-2112 in 30 PCR Zyklen (40 sec 94°C, 45 sec 45°C, 2 min 72°C) amplifiziert. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol und Chloroform gestoppt und die DNA mit Äthanol gefällt. Die 5′-Enden des PCR Produktes wurden mit T4 Polynukleotidkinase phosphoryliert (Reaktionspuffer: 70 mM Tris-Cl pH 7,6, 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreit, 1 mM ATP) und anschließend mit XbaI geschnitten. Die DNA wurde in einem Agarosegel aufgetrennt und ein Fragment von 0,98 kb Länge isoliert. Plasmid pAD-CMV10 wurde mit PvuII und XbaI doppelt geschnitten und der Vektoranteil ohne CMV Promotor aus einem Agarosegel isoliert. Dieser Plasmidvektor wurde mit dem 0,97 kb DNA Fragment, enthaltend den CMV Promoter und Enhancer mit Intron und Multiklonierstelle, ligiert und E.coli HB101 transformiert. Von den erhaltenen Transformanten wurde Plasmid DNA hergestellt und das neue DNA Insert mit den Oligonukleotiden EBI-2112, EBI-2586 und EBI-1733 (5′-GGTCGACATTGATTATTGACTAG-3′) nach der Didesoxy-Kettenabbruch Methode (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463-5467) mit modifizierter T7 DNA Polymerase (S. Tabor and C.C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (4767-4771); Sequenase, United States Biochemical Corp.) sequenziert. Ein Plasmid mit der erwarteten Sequenz wurde pAD-CMV15 benannt (Fig. 3).

pAD-CMV10A wurde mit SpeI und BglII doppelt geschnitten unter der Vektoranteil ohne CMV Promoter aus einem Agarosegel isoliert. pAD-CMV15 wurde mit SpeI und HindIII doppelt geschnitten und ein 0,8 kb DNA Fragment enthaltend den CMV Promoter und das synthetische Intron, isoliert. pAD-CMV13 wurde mit HindIII und BglII doppelt geschnitten und ein 0,36 kb DNA Fragment isoliert, das die Multiklonierstelle, das SV40 early poly-Adenylierungsignal und einen Teil der Hamster-DHFR Promoterregion enthielt. Diese drei DNA Fragmente wurden mit T4 DNA Ligase ligiert und E.coli HB101 transformiert. Von den erhaltenen Transformanten wurde Plasmid DNA hergestellt und durch Schneiden mit verschiedenen Restriktionsenzymen charakterisiert. Ein Plasmid der gewünschten Struktur wurde pAD-CMV19 benannt (Fig. 4, Fig. 5).

Beispiel 2 Herstellung einer modifizierten cDNA für huIFNα2C

Die für humanes IFNα2C kodierende cDNA des Klons lF7 (E. Dworkin-Rastl et al., J. Interferon Res. 2 (1982) 575-585; E. Dworkin-Rastl et al., Gene 21 (1983) 237-248) wurde mittels PCR in der 5′-nicht kodierenden Region modifiziert, indem diese gegen die Sequenz der 5′-nicht kodierende Region der humanen β-Globin mRNA (Lawn et al., Cell 21 (1980) 647-651) ausgetauscht wurde. Eine derartige Veränderung der 5′-nicht kodierenden Region bewirkt eine deutliche Erhöhung der Expression, möglicherweise durch eine effizientere Initiation der Translation. Gleichzeitig wurden an beiden Enden der cDNA Restriktionsenzymschnittstellen eingeführt, die eine nachfolgende gerichtete Klonierung der cDNA in Expressionsplasmide erleichterten.

100 ng mit EcoRI linearisiertes Plasmid lF7 wurden mit je 50 pMol der Oligonukleotide EBI-2747 (5′-CTTCAGAAGCTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCT­ CAAACAGACACCATGGCCTTGACCTTTGCTTTAC-3′) und EBI-2744 (5′-GACTTCAGTCTAGAGAACCAGTTTTCATTCCTTACTTC-3′) in 100 µl PCR Ansatz in 20 Zyklen (40 sec 94°C, 45 sec 55°C, 90 sec 72°C) amplifiziert. EBI-2747 enthält nach einer HindIII Schnittstelle die 5′-nicht kodierende Region der humanen β-Globin mRNA gefolgt von den ersten 22 Basen der für das Signalpeptid von huIFNα2C kodierenden Sequenz (Startkodon ist unterstrichen). EBI-2744 bindet am komplementären Strang am Ende der für huIFNα2C kodierenden Sequenz (Stopkodon ist unterstrichen) und enthält eine Schnittstelle für XbaI. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol und Chloroform gestoppt und die DNA mit Äthanol gefällt. Das PCR Produkt wurde mit HindIII und XbaI an den Enden nachgeschnitten und das 0,64 kb lange DNA Fragment aus einem Agarosegel isoliert (Fig. 6, Fig. 7). Plasmid pAD-CMV19 wurde ebenfalls mit HindIII und XbaI doppelt geschnitten und anschließend mit dem cDNA Fragment ligiert. Nach Transformation von E.coli HB101 erhaltene Kolonien wurden zur Präparation von Plasmid DNA gezüchtet. Eines der erhaltenen Plasmide wurde über den Verlauf des insertierten HindIII-XbaI Bereiches vollständig sequenziert. Mit Ausnahme eines einzigen Basenaustausches (CTG zu TTG) im 8. Kodon des Signalpeptides, der jedoch zu keiner Änderung der kodierten Aminosäure (Leu) führte, wurde die erwartete Sequenz erhalten. Das Expressionsplasmid für sekretiertes und O-glykosyliertes huIFNα2C wurde pAD19B-IFN benannt (Fig. 6).

Beschreibung der Sequenzelemente von Plasmid pAD-CMV19 (Fig. 5)

Basen
   1-21 Bindungsstelle von Oligonukleotid EBI-2133
   1-590 Cytomegalovirus Enhancer und Promoter
 722-740 Intronsequenz von Cytomegalovirus (Splice Donor)
 741-805 Intronsequenz von humanem β-Globin (Splice Acceptor)
 836-853 T7 Promoter
 862-922 Multiklonierstelle
 923-1055 Polyadenylierungsstellen von SV40
1056-1953 Promoter und 5′-nicht kodierende Region von Hamster DHFR Gen
1954-2039 DHFR Exon 1
2040-2333 DHFR Intron 1
2151-2168 Bindungsstelle von EBI-1857
2344-2821 DHFR Exons 2-6 kodierender Bereich
2822-3474 DHFR 3′-nicht kodierende Region
3475-3812 SV40 Replikationsursprung (SV40 ori)
3813-6055 pBluescript Anteil
3813-4291 M13 intergenische Region (M13 ori)
4423-5283 β-Lactamase, kodierende Region
6038-6062 Bindungsstelle von EBI-2134

Beispiel 3 Transiente Expression von huIFNα2C in höheren eukaryotischen Zellen

Etwa 10⁶ Zellen (293, humane embryonale Nierenzellen transformiert mit einem Teil des Adenovirus AD5 Genoms; F.L. Graham et al., J. Gen. Virol., 36 (1977) 59-77; ATCC CRL1573) pro 80 mm Petrischale wurden 24 Stunden vor der Transfektion mit Medium (Dulbecco s MEM/Nutrient Mix F12 (1 : 1) mit 15 mM Hepes; Gibco) mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum angesetzt und bei 37°C in 5% CO₂ Atmosphäre inkubiert. Die Zellen wurden 3 Stunden vor der Transfektion mit 10 ml frischem Medium versehen und bei 37°C inkubiert. 10 µg Plasmid DNA (gereinigt durch zweimalige CsCl Dichtegradientenzentrifugation) pAD19B-IFN gelöst in 0,5 ml 250 mM CaCl₂ wurden tropfenweise zu 0,5 ml 2× HBS (16,36 g/l NaCl, 11,9 g/l Hepes, 0,40 g/l Na₂HPO₄, pH 7,12) zugefügt. Das entstandene Präzipitat wurde zu einer Petrischale zugegeben und die Zellen weitere 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, 30 Sekunden mit 15% Glyzerin in 1× HBS geschockt, nochmals mit PBS gewaschen und mit 10 ml frischem Medium mit 10% Kälberserum bei 37°C inkubiert. Nach 72 Stunden wurde der Zellüberstand geerntet und zum Nachweis des sekretierten IFN verwendet.

Beispiel 4 Konstruktion der Expressionsplasmide pAD-CMV1 und pAD-CMV2

Aus Teilen der Expressionsplasmide pCDM8 (Seed und Aruffo, 1987. Seed, 1987; Invitrogen), pSV2gptDHFR20 (EP-A1 03 21 842) und dem Plasmid Bluescript SK+ (Short et al., 1988; Stratagene) wurde ein neues Plasmid konstruiert, das eine Multiklonierstelle für die gerichtete Insertion heterologer DNA-Sequenzen aufweist und sich in E.coli mittels Ampicillinresistenz mit hoher Kopienzahl vermehren läßt. Die intergenische Region von M13 ermöglicht die Herstellung einzelsträngiger Plasmid-DNA mittels Superinfektion der transformierten Bakterien mit einem Helferphagen (z. B. R408 oder M13K07) zur erleichterten Sequenzierung und Mutagenese der Plasmid-DNA. Der T7 Promotor, der der Multiklonierstelle vorangeht, ermöglicht die Herstellung von RNA Transkripten in vitro. In Säugetierzellen erfolgt die Expression heterologer Gene getrieben vom Cytomegalovirus (CMV) Promoter/Enhancer (Boshart et al., 1985). Der SV 40 Replikationsursprung ermöglicht in geeigneten Zellinien (z.B. SV40 transformierte Zellen wie COS-7, Adenovirus transformierte Zellinie 293 (ATCC CRL1573) die autonome Replikation des Expressionsplasmides zu hohen Kopienzahlen und damit hohe Raten in transienter Expression. Für die Herstellung permanent transformierter Zellinien und die nachfolgende Amplifikation der Expressionskassette mittels Methotrexat dient ein modifiziertes Hamster-Minigen (Promoter mit kodierendem Bereich und dem ersten Intron) für Dihydrofolatreduktase (DHFR) als Selektionsmarker.

a) Herstellung der Vektor- und Promoteranteile durch PCR

Das Plasmid Bluescript SK+ wurde mit HindIII linearisiert und 5 ng DNA in einem 100 µl PCR Ansatz eingesetzt (Reaktionspuffer: 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl pH=8,3, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% (w/v) Gelatine, 0,2 mM der vier Desoxynukleotidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 2,5 Einheiten Taq Polymerase pro 100 µl). Als Primer wurden je 50 pmol der synthetischen Oligonukleotide EBI-1786 (5′-GGAATTCAGCCTGAA­ TGGCGAATGGG-3′; bindet knapp außerhalb von M13 ori-Region in Bluescript Pos. 475, unabhängig von M13 ori-Orientierung) und EBI-1729 (5′-CCTCGAGCGTTGC­ TGGCGTTTTTCC-3′; bindet an Bluescript an Pos. 1195 vor ori, entspricht dem Anfang der Bluescript-Sequenz in pCDM8, 6 Basen 5′ ergeben XhoI) eingesetzt. Nach 5 Minuten Denaturieren bei 94°C erfolgte die PCR über 20 Zyklen (40 sec bei 94°C, 45 sec bei 55°C, 5 min bei 72°C, Perkin Elmer Cetrus Thermal Cycler). Die Oligonukleotide flankieren die intergenische Region von M13 bzw. den Replikationsursprung (ori) mit dem dazwischenliegenden Gen für die β-Lactamase. Gleichzeitig wird am Ende des Replikationsursprungs eine XhoI- und am anderen Ende eine EcoRI-Schnittstelle erzeugt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Extraktion mit Phenol-Chloroform von Protein befreit und die DNA mit Ethanol präzipitiert. Die erhaltene DNA wurde mit XhoI und EcoRI geschnitten und nach Elektrophorese in einem Agarosegel ein Fragment mit 2,3 kb isoliert.

5 ng mit SacII linearisiertes Plasmid pCDM8 wurden mit den Oligonukleotiden EBI-1733 (5′-GGTCGACATTGA­ TTATTGACTAG-3′; bindet an CMV-Promotorregion (Pos. 1542) von pCDM8, entspricht Pos. 1 in pAD-CMV, SalI-Stelle für Klonierung) und EBI-1734 (5′-GGAATTCCCTAG­ GAATACAGCGG-3′; bindet an Polyoma origin von 3′SV40 polyA-Region in pCDM8 (Pos. 3590)) unter identischen Bedingungen wie für Bluescript SK+ beschrieben, durch PCR amplifiziert. Die Oligonukleotide binden am Beginn der CMV-Promoter-Enhancer-Sequenz und erzeugen eine SalI Schnittstelle (EBI-1733) bzw. binden am Ende der SV40 poly-Adenylierungstelle und erzeugen eine EcoRI Schnittstelle (EBI-1734). Das PCR-Produkt wurde mit SalI und EcoRI geschnitten und ein DNA Fragment von 1,8 kb aus einem Agarosegel isoliert.

Die beiden PCR Produkte wurden mit T4 DNA-Ligase ligiert, mit dem erhaltenen Ligationsprodukt E.coli HB101 transformiert und nach Standardmethoden Plasmid-DNA amplifiziert und präpariert. Das Plasmid der gewünschten Beschaffenheit (siehe Fig. 8) wurde pCMV-M13 benannt.

Der SV40 Replikationsursprung (SV40 ori) wurde aus dem Plasmid pSV2gptDHFR20 (EP-A1 03 21 842) isoliert. Dazu wurde dieses Plasmid mit HindIII und PvuII doppelt geschnitten und die DNA-Enden durch nachfolgende Behandlung mit dem großen Fragment der E.coli DNA Polymerase (Klenow Enzym) in Gegenwart der vier Desoxynukleotidtriphosphate stumpf gemacht. Ein dabei erhaltenes 0,36 kb DNA Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert und in mit EcoRI linearisiertem pCMV-M13 ligiert. Ein nach Transformation von E.coli HB101 erhaltenes Plasmid mit dem SV40 ori in gleicher Orientierung wie das β-Lactamase Gen und dem CMV-Promoter wurde pCMV-SV40 benannt. Die Konstruktion dieses Plasmids ist in Fig. 8 dargestellt.

b) Mutagenese des DHFR-Gens

Zur Herstellung eines Expressionsplasmids mit einer vielseitigen Multiklonierstelle wurden aus dem DHFR Minigen durch gerichtete Mutagenese zwei und durch Deletion drei Restriktionsenzymschnittstellen entfernt. Dazu wurde aus dem Plasmid pSV2gptDHFR20 ein 1,7 kb BglII Fragment, das die gesamte kodierende Region des Hamster-DHFR-Gens enthält, in die BglII Stelle des Plasmids pUC219 (IBI) kloniert und das Plasmid pUCDHFR erhalten. Mit pUCDHFR transformierte E.coli JM109 (Stratagene) Zellen wurden mit etwa 40fachem Überschuß des Helferphagen R408 (Stratagene) infiziert und 16 Stunden bei 37°C in LB-Medium geschüttelt. Aus dem Bakterienüberstand wurde einzelsträngige Plasmid-DNA isoliert.

Die gerichtete Mutagenese erfolgte in zwei aufeinanderfolgenden Schritten, wobei das in vitro Mutagenese System RPN1523 (Amersham) verwendet wurde. Die am Beginn von Exon 2 befindliche EcoRI Stelle wurde durch Austausch einer Base von GAATTC zu GAGTTC zerstört. Dieser Basenaustausch führt zu keiner Änderung der kodierten Aminosäuresequenz und entspricht außerdem der Nukleotidsequenz im natürlichen murinen DHFR-Gen (McGrogan et al., 1985, Mitchell et al., 1986). Für die Mutagenese wurde ein Oligonukleotid (Antisense-Orientierung) der Sequenz 5′-GTACTTGA­ ACTCGTTCCTG-3′ (EBI-1751) verwendet. Ein Plasmid mit der gewünschten Mutation wurde, wie oben beschrieben, als Einzelstrang-DNA präpariert und die im ersten Intron befindliche PstI Stelle durch Mutagenese mit dem Oligonukleotid EBI-1857 (Antisense Orientierung, 5′- GGCAAGGGCAGCAGCCGG-3′) von CTGCAG in CTGCTG entfernt. Die Mutationen wurden durch Sequenzierung bestätigt und das erhaltene Plasmid pUCDHFR-Mut2 benannt.

Aus dem Plasmid pUCDHFR-Mut2 wurde das 1,7 kb BglII Fragment isoliert und in mit BglII und BamHI doppelt geschnittenes Plasmid pSV2gptDHFR20 ligiert. Nach Transformation von E.coli, Amplifikation und DNA-Isolierung wurde ein Plasmid der gewünschten Beschaffenheit erhalten, das als pSV2gptDHFR-Mut2 bezeichnet wurde. Durch Schneiden mit BamHI wurde in der 3′-nicht-kodierenden Region des DHFR Gens ein auf die BglII Stelle folgendes 0,12 kb DNA-Fragment entfernt, das außerdem noch eine KpnI Schnittstelle enthält. Durch Verknüpfen der mit BglII und BamHI entstandenen überhängenden DNA-Enden wurden auch die Erkennungssequenzen für diese beiden Enzyme zerstört.

Das Plasmid pCMV-SV40 wurde mit EcoRI und BamHI doppelt geschnitten, die DNA-Enden nachfolgend mit Klenow-Enzym stumpf gemacht. Die DNA wurde durch Extraktion mit Phenol-Chloroform und Ethanolfällung gereinigt, anschließend durch Inkubation mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und die 4,4 kb lange Vektor DNA aus einem Agarosegel isoliert.

Das Plasmid pSV2gptDHFR-Mut2 (Fig. 9) wurde mit EcoRI und PstI doppelt geschnitten und die DNA-Enden durch 20 Minuten Inkubation bei 11°C mit 5 Einheiten T4 DNA-Polymerase (50 mM Tris-HCl pH=8,0, 5 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreit, 0,1 mM jedes der vier Desoxynukleotidtriphosphate, 50 µg/ml Rinderserumalbumin) stumpf gemacht. Das 2,4 kb lange DNA-Fragment mit dem mutierten DHFR-Gen wurde aus einem Agarosegel isoliert und mit dem wie oben beschrieben präparierten pCMV-SV40 ligiert. Ein nach Transformation von E.coli erhaltenes Plasmid, das das DHFR-Gen in derselben Orientierung wie den CMV-Promoter enthielt, wurde pCMV-SV40DHFR benannt.

Im letzten Schritt wurde das 0,4 kb "Stuffer"-Fragment nach dem CMV-Promotor, das noch aus dem Ausgangsplasmid pCDM8 stammte, gegen eine Multiklonierstelle ausgetauscht. Dazu wurde das Plasmid pCMV-SV40DHFR mit HindIII und XbaI doppelt geschnitten und der Vektoranteil aus einem Agarosegel isoliert. Die Multiklonierstelle, gebildet aus den beiden Oligonukleotiden EBI-1823 (5′-AGCTTCTGCAGGTCGA­ CATCGATGGATCCGGTACCTCGAGCGGCCGCGAATTCT-3′) und EBI-1829 (5′-CTAGAGAATTCGCGGCCGCTCGAGGTACCGGATCCATCGATG­ TCGACCTGCAGA-3′), enthält inklusive der für die Klonierung in HindIII-XbaI kompatiblen Enden Restriktionsschnittstellen für die Enzyme PstI, SalI, ClaI, BamHI, KpnI, XhoI, NotI und EcoRI.

Je 1 µg der beiden Oligonukleotide wurden in 20 µl Reaktionspuffer (70 mM Tris-Cl pH=7,6, 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreit, 0,1 mM ATP) mit 5 Einheiten T4 Polynukleotidkinase eine Stunde bei 37°C inkubiert, um die 5′-Enden zu phosphorylieren. Die Reaktion wurde durch 10minütiges Erhitzen auf 70°C gestoppt und die komplementären Oligonukleotide miteinander hybridisiert, indem die Probe weitere 10 Minuten bei 56°C inkubiert und anschließend langsam auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. 4 µl der hybridisierten Oligonukleotide (100 ng) wurden mit etwa 100 ng Plasmidvektor ligiert und E.coli HB101 transformiert. Ein Plasmid, das sich mit den Enzymen der Multiklonierstelle (ausgenommen NotI) linearisieren ließ, wurde pAD-CMV1 benannt. Von vielen getesteten Klonen konnte keiner identifiziert werden, dessen Plasmid sich mit NotI schneiden ließ. Die Sequenzierung zeigte immer die Deletion von einigen Basen innerhalb der NotI Erkennungssequenz.

In gleicher Weise wurde mit dem Oligonukleotidpaar EBI-1820 (5′-AGCTCTAGAGAATTCGCGGCCGCTCGAGGT­ ACCGGATCCATCGATGTCGACCTGCAGAAGCTTG-3′) und EBI-1821 (5′-CTAGCAAGCTTCTGCAGGTCGACATCGATGGATCCGGTACCTCGAGCG­ GCCGCGAATTCTCTAG-3′) das Expressionsplasmid pAD-CMV2 hergestellt, das die Restriktionsschnittstellen innerhalb der Multiklonierstelle in umgekehrter Reihenfolge enthält. Dabei wurde das Plasmid pAD-CMV2 erhalten, das sich mit sämtlichen Restriktionsenzymen, einschließlich NotI, linearisieren ließ.

Die Nukleotidsequenz des 6414 bp großen Plasmids pAD-CMV1 (Fig. 10) ist zur Gänze in Fig. 11 dargestellt.

Die Abschnitte auf dem Plasmid (angegeben in der Numerierung der Basen) entsprechen folgenden Sequenzen:

   1-21 EBI-1733, Beginn CMV Enhancer-Promotor (aus CDM8)
 632-649 T7 Promotor
 658-713 Multiklonierstelle (HindIII bis XbaI aus EBI-1823, EBI-1829)
 714-1412 SV40 Intron und poly-Adenylierungsstelle (aus CDM8)
1413-2310 5′-nicht kodierende Region und Promotor des Hamster DHFR Gen (aus pSV2gptDHFR20)
2311-2396 Hamster DHFR: Exon 1
2516 A zu T Mutation zerstört PstI Stelle in DHFR Intron 1
2701-3178 DHFR Exons 2-6 (kodierende Region)
2707 A zu G Mutation zerstört EcoRI Stelle
3272-3273 Deletion zwischen BglII und BamHI in DHFR 3′-nicht kodierender Region
3831 Ende DHFR Gen (aus pSV2gptDHFR20)
3832-4169 SV40 ori (aus pSV2gptDHFR20)
4170-4648 M13 ori (aus pBluescript SK+)
4780-5640 β-Lactamase (kodierende Region)
6395-6414 EBI-1729, Ende der pBluescript Vektorsequenz

Die Herstellung der Plasmide pAD-CMV1 und pAD-CMV2 ist in Fig. 10 dargestellt.

Claims (7)

1. Verfahren zur Herstellung von O-glykosyliertem IFN alpha, dadurch gekennzeichnet, daß Säugetierzellen mit einem geeigneten Expressionsplasmid, das DNA Molekül kodierend für IFN alpha enthaltend, transfiziert werden, anschließend in einem geeigneten Medium kultiviert werden, der Zellüberstand geerntet wird und das O-glykosylierte IFN alpha isoliert und gereinigt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das O-glykosylierte IFN alpha das humane IFN alpha 2, insbesondere das humane IFN alpha 2C ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Expressionsplasmid pAD19B-IFN eingesetzt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Säugetierzellen humane embryonale Nierenzellen verwendet werden.

5. O-glykosyliertes IFN alpha herstellbar nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. O-glykosyliertes IFN alpha gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es humanes IFN alpha 2, bevorzugt humanes IFN alpha 2C ist.

7. O-glykosyliertes IFN alpha gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6 zur Verwendung als Arzneimittel.