JP2711258B2 - 組換プラスミド、当該プラスミドを含有する細菌及び当該細菌を使用して、酸酵食品、動物用飼料、同成分又は蛋白質を製造する方法 - Google Patents
組換プラスミド、当該プラスミドを含有する細菌及び当該細菌を使用して、酸酵食品、動物用飼料、同成分又は蛋白質を製造する方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
2.技術分野
この発明は、組換プラスミド、当該プラスミドを含有
する細菌及び当該細菌を使用して、醗酵食品、動物用飼
料、同成分又は酵素などの蛋白質を、製造する方法に関
するものである。特に、この発明は枯草菌（Bacillus s
ubstilis）、大腸菌（Escherichia coli）及び乳酸菌の
菌体内で複製できる組換プラスミドに関するものであ
る。もしも、少くなくともひとつの同属の又は外来の遺
伝子を含み、その遺伝子をえり抜きの宿主細胞内に移入
し発現させることが出来るならば、上述の組換プラスミ
ドは大変好ましいものとなる。また、それによつて当該
宿主細胞の醗酵性を改良し又は拡大することができる。 3.背景技術 大部分の組換DNAについての研究は大腸菌や枯草菌な
どの細菌を用いて行われて居り、乳酸菌に属する連鎖状
球菌類（streptococci）の遺伝学については殆んど知ら
れていない。しかし、連鎖状球菌類は食品工業にとつて
もつともつと重要なものであり、例えば、ミルク又は乳
製品の醗酵により調製する酪農製品、動物用飼料に加
え、他の醗酵食品例えば肉、サーワード・ブレツド（so
ured bread）及び醗酵野菜の調製などが挙げられる。 チーズ、ヨーグルトなどの酪農工業に使用される乳酸
菌のうち連鎖状球菌類の上質スーターターの培養株は産
酸能、蛋白分解能、フアージ抵抗力及びフレーバー形成
能などの菌株の特長を注意深く維持・管理しなければな
らない。何故ならば、容易に変異株が生じたり、感染し
たりするため、スターターの品質が破壊されるからであ
る（文献１参照）。乳酸菌の培養株を改良するために組
換DNA技術により何をなすべきであるかということにつ
いての幾つかの見解はウオターズ（Wouters）及びスタ
ドハウダーズにより公表されている（文献２参照）が、
しかしこの著者らは実際的な解決手段を示していない。 そのため、乳酸菌内で所望の蛋白質を発現することが
でき、それにより形質転換された乳酸菌の性質が食品工
業に適つたように改良されるか、又は適つた新規の性質
を保有している組換プラスミドが望まれている。 3.発明の要約 この発明は、枯草菌、大腸菌及び乳酸菌、特に連鎖状
球菌類の菌体内で複製でき、乳酸菌に存在する少くなく
ともひとつのプラスミドから得られたDNAを含み、上記
の三種類の細菌内で発現可能であるマーカーを少くなく
ともひとつ含み、かつ発現したとき当該微生物に対して
改良され、又は新規な性質を与える挿入DNA断片を含
む、組換プラスミドを提供するものである。 かゝるプラスミドとしては、少くなくともストレプト
コツカス クレモリス（Streptococcus cremoris）のプ
ラスミドpWV01の一部、特にプラスミドpWV01の最大Cla
I断片を含有することが望ましい。スタフイロコツカス
アウレウス（Staphylococcus aureus）プラスミドpC1
94及びpE194 Cop−６由来のクロラムフエニコール抵抗
性（CmR）及びエリスロマイシン抵抗性（EmR）遺伝子が
共にマーカーとして適切であることが判明した。しか
し、自家マーカー、例えば乳糖代謝に関与する遺伝子な
どが上記の抗生物質抵抗性マーカーよりも好ましい。何
故ならば、抗生物質による淘汰圧を継続することは、醗
酵食品の調製には特に好ましくないからである。上記細
菌類に対して望ましい性質を与えることのできる挿入DN
Aの断片の例としては、蛋白質を当該細胞が同化できる
ペプチド及び／又はアミノ酸に分解可能なプロテアーゼ
を暗号化している遺伝子、キモシンなど牛乳凝固酵素を
暗号化している遺伝子、当該細菌にバクテリオフアージ
抵抗性を付与する遺伝子、クエン酸塩代謝に影響する遺
伝子、及び乳酸代謝に関与する遺伝子などの構造遺伝子
があげられる。 この発明は、更に、発現により細菌に所望の性質を付
与する構造遺伝子の挿入により、上記プラスミドの製造
用の出発原料として適当な組換ベクタープラスミドを提
供するものである。 当該プラスミドは、また制御配列、例えば、構造遺伝
子に結合し、かつ構造遺伝子に属するプロモータか、又
は同属又は外来のプロモータであつても差支えはないが
既にベクタープラスミド中に存在している（強力な）プ
ロモータおよび好ましくは転写終了配列などを含有して
いなければならない。 この発明は、また挿入された構造遺伝子を含み、又は
含まない当該組換プラスミドを含有する細菌、特に連鎖
状球菌を提供するものである。 他の実施態様は上記の形質転換された細菌を醗酵に用
いた醗酵食品、動物用飼料又は同飼料用成分の製造方法
及び同方法により製造された製品に関するものである。 この発明は、更には、通常乳酸菌では生産されないか
されたとしても極く少量である蛋白質の製造方法及びそ
のようにして得られた蛋白質に関するものである。 4.図面の簡単な説明 この明細書にはこの発明の説明の参考として次の図面
を添付している。 第１図には、プラスミドpGK1、pGK11及びpGK12の制限
酵素地図及びプラスミドpWV01、pGL112（プラスミドpC1
94とpUB110とのキメラの一つ）及びpE194 cop−６から
の上記プラスミドの製造過程を示す。pWV01は、更に
（プラスミド）の構築に使用出来る特異的なMbo１切断
部位一個とCla I切断部位２個を有している。pGK1は一
個の特異的なHpa II切断部位を、pG11は特異的なCla I
及びHpa II切断部位を、pG12は特異的なBcl I、Cla I及
びHpa II切断部位を有している。 第２図には、プラスミドpGKV1及びpGKV2の直線状に表
わした制限酵素地図及び重要遺伝子及びそれらの方向並
びにpPL608及びpGK3からの上記プラスミドの製造過程、
及びpWV01及びpE194 cop−６からのpGK3の製造過程を示
す。この三種類のプラスミドすべてがEmR遺伝子中に１
個のBcl I切断部位を有し、更にpGKV1及びpGKV2はCAT
（クロラムフエニコール アセチル トランスエラーゼ
の略称）遺伝子中に特異的なHind III切断部位１個を有
する。 第３図には、プラスミドpWV05の制限地図をBamH I、B
gl II、Cla I、EcoR I、Hind III、Pst I及びSal Iに関
して直線状にして示す。更に、プラスミドpGD4及びpGD6
の制限酵素地図を、pGD4及びpGD6中に存在するpWV05の
断片との関係について直線状にして示す。pGD4及びpGD6
（それぞれpACYC184及びpBR329より製造）中のベクター
DNAを太線で示した。第３図はpGD4及びpGD6が共にpWV05
のHind III断片Ｃを包含することも示している。 第４図には、プラスミドpGKV2及びpGKV500の制限酵素
地図と当該プラスミドの断片のオリジンを直線状にして
示す。 第５図にはエス・クレモリスWg2株の蛋白分解系に対
して（抗体活性を）高めた抗体を使用した、枯草菌PDL1
株（pGKV500）の無細胞抽出物及びエス・クレモリスWg2
株の精製蛋白分解系についての交差及び縦列免疫電気泳
動の結果を示す。 第６図にはエス・クレモリスWg2株の蛋白分解系に対
しての（抗体活性を）高めた抗体を使用した、エス・ラ
クテイスMG1363株（pGKV2）及びエス・ラクテイス1363
株（pGKV500）の無細胞抽出物の交差免疫電気泳動の結
果を示す。 第７図にはpGKV2とM13 mp11から誘導されたpGKV41の
構築、M13mp11から誘導された修飾された多重クローン
部位（MCSと称す）及びpGKV41の制限酵素地図を直線状
として表わしたものを示す。枯草菌由来のSPO2プロモー
タとビー・プミリス（B.pumilis）のCAT遺伝子の間に一
つのMCSを、このプラスミドは有する。 第８図にはpGKU1の構築を示す。これは、pGKV41の誘
導体で化学的に合成したリボゾーム結合部位（RBSを称
す）、化学的に合成したアルフアーアミラーゼ信号配列
とpMS48由来のメチオニル−プロキモシン遺伝子をも含
有する。 第９図にはエス・ラクテイスMG1363株（pGKV500）及
びエス・ラクテイスMG1363（pGKV2）のグルコース及び
エリスロマイシンを含む透明クエン酸塩−ミルク−寒天
平板培地上の成育結果を示す。尚、その成育結果が異な
るのは、両菌株の代謝上の差異の結果である。 第10図にはエス・ラクテイスMG1363のミルク中での成
育及び産酸能に及ぼす影響をpGKV2の効果及び二野生
株、すなわちエス・クレモリスWg2（Prt+）及びエス・
ラクテイス712株と比較し、示す。 第11図には、pPL608中に存在するフアージSP02プロモ
ータの転写支配下でそれぞれプレプロキモシン及び（メ
チオニル）−プロモキシンを暗号化している配列を含む
プラスミドpMS48（外円）及びpMS50（内円）の構造を示
す。このプラスミドを網羅する範囲が示されている。 第12図には、当該Pst I/BstE II切断部位とプロキモ
シンを暗号化した遺伝子の第４番のコドンとの間の領域
のDNA配列をpMS48（Ａ）及びpMS50（Ｂ）に存在するま
ゝに示してある。 第13図には、pMS48を含有するバチルスの細胞溶解物
と上澄液中でのプレプロキモシンの存在を示すためのウ
エスタンブロツトのオートラジオグラムを示す。 第１レーン:1A436Aの細胞溶解物 第２レーン:pMS50を含む1A436Aの細胞溶解物 第３レーン:pMS48を含む1A436Aの細胞溶解物 第４レーン:1A436Aの上澄液と混合したpMS48を含む1A43
6Aの細胞溶解物 第５レーン:pMS48を含有する1A436の上澄液 第６レーン:pMS50を含有する1A436の上澄液 第７レーン:1A436の上澄液 第８レーン：精製したキモシンを含む対照レーン 細胞溶解物の場合には、約108個の細胞に相当する量
をレーンあたり負荷した。上澄液の解析には、109cfu/m
lの培養物の上澄液4mlに相当する量をレーンに負荷し
た。第４レーンの混合物は種々のサンプルの電気泳動時
の行動による差異に起因する誤まつた解釈を除外するた
めに導入した。 第14図にはプレプロキモシン及びそのプロセス化され
た形態の細胞溶解物中に存在することを明らかにするた
めのウエスタンブロツトのオートラジオグラムを示す。 第１レーン:1A436の細胞溶解物 第２レーン:pMS48を含有する1A436の細胞溶解物 第３レーン:2％グルタミン酸ソーダ存在下の第２レーン
負荷物 第４レーン:pMS48を含有する1A435の細胞溶解物 第５レーン:pMS50を含有する1A436の細胞溶解物 バンドは抗キモシンIgG及び125I−蛋白Ａとの反応を
用い明視化した。 約108個の細胞に相当する量を各レーンに負荷した。 5.詳細な説明 上述の如く、乳酸菌内において蛋白質を発現でき、そ
の結果形質転換された乳酸菌が、食品工業で望まれてい
る改良され又は新規の性質を有することとなる、組換プ
ラスミドへの要望が存在する。 この発明は枯草菌、大腸菌ばかりでなく乳酸菌、特に
連鎖状球菌内で発現できる遺伝子を含む組換プラスミド
を提供するものである。その結果、このようにして形質
転換された乳酸菌は、食品、動物用飼料及び食品又は飼
料用の原料の醗酵を利用した生産に使用でき、その結果
上記菌は改良され又は新規の性質を有することとなる。 よつて、この発明の第１の特長は枯草菌、大腸菌及び
乳酸菌内で複製できる組換プラスミドであり、それは、
乳酸菌体内に存在するプラスミドより構築され、少くな
くとも一つのマーカーと、少くなくともひとつの挿入DN
A断片が挿入されて居り、かつマーカーは上記の三種類
の微生物の菌体内で発現でき、発現により当該微生物に
改良され又は新規な性質を付与するものである。 本発明による組換プラスミドは上記三種類の微生物内
で発現できるマーカーを少くなくとも２個有することが
好ましい。 更に少くなくともマーカーのうち１個は挿入DNAの挿
入により不活性化されるものであり、当該マーカーに挿
入DNA断片が挿入できるという利点を有することのでき
るものであることが望ましい。最も適切なマーカーはそ
れぞれスタヒロコツカス アウレウス プラスミドpC19
4（文献３参照）及び同プラスミツド pE194 cop−６
（文献４参照）由来のクロラムフエニコール抵抗性（Cm
R）遺伝子及びエリスロマイシン抵抗物（EmR）遺伝子の
様であつた。これらのマーカーの一つの利点は完全な塩
基配列が知られていることである。EmRマーカー固有の
もう一つの利点はEmRプロモータを誘導可能であり、そ
の結果EmR遺伝子のプロモータの規制下にもたらされた
遺伝子の発現もまた乳酸菌内で誘発しうるという事実に
ある。EmRのもう一つの利点は特異なBcl I切断部位を有
し、その部分は挿入を容易にするということである（こ
の点についてはpGK12についての後述の記載を参照のこ
と。）。 CmR及びEmR遺伝子は枯草菌及び大腸菌内で発現が可能
なことは既で知られている。これらの遺伝子は乳酸菌内
でも驚くべきことに発現できるということを見出した。
この発明による組換プラスミドは少くなくともストレプ
トコツカス クレモリスのプラスミドpWV01（文献１及
び５参照）の一部を含有することが好ましい。 上記の発現プラスミドの調製用の出発原料としては、
枯草菌、大腸菌及び乳酸菌、特に連鎖状球菌内で複製が
でき、少くなくとも上記の三種類の菌内で発現可能なマ
ーカー１個を含み、及び／又はストレプトコツカス ク
レモリス内での発現のため複製ori領域を有する同菌の
プラスミドpWV01の一部を含有する組換ベクタープラス
ミドを使用することができる。 第１世代のベクタープラスミド、すなわち、マーカー
１個を含有するものの例としてはpGK1と称されるものが
あり、これはpGL112由来のMbo I断片をpWV01のMbo I切
断部位挿入することにより調製されたものである。（文
献１）尚、pGL112はプラスミドpC194及びpUB110（文献
６参照）のキメラである。pGK1は、ホリノウチ等（文献
３）の配列の等973番目のマクレオチドから始じまるプ
ラスミドpC194由来の特異的Hap II部位を有する。 このプラスミドは、２個のCla I切断部位の間の小さ
な断片を除去するためのCla Iによる処理及びリガーゼ
による再連結により、pGK11と称されるより小さいプラ
スミドへと転換された。形質転換についての研究によ
り、プラスミドpGK1及びpGK11の必須特性に影響を及ぼ
すことなくこの小断片を削除できることが見出された。
しかし、利点はpGK11は当該Hpa II切断部位に加え、も
う一つの特異的制限（酵素）切断部位、すなわち、Cla
Iを有しているということである。 第２世代の淘汰マーカーを有するベクタープラスミド
の例としては、pE194 cop−６をCla I及びHpa IIで処理
し、次いでEmR遺伝子を含む最大断片をCla−処理pGK11
とリガーゼで連結し、pE194 cop−６由来のEmR遺伝子を
gGK11に組み込むことにより調製されたものが挙げられ
る。このようにして調製されたプラスミドの一つは第１
図に示した構成を有して居り、pGK12と命名された。こ
のプラスミドはBcl I、Cla I及びHpa IIに対する三つの
特異的な切断個所を有している。 このBcl I切断部位はEmR遺伝子内に存在し、この箇所
へのDNAの挿入は当該遺伝子を不活性化することとなる
（文献７参照）。それ故、pGK12はCmR形質転換体の最初
の選抜に続いてBamH I、Bcl I、Bgl II及びMbo Iで産出
された断片〔いずれも（５′）GATC（３′）突出末端
（protruding ends）を有する。〕を挿入し不活性化す
ることによるクローン化に用いることができる。pGK12
はまたEmRの不活性化を利用した指向的クローン化の可
能性をも提供する。すなわち、異つた突出末端を有する
ベクターが当該プラスミドのBcl I及びCla Iによる切断
により得られる。Cla I及びBcl I切断部位は共に両抵抗
性遺伝子の外に位置して居り、いずれも（５′）CG
（３′）突出末端を有するCla I、Hpa II及びTaq Iによ
り生成される外部のDNA断片の挿入に用いることができ
る。CmRの不活性を伴う挿入は、またpGK12のCmR遺伝子
を含むCla I−Hpa II断片を除去し、Cla I、Hpa II、Ta
q I又はそれらを組合せたものにより生成された突出末
端を有する断片を挿入することにより、同様に可能であ
る。 これらの抗生物質抵抗性マーカーは、乳酸菌内へ外部
遺伝子をクローニングするのに大変役立つように思われ
ていたが、これらのマーカーは（乳酸菌では）不活性化
するか又は削除し、自家マーカーを用いることが好まし
い。自家マーカーは食品工業に使用する微生物にとつて
は利点となる。更に、醗酵過程で宿主細胞に種々の利益
を与えうる。このような自家マーカーの例としては、pG
K12のBcl I切断部位に組込むことができる乳糖代謝に関
する遺伝子（文献８参照）がある。 第１世代のベクタープラスミドのもう一つの例として
は、pGK3と称されるものがある。これはストレプトコツ
カス クレモリスWg2プラスミドpWV01をCla Iで処理
し、Cla Iの最大断片を分離し、次いでEmR遺伝子を含む
pE194 cop6のCla I−Hpa II最大断片でもつて上記最大
断片をリゲートすることにより調製されたものである。 このpGK3は次のようにして第２世代のプラスミドに変
換可能である。 （１） このプラスミドをCla Iで直鎖状とし、第１のD
NA分子を得るために大腸菌DNAポリメラーゼＩのレナウ
（Klenow）断片を用いて接着末端を閉ぐ。 （２） 枯草ベクターpPL608（文献９参照）をPvu IIに
よる完全消化とEcoR Iによる部分消化にさらし、SP02プ
ロモータ及びCAT遺伝子を含有するPvu II−EcoR I最大
断片を分離し、第２のDNA分子を得るために大腸菌DNAポ
リメラーゼＩのクレナウ断片を用いてEcoR Iの接着末端
を閉ぐ。 （３） 第１と第2DNA分子をリゲートする。得られるプ
ラスミドには２種の型態があり、それぞれpGKV1及びpGK
V2と命名されている。これらの調製及び直線状にあらわ
した制限酵素地図を第２図に示す。 pGKV1及びpGKV2の両者ともに第２図に示した如く大腸
菌SP02プロモータの支配下のCAT遺伝子内に特異的Hind
III切断部位を含有する。尚、ここでCATとはクロラムフ
エニコールアセチルトラン・フエラーゼを意味し、この
酵素はクロラムフエニコールを連続的に不活性の３−ア
セチル、及び1,3−ジアセチル一体に変換することによ
り不活性化する。（文献３参照）。このように、CAT遺
伝子は、CmR遺伝子とは異なるが、共に発現により、CmR
形質転換体を与える。 プラスミドpGKV2はプロテアーゼの暗号を有する構造
遺伝子を含有する組換プラスミを調製するのに使用さ
れ、そのプラスミドはpGKV500と命名された。このプラ
スミドは、ストレプトコツカス クレモリスWg2プラス
ミドpWV05の4.3MdのHind III断片Ｃ（この調製方法につ
いてはこの明細書中で後述する。）を、プラスミドpGKV
2の特異的Hind III切断部位へ挿入することにより調製
された。 CAT遺伝子のHind III切断部位への挿入の結果、pGKV5
00を用いた形質転換によりCmSEmR（ここでＳは感受性を
示す。）形質転換体が得られる。 乳酸菌内で構造遺伝子を発現する組換プラスミドを調
製した場合、当該プラスミド淘汰圧をかけずに複製でき
るほど充分に安定であることを条件として、形質転換さ
れた微生物が再び抗生物質に感受性を有するようにする
ためには、少くなくとも１つのマーカーを除去すること
が、実際に使用する場合には好ましい。 この発明による組換プラスミド中に自家マーカーが存
在するならば、これらのプラスミドが発現する当該細菌
に対して他の細菌を越えた利点を与えることができる。
というのは、醗酵培地中の成分をより効果的に使用し、
その結果良く成育することとなるからである。 この発明のもう一つの実施態様は、改良された新しい
性質の暗号を有する挿入−DNAの一片を含んでいても、
また、含んでいなくとも良いが、この発明により得られ
た一以上の組換プラスミドを植え込んだ枯草菌、大腸菌
及び乳酸菌、特に連鎖状球菌、に関するものである。 好ましい乳酸菌としては、プラスミド中にプロテアー
ゼを暗号化している挿入DNAにより、より安定で及び／
又はより高いプロテアーゼ活性を有するものである。 もう一つの好ましい乳酸菌としては、プラスミド中の
バクテリオフアージ抵抗性遺伝子を一つ以上含有する挿
入DNAにより、バクテリオフアージに対する感受性が低
くなつた乳酸菌である。 更にもう一つの好ましいものとしてはミルクの凝固酵
素又は乳製品の醗酵中に生成する当該酵素の前駆物質を
製造できる乳酸菌、特に好ましくは、キモシン又はその
前駆物質のうちの一つ、例えば、（メチオニル−）プソ
イドキモシン、（メチオニル−）プロキモシン及びプレ
キモシンなどを、キモシン又はその前駆物質の暗号を有
するプラスミド中の挿入DNAにより製造できるものであ
る。 この発明による乳酸菌はストレプトコツカス属に属す
るものが好ましい。ストレプトコツカス クレモリス、
ストレプトコツカス、 ジアセチラクチス（Streptococ
cus diacetilactis）又はストレプスコツカス ラクチ
ス（Streptococcus lactis）種に属するものが特に好ま
しい。 この発明の更にもう一つの実施態様は醗酵食品、動物
用飼料又はその成分を製造するに際し、この発明による
乳酸菌を使用する方法及びその結果得られたこれらの生
産物に関するものである。 この発明を下記の６つの実施例を用いて説明するが、
これに限定されるものではない。 実施例１においては組換ベクタープラスミドpGK1、pG
K2及びpGK12の構築について述る。このプラスミドは、
ストレプトコツカス クレモリス Wg2プラスミドpW01
の複製ori領域に加えて、１つ（pGK1及びpGK11の場合）
又は２つ（pGK12の場合）のマーカーを含有する。ま
た、枯草菌、大腸菌、ストレプトコツカス クレモリス
中のpGK12に存在する外来遺伝子CmR及びEmRの発現につ
いても記述する。 実施例２においては、pW101の複製ori領域に加え、１
つ（pGK3）及び２つ（pGKV1及びpGKV2）のマーカーを有
する組換プラスミドの構築について述べる。更に、二つ
（EmR及びCAT）の外来遺伝子の発現についても記載す
る。後者の遺伝子は枯草菌のSP02プロモータの統制下で
発現された。 実施例３においては、枯草菌及びストレプトコツカス
ラクチス中でのストレプトコツカス クレモリスのプ
ロテアーゼの暗号化した遺伝子のクローン化及び発現
を、pWV01の誘導体特に、プロテアーゼ遺伝子を含有す
るpGKV500を使用する場合について記載する。pGD4、pGD
6及びpGKV500の構築についてもまた記述した。 実施例４においては、枯草菌のプロモータの統制下で
ストレプトコツカス ラクチス内でのプロキモンを暗号
化した遺伝子についてのクローニング及び発現について
記載する。また、それに使用されるプラスミドpGK20、p
GKV210、pGKV21、pGKV41及びpGKU1の構築についても述
べる。 実施例５においては、pGKV500の組み込みにより、プ
ロテアーゼ活性を有する（Prt+）ように形質転換された
プロテアーゼ活性を有しない（Prt-）ストレプトコツカ
ス ラクチスMG1363の成育及び産酸能について記載す
る。 実施例６においては、pGD4からの5.0Md BamH I断片と
pGD6からの1.4MdのBamH I/Hind III断片とのハイブリッ
ド形成により他のプロテアーゼ遺伝子を検出し、分離す
る方法について記載する。 pWV05のプロテアーゼの分離及びその全般的な発現の
詳細は実施例３及び５に示すが、この出願においては特
許請求の範囲に含ませていない。しかし、この出願又は
昭和60年３月４日にヨーロツパ特許条約にもとづき出願
した関連技術についての他の出願からの優先権を主張し
て出願する他の出願の主題とする予定である。 実施例４において記載した枯草菌プロモータSP02及び
プロキモシンに関する構造遺伝子の組み合せに関する項
目についてもこの出願又は昭和60年３月４日にヨーロツ
パ特許条約にもとづき出願した他のこの発明と関連した
出願からの優先権を主張して出願する他の出願の主題と
する。 しかし、ストレプトコツカス ラクテイス内でのプロ
テアーゼ遺伝子の発現に関する実施例３及び５、並びに
ストレプトコツカス ラクテイス内でのキモシンの前駆
物質の遺伝子の発現に関する実施例４は組換プラスミド
で形質転換された乳酸菌の使用に関するこの発明の実施
態様を示す。尚この組換プラスミドは元の乳酸菌に対し
て改良され又は新しい性質を付与する。それ故に、これ
らの実施例もまずこの発明の実施例となつているのであ
る。 実施例６はpGD4からの5.0Md BamH I断片及びpGD6から
の1.4MdのBamH I/Hind III断片を他のプロテアーゼ遺伝
子の検出及び分離の指標として使用する場合を記載す
る。尚、当該遺伝子はプラスミドに挿入することにより
プロテアーゼ活性を有しない乳酸菌にプロテアーゼ活性
を付与することができる。 かくして、実施例１から５は、組換ベクタープラスミ
ド（pGK1、pGK3、pGK11、pGK12、pGD4、pGD6、pGKV1、p
GKV2、pGKV20、pGKV210、pGKV21、pGKV41）を乳酸菌に
たいして改良され、または新しい性質を付与することの
できる挿入−DNAを含有する組換プラスミド（プロテア
ーゼ活性についてはpGKV500、ミルク凝固活性について
はpGKU1）の双方について記載する。 実施例1:pWV01の複製機能を有するori領域に加え、少く
なくとも一つのマーカーを有するpWV01の誘導体、特に
プラスミドpGK1、pGK11及びpGK12の構築並びにpGK12内
に位置する外来遺伝子の枯草菌、大腸菌及びエス・ラク
チス内での発現 材料及び方法 細菌の菌株及び培地 使用した菌株は表Ａに示した。プラスミドDNAの調製
に際し、枯草菌及び大腸菌はTYブロス（文献13参照）中
で培養した。平板培養では、TYブロスを1.5％の寒天で
固化させ使用した。枯草菌及び大腸菌に対し、それぞれ
クロラムフエニコールは５及び２μg/ml、エリスロマイ
シンは５及び50μg/mlの濃度で使用した。ストレプトコ
ツカス ラクチスの培養には、M17−グルコースブロス
及びM17−グルコース寒天平板培地を用いた。ストレプ
トコツカス ラクチスにはクロラムフエニコール及びエ
リスロマイシンをそれぞれ５及び１μg/mlの割合で使用
した。 プラスミドDNAの単離 プラスミドpE194 cop−６及びpGL112は、エチジウム
ブロミドを含むCsCl密度勾配遠心法で、デ・ボスらの修
正方法を使用した（文献15参照）。大腸菌からの組換プ
ラスミド及びpWV01並びに枯草菌からの組換プラスミド
の大規模及び極く小規模及び大規模の調製は、ともにイ
シホロヴイツ（Ish Horowicz）及びバーク（Burke）の
方法によつた（文献16参照）。尚、イシボロヴイツ等の
方法による極く小規模及び大規模の調製方法の概要は次
の通りである。 （１） 培養物を遠心分離により収集する。 （２） 50ミリモルのグルコース、25ミリモルのトリス
（pH＝８）、10ミリモルのEDTAを含む溶液に懸濁し、イ
ンキュベートする。 （３） 0.2N NaOH、１％SDSを加え、おだやかに混合
し、氷上におく。 （４） 予じめ冷却した5M酢酸カリウム（pH4.8）を加
え、おだやかに混合し、氷上におく。 （５） 遠心分離により、沈澱した蛋白、ドデシル硫酸
塩、染色体DNAを除く。 （６） 上澄液にエチルアルコールを加え、短時間イン
キユベートし、遠心分離により核酸を沈澱させる。 （７） 得られたペレツトを70％のエタノールで洗浄
し、TE緩衝液にとる。 （８） 制限酵素を煮沸したRNaseを含む緩衝液中で作
用させ、トリス−ホウ酸塩−EDTA緩衝液中でアガロース
を用い解析する。 尚、大規模の場合は、培養物の使用量を多くすると共
に核酸の沈澱にイソプロパノールを使用する。 また、枯草菌については上記方法を次の如く修正した
方法により行なつた。すなわち、当該細胞を20％の庶糖
とml当り2mgのリゾチームを含むTES緩衝液（50ミリモル
のトリス塩酸塩、５ミリモルのEDTA、50ミリモルのNaC
l、pH＝8.0）中で０℃で15分間、次いで37℃で15分間イ
ンキユベートして溶菌させた。大規模又は小規模のスト
レプトコツカス ラクテイスからのプラスミドDNAの分
離はガツソン（Gasson）の方法により行なつた（文献８
参照）。尚、ガツソンの小量及び大量DNA調製方法の概
要は次の通りである。 少量の場合 （１） M17培地上で培養した細胞を遠心分離によりペ
レツト化する。 （２） 細胞をプロトプラスト用緩衝液に4mg/mlのリゾ
チームを含む溶液に懸濁させ、37℃でインキユベートす
る。 （３） 細胞溶解液を用いて溶解させ、5Mの塩化ナトリ
ウムを加える。 （４） 溶解物を遠心分離し、上澄液をデカンテーシヨ
ンにより得、得られた上澄液にクロロホルム−イソアミ
ルアルコールを加えて蛋白をのぞき、エタノールを加え
−20℃で一晩放置DNAを沈澱させる。 （５） 核酸を遠心分離により収集し、エタノールを除
きTE緩衝液に懸濁させる。 大量の場合 （１） １バツチ500mlの培養細胞液を遠心分離により
収集する。 （２） 水で洗浄し、4mg/mlのリゾチームを含むプロト
プラスト緩衝液に懸濁させて、遠心管に移しかえる。 （３） 遠心管でインキユベートし、ジエチルピロカー
ボネートを加え、更に短時間インキユベートする。 （４） 細胞溶解液を用いて溶解させ、次いで5Mの塩化
ナトリウムを加える。 （５） 溶解物を氷上の短時間放置し、次いで遠心分離
により透明とする。 （６） 上澄液をデカンテーシヨンにより得、クロロホ
ルム−イソアミルアルコールによる抽出で蛋白をのぞ
き、エタノールを加え核酸を沈澱させる。 （７） 沈澱した核酸を遠心分離により回収し、TE緩衝
液に溶解させる。 （８） RNaseで消化させ、適当量の塩化セシユウムを
加え屈折率を定められた値（例えば1.395）に調製し、1
0mg/mlの臭化エチジウム液と共に遠心分離する。 （９） 環状DNAを勾配法により除去し、イソアミルア
ルコールで抽出臭化エチジウムをのぞく。 （10） 得られたDNAをTE緩衝液で透析し、エタノール
で沈澱させ、更にTE緩衝液に懸濁させる。 制限酵素反応及びDNA断片の精製 制限酵素は製造業者により指定された方法にもとづき
使用した。消化されたDNAはTBE緩衝液〔89ミリモルのト
リス、89ミリモルのホウ酸、２ミリモルのEDTA、ml当り
0.5μｇの臭化エチジウム（ethidium bromide）、pH＝
8.0〕中で１％の水平状アガローズ（カルフオルニア
州、リツチモンド市バイオーラドラボラトリーズ社製）
ゲル中で解析した。EcoR Iで消化したバクテリオフアー
ジSPP1 DNAをDNAの大きさのマーカーとして使用した。
クローニングに使用した制限酵素により得られたDNA断
片は供給業者よりの指示に従つてアガローズゲル中で分
離し、DEAE膜〔西独国ダツセル市シユライフアー アン
ド シユーエル（Scheicher ＆ Schuell）社製〕で分
離、精製した。 分子クローニング及び形質転換 100μg/mlの濃度でベクター分子を、挿入すべき制限
酵素を作用させ得られた断片と約1:2の割合でTE緩衝液
（10ミリモルのトリス塩酸塩、１ミリモルのEDTA;pH＝
7.4）中で混合した。68℃で５分間加熱し、リガーゼ用
緩衝液〔10ミリモルのトリス塩酸塩、10ミリモルのジチ
オスライトール（dithiothreitol）、１ミリモルのAT
P、50ミリモルのNaCl;pH＝7.4〕にサンプルを順応させ
た。T4DNAリガーゼを加え、混合物を７℃で２時間イン
キユベートした。リガーゼ用緩衝液で５倍に希釈後、イ
ンキユベーシヨンを７℃で18時間行なつた。リガーゼで
処理したDNAと枯草菌8G5のプロトラストをチヤン及びコ
ーエンの方法に従い、すなわち、PEG溶液で２分間処理
し、庶糖及びブロスに再懸濁させ90分間成育させ形質転
換を行なつた。形質転換体は、５μｇのクロラムフエニ
コール又はエリスロマイシンを1ml当り含むDM3平板培地
上で淘汰した。枯草菌BG5株は、ブロン及びベネマによ
り記載された如く本質的にコンピテントに成育した（文
献10参照）。当該DNAに曝露後、TYブロスで培養物を二
倍に希釈し、発現のために90分間培養した。形質転換体
は1ml当り５μｇのクロラムフエニコール、５μｇのエ
リスロマイシン又は双方を含むTY平板培地上で淘汰し
た。大腸菌の形質転換には、定温下でCaCl2処理した菌
体を使用するいわゆるマンデル及びヒガ法（文献18参
照）を使用した。ストレプストコツカス ラクチスMG13
63株のプロトプラストの形質転換は、25％の庶糖をプロ
トプラストの安定化に使用した以外はコンドー及びマツ
カイによる修正チヤン及びコーエン法（文献19参照）に
より行なつた。 プラスミツドのコピー数の測定 枯草菌をスピツツエン（Spizizen）最少塩類（文献20
参照）とグルコース（0.5％）、カゼイン加水分解物
（0.02％）、及び成長因子（ビタミンをのぞき1ml当り1
4μｇ、ビタミンはml当り0.4μｇ）を含有する最少培地
で一晩成育させた。M9−グルコース最少培地（文献21）
に0.02％のカゼイン加水分解物及びml当り20μｇの濃度
で成長因子を補充した培地を、大腸菌の培養には使用し
た。ストレプトコツカス ラクチスをM17−グルコース
ブロス中で、対数増殖期後半まで培養した。三つの培地
のすべてにml当り５μCiの〔メチル−3H〕サイメジン
（〔methyl−3H〕thymidine）（マサチユウセツツ州ボ
ストン市ニユーイングランドヌクレアコーポレーシヨン
製）と適切な抗生物質を補充添加した。デユボスらのプ
ラスミドDNA分離手順（この実施例のプラスミドDNAの分
離の頂参照）の規模を100培に縮少し、培養物各2mlから
全細胞体及びプラスミドを分離した。ストレプトコツカ
ス ラクチスについては、10mlの培養物にリゾチームを
1ml当り5mgの濃度でリゾチームを加えて使用した。プロ
ナーゼでのインキユベーシヨン後、溶解物は凍結するま
で−80℃に放置し、次いで65℃で５分間加熱し、更にボ
ルテツクス混合機で30分間隔で２回（最高速度で）はげ
しくかきまぜた。溶解物中の染色体及びプラスミドDNA
は0.8％アガロースゲル中で分離した。臭化エチジウム
で染色されたバンドを切り取り、沸騰水浴上で溶解させ
た。ハイドルマ（Hydroluma;ペンシルバニア州チツスビ
ル市ルマツク システムス インコポーレーシヨン製）
を15ml添加後、試料をマークII液体シンチレーシヨンカ
ウンター〔イリノイ州デス プレインズ（Des Plaine
s）ニユークレアーシカゴコープ製〕中で計測した。 結果 pWV01の遺伝子のマーキング pGL112、pE194 cop−６、及びpWV01の構造地図は、そ
のクローニング方法と共に第１図に示した。pGL112はMb
o I生成した断片を１％のアガロースゲル上で分離し
た。最大断片はホリノウチ及びワイズブラム（Weisblu
m）の配列上の第973番目から第2004番目の塩基のpC191
配列により構成されている文献３参照。また、完全なク
ロラムフエニコール抵抗性（CmR）遺伝子を含むが、し
かしpC194の複製機能ori領域を欠く。pUB110の複製機能
ori領域（文献22を参照）を含まない。この断片は精製
され、pW101の特異的なMbo I部位へとリゲートされ、リ
ーゲシヨン混合物は枯草菌のプロトプラストの形質転換
に用いられた。CmR再生体が得られ、そのうちの一つの
プラスミド〔2.4メガダルトン、尚メガダルトンはMdと
略称する。〕は、pGK Iと命名され、制限酵素解析によ
り、特質が明らかにされた。Mbo Iによる消化により二
つの断片が生じたが、大きな断片は直線状としたプラス
ミドpWV01（1.5Md）と同一の場所へ移動した。第２の断
片（0.9Md）はpGL112の最大Mbo I断片に相当した。Cla
IでpGK1を消化した結果、次の二つの断片が得られた。
未変化のまゝのpWV01の小さいCla I断片（第１図参照）
と2.1Mdの断片で、これらはpWV01の大きな1.2MdのCla I
断片へpGL112のCmR遺伝子を含有する断片の挿入により
生じたものである。この小さなCla I断片は、Cla IでpG
K1から試験管中で切り取つたものである。この最大断片
の分離及び再リゲーシヨンの後、枯草菌のプロトプラス
トの形質転換体をリゲーシヨン混合液で処理すると、Cm
R再生体が得られる。これらの細胞は、pGK1からの一部
分の取り切りにより生じた誘導体であり、pGK11（2.1M
d）と命名され、特異的なCla I切断部位を有していた。
pGK1と同様、ホリノウチ及びワイズブラムの配列の第97
3番目の塩基（文献３参照）である特異的Hpa II部位を
有して居り、かつ両者とも特異的なPGL112 Mbo I切断部
位を有する組換プラスミドであるというもう一つ別の証
拠も提供した。Cla IとHpa IIでの二重消化によりpGK1
におけるこの断片の方向性も推論された。pGK1のこの小
さなCla I断片をプラスミド複製能を保持したまゝ切り
取りうるということは、pGK11に残つているCla I切断部
位がクローニングに使用しうるというとを示唆してい
る。 挿入−不活性化ベクターの構築 Cla I切断部位が挿入に使用可能であり、かつこれら
のpWV01から誘導された組換プラスミドがクローニング
のために再に使用可能であるか否か明らかにするため
に、pGK11から挿入−不活性化ベクターを構築した（第
１図）。このために、pE194 cop−６をCla I及びHpa II
で消化し、最大のCla I/Hpa II断片を分離した。この断
片は、ホリノウチとワイズバルムの配列（文献４参照）
上の第1939番目から3137番目の塩基に対応し、エリスロ
マイシン抵抗性（EmR）遺伝子を含みpE194 cop−６の複
製ori領域を欠いている。pGK11の特異的なCla I部位
に、これリゲートした。枯草菌のプロトプラストをリー
ゲシヨン混合物で形質転換すると、CmREmR形質転換体が
得られた。そのうちの１つを選んだら、2.9Mdのプラス
ミドを含有していた。pK12と命名したこのプラスミドと
親プラスミドpGK11の制限酵素による解析結果は、第１
図とよく一致した。Cla Iで直線状としたpGK11へのリゲ
ーシヨンによるCla I−Hpa II挿入の結果、プラスミドp
GK12は依然として特異的なCla I切断部位及びHpa II切
断部位を含有していた。pGK12をBcl Iで直鎖化し、挿入
の同一小生を確認した。このBcl I切断部位は、EmR遺伝
子の暗号化配列に位置して居り、この部位へのDNA断片
の挿入は、組換プラスミドのEmRを不活性化する（文献
７参照）。更に、ストレプトコツカス クレモリスWg2
から分離したpWV01をプローブに使用し、これらの組換
体のサウザンハイブリダイゼーシヨン（文献23参照）に
よりpWV01配列の存在を確認した。 大腸菌及び枯草菌内におけるpGK12の複製及び外来遺伝
子の発現 遺伝子学的にプラスミドpWV01をマークするために使
用したCmR及びEmR遺伝子が共に大腸菌（文献24及び25参
照）内で発現するという事実は、上記菌体中で組換プラ
スミドかまた複製するのか否かを研究することを可能に
した。そのため、大腸菌BHB2600株のコンピテント細胞
を、プラスミドpGK12に曝露した。発現のために時間を
与えた後、希釈し、ml当り２μｇのクロラムフエニコー
ルと50μｇのエリスロマイシンを含有するTY寒天平板培
地で平板培養した。一晩培養したところ、小さなコロニ
ーが現われた。これらのコロニーは大きさと制限酵素の
作用パターンの点に関して、枯草菌から分離したpGK12
と差がないプラスミドDNAを含有していた。形質転換さ
れた大腸菌BHB2600株の選抜には、ml当２μｇのクロラ
ムフエニコールと50μｇのエリスロマイシンの組み合せ
が適切であつた。エリスロマイシン又はクロラムフエニ
コールのみでは、使用大腸菌の菌株にもよるが、1ml当
り、エリスロマイシンの場合で100μｇ以上、クロラム
フエニコールの場合で10μｇ程度まで、淘汰には必要で
ある。大腸菌から分離したpGK12は通常の頻度でコンピ
テント枯草菌をCmR及びCmRに形質転換した。枯草菌のCm
R及びCmRへの形質転換には、発現時にml当りエリスロマ
イシン50ngで細胞を誘導する必要があつた。この誘導な
しには、形質転換体は、クロラムフエニコールのみを含
有する平板上では極く僅か数えられる程度であつた。 両給源からのpG12のコンピテント枯草菌及び大腸菌細
胞の形質転換効率を表Ｂに示す。表から明らかな如くい
ずれの宿主においても、形質転換能はプラスミドDNAの
給源とは独立したものである。 pGK12の複製及びストレプトコツカス ラクチス菌体内
での外来遺伝子の発現について pWV101由来のベクターに保持されているマーカーが乳
酸菌ストレプトコツカス属に属する菌種内で発現可能で
あるか否かを調べるために、枯草菌から分離したpGK12
プラスミドを用いて、プラスミドを有さない菌株である
ストレプトコツカス ラクチスMG1363株（文献８参照）
のプロトプラストの形質転換を行なつた。同株のプロト
プラストをコンドウ及びマツカイ（Mckay）の方法（前
出；文献19参照）により調製し、１μｇのpGK12で処理
した。発現のための時間を与えるため、30℃で２時間イ
ンキユベートしたのち、希釈しml当り５μｇのクロラム
フエニコールか１μｇのエリスロマイシンを含む砂糖−
M17平板培地上で平板培養した。30℃で,7ないし10日間
インキユベートした後、両平板培地上にコロニーが出現
した。CmRコロニーはEmRでもあり、また逆にEmRはCmRで
もあつた。典型的な実験例において、再生は10％、pGK1
21μｇ当りの形質転換体は約0.5×104であつた。形質転
換されたコロニーはpGK12と同一の分子量、同一の制限
酵素に対する作用形式を有するプラスミドを含有してい
た。 コピー数及びプラスミドの安定性 pGK12の三宿主内におけるコピー数を測定した（表Ｃ
参照）。 ストレプトコツカス ラクチス及び枯草菌の両者にお
いてはコピー数は低い数値に維持されていた；枯草菌で
は、約５でこれは枯草菌内におけるpWV01について知ら
れている値と良く一致していた（文献５参照）。大腸菌
内におけるpGK12のコピー数は枯草菌のそれと比較し約1
0培大きかつた。 表Ｄは淘汰圧がなくともpGK12はストレプトコツカス
ラクチス及び枯草菌中で安定的に保持されていたこと
を示す。これは大腸菌とは対照的で、大腸菌では48％の
頻度でpGK12が失われていた。pGK12は上記三種類の微生
物において、すくなくとも1ml当り2mgのエリスロマイシ
ンに対して抵抗性を付与した。クロラムフエニコールに
対する耐性の水準はそれぞれストレプトコツカス ラク
チス、大腸菌及び枯草菌において、５、10及び50μg/ml
であつた。 実施例2:枯草菌のプロモータの統制下でのエス・ラクチ
ス内での遺伝子の発現 〔pGK3、pGKV1及びpGKV2プラスミドの構築についての記
述〕 pGK3の構築（第２図参照） この実施例中で使用する種々の方法についてはすべて
詳細に実施例１及び同３で述べている。エス・クレモリ
スWg2プラスミドpW01を制限酵素Cla Iで処理し、pWV01
のori領域を含有する最大のCla I断片を分離した。プラ
スミドpE194−cop−６を制限酵素Cla I及びHpa IIを処
理し、EmR遺伝子を含有する最大Cla I/Hpa II断片を分
離した。次いで、この２個の断片を互にリゲートした。
Cla I及びHpa IIの接着末端は互によく適合しているの
で、二種類のプラスミドをこうして得た。pWV01のCla I
による最大断片のMbo I部位に近い位置に修復されたCla
I部位を有するプラスミドをpGK3と命名した。 pGKV1及びpGKV2の構築（第２図参照） プラスミドpGK3を制限酵素Cla Iで処理し、接着末端
を大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレナウ断片を使用し満
した。 CAT遺伝子を保有する枯草菌プラスミドpPL608（文献
８参照）は制限酵素Pvu IIで完全に消化し、次いでEcoR
I制限エンドヌクレアーゼで部分消化した。 SP02プロモータ及びCAT遺伝子を含有する最大Pvu II/
EcoR I断片はアガロースゲルから電気溶出により分離し
た。 Pvu II/EcoR I断片のEcoR I接着末端は大腸菌DNAポメ
ラーゼＩのレナウ断片を使用し満した。 このPvu II/EcoR I断片及びCla I及びレナウ処理した
pGK3は互いに平滑末端リゲートした。ClaＩ及びEcoR I
部位を満した平滑末端のリゲーシヨンにより新しいEcoR
I部位が生じた。 次いで、枯草菌PSL1株のプロトプラストをチヤン等の
方法（実施例１及び文献17参照）によりリーゲシヨン混
合物に曝露し、EmR及びCmR形質転換体を選抜した。 二種類の形質転換体が得られたが、そのうちの一つ
は、pGKV1を保持し、他の一つはpGKV2を保持していた。
（尚、この両プラスミドの制限酵素地図は第２図に示し
た。）pGKV1及びpGKV2の間の差異はSP02プロモータに対
するCAT遺伝子の方向性に関するものである。 これらのベクターをエス・ラクチスのプロトプラスト
の形質転換に使用した。 形質転換されたエス・ラクチスがEmRに加えてCmRであ
ることは、枯草菌のSP02プロモータがエス・ラクチス内
で機能したことで証明された。それ故、これは発現のた
めに他の外来遺伝子の組み込みに使用することができ
る。 実施例３ pWV01の誘導体を使用して枯草菌及びエス・ラクチス
菌内でのエス・クレモリスのプロテアーゼを暗号化した
遺伝子のクローニング及び発現〔pGK500の構築について
の記載〕 微生物菌株、プラスミド及び培地 使用した菌株及びプラスミドを表Ｅに示す。 枯草菌及び大腸菌はTYブロス中で成育させた。平均培
養には1.5％の寒天で固化したTYブロスを用いた。クロ
ラムフエニコール及びエリスロマイシンは、枯草菌に対
してそれぞれ５μg/ml、クロラムフエニコール、アジピ
シリン及びテトラサイクリンは、大腸菌に対してそれぞ
れ40、30及び12.5μg/mlの割合で用いた。エス・ラクチ
スの培養にはグルコース−M17−ブロスと寒天（文献14
参照）を用いた。エス・ラクチスの場合は、クロラムフ
エニコール及びエリスロマイシンをそれぞれ４μg/ml及
び１μg/mlの割合で使用した。エス・クレモリスWg2及
びエス・クレモリスHPは絶えず成分調整スキン・ミルク
を10％（w/v）含む滅菌培地中に保持した。グリセロホ
スフエート−ミルク−寒天培地（文献32参照）を0.001
％のブロモクレゾールパープルを加えて幾分修正したも
の及びクエン酸塩−ミルク−寒天培地（文献32a参照）
を、エス・ラクチス菌株のミルク蛋白の利用可能性につ
いての検査に用いた。 プラスミドDNAの分離 イシ−ホロヴイツ（Ish−Horowitz）らの方法（実施
例１及び文献16参照）により大腸菌からプラスミドを分
離した。枯草菌由来のプラスミドは実施例１の方法によ
り分離した。この方法はエス・ラクチスからのプラスミ
ドの極少量調製には有用であることが判明した。レブラ
ンク（LeBlanc）らの方法（文献33参照）をエス・クレ
モリスWg2及びエス・クレモリスHPからのプラスミドの
分離に使用した。 レブランクの方法の概要は次の通りである。 （１）培養した細胞を遠心分離により収集し、10ミリモ
ルのリン酸ソーダ緩衝液（pH7.0）で洗う （２）50ミリモルのトリス塩酸塩（pH8.0）に懸濁させ
る。 （３）40mg/mlのリゾチームを含むトリス塩酸塩を加
え、インキユベートする。 （４）0.25MのEDTAを加え、短時間氷上に保持する。 （５）20％のSDS（ドデシル硫酸ソーダ）を含むTE緩衝
液（50ミリモルのトリス塩酸塩−10ミリモルのEDTA、pH
＝8.0）を加えて溶菌させる。 （６）55℃でインキユベートし更に細胞溶解をおこさせ
る。 （７）3N NaOHを加えて、DNAを変性させる。 （８）水を加え一定量とし、２モルトリス塩酸（pH＝7.
0）を加えて中和して、混合する。 （９）更に適当量の２モルトリス塩酸を加えて混合す
る。 （10） 高分子の染色体DNAを20％のSDS TE液、及び直
後5MのNaClを加えてSDS−NaCl沈澱法により除去する。 （11）一晩サンプルを４℃に保持し、17000Gで遠心分離
により上澄液をうる。 （12）上澄液に二倍量の水を加え、煮沸、RNase（2mg/m
l水）を加えて、インキユベートし単鎖DNAをNaCl飽和フ
エノールで抽出除去する。 （13水相を当量のクロロホルム−イソアミルアルコール
（24:1）で抽出し、水相中のDNAをエタノールで分解し
たRNAを除去することにより分離し、３モルの酢酸ソー
ダと95％エタノールを必要量加えて−20℃で一晩保持す
る。 （14遠心分離しTES（10ミリモルのトリス塩酸塩、10ミ
リモルのEDTA、50ミリモルのNaCl、pH＝8.0）に懸濁す
る。アガロースゲル電気泳動により検査する。 pMV05の分離 エス・クレモリスWg2からの全プラスミドはトリス−
酢酸塩緩衝液（40ミリモルのトルス−酢酸塩、20mMの酢
酸ソーダ２ミリモルのEDTA;pH＝7.8）を用いて、0.5％
アガロースゲル中で分離した。pWV05をゲルより切り取
り、下記の点で修飾したブリン（Blin）らの方法（文献
34参照）によるKIの濃度勾配遠心分離法を用いてプロセ
ス化した。ゲル切り取り分を凍結（−20℃）し、溶解
し、6.5gの切り取り分に対して約12gの固体の沃化カリ
を加えた。全部のアガローズを溶解させるために、血液
細胞懸濁液ミキサー中で混合後、0.1mlのエチジウムブ
ロマイド（5mg/ml）を加え、得られた溶液を光屈折率を
1.444に調整した。勾配溶出物を20℃でベツクマン型式7
5Ti固定角度ローター中で53,000rpmで20時間遠心分離し
た。すべてのアガロースをDNA帯より除去するため二度
の運転が必要とされた。 制限酵素による解析及び分子クローニング 制限酵素及びT4DNAリガーゼはベーリンガー（西独マ
ンハイム市）より購入し、供給業者の指示に従い使用し
た。消化したDNA調製品はTBE緩衝液（89ミリモルのトリ
ス、89ミリモルのホウ酸、２ミリモルのEDTA、0.5μg/m
lのエチジウムブロマイド;pH＝8.0）中での水平アガロ
ースゲル中で電気泳動した。pWV05の制限酵素による断
片を、pBR329又はpACYC184中でKIにより精製したpWV05
を使用してシヨツトガン・クローニングを行なつた。ま
たは、特定の断片を全エス・クレモリスWg2のプラスミ
ドDNAの消化物からアガロースゲル電気泳動法により精
製し、次いで電気溶出した。大腸菌のコンピテント細胞
はマンデルらの方法（実施例１及び文献18参照）により
形質転換した。枯草菌のプロトプラストはチヤンらの方
法により形質転換した（実施例１及び文献17参照）。エ
ス・ラクチスのプロトプラストはオカモトらの方法（文
献35参照）を修飾した方法により調製した。すなわち、
グルコース−M17培地での一晩培養物をグルコース−M17
で100倍に希釈し、30℃で２時間インキユベートした。
細胞をTMS（30ミリモルのトリス塩酸塩、３ミリモルのM
gCl2、25％庶糖;pH＝8.0）で洗浄し、ml当り30μｇのリ
ゾチームを添加したTMSの当初液量の半量に再懸濁し
た。37℃で１時間インキユベートしたのち、プロトプラ
ストをSMM（25％庶糖、20ミリモルのMgCl2、20ミリモル
のマレイン酸塩;pH＝6.5）中で洗浄し、当初液量の1/30
のSMMに再懸濁した。プロトプラストの形質転換は、22.
5％ポリエチレングルコール中で室温で20分間プロトプ
ラストとDNAをインキユベートした以外は実施例１と同
様にして行なつた。 プラスミドpWV05のサブクローン化 エス・クレモリスWg2の全プラスミドのゲル電気泳動
及び引き続いての切り取つたpWV05帯のKI濃度勾配遠心
分離法により培養液当り約pWV05 1.5μｇを得た。数
種類の制限エントヌクレアーゼによる、精製pWV05の同
時又は継時的消化により誘導された制限酵素地図は第３
図に示した。pWV05の一部分をクローン化するために大
腸菌プラスミドpBR329（2.69Md）及びpACYC184（2.65M
d）を用いた。BamH I断片Ｂ（5.0Md）は、pACYC184中に
クローン化した（その結果プラスミドpGD4を生成：第３
図参照）。EcoR Iの断片Ａ（9.0Md）及び同Ｃ（2.0Md）
も同様であつた。シヨツトガン方式クローン化やベクタ
ーDNAへの特定断片のリゲーシヨンにより得られたいず
れの組換ベクター中にも、Hind III断片Ｃ（4.3Md）及
びEcoR I断片Ｂは、発見されなかつた。pWV05の残存部
をクローン化するため、全エス・クレモリスWg2プラス
ミドDNAのBamH I/Hind III二重消化物をpBR329のBamH I
/Hind III切断物とリゲートした。一つの組換体をとり
上げたところ、HindIII断片Ｃの左側を構成する1.4Mdの
BamH I/Hind IIIを含有していた。このスクランブルプ
ラスミド（第３表中のpGD6）中には、BamH I/Hind III
断片Ｂの右側及び0.5Mdの起原不明のHind III断片も含
まれていた。Hind III断片Ｃの連続性の切断及びEcoR I
断片Ｂとが大腸菌内でのサブブラグメントのクローン化
をなしうるということを示す上記結果は、DNA配列の特
別の性質がプラスミドの安定性を阻害するか、またはこ
のDNAの発現が大腸菌の活性により阻止されるというこ
とを示唆している。 交差免疫電気泳動法 枯草菌及びエス・ラクチスをml当り５μｇのエリスロ
マイシンを含むTYブロスあるいは、ml当り１μｇのエリ
スロマイシンを含むグルコーズ−M17−ブロス各500ml中
で一晩培養した。細胞を遠心分離により収集し、冷50ミ
ルモル リン酸カリウム塩溶液（pH＝6.8）で洗浄し、
１ミリモルのEDTAを含む同一の緩衝液2mlに再懸濁し
た。細胞は超音波により分解した。トリトンX100を最終
濃度４％になるまで添加し、30分間室温でインキユベー
トした後、４℃でベツクマンSW41ローター中で15000rpm
で15分間遠心分離することにより細胞破片を除去した。
無細胞抽出物をアトン沈澱法により濃縮した。蛋白濃度
はブラツドフオードの方法（文献36参照）により測定し
た。エス・クレモリスWg2の蛋白分解系の精製蛋白質に
対して高められた抗体の存在下で無細胞抽出物の交差免
疫電気泳動を前に記載した通りに行なつた（文献37参
照）。ゲルを第一次元では2.5V/cmで３時間、第２次元
では1.5V/cmで16−18時間泳動させた。 pGKV500の構築 pGKV2（第２図）はCATを暗号化した配列中に特異的な
Hind III部位を有している。この部位は、4.3Mdの、エ
ス・クレモリス プラスミドpWV05のHind IIIの消化物
から電気泳動により精製したHind III断片Ｃを挿入する
に用いられた。この構築により、pGKV500（7.4Md）が得
られた。制限酵素地図は、同一のEcoR I部位を地図の零
地点として直線状にして示してある。 エス・ラクチスへのプラスミドpGKV500の形質転換 pWV01由来のベクターは、枯草菌ばかりでなく大腸
菌、エス・ラクチスも形質転換する。それ故、枯草菌よ
り分離したpGKV500を、プラスミドを含まず、33Mdのラ
クトーズ及びプロテナーゼプラスミドを損失しているた
めに乳糖も醗酵できず、プロテナーゼも生産できないエ
ス・ラクチスMG1363のプロトプラストの形質転換に使用
した。５種類の無作為に抽出した形質転換体について迅
速プラスミドDNA抽出を実施したところ、これらはすべ
て枯草菌からのpGKV500の同一の分子量を有するプラス
ミドを含んでいることが明らかとなつた。 Hind III断片Ｃにより特異化された蛋白の特性化 pGKV500を保有するエス・ラクチス株のうちの一種と
枯草菌（pGKV500）から無細胞抽出物を精製し、交差免
疫電気泳動法（CIE）により解析した。第一次元により
分離した抽出物を、第二次元ではエス・クレモリスWg2
（Prt+）の精製蛋白系の蛋白に対して高められた抗体と
反応させた。CIEのパターンは次の如きものよりなる。 第５図:A枯草菌PSL1（pGKV500）の無細胞抽出物 B:エス・クレモリスWg2の精製した蛋白分解系 C:同一の穴に枯草菌PSL1（pGKV500）の無細胞抽
出物とエス・クレモリスWg2の精製蛋白分解系を適用し
たときの縦列免疫電気泳動 D:右側及び左側に別々に適用したほかはＣと同一 第６図A:エス・ラクチスMG1363（pGKV2）株の無細胞抽
出物 B:エス・ラクチスMG1363（pGKV500）株の無細胞
抽出物 ＡからＤ（第５図）においては、枯草菌抽出物（42μ
ｇ蛋白/ml）１μとエス・クレモリスの単離物（210μ
ｇ蛋白/ml）３μを使用した。第二次元ゲルは、エス
・クレモリスWg2の蛋白分解系に対する抗体（28mg/ml）
を30μ含有していた。 第６図のＡとＢにおいては、15μのエス・ラクチス
MG1363（pGKV2）抽出物（45mg蛋白/ml）及び15μのエ
ス・ラクチスMG1363（pGKV500）抽出物（53mg蛋白/ml）
を使用した。第二次元ゲルは、エス・クレモリスWg2の
蛋白分解系に対する抗体を28mg/ml含む溶液30μを含
有していた。 第５図Ｂの交差免疫電気泳動パターンは、エス・クレ
モリスWg2蛋白分解系の二つの主要な沈降線があり、そ
れぞれ、Ａ及びＢと命名された。蛋白Ａはカゼイン分解
性を有していることが判明した。ＡおよびＢの左側の弱
い線は、蛋白分解系には関係のない不純物のものであ
る。第５図Ａ及び第６図Ｂの交差免疫電気泳動パターン
は、枯草菌PSL1（pGKV50）及びエス・ラクチスMG1363
（pGKV500）も、抗体と一緒に沈澱する二つの蛋白質を
生産することを示す。この二つの蛋白質はエス・ラクチ
スMG1363（pGKV2）（第６図Ａの交差免疫電気泳動パタ
ーン参照）及び枯草菌PSL1（pGKV2）には存在していな
かつた。エス・ラクチスMG1363抽出物中のゲルからの流
出した沈降線（第６図の交差免疫電気泳動パターンＡ及
びＢ参照）は、エス・ラクチスMG1363（pGKV2）及びエ
ス・ラクチスMG1363（pGKV500）の両者に存在してい
た。それ故、共に挿入により生じたものとは考えられな
い。挿入した特定の蛋白質とエス・クレモリスWg2由来
の蛋白Ａ及びＢとの関係は縦形免疫電気泳動による実験
により調査した。 枯草菌PSL1（pGKV500）抽出物及びエス・クレモリスW
g2分離物を、同一サンプル穴に負荷したところ二つのピ
ークが明らかになつた（CIEパターンＣ）。このこと
は、枯草菌PSL1（pGKV500）の上と下のピークの蛋白
は、それぞれエス・クレモリスWg2蛋白分解系の成分Ａ
及びＢであることを示唆している。二つの櫛形ピークの
下の表面は個々のピークの合計にほゞ相当するという観
察は、この見解を強化するものである。同一のゲルの隣
接するサンプル穴にサンプルを適用したときの縦形免疫
電気泳動の結果を第５図Ｄは示す。 エス・クレモリスWg2のピークＢと枯草菌PSL1（pGKV5
00）の上部ピークの完全溶解物は、一つのより高くより
広いピークを与えた。エス・クレモリスWg2からの蛋白
Ａは枯草菌PSL1（pGKV500）及びエス・ラクチスMG1363
（pGKV500）の両調製物の下位の沈降線中の蛋白と共通
の特徴を有して居り、上記の二つの場合ともに一部はピ
ークがかなり合つて居り、抽出物のピークがやゝ高くも
ち上げられていた。 実施例4:枯草菌プロモータ統制下でのエス・ラクチス菌
内でのプロキモシンを暗号化している遺伝子のクローニ
ング及び発現〔pGKV20、pGKV210、pGKV21、pGKV41及びp
GKU1の構築：第７図及び第８図参照〕 用途の広いクローニングベクターを造るために、M13m
p11の多重クローン部位（以下MCSと称す；文献38参照）
を、プラスミドpGKV2のSP02プロモータとCAT遺伝子の間
に挿入（第７図参照）した。そのために、このプラスミ
ドを制限酵素EcoR Iで処理し、DNA分子内リゲーシヨン
に適合しているところの希釈条件下でリゲートした。リ
ゲーシヨン混合物で大腸菌BHB2600を形質転換後、形質
転換体にはpGKV2のEcoR Iの最大断片を含んでおり、pGK
V20と称されるプラスミドが得られた。プラスミドpGKV2
0とフアージM13mp11の複製可能な形態（RFと称す）を制
限酵素EcoR IとPst Iで消化した。pGKV20のEcoR I/Pst
Iの最大断片及びMCSの38bp EcoR I/Pst I断片を分離
し、リゲートしてpGKV210を創製した。 結果として、SP02プロモータは、再びCAT遺伝子の前
に位置することとなつた。pPL608のEcoR Iの最小断片の
このプラスミドのEcoR I消化物より分離し、EcoR Iで処
理したpGKV210とリゲートし、pGKV21を創製した。SP02
プロモータ含有断片は、二つの方向性に位置しうるの
で、形質転換体についてCmRによりコロニーを淘汰し
た。得られた形質転換体には、プロモータの指示により
CATの転写させるプラスミドが含まれていなければなら
ないことである。更に構築を実行化するために、pGKV21
の中のMCSのBamH I部位をCla I部位に変換させた。pGKV
21を制限酵素BamH Iで処理し、接着末端を大腸菌DNAポ
リメラーゼＩのレナウ断片で満し、得られた平滑末端を
内部リゲーシヨンを実施させるために希釈条件下でリゲ
ートさせた。得られたプラスミドはpGKV41と称するもの
であるが、これはBamH I部位を満した平滑末端リゲーシ
ヨンにより形成されたCla I部位を含有する。このプラ
スミドの中では、CAT遺伝子の一部がプロキモシンを暗
号化している遺伝子で置換されていた。この遺伝子は、
プラスミドpMS48上に位置して居り（枯草菌内のプレプ
ロキモンの発現及び排出の項参照）、枯草菌リボゾーム
結合部位（RBSと称す）とビー・アミロリクエフアシエ
インス（Ｂ・amyloliquefaciens）のアルフアーアミラ
ーゼ遺伝子の信号配列によりこのプラスミドに先導され
たものである。SP02プロモータの支配下で枯草菌内での
発現のために、それは導入されたものである。RBS、ア
ルフアーアミラーゼ信号配列及びプロキモシン暗号化配
列を含む全遺伝子を次の手順によりpGK41に挿入した。 PMS48を制限酵素BstE IIで処理し、接着末端を大腸菌
DNAポリメラーゼＩのレナウ断片で満した。次いで、当
該プラスミドを制限酵素Hind IIIで処理をし、約1Md
の、特にプロキモシン遺伝子を含む断片を分離した。pG
K41は制限酵素Cla Iで処理し、接着末端は大腸菌DNAポ
リメラーゼＩのレナウ断片で同様に満した。直鎖状にし
たプラスミドを制限酵素Hind IIIで処理し、最大の、と
りわけ、pWV01のori領域とEmRを暗号化した遺伝子を含
む断片を分離した。上記の両者の断片のリゲーシヨンの
結果、pGKU1と呼ばれる一つのプラスミドを得た。な
お、このプラスミドにはSP02プロモータの統制下でプロ
キモシンを暗号化している遺伝子を導入している。満さ
れたCla I及びBstE II部位の平滑末端のリゲーシヨンに
よりBstE II部位は再生された。このプラスミドでエス
・ラクチスMG1363を形質転換した。ウエスタンブロツト
（Western blots:文献39参照）は、プレプロキモシンが
枯草菌SP02プロモータの統制下でエス・ラクチス内で発
現することを示唆した。 上述と同様の方法によりpMS50のBstE II−Hind III断
片をpMS48のBstE II−Hind III断片の代りに使用して同
様の構築が可能である（後述の枯草菌のプレキモシンの
発現及び排出の項参照）。 実施例5:pGKV500で形質転換したエス・ラクチスMG1363
の成育及び産酸能 手順 グルコース−M17−ブロスで１晩培養した培養物を滅
菌蒸留水で洗浄し、0.5％のグルコースを含むスキンミ
ルク（10％重量／容量）で100倍に希釈した。30℃でイ
ンキユベートし、１時間間隔で試料を採取した。グルコ
ース−M17−寒天平板培地を用いて形成されたコロニー
数を数えた。酸度は0.1規定のNaOH液で滴定した。 エス・ラクチス（pGKV500）のミルク中の遺伝表現型 ストレプトコツカス属の乳酸菌は栄養要求的には特殊
栄養を必要とし多くのアミノ酸を外部から供給する必要
がある。ミルク中の小さなペプチド及びアミノ酸の濃度
が成育とそれに付随する産酸力を規制する。最適な成育
には、ミルク蛋白を加水分解する自己のプロテナーゼに
ストレプトコツカス属の乳酸菌は依存する。ミルク中の
成長及び産酸力の差異にもとづき、プロテナーゼ活性を
有する変種とそれを有しないものの分離のための培地を
開発した。pGKV500のHind III断片が、Prt-の宿主エス
・ラクチスMG1363内で成長及び産酸力を再生しうるかど
うか調べるために、エス・ラクチスMG1363（pGKV500）
のミルクを基材とした寒天平板培地上の成育及びミルク
中での産酸力を調査した。透明なクエン酸ミルク寒天培
地中に懸濁させたとき、エス・ラクチスMG1363（pGKV50
0）は、迅速な成長と酸性化により引き越されたカゼイ
ンの白色沈澱によりかこまれた典型的な、大きいPrt+コ
ロニーを形成した（第９図参照）。エス・ラクチスMG13
63（pKGV2）は、30℃で長時間インキユベートしたあと
でさえ、Prt-の遺伝表現型の特色である非常に小さなコ
ロニーを形成するにすぎない。 GMAB培地上では、エス・ラクチスMG1363（pGKV500）
は黄色のかさ（halo）をともなう明るい黄色のコロニー
を形成するに対し、エス・ラクチスMG1363（pGKV2）は
白色又は淡い黄色のかさ又はかさなしで小さなコロニー
を形成するにすぎない。 エス・ラクチスMG1363（pGKV500）、エス・ラクチスM
G1363（pGKV2）及びエス・クレモリスWg2のミルク中の
成長及び産酸力について比較した。この試験で一貫して
使用したプラスミドを含まないエス・ラクチスMG1363株
の母株で、33Mdのラクトーズ／プロテナーゼプラスミド
pLP712（文献８参照）を有するエス・ラクチス712をこ
の比較には使用した（第10図参照）。 この例から代謝機能に関する遺伝子を含むプラスミド
で形質転換した宿主細胞は、良好な成育を示すか又はプ
ラスミドを有しない細胞よりもより活発であることを立
証した。 乳糖は、乳酸菌の通常の炭素源であり、それ故プラス
ミドのマーカーとして乳糖の代謝に関する遺伝子の一つ
ないし数種の遺伝子を用いることは、それ故、魅力的で
ある。 乳酸代謝に関与する遺伝子を含有するpLP712のBcl I
の大きな断片を、pGKV41又はPGKV500のEmR遺伝子のBcl
I部位に結合することによりlac-宿主細胞にミルク又は
同様な基質中で他の淘汰圧をかけることなく良好な成長
を示す性質を与えるプラスミドを生成することが期待出
来よう。 実施例6:他のプロテアーゼ遺伝子を検出、分離するため
のプローブとしてpGD4からの5.0Md BamH I断片及びpGD6
からの1.4Md BamH I/Hind III断片の利用。 プロテナーゼ（プロテアーゼ）の最適pH及び温度をも
とに、エス・クレモリスの菌株は５種類のグループに分
類される。この分類によればエス・クレモリスHP株及び
同Wg2株は同一のグループに属する（文献40参照）。 更に、エス・クレモリスHP株は9Mdのプロテナーゼプ
ラスミドを保有していると報告されている（文献41参
照）。pGD4由来の5.0Md BamH I断片とpGD6由来の1.4Md
のBamH I/Hind III断片が、他の給源からの同属の又は
一部同属であるプロテナーゼ遺伝子の検出及び分離のた
めのプローブとして利用しうるか否かを知るために、以
下の実験を行なつた。pGD4からの5.0MdのBamH I断片及
びpGD6からのBamH I/Hind III断片を、両プラスミドの
制限酵素消化物より分離した。これらを〔アルフアー32
P〕dCTPを用いてニツク・トランスレーシヨン］し、
（文献42参照）サザンハイブリダイゼーシヨン（文献2
3）でプローブとして使用した。操作手順の確認のため
プローブをプロテナーゼの豊富な、あるいはプロテナー
ゼ欠損したエス・クレモリスWg2株の全プラスミドに使
用した。BamH I及びBamH I/Hind IIIの両断片ともエス
・クレモリスWg2（Prt+）のpWV05とのみハイブリダイズ
化し、エス・クレモリスWg2（Prt-）とは反応しなかつ
た。このことは、エス・クレモリスWg2（Prt+）の他の
プラスミド中には同属又は一部同属のプロテナーゼ遺伝
子がなくBamH I及びBamH I/Hind III断片は真にpWV05起
源のものであることを示唆している。 更に、エス・クレモリスHP（Prt-）のプラスミドとは
両断片ともハイブリダイズ化しなかつた。しかし、両者
ともエス・クレモリスHP中に存在する9Mdプラスミドと
ハイブリダイズ化した。このことは、このプラスミドも
勿論pWV05のプロテナーゼ遺伝子に同属の遺伝子を含ん
でいることを立証している。次の段階では、この9Mdの
プラスミドを制限酵素に消化させエス・クレモリスHPの
プロテナーゼ遺伝子が位置している断片を決定すること
である。それ故、pWV05のプロテナーゼの完全遺伝子又
はその断片を使用して、他の乳酸菌の別の同質又は一部
同質のプロテナーゼ遺伝子をプローブ及び分離すること
もできよう。 枯草菌内でのプレプロキシモンの発現及び排出 バチルス系の細菌はある種の蛋白質を体外に特に分泌
することができるので、クローン化した遺伝子の発現の
ための宿主細胞として使用するには魅力的な微生物群で
ある。バチルス系細菌を組換DNA発現用宿主として使用
するための可能性を確立するともに先にのべた菌外排出
プロセスを見極めるべく、（メチオニル）プロキモシン
それ自体として及びバクテリオフアージSP02プロモータ
及びα−アミラーゼ又は統合リボゾーム結合部位の統制
下でのビー・アミロリクエフアシエンスα−アミラーゼ
信号配列（プレプロキモシン）とのプロキモシンの正確
な融合としてのプロキモシンの発現及び排出を研究し
た。 プレプロキモシン蛋白は細胞内で一部プロセス化され
てプロキモシンと一緒に移動する形態となる。 プレプロキモシンは枯草菌により菌外に排出されるが
非常に不充分である。培養液中でのプロセス化した形態
の実証はできないが、プロセス化が全く起らないか、又
はプロセス化された形態が迅速に分解されるためであろ
う。プレプロキモシンを暗号化しているDNAを含有する
プラスミドpMS48は250世代の間の淘汰圧でも恒成分培養
そう中では安定であることが明らかとなつた。 はじめに バチルス属細菌は、クローン化された遺伝子の発現に
とつては魅力的な宿主である。このグラム陽性の微生物
は、非病原性でエンドトキシンを有さず、大規模で工業
的に酵素を製造するのに重要である。これらの酵素は菌
体外に高収率で製造される。組換DNA技術での宿主系と
しての微生物を開発するにあたつて肝に銘じておかなけ
ればならない点は、外来遺伝子製品の効率的発現と排出
である。 排出は収率を増加させ、かつ醗酵ブロスから蛋白質の
回収を簡便にするだけでなく、排出された蛋白の保持及
びそれに引き続いての機能に陽性の影響を与えるようで
ある。 このようにして今までに数種類の外来性蛋白がバチル
ス属の細菌内で作られて居り、それらの内にはマウスの
ジハイドホレート還元酵素（ウイルアムス等、文献58参
照）シユードモナス カテコール2,3−ジオキシゲナー
ゼ（ツコウスキー等、文献59参照）プロインシユリン
（モスバツク等、文献52参照）、ウイルスの抗原（ハー
デイ等、文献48参照）、大腸菌のβ−ラクタマーゼ（パ
ルバウ等、文献55及びオオムラ等、文献53参照）及びα
−インターフエロン（パルバア等、文献56参照）が含ま
れる。 外来性蛋白の排出はビー・アミロリクエフアシエンス
（パルバア等、文献55及び56参照）又は枯草菌（オオム
ラ等、前出）からのα−アミラーゼ、又はビー・リキニ
ホルミス（B. licheniformis；モスバツク等、前出）の
ペニシリナーゼの信号配列を上記の蛋白を暗号化してい
る配列と融合させたときに観察できた。これらの融合体
は、しかし、蛋白を誘導化する、当該蛋白の信号配列以
外に常に１ないしそれ以上のアミノ残基を余分に含んで
いるので、厳密な意味では存在していなかつた。キモシ
ン（レンネン、イー・シー３・４・23・４）は、はんす
うを開始していない仔牛の第４胃（アボマスム）に存在
するアスパルチルプロテナーゼである。この酵素はミル
ク中のκ−カゼインの制限された蛋白分解に関与し、そ
の結果ミルク中の蛋白を凝固させる（ホルトマン、文献
46参照）、チーズ製造において幾種かの製品で全世界的
に応用されているのでキモシンは重要な因子である。キ
モシンは不足しているが、微生物由来のプロテアーゼで
それを満すことは、法的規制や性状や味覚の点で好まし
くない副作用があることから、できない。キモシンの利
点と微生物による生産による多様性を結合させるため
に、mRNA−由来の二重鎖のDNA形態中へキモシンを暗号
化している遺伝情報の大腸菌への分子クローン化を行な
つた（マート等、文献49参照）。 キモシンは一次翻訳製品、プレプロキモシンの特定蛋
白分解により形成される成熟製品である。プレキモシン
は16個のアミノ酸残基の長さを有し、非常に疎水性の信
号配列の排出に関連した除去によりプロキモシンへとま
ず転換される。次いで、低pH−依存性の制限された加水
分解によりキモシンへと転換される。 バチルス属の細菌での排出プロセス及び収率に及ぼす
排出の影響を究明し、組換DNA発現宿主としてのバチル
ス属細菌の使用可能性を確定するためにプロキモシンそ
れ自体及びビー・アミロリクエアシエンスα−amylose
信号配列を用いての正確な融合蛋白としての発現を実施
した（パルバア等、文献54参照）。この融合製品はプレ
プロキモシンと名づけられた。 後次過変異を含むプラスミツドpMS48の安定性を恒成
分培養そう中で研究した。 材料及び方法 細菌 使用した細菌宿主は次の通りである。 1A435（VBBBa01−113）:pro−１ 1A436（VBBa01−105;1G20）:trpC2、hsdR、hsdM（デー
ン等、文献43参照）。 プラスミド及び酵素 プラスミドpMS48及びpMS50はpPL608の誘導体である。
（ウイルアムズ等、文献58参照） 制限酵素、T4−DNA−リガーゼ及びDNA−ポリメラーゼ
は、アメルシヤム社（Amersham Ltd）、エヌ・イー バ
イオラボ社、ベセスダ リサーチ ラボ社（Bethesda R
esearch Labs）及びベーリンガー社より入手した。 放射性化学物質はアメルシヤム社より入手した。 分子生物化学的手法 枯草菌をチヤン及びコーエンのプロトプラスト/PEG手
順（文献17参照）により系質転換した。単離、特性化及
びDNAの核酸配列の解析は、本質的にはマニアテス（Man
iatis;文献50参照）等の方法により実施した。プレプロ
キモシン及びプロキモシンをそれぞれ暗号化したpMS48
及びpMS50の構造はいずれ詳細に発表する予定である
（マートら、現在投稿中） プレプロキモシンの枯草菌による発現は次のようにし
てモニターした。すなわち、細菌を20マイクログラム/m
lのトリプトフアン、20マイクログラム/mlのアミノ酸、
7.5マイクログラム/mlのカナマイシン及び必要に応じて
２％のグルタミン酸ソーダをも含む、エバンスらの炭素
制限培地（文献45参照）で成育させた。 サンプルは、対数増殖期の成長培地から採取した。ED
TA（エチレンジアミンテトラアセテート）及びPMSF（フ
ツ化パラ−メチルスルホン酸）を、蛋白分解を停止させ
るために、それぞれ10ミルモル/ml及び100μg/mlの濃度
で加えた。 細胞は遠心分離により回収した。 細胞溶解物はペレツト状の細菌を10ミリモル／の、
１ミリモル／のEDTA、２％のSDS（ドデシル硫酸ソー
ダ）を含むpH7.0のリン酸カリウム緩衝液に再懸濁さ
せ、次いでフレンチプレスで破壊し、調製した。溶解物
は残つている細胞残さを除去するため遠心分離した。 培養液を凍結乾燥し、当初容量の10分の１量の蒸留水
中にとり、当量の20％TCA（トリクロロ酢酸）を加えて
沈澱させた。ペレツト化した蛋白を蒸留水中に溶解さ
せ、再び蛋白を10倍量のアセトンを加えて沈澱させた。
ペレツト状の残存蛋白をアセトンで洗い、真空乾燥し、
次いでクラツキング用緩衝液（エデンス等、文献44参
照）にとつた。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を上記文献記載に従い実施した。 ウエスタン ブロツト（Western blots）はゲル分離
蛋白をニトロセルロース上に電気泳動的に移行させた。
プレプロキモシンはトウビン等の方法（文献57参照）に
よりうさぎの抗キモシンIgG及び125I−蛋白Ａで反応さ
せ検出した。 恒成分培地そう 恒成分培地そう実験は50mlの実働容量のガラス製の醗
酵そうで0.6h-1の希釈率、細胞濃度109cfu/mlで37℃で
エヴンス等の炭素制限培地（前出）に上述の物質を補足
添加したものを用いて行なつた。 結果及び考察 枯草菌による外来遺伝子の発現及び排出を研究するモ
デルとしてpPL608の生長性のバクテリオフアージSP02−
プロモーターを含む一般的なプラスミドベクターを複数
作成した。プラスミドMS48は、ビー・アミロリクエフア
シエンスα−アミラーゼ信号配列がプロキモシンとの正
確な融合体（すなわちプレプロキモシン）となつて続い
ている同アミラーゼのリボソーム結合部位をも含有して
いる。プラスミドMS50は、そのSP02−プロモーターに加
えて、メチオニル−プロキモシンをともなう“統合”リ
ボゾームを含有する。 プラスミドpMS48及びpMS50の概要は第11図に示した。
リボゾーム結合部位及びNH2−ターミナル暗号化配列の
一部については第12図Ａ及び同Ｂに示した。 α−アミラーゼリボゾーム結合部位及び信号配列は化
学的に合成され、それはパラバア等（1981）に公表され
た配列の127位から268位にわたる。“統合”リボゾーム
結合部位は、17個のヌクレオチドを越える16Sリボゾー
ムRNAの３′−末端に対して充分に補足的であるように
合成されている。信号配列とプロキモシンの結合におけ
るSac II制限エンドヌクレアーゼ切断部位の存在（第12
図Ａ）及び“統合”リボゾーム結合部位のEcoR I制限エ
ンドヌクレアーゼ切断部位の下流（第12図Ｂ）は他の暗
号化配列の正確な導入を可能とし、構築されたプラスミ
ドの適用性を広げることとなる。全くプラスミドを含ま
ないか、プラスミドpMS48とpMS50を含まない枯草菌培養
物の細胞溶解物及び同上澄液のウエスタンブロツト解析
は第13図に示す。pMS50で暗号化されたプロキモシンは
すべて細胞間で検出されるのに対しpMS48で暗号化され
たプレプロキモシンは細胞溶解物（約５×104分子／細
胞）及び上澄液（約５×102分子／細胞）中で確認でき
る。 非常に特記すべき事実は、明らかに、プレプロキモシ
ンは細胞間で一部プロセス化されてプロキモシンと一緒
に移動する蛋白質となりプロセス化された形態のものは
上澄液中では検出されないことである。明らかに、プロ
セス化及び排出は、細胞中に存在する量（又はそれに付
着している量）と培地中の量で100倍の差異があるほど
に非常に不充分である。pMS50含有細胞の上澄液中で
は、プロキモシンを検出できないが、一方pMS48含有バ
チルスの上澄液中でのプレプロキモシンの検出は、細胞
溶解物そのものに起因するものとすることも出来ない。
細胞外のプレプロキモシンのこのフラクシヨンは、それ
故、細胞膜を通過してきたものであると考えなければな
らない。しかし、まだ、細胞溶解物中で検出されたプレ
プロキモシンが、非常に疎水性の信号配列を経由して細
胞膜に固定されているはずのものが、それから遊離して
きた蛋白から実際に一部でも構成されていると結論づけ
ることはできないし、また上澄液中のプレプロキモシン
が細胞膜から洗い出されたとすることもできない。プロ
セス化された形態のものが上澄液中に検出されないとい
う事実は、蛋白分解作用により説明できるのかもしれな
い。反対に、プレプロセス化されていない形態のものは
細胞壁と密接に連合しているので、それはプロテアーゼ
に対して良く防護されているのかもしれない。洗い出し
現象はEDTAの添加又は遠心分離工程により起りうる。グ
ルタミン酸塩による（エキソ）プロテアーゼの抑制は、
発現の水準には影響しなかつたようである（第14図、第
１及び第２レーン参照）。プロー１菌株の場合と比較し
てプレプロキモシンの発現水準は幾分高いようであつた
（第14図、第４レーン参照）加えて、プロセツシングの
量はこの場合、より低いようであつた。枯草菌1A436（V
BBBa01−105）内のpMS48上に位置するクローン化したDN
Aの安定性は、炭素源制限培地を用いた恒成分培養そう
を使用し決定した。μmax（Ｄ＝0.6h-1）の約80％で成
長させ、pMS48を含む枯草菌を種々の時間間隔でモニタ
ーした。250世代後においてさえ、制限酵素解析により
示した如く認めうる変化を有さず、元のまゝのプラスミ
ドを全細胞とも含んでいた。更に、すべての細胞もプレ
プロキモシンを依然として生産できた。 結論 − pPL608由来のベクターは、外来DNAの発現水準を比
較的高めることのできる安定な系の一標本であると思わ
れる。 − “統合”リボゾーム結合部合はそのまゝ機能する。 − ビー・アミロリクエフアシエンスの信号配列が正確
にプロキモシンに融合されているプレプロキモシンの部
分は枯草菌の細胞膜を通過する。 − このプレプロキモシンのプロキモシンと共に移動す
る形態へのプロセス化が起ることが立証されたが、しか
し、このような形態は細胞溶解物中でのみ検出できた。 − 明らかに効果的発現及びプロセス化には信号配列の
構造的存在に加え他の因子を必要とする。 参考文献一覧表 1. アール・オツトー、ダブチユー・エム・デボス及び
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ルバス、エイチ・セーダーランド、ケイ・タキンネン及
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クエフアシエンスからのプロモータ及びα−アミラーゼ
遺伝子のNH2−ターミナル信号ペプチド領域の核酸配列 （Palva,I.,Pettersson,R.F.,Kalkkinen,N.,Lektovaar
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ーラ、エム・シバコフ、及びエル・ケール−ネン著、19
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ルーネン、エム・シバコフ、ケイ・カンテル、スイー・
エイチ・シヤイン、ケイ・カシワギ及びスイー・ワイス
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遺伝子、22巻、229−235頁 （Palva,I.,Lehtovaara,P.,Kriinen,L.,sibakov,
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horetic transfer of proteins from polyacryalamide
gels to nitrocellulose sheets:Procedure and some a
pplications.Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:4350−4354.） 58. デイー・エム・ウイリアムズ、アール・ジイー・
シヨナー、イー・ジエイ・デバール、エル・エイチ・プ
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ー、デイー・スペツク、エム・カウフマン、エイ・フイ
ンデリ、エイ・ワイスカツプ及びジエイ・ピー・レコツ
ク著、1983年、クローン化したシユードモナス遺伝子の
発現にもとづく枯草菌での遺伝子制御信号の色素産生性
の決定、米国国立教養学会大会講演集、80巻、1101−11
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n Bacillus subtilis based on expression of a clon
ed Pseudomonas gene.Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:1101
−1105.）
する細菌及び当該細菌を使用して、醗酵食品、動物用飼
料、同成分又は酵素などの蛋白質を、製造する方法に関
するものである。特に、この発明は枯草菌（Bacillus s
ubstilis）、大腸菌（Escherichia coli）及び乳酸菌の
菌体内で複製できる組換プラスミドに関するものであ
る。もしも、少くなくともひとつの同属の又は外来の遺
伝子を含み、その遺伝子をえり抜きの宿主細胞内に移入
し発現させることが出来るならば、上述の組換プラスミ
ドは大変好ましいものとなる。また、それによつて当該
宿主細胞の醗酵性を改良し又は拡大することができる。 3.背景技術 大部分の組換DNAについての研究は大腸菌や枯草菌な
どの細菌を用いて行われて居り、乳酸菌に属する連鎖状
球菌類（streptococci）の遺伝学については殆んど知ら
れていない。しかし、連鎖状球菌類は食品工業にとつて
もつともつと重要なものであり、例えば、ミルク又は乳
製品の醗酵により調製する酪農製品、動物用飼料に加
え、他の醗酵食品例えば肉、サーワード・ブレツド（so
ured bread）及び醗酵野菜の調製などが挙げられる。 チーズ、ヨーグルトなどの酪農工業に使用される乳酸
菌のうち連鎖状球菌類の上質スーターターの培養株は産
酸能、蛋白分解能、フアージ抵抗力及びフレーバー形成
能などの菌株の特長を注意深く維持・管理しなければな
らない。何故ならば、容易に変異株が生じたり、感染し
たりするため、スターターの品質が破壊されるからであ
る（文献１参照）。乳酸菌の培養株を改良するために組
換DNA技術により何をなすべきであるかということにつ
いての幾つかの見解はウオターズ（Wouters）及びスタ
ドハウダーズにより公表されている（文献２参照）が、
しかしこの著者らは実際的な解決手段を示していない。 そのため、乳酸菌内で所望の蛋白質を発現することが
でき、それにより形質転換された乳酸菌の性質が食品工
業に適つたように改良されるか、又は適つた新規の性質
を保有している組換プラスミドが望まれている。 3.発明の要約 この発明は、枯草菌、大腸菌及び乳酸菌、特に連鎖状
球菌類の菌体内で複製でき、乳酸菌に存在する少くなく
ともひとつのプラスミドから得られたDNAを含み、上記
の三種類の細菌内で発現可能であるマーカーを少くなく
ともひとつ含み、かつ発現したとき当該微生物に対して
改良され、又は新規な性質を与える挿入DNA断片を含
む、組換プラスミドを提供するものである。 かゝるプラスミドとしては、少くなくともストレプト
コツカス クレモリス（Streptococcus cremoris）のプ
ラスミドpWV01の一部、特にプラスミドpWV01の最大Cla
I断片を含有することが望ましい。スタフイロコツカス
アウレウス（Staphylococcus aureus）プラスミドpC1
94及びpE194 Cop−６由来のクロラムフエニコール抵抗
性（CmR）及びエリスロマイシン抵抗性（EmR）遺伝子が
共にマーカーとして適切であることが判明した。しか
し、自家マーカー、例えば乳糖代謝に関与する遺伝子な
どが上記の抗生物質抵抗性マーカーよりも好ましい。何
故ならば、抗生物質による淘汰圧を継続することは、醗
酵食品の調製には特に好ましくないからである。上記細
菌類に対して望ましい性質を与えることのできる挿入DN
Aの断片の例としては、蛋白質を当該細胞が同化できる
ペプチド及び／又はアミノ酸に分解可能なプロテアーゼ
を暗号化している遺伝子、キモシンなど牛乳凝固酵素を
暗号化している遺伝子、当該細菌にバクテリオフアージ
抵抗性を付与する遺伝子、クエン酸塩代謝に影響する遺
伝子、及び乳酸代謝に関与する遺伝子などの構造遺伝子
があげられる。 この発明は、更に、発現により細菌に所望の性質を付
与する構造遺伝子の挿入により、上記プラスミドの製造
用の出発原料として適当な組換ベクタープラスミドを提
供するものである。 当該プラスミドは、また制御配列、例えば、構造遺伝
子に結合し、かつ構造遺伝子に属するプロモータか、又
は同属又は外来のプロモータであつても差支えはないが
既にベクタープラスミド中に存在している（強力な）プ
ロモータおよび好ましくは転写終了配列などを含有して
いなければならない。 この発明は、また挿入された構造遺伝子を含み、又は
含まない当該組換プラスミドを含有する細菌、特に連鎖
状球菌を提供するものである。 他の実施態様は上記の形質転換された細菌を醗酵に用
いた醗酵食品、動物用飼料又は同飼料用成分の製造方法
及び同方法により製造された製品に関するものである。 この発明は、更には、通常乳酸菌では生産されないか
されたとしても極く少量である蛋白質の製造方法及びそ
のようにして得られた蛋白質に関するものである。 4.図面の簡単な説明 この明細書にはこの発明の説明の参考として次の図面
を添付している。 第１図には、プラスミドpGK1、pGK11及びpGK12の制限
酵素地図及びプラスミドpWV01、pGL112（プラスミドpC1
94とpUB110とのキメラの一つ）及びpE194 cop−６から
の上記プラスミドの製造過程を示す。pWV01は、更に
（プラスミド）の構築に使用出来る特異的なMbo１切断
部位一個とCla I切断部位２個を有している。pGK1は一
個の特異的なHpa II切断部位を、pG11は特異的なCla I
及びHpa II切断部位を、pG12は特異的なBcl I、Cla I及
びHpa II切断部位を有している。 第２図には、プラスミドpGKV1及びpGKV2の直線状に表
わした制限酵素地図及び重要遺伝子及びそれらの方向並
びにpPL608及びpGK3からの上記プラスミドの製造過程、
及びpWV01及びpE194 cop−６からのpGK3の製造過程を示
す。この三種類のプラスミドすべてがEmR遺伝子中に１
個のBcl I切断部位を有し、更にpGKV1及びpGKV2はCAT
（クロラムフエニコール アセチル トランスエラーゼ
の略称）遺伝子中に特異的なHind III切断部位１個を有
する。 第３図には、プラスミドpWV05の制限地図をBamH I、B
gl II、Cla I、EcoR I、Hind III、Pst I及びSal Iに関
して直線状にして示す。更に、プラスミドpGD4及びpGD6
の制限酵素地図を、pGD4及びpGD6中に存在するpWV05の
断片との関係について直線状にして示す。pGD4及びpGD6
（それぞれpACYC184及びpBR329より製造）中のベクター
DNAを太線で示した。第３図はpGD4及びpGD6が共にpWV05
のHind III断片Ｃを包含することも示している。 第４図には、プラスミドpGKV2及びpGKV500の制限酵素
地図と当該プラスミドの断片のオリジンを直線状にして
示す。 第５図にはエス・クレモリスWg2株の蛋白分解系に対
して（抗体活性を）高めた抗体を使用した、枯草菌PDL1
株（pGKV500）の無細胞抽出物及びエス・クレモリスWg2
株の精製蛋白分解系についての交差及び縦列免疫電気泳
動の結果を示す。 第６図にはエス・クレモリスWg2株の蛋白分解系に対
しての（抗体活性を）高めた抗体を使用した、エス・ラ
クテイスMG1363株（pGKV2）及びエス・ラクテイス1363
株（pGKV500）の無細胞抽出物の交差免疫電気泳動の結
果を示す。 第７図にはpGKV2とM13 mp11から誘導されたpGKV41の
構築、M13mp11から誘導された修飾された多重クローン
部位（MCSと称す）及びpGKV41の制限酵素地図を直線状
として表わしたものを示す。枯草菌由来のSPO2プロモー
タとビー・プミリス（B.pumilis）のCAT遺伝子の間に一
つのMCSを、このプラスミドは有する。 第８図にはpGKU1の構築を示す。これは、pGKV41の誘
導体で化学的に合成したリボゾーム結合部位（RBSを称
す）、化学的に合成したアルフアーアミラーゼ信号配列
とpMS48由来のメチオニル−プロキモシン遺伝子をも含
有する。 第９図にはエス・ラクテイスMG1363株（pGKV500）及
びエス・ラクテイスMG1363（pGKV2）のグルコース及び
エリスロマイシンを含む透明クエン酸塩−ミルク−寒天
平板培地上の成育結果を示す。尚、その成育結果が異な
るのは、両菌株の代謝上の差異の結果である。 第10図にはエス・ラクテイスMG1363のミルク中での成
育及び産酸能に及ぼす影響をpGKV2の効果及び二野生
株、すなわちエス・クレモリスWg2（Prt+）及びエス・
ラクテイス712株と比較し、示す。 第11図には、pPL608中に存在するフアージSP02プロモ
ータの転写支配下でそれぞれプレプロキモシン及び（メ
チオニル）−プロモキシンを暗号化している配列を含む
プラスミドpMS48（外円）及びpMS50（内円）の構造を示
す。このプラスミドを網羅する範囲が示されている。 第12図には、当該Pst I/BstE II切断部位とプロキモ
シンを暗号化した遺伝子の第４番のコドンとの間の領域
のDNA配列をpMS48（Ａ）及びpMS50（Ｂ）に存在するま
ゝに示してある。 第13図には、pMS48を含有するバチルスの細胞溶解物
と上澄液中でのプレプロキモシンの存在を示すためのウ
エスタンブロツトのオートラジオグラムを示す。 第１レーン:1A436Aの細胞溶解物 第２レーン:pMS50を含む1A436Aの細胞溶解物 第３レーン:pMS48を含む1A436Aの細胞溶解物 第４レーン:1A436Aの上澄液と混合したpMS48を含む1A43
6Aの細胞溶解物 第５レーン:pMS48を含有する1A436の上澄液 第６レーン:pMS50を含有する1A436の上澄液 第７レーン:1A436の上澄液 第８レーン：精製したキモシンを含む対照レーン 細胞溶解物の場合には、約108個の細胞に相当する量
をレーンあたり負荷した。上澄液の解析には、109cfu/m
lの培養物の上澄液4mlに相当する量をレーンに負荷し
た。第４レーンの混合物は種々のサンプルの電気泳動時
の行動による差異に起因する誤まつた解釈を除外するた
めに導入した。 第14図にはプレプロキモシン及びそのプロセス化され
た形態の細胞溶解物中に存在することを明らかにするた
めのウエスタンブロツトのオートラジオグラムを示す。 第１レーン:1A436の細胞溶解物 第２レーン:pMS48を含有する1A436の細胞溶解物 第３レーン:2％グルタミン酸ソーダ存在下の第２レーン
負荷物 第４レーン:pMS48を含有する1A435の細胞溶解物 第５レーン:pMS50を含有する1A436の細胞溶解物 バンドは抗キモシンIgG及び125I−蛋白Ａとの反応を
用い明視化した。 約108個の細胞に相当する量を各レーンに負荷した。 5.詳細な説明 上述の如く、乳酸菌内において蛋白質を発現でき、そ
の結果形質転換された乳酸菌が、食品工業で望まれてい
る改良され又は新規の性質を有することとなる、組換プ
ラスミドへの要望が存在する。 この発明は枯草菌、大腸菌ばかりでなく乳酸菌、特に
連鎖状球菌内で発現できる遺伝子を含む組換プラスミド
を提供するものである。その結果、このようにして形質
転換された乳酸菌は、食品、動物用飼料及び食品又は飼
料用の原料の醗酵を利用した生産に使用でき、その結果
上記菌は改良され又は新規の性質を有することとなる。 よつて、この発明の第１の特長は枯草菌、大腸菌及び
乳酸菌内で複製できる組換プラスミドであり、それは、
乳酸菌体内に存在するプラスミドより構築され、少くな
くとも一つのマーカーと、少くなくともひとつの挿入DN
A断片が挿入されて居り、かつマーカーは上記の三種類
の微生物の菌体内で発現でき、発現により当該微生物に
改良され又は新規な性質を付与するものである。 本発明による組換プラスミドは上記三種類の微生物内
で発現できるマーカーを少くなくとも２個有することが
好ましい。 更に少くなくともマーカーのうち１個は挿入DNAの挿
入により不活性化されるものであり、当該マーカーに挿
入DNA断片が挿入できるという利点を有することのでき
るものであることが望ましい。最も適切なマーカーはそ
れぞれスタヒロコツカス アウレウス プラスミドpC19
4（文献３参照）及び同プラスミツド pE194 cop−６
（文献４参照）由来のクロラムフエニコール抵抗性（Cm
R）遺伝子及びエリスロマイシン抵抗物（EmR）遺伝子の
様であつた。これらのマーカーの一つの利点は完全な塩
基配列が知られていることである。EmRマーカー固有の
もう一つの利点はEmRプロモータを誘導可能であり、そ
の結果EmR遺伝子のプロモータの規制下にもたらされた
遺伝子の発現もまた乳酸菌内で誘発しうるという事実に
ある。EmRのもう一つの利点は特異なBcl I切断部位を有
し、その部分は挿入を容易にするということである（こ
の点についてはpGK12についての後述の記載を参照のこ
と。）。 CmR及びEmR遺伝子は枯草菌及び大腸菌内で発現が可能
なことは既で知られている。これらの遺伝子は乳酸菌内
でも驚くべきことに発現できるということを見出した。
この発明による組換プラスミドは少くなくともストレプ
トコツカス クレモリスのプラスミドpWV01（文献１及
び５参照）の一部を含有することが好ましい。 上記の発現プラスミドの調製用の出発原料としては、
枯草菌、大腸菌及び乳酸菌、特に連鎖状球菌内で複製が
でき、少くなくとも上記の三種類の菌内で発現可能なマ
ーカー１個を含み、及び／又はストレプトコツカス ク
レモリス内での発現のため複製ori領域を有する同菌の
プラスミドpWV01の一部を含有する組換ベクタープラス
ミドを使用することができる。 第１世代のベクタープラスミド、すなわち、マーカー
１個を含有するものの例としてはpGK1と称されるものが
あり、これはpGL112由来のMbo I断片をpWV01のMbo I切
断部位挿入することにより調製されたものである。（文
献１）尚、pGL112はプラスミドpC194及びpUB110（文献
６参照）のキメラである。pGK1は、ホリノウチ等（文献
３）の配列の等973番目のマクレオチドから始じまるプ
ラスミドpC194由来の特異的Hap II部位を有する。 このプラスミドは、２個のCla I切断部位の間の小さ
な断片を除去するためのCla Iによる処理及びリガーゼ
による再連結により、pGK11と称されるより小さいプラ
スミドへと転換された。形質転換についての研究によ
り、プラスミドpGK1及びpGK11の必須特性に影響を及ぼ
すことなくこの小断片を削除できることが見出された。
しかし、利点はpGK11は当該Hpa II切断部位に加え、も
う一つの特異的制限（酵素）切断部位、すなわち、Cla
Iを有しているということである。 第２世代の淘汰マーカーを有するベクタープラスミド
の例としては、pE194 cop−６をCla I及びHpa IIで処理
し、次いでEmR遺伝子を含む最大断片をCla−処理pGK11
とリガーゼで連結し、pE194 cop−６由来のEmR遺伝子を
gGK11に組み込むことにより調製されたものが挙げられ
る。このようにして調製されたプラスミドの一つは第１
図に示した構成を有して居り、pGK12と命名された。こ
のプラスミドはBcl I、Cla I及びHpa IIに対する三つの
特異的な切断個所を有している。 このBcl I切断部位はEmR遺伝子内に存在し、この箇所
へのDNAの挿入は当該遺伝子を不活性化することとなる
（文献７参照）。それ故、pGK12はCmR形質転換体の最初
の選抜に続いてBamH I、Bcl I、Bgl II及びMbo Iで産出
された断片〔いずれも（５′）GATC（３′）突出末端
（protruding ends）を有する。〕を挿入し不活性化す
ることによるクローン化に用いることができる。pGK12
はまたEmRの不活性化を利用した指向的クローン化の可
能性をも提供する。すなわち、異つた突出末端を有する
ベクターが当該プラスミドのBcl I及びCla Iによる切断
により得られる。Cla I及びBcl I切断部位は共に両抵抗
性遺伝子の外に位置して居り、いずれも（５′）CG
（３′）突出末端を有するCla I、Hpa II及びTaq Iによ
り生成される外部のDNA断片の挿入に用いることができ
る。CmRの不活性を伴う挿入は、またpGK12のCmR遺伝子
を含むCla I−Hpa II断片を除去し、Cla I、Hpa II、Ta
q I又はそれらを組合せたものにより生成された突出末
端を有する断片を挿入することにより、同様に可能であ
る。 これらの抗生物質抵抗性マーカーは、乳酸菌内へ外部
遺伝子をクローニングするのに大変役立つように思われ
ていたが、これらのマーカーは（乳酸菌では）不活性化
するか又は削除し、自家マーカーを用いることが好まし
い。自家マーカーは食品工業に使用する微生物にとつて
は利点となる。更に、醗酵過程で宿主細胞に種々の利益
を与えうる。このような自家マーカーの例としては、pG
K12のBcl I切断部位に組込むことができる乳糖代謝に関
する遺伝子（文献８参照）がある。 第１世代のベクタープラスミドのもう一つの例として
は、pGK3と称されるものがある。これはストレプトコツ
カス クレモリスWg2プラスミドpWV01をCla Iで処理
し、Cla Iの最大断片を分離し、次いでEmR遺伝子を含む
pE194 cop6のCla I−Hpa II最大断片でもつて上記最大
断片をリゲートすることにより調製されたものである。 このpGK3は次のようにして第２世代のプラスミドに変
換可能である。 （１） このプラスミドをCla Iで直鎖状とし、第１のD
NA分子を得るために大腸菌DNAポリメラーゼＩのレナウ
（Klenow）断片を用いて接着末端を閉ぐ。 （２） 枯草ベクターpPL608（文献９参照）をPvu IIに
よる完全消化とEcoR Iによる部分消化にさらし、SP02プ
ロモータ及びCAT遺伝子を含有するPvu II−EcoR I最大
断片を分離し、第２のDNA分子を得るために大腸菌DNAポ
リメラーゼＩのクレナウ断片を用いてEcoR Iの接着末端
を閉ぐ。 （３） 第１と第2DNA分子をリゲートする。得られるプ
ラスミドには２種の型態があり、それぞれpGKV1及びpGK
V2と命名されている。これらの調製及び直線状にあらわ
した制限酵素地図を第２図に示す。 pGKV1及びpGKV2の両者ともに第２図に示した如く大腸
菌SP02プロモータの支配下のCAT遺伝子内に特異的Hind
III切断部位を含有する。尚、ここでCATとはクロラムフ
エニコールアセチルトラン・フエラーゼを意味し、この
酵素はクロラムフエニコールを連続的に不活性の３−ア
セチル、及び1,3−ジアセチル一体に変換することによ
り不活性化する。（文献３参照）。このように、CAT遺
伝子は、CmR遺伝子とは異なるが、共に発現により、CmR
形質転換体を与える。 プラスミドpGKV2はプロテアーゼの暗号を有する構造
遺伝子を含有する組換プラスミを調製するのに使用さ
れ、そのプラスミドはpGKV500と命名された。このプラ
スミドは、ストレプトコツカス クレモリスWg2プラス
ミドpWV05の4.3MdのHind III断片Ｃ（この調製方法につ
いてはこの明細書中で後述する。）を、プラスミドpGKV
2の特異的Hind III切断部位へ挿入することにより調製
された。 CAT遺伝子のHind III切断部位への挿入の結果、pGKV5
00を用いた形質転換によりCmSEmR（ここでＳは感受性を
示す。）形質転換体が得られる。 乳酸菌内で構造遺伝子を発現する組換プラスミドを調
製した場合、当該プラスミド淘汰圧をかけずに複製でき
るほど充分に安定であることを条件として、形質転換さ
れた微生物が再び抗生物質に感受性を有するようにする
ためには、少くなくとも１つのマーカーを除去すること
が、実際に使用する場合には好ましい。 この発明による組換プラスミド中に自家マーカーが存
在するならば、これらのプラスミドが発現する当該細菌
に対して他の細菌を越えた利点を与えることができる。
というのは、醗酵培地中の成分をより効果的に使用し、
その結果良く成育することとなるからである。 この発明のもう一つの実施態様は、改良された新しい
性質の暗号を有する挿入−DNAの一片を含んでいても、
また、含んでいなくとも良いが、この発明により得られ
た一以上の組換プラスミドを植え込んだ枯草菌、大腸菌
及び乳酸菌、特に連鎖状球菌、に関するものである。 好ましい乳酸菌としては、プラスミド中にプロテアー
ゼを暗号化している挿入DNAにより、より安定で及び／
又はより高いプロテアーゼ活性を有するものである。 もう一つの好ましい乳酸菌としては、プラスミド中の
バクテリオフアージ抵抗性遺伝子を一つ以上含有する挿
入DNAにより、バクテリオフアージに対する感受性が低
くなつた乳酸菌である。 更にもう一つの好ましいものとしてはミルクの凝固酵
素又は乳製品の醗酵中に生成する当該酵素の前駆物質を
製造できる乳酸菌、特に好ましくは、キモシン又はその
前駆物質のうちの一つ、例えば、（メチオニル−）プソ
イドキモシン、（メチオニル−）プロキモシン及びプレ
キモシンなどを、キモシン又はその前駆物質の暗号を有
するプラスミド中の挿入DNAにより製造できるものであ
る。 この発明による乳酸菌はストレプトコツカス属に属す
るものが好ましい。ストレプトコツカス クレモリス、
ストレプトコツカス、 ジアセチラクチス（Streptococ
cus diacetilactis）又はストレプスコツカス ラクチ
ス（Streptococcus lactis）種に属するものが特に好ま
しい。 この発明の更にもう一つの実施態様は醗酵食品、動物
用飼料又はその成分を製造するに際し、この発明による
乳酸菌を使用する方法及びその結果得られたこれらの生
産物に関するものである。 この発明を下記の６つの実施例を用いて説明するが、
これに限定されるものではない。 実施例１においては組換ベクタープラスミドpGK1、pG
K2及びpGK12の構築について述る。このプラスミドは、
ストレプトコツカス クレモリス Wg2プラスミドpW01
の複製ori領域に加えて、１つ（pGK1及びpGK11の場合）
又は２つ（pGK12の場合）のマーカーを含有する。ま
た、枯草菌、大腸菌、ストレプトコツカス クレモリス
中のpGK12に存在する外来遺伝子CmR及びEmRの発現につ
いても記述する。 実施例２においては、pW101の複製ori領域に加え、１
つ（pGK3）及び２つ（pGKV1及びpGKV2）のマーカーを有
する組換プラスミドの構築について述べる。更に、二つ
（EmR及びCAT）の外来遺伝子の発現についても記載す
る。後者の遺伝子は枯草菌のSP02プロモータの統制下で
発現された。 実施例３においては、枯草菌及びストレプトコツカス
ラクチス中でのストレプトコツカス クレモリスのプ
ロテアーゼの暗号化した遺伝子のクローン化及び発現
を、pWV01の誘導体特に、プロテアーゼ遺伝子を含有す
るpGKV500を使用する場合について記載する。pGD4、pGD
6及びpGKV500の構築についてもまた記述した。 実施例４においては、枯草菌のプロモータの統制下で
ストレプトコツカス ラクチス内でのプロキモンを暗号
化した遺伝子についてのクローニング及び発現について
記載する。また、それに使用されるプラスミドpGK20、p
GKV210、pGKV21、pGKV41及びpGKU1の構築についても述
べる。 実施例５においては、pGKV500の組み込みにより、プ
ロテアーゼ活性を有する（Prt+）ように形質転換された
プロテアーゼ活性を有しない（Prt-）ストレプトコツカ
ス ラクチスMG1363の成育及び産酸能について記載す
る。 実施例６においては、pGD4からの5.0Md BamH I断片と
pGD6からの1.4MdのBamH I/Hind III断片とのハイブリッ
ド形成により他のプロテアーゼ遺伝子を検出し、分離す
る方法について記載する。 pWV05のプロテアーゼの分離及びその全般的な発現の
詳細は実施例３及び５に示すが、この出願においては特
許請求の範囲に含ませていない。しかし、この出願又は
昭和60年３月４日にヨーロツパ特許条約にもとづき出願
した関連技術についての他の出願からの優先権を主張し
て出願する他の出願の主題とする予定である。 実施例４において記載した枯草菌プロモータSP02及び
プロキモシンに関する構造遺伝子の組み合せに関する項
目についてもこの出願又は昭和60年３月４日にヨーロツ
パ特許条約にもとづき出願した他のこの発明と関連した
出願からの優先権を主張して出願する他の出願の主題と
する。 しかし、ストレプトコツカス ラクテイス内でのプロ
テアーゼ遺伝子の発現に関する実施例３及び５、並びに
ストレプトコツカス ラクテイス内でのキモシンの前駆
物質の遺伝子の発現に関する実施例４は組換プラスミド
で形質転換された乳酸菌の使用に関するこの発明の実施
態様を示す。尚この組換プラスミドは元の乳酸菌に対し
て改良され又は新しい性質を付与する。それ故に、これ
らの実施例もまずこの発明の実施例となつているのであ
る。 実施例６はpGD4からの5.0Md BamH I断片及びpGD6から
の1.4MdのBamH I/Hind III断片を他のプロテアーゼ遺伝
子の検出及び分離の指標として使用する場合を記載す
る。尚、当該遺伝子はプラスミドに挿入することにより
プロテアーゼ活性を有しない乳酸菌にプロテアーゼ活性
を付与することができる。 かくして、実施例１から５は、組換ベクタープラスミ
ド（pGK1、pGK3、pGK11、pGK12、pGD4、pGD6、pGKV1、p
GKV2、pGKV20、pGKV210、pGKV21、pGKV41）を乳酸菌に
たいして改良され、または新しい性質を付与することの
できる挿入−DNAを含有する組換プラスミド（プロテア
ーゼ活性についてはpGKV500、ミルク凝固活性について
はpGKU1）の双方について記載する。 実施例1:pWV01の複製機能を有するori領域に加え、少く
なくとも一つのマーカーを有するpWV01の誘導体、特に
プラスミドpGK1、pGK11及びpGK12の構築並びにpGK12内
に位置する外来遺伝子の枯草菌、大腸菌及びエス・ラク
チス内での発現 材料及び方法 細菌の菌株及び培地 使用した菌株は表Ａに示した。プラスミドDNAの調製
に際し、枯草菌及び大腸菌はTYブロス（文献13参照）中
で培養した。平板培養では、TYブロスを1.5％の寒天で
固化させ使用した。枯草菌及び大腸菌に対し、それぞれ
クロラムフエニコールは５及び２μg/ml、エリスロマイ
シンは５及び50μg/mlの濃度で使用した。ストレプトコ
ツカス ラクチスの培養には、M17−グルコースブロス
及びM17−グルコース寒天平板培地を用いた。ストレプ
トコツカス ラクチスにはクロラムフエニコール及びエ
リスロマイシンをそれぞれ５及び１μg/mlの割合で使用
した。 プラスミドDNAの単離 プラスミドpE194 cop−６及びpGL112は、エチジウム
ブロミドを含むCsCl密度勾配遠心法で、デ・ボスらの修
正方法を使用した（文献15参照）。大腸菌からの組換プ
ラスミド及びpWV01並びに枯草菌からの組換プラスミド
の大規模及び極く小規模及び大規模の調製は、ともにイ
シホロヴイツ（Ish Horowicz）及びバーク（Burke）の
方法によつた（文献16参照）。尚、イシボロヴイツ等の
方法による極く小規模及び大規模の調製方法の概要は次
の通りである。 （１） 培養物を遠心分離により収集する。 （２） 50ミリモルのグルコース、25ミリモルのトリス
（pH＝８）、10ミリモルのEDTAを含む溶液に懸濁し、イ
ンキュベートする。 （３） 0.2N NaOH、１％SDSを加え、おだやかに混合
し、氷上におく。 （４） 予じめ冷却した5M酢酸カリウム（pH4.8）を加
え、おだやかに混合し、氷上におく。 （５） 遠心分離により、沈澱した蛋白、ドデシル硫酸
塩、染色体DNAを除く。 （６） 上澄液にエチルアルコールを加え、短時間イン
キユベートし、遠心分離により核酸を沈澱させる。 （７） 得られたペレツトを70％のエタノールで洗浄
し、TE緩衝液にとる。 （８） 制限酵素を煮沸したRNaseを含む緩衝液中で作
用させ、トリス−ホウ酸塩−EDTA緩衝液中でアガロース
を用い解析する。 尚、大規模の場合は、培養物の使用量を多くすると共
に核酸の沈澱にイソプロパノールを使用する。 また、枯草菌については上記方法を次の如く修正した
方法により行なつた。すなわち、当該細胞を20％の庶糖
とml当り2mgのリゾチームを含むTES緩衝液（50ミリモル
のトリス塩酸塩、５ミリモルのEDTA、50ミリモルのNaC
l、pH＝8.0）中で０℃で15分間、次いで37℃で15分間イ
ンキユベートして溶菌させた。大規模又は小規模のスト
レプトコツカス ラクテイスからのプラスミドDNAの分
離はガツソン（Gasson）の方法により行なつた（文献８
参照）。尚、ガツソンの小量及び大量DNA調製方法の概
要は次の通りである。 少量の場合 （１） M17培地上で培養した細胞を遠心分離によりペ
レツト化する。 （２） 細胞をプロトプラスト用緩衝液に4mg/mlのリゾ
チームを含む溶液に懸濁させ、37℃でインキユベートす
る。 （３） 細胞溶解液を用いて溶解させ、5Mの塩化ナトリ
ウムを加える。 （４） 溶解物を遠心分離し、上澄液をデカンテーシヨ
ンにより得、得られた上澄液にクロロホルム−イソアミ
ルアルコールを加えて蛋白をのぞき、エタノールを加え
−20℃で一晩放置DNAを沈澱させる。 （５） 核酸を遠心分離により収集し、エタノールを除
きTE緩衝液に懸濁させる。 大量の場合 （１） １バツチ500mlの培養細胞液を遠心分離により
収集する。 （２） 水で洗浄し、4mg/mlのリゾチームを含むプロト
プラスト緩衝液に懸濁させて、遠心管に移しかえる。 （３） 遠心管でインキユベートし、ジエチルピロカー
ボネートを加え、更に短時間インキユベートする。 （４） 細胞溶解液を用いて溶解させ、次いで5Mの塩化
ナトリウムを加える。 （５） 溶解物を氷上の短時間放置し、次いで遠心分離
により透明とする。 （６） 上澄液をデカンテーシヨンにより得、クロロホ
ルム−イソアミルアルコールによる抽出で蛋白をのぞ
き、エタノールを加え核酸を沈澱させる。 （７） 沈澱した核酸を遠心分離により回収し、TE緩衝
液に溶解させる。 （８） RNaseで消化させ、適当量の塩化セシユウムを
加え屈折率を定められた値（例えば1.395）に調製し、1
0mg/mlの臭化エチジウム液と共に遠心分離する。 （９） 環状DNAを勾配法により除去し、イソアミルア
ルコールで抽出臭化エチジウムをのぞく。 （10） 得られたDNAをTE緩衝液で透析し、エタノール
で沈澱させ、更にTE緩衝液に懸濁させる。 制限酵素反応及びDNA断片の精製 制限酵素は製造業者により指定された方法にもとづき
使用した。消化されたDNAはTBE緩衝液〔89ミリモルのト
リス、89ミリモルのホウ酸、２ミリモルのEDTA、ml当り
0.5μｇの臭化エチジウム（ethidium bromide）、pH＝
8.0〕中で１％の水平状アガローズ（カルフオルニア
州、リツチモンド市バイオーラドラボラトリーズ社製）
ゲル中で解析した。EcoR Iで消化したバクテリオフアー
ジSPP1 DNAをDNAの大きさのマーカーとして使用した。
クローニングに使用した制限酵素により得られたDNA断
片は供給業者よりの指示に従つてアガローズゲル中で分
離し、DEAE膜〔西独国ダツセル市シユライフアー アン
ド シユーエル（Scheicher ＆ Schuell）社製〕で分
離、精製した。 分子クローニング及び形質転換 100μg/mlの濃度でベクター分子を、挿入すべき制限
酵素を作用させ得られた断片と約1:2の割合でTE緩衝液
（10ミリモルのトリス塩酸塩、１ミリモルのEDTA;pH＝
7.4）中で混合した。68℃で５分間加熱し、リガーゼ用
緩衝液〔10ミリモルのトリス塩酸塩、10ミリモルのジチ
オスライトール（dithiothreitol）、１ミリモルのAT
P、50ミリモルのNaCl;pH＝7.4〕にサンプルを順応させ
た。T4DNAリガーゼを加え、混合物を７℃で２時間イン
キユベートした。リガーゼ用緩衝液で５倍に希釈後、イ
ンキユベーシヨンを７℃で18時間行なつた。リガーゼで
処理したDNAと枯草菌8G5のプロトラストをチヤン及びコ
ーエンの方法に従い、すなわち、PEG溶液で２分間処理
し、庶糖及びブロスに再懸濁させ90分間成育させ形質転
換を行なつた。形質転換体は、５μｇのクロラムフエニ
コール又はエリスロマイシンを1ml当り含むDM3平板培地
上で淘汰した。枯草菌BG5株は、ブロン及びベネマによ
り記載された如く本質的にコンピテントに成育した（文
献10参照）。当該DNAに曝露後、TYブロスで培養物を二
倍に希釈し、発現のために90分間培養した。形質転換体
は1ml当り５μｇのクロラムフエニコール、５μｇのエ
リスロマイシン又は双方を含むTY平板培地上で淘汰し
た。大腸菌の形質転換には、定温下でCaCl2処理した菌
体を使用するいわゆるマンデル及びヒガ法（文献18参
照）を使用した。ストレプストコツカス ラクチスMG13
63株のプロトプラストの形質転換は、25％の庶糖をプロ
トプラストの安定化に使用した以外はコンドー及びマツ
カイによる修正チヤン及びコーエン法（文献19参照）に
より行なつた。 プラスミツドのコピー数の測定 枯草菌をスピツツエン（Spizizen）最少塩類（文献20
参照）とグルコース（0.5％）、カゼイン加水分解物
（0.02％）、及び成長因子（ビタミンをのぞき1ml当り1
4μｇ、ビタミンはml当り0.4μｇ）を含有する最少培地
で一晩成育させた。M9−グルコース最少培地（文献21）
に0.02％のカゼイン加水分解物及びml当り20μｇの濃度
で成長因子を補充した培地を、大腸菌の培養には使用し
た。ストレプトコツカス ラクチスをM17−グルコース
ブロス中で、対数増殖期後半まで培養した。三つの培地
のすべてにml当り５μCiの〔メチル−3H〕サイメジン
（〔methyl−3H〕thymidine）（マサチユウセツツ州ボ
ストン市ニユーイングランドヌクレアコーポレーシヨン
製）と適切な抗生物質を補充添加した。デユボスらのプ
ラスミドDNA分離手順（この実施例のプラスミドDNAの分
離の頂参照）の規模を100培に縮少し、培養物各2mlから
全細胞体及びプラスミドを分離した。ストレプトコツカ
ス ラクチスについては、10mlの培養物にリゾチームを
1ml当り5mgの濃度でリゾチームを加えて使用した。プロ
ナーゼでのインキユベーシヨン後、溶解物は凍結するま
で−80℃に放置し、次いで65℃で５分間加熱し、更にボ
ルテツクス混合機で30分間隔で２回（最高速度で）はげ
しくかきまぜた。溶解物中の染色体及びプラスミドDNA
は0.8％アガロースゲル中で分離した。臭化エチジウム
で染色されたバンドを切り取り、沸騰水浴上で溶解させ
た。ハイドルマ（Hydroluma;ペンシルバニア州チツスビ
ル市ルマツク システムス インコポーレーシヨン製）
を15ml添加後、試料をマークII液体シンチレーシヨンカ
ウンター〔イリノイ州デス プレインズ（Des Plaine
s）ニユークレアーシカゴコープ製〕中で計測した。 結果 pWV01の遺伝子のマーキング pGL112、pE194 cop−６、及びpWV01の構造地図は、そ
のクローニング方法と共に第１図に示した。pGL112はMb
o I生成した断片を１％のアガロースゲル上で分離し
た。最大断片はホリノウチ及びワイズブラム（Weisblu
m）の配列上の第973番目から第2004番目の塩基のpC191
配列により構成されている文献３参照。また、完全なク
ロラムフエニコール抵抗性（CmR）遺伝子を含むが、し
かしpC194の複製機能ori領域を欠く。pUB110の複製機能
ori領域（文献22を参照）を含まない。この断片は精製
され、pW101の特異的なMbo I部位へとリゲートされ、リ
ーゲシヨン混合物は枯草菌のプロトプラストの形質転換
に用いられた。CmR再生体が得られ、そのうちの一つの
プラスミド〔2.4メガダルトン、尚メガダルトンはMdと
略称する。〕は、pGK Iと命名され、制限酵素解析によ
り、特質が明らかにされた。Mbo Iによる消化により二
つの断片が生じたが、大きな断片は直線状としたプラス
ミドpWV01（1.5Md）と同一の場所へ移動した。第２の断
片（0.9Md）はpGL112の最大Mbo I断片に相当した。Cla
IでpGK1を消化した結果、次の二つの断片が得られた。
未変化のまゝのpWV01の小さいCla I断片（第１図参照）
と2.1Mdの断片で、これらはpWV01の大きな1.2MdのCla I
断片へpGL112のCmR遺伝子を含有する断片の挿入により
生じたものである。この小さなCla I断片は、Cla IでpG
K1から試験管中で切り取つたものである。この最大断片
の分離及び再リゲーシヨンの後、枯草菌のプロトプラス
トの形質転換体をリゲーシヨン混合液で処理すると、Cm
R再生体が得られる。これらの細胞は、pGK1からの一部
分の取り切りにより生じた誘導体であり、pGK11（2.1M
d）と命名され、特異的なCla I切断部位を有していた。
pGK1と同様、ホリノウチ及びワイズブラムの配列の第97
3番目の塩基（文献３参照）である特異的Hpa II部位を
有して居り、かつ両者とも特異的なPGL112 Mbo I切断部
位を有する組換プラスミドであるというもう一つ別の証
拠も提供した。Cla IとHpa IIでの二重消化によりpGK1
におけるこの断片の方向性も推論された。pGK1のこの小
さなCla I断片をプラスミド複製能を保持したまゝ切り
取りうるということは、pGK11に残つているCla I切断部
位がクローニングに使用しうるというとを示唆してい
る。 挿入−不活性化ベクターの構築 Cla I切断部位が挿入に使用可能であり、かつこれら
のpWV01から誘導された組換プラスミドがクローニング
のために再に使用可能であるか否か明らかにするため
に、pGK11から挿入−不活性化ベクターを構築した（第
１図）。このために、pE194 cop−６をCla I及びHpa II
で消化し、最大のCla I/Hpa II断片を分離した。この断
片は、ホリノウチとワイズバルムの配列（文献４参照）
上の第1939番目から3137番目の塩基に対応し、エリスロ
マイシン抵抗性（EmR）遺伝子を含みpE194 cop−６の複
製ori領域を欠いている。pGK11の特異的なCla I部位
に、これリゲートした。枯草菌のプロトプラストをリー
ゲシヨン混合物で形質転換すると、CmREmR形質転換体が
得られた。そのうちの１つを選んだら、2.9Mdのプラス
ミドを含有していた。pK12と命名したこのプラスミドと
親プラスミドpGK11の制限酵素による解析結果は、第１
図とよく一致した。Cla Iで直線状としたpGK11へのリゲ
ーシヨンによるCla I−Hpa II挿入の結果、プラスミドp
GK12は依然として特異的なCla I切断部位及びHpa II切
断部位を含有していた。pGK12をBcl Iで直鎖化し、挿入
の同一小生を確認した。このBcl I切断部位は、EmR遺伝
子の暗号化配列に位置して居り、この部位へのDNA断片
の挿入は、組換プラスミドのEmRを不活性化する（文献
７参照）。更に、ストレプトコツカス クレモリスWg2
から分離したpWV01をプローブに使用し、これらの組換
体のサウザンハイブリダイゼーシヨン（文献23参照）に
よりpWV01配列の存在を確認した。 大腸菌及び枯草菌内におけるpGK12の複製及び外来遺伝
子の発現 遺伝子学的にプラスミドpWV01をマークするために使
用したCmR及びEmR遺伝子が共に大腸菌（文献24及び25参
照）内で発現するという事実は、上記菌体中で組換プラ
スミドかまた複製するのか否かを研究することを可能に
した。そのため、大腸菌BHB2600株のコンピテント細胞
を、プラスミドpGK12に曝露した。発現のために時間を
与えた後、希釈し、ml当り２μｇのクロラムフエニコー
ルと50μｇのエリスロマイシンを含有するTY寒天平板培
地で平板培養した。一晩培養したところ、小さなコロニ
ーが現われた。これらのコロニーは大きさと制限酵素の
作用パターンの点に関して、枯草菌から分離したpGK12
と差がないプラスミドDNAを含有していた。形質転換さ
れた大腸菌BHB2600株の選抜には、ml当２μｇのクロラ
ムフエニコールと50μｇのエリスロマイシンの組み合せ
が適切であつた。エリスロマイシン又はクロラムフエニ
コールのみでは、使用大腸菌の菌株にもよるが、1ml当
り、エリスロマイシンの場合で100μｇ以上、クロラム
フエニコールの場合で10μｇ程度まで、淘汰には必要で
ある。大腸菌から分離したpGK12は通常の頻度でコンピ
テント枯草菌をCmR及びCmRに形質転換した。枯草菌のCm
R及びCmRへの形質転換には、発現時にml当りエリスロマ
イシン50ngで細胞を誘導する必要があつた。この誘導な
しには、形質転換体は、クロラムフエニコールのみを含
有する平板上では極く僅か数えられる程度であつた。 両給源からのpG12のコンピテント枯草菌及び大腸菌細
胞の形質転換効率を表Ｂに示す。表から明らかな如くい
ずれの宿主においても、形質転換能はプラスミドDNAの
給源とは独立したものである。 pGK12の複製及びストレプトコツカス ラクチス菌体内
での外来遺伝子の発現について pWV101由来のベクターに保持されているマーカーが乳
酸菌ストレプトコツカス属に属する菌種内で発現可能で
あるか否かを調べるために、枯草菌から分離したpGK12
プラスミドを用いて、プラスミドを有さない菌株である
ストレプトコツカス ラクチスMG1363株（文献８参照）
のプロトプラストの形質転換を行なつた。同株のプロト
プラストをコンドウ及びマツカイ（Mckay）の方法（前
出；文献19参照）により調製し、１μｇのpGK12で処理
した。発現のための時間を与えるため、30℃で２時間イ
ンキユベートしたのち、希釈しml当り５μｇのクロラム
フエニコールか１μｇのエリスロマイシンを含む砂糖−
M17平板培地上で平板培養した。30℃で,7ないし10日間
インキユベートした後、両平板培地上にコロニーが出現
した。CmRコロニーはEmRでもあり、また逆にEmRはCmRで
もあつた。典型的な実験例において、再生は10％、pGK1
21μｇ当りの形質転換体は約0.5×104であつた。形質転
換されたコロニーはpGK12と同一の分子量、同一の制限
酵素に対する作用形式を有するプラスミドを含有してい
た。 コピー数及びプラスミドの安定性 pGK12の三宿主内におけるコピー数を測定した（表Ｃ
参照）。 ストレプトコツカス ラクチス及び枯草菌の両者にお
いてはコピー数は低い数値に維持されていた；枯草菌で
は、約５でこれは枯草菌内におけるpWV01について知ら
れている値と良く一致していた（文献５参照）。大腸菌
内におけるpGK12のコピー数は枯草菌のそれと比較し約1
0培大きかつた。 表Ｄは淘汰圧がなくともpGK12はストレプトコツカス
ラクチス及び枯草菌中で安定的に保持されていたこと
を示す。これは大腸菌とは対照的で、大腸菌では48％の
頻度でpGK12が失われていた。pGK12は上記三種類の微生
物において、すくなくとも1ml当り2mgのエリスロマイシ
ンに対して抵抗性を付与した。クロラムフエニコールに
対する耐性の水準はそれぞれストレプトコツカス ラク
チス、大腸菌及び枯草菌において、５、10及び50μg/ml
であつた。 実施例2:枯草菌のプロモータの統制下でのエス・ラクチ
ス内での遺伝子の発現 〔pGK3、pGKV1及びpGKV2プラスミドの構築についての記
述〕 pGK3の構築（第２図参照） この実施例中で使用する種々の方法についてはすべて
詳細に実施例１及び同３で述べている。エス・クレモリ
スWg2プラスミドpW01を制限酵素Cla Iで処理し、pWV01
のori領域を含有する最大のCla I断片を分離した。プラ
スミドpE194−cop−６を制限酵素Cla I及びHpa IIを処
理し、EmR遺伝子を含有する最大Cla I/Hpa II断片を分
離した。次いで、この２個の断片を互にリゲートした。
Cla I及びHpa IIの接着末端は互によく適合しているの
で、二種類のプラスミドをこうして得た。pWV01のCla I
による最大断片のMbo I部位に近い位置に修復されたCla
I部位を有するプラスミドをpGK3と命名した。 pGKV1及びpGKV2の構築（第２図参照） プラスミドpGK3を制限酵素Cla Iで処理し、接着末端
を大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレナウ断片を使用し満
した。 CAT遺伝子を保有する枯草菌プラスミドpPL608（文献
８参照）は制限酵素Pvu IIで完全に消化し、次いでEcoR
I制限エンドヌクレアーゼで部分消化した。 SP02プロモータ及びCAT遺伝子を含有する最大Pvu II/
EcoR I断片はアガロースゲルから電気溶出により分離し
た。 Pvu II/EcoR I断片のEcoR I接着末端は大腸菌DNAポメ
ラーゼＩのレナウ断片を使用し満した。 このPvu II/EcoR I断片及びCla I及びレナウ処理した
pGK3は互いに平滑末端リゲートした。ClaＩ及びEcoR I
部位を満した平滑末端のリゲーシヨンにより新しいEcoR
I部位が生じた。 次いで、枯草菌PSL1株のプロトプラストをチヤン等の
方法（実施例１及び文献17参照）によりリーゲシヨン混
合物に曝露し、EmR及びCmR形質転換体を選抜した。 二種類の形質転換体が得られたが、そのうちの一つ
は、pGKV1を保持し、他の一つはpGKV2を保持していた。
（尚、この両プラスミドの制限酵素地図は第２図に示し
た。）pGKV1及びpGKV2の間の差異はSP02プロモータに対
するCAT遺伝子の方向性に関するものである。 これらのベクターをエス・ラクチスのプロトプラスト
の形質転換に使用した。 形質転換されたエス・ラクチスがEmRに加えてCmRであ
ることは、枯草菌のSP02プロモータがエス・ラクチス内
で機能したことで証明された。それ故、これは発現のた
めに他の外来遺伝子の組み込みに使用することができ
る。 実施例３ pWV01の誘導体を使用して枯草菌及びエス・ラクチス
菌内でのエス・クレモリスのプロテアーゼを暗号化した
遺伝子のクローニング及び発現〔pGK500の構築について
の記載〕 微生物菌株、プラスミド及び培地 使用した菌株及びプラスミドを表Ｅに示す。 枯草菌及び大腸菌はTYブロス中で成育させた。平均培
養には1.5％の寒天で固化したTYブロスを用いた。クロ
ラムフエニコール及びエリスロマイシンは、枯草菌に対
してそれぞれ５μg/ml、クロラムフエニコール、アジピ
シリン及びテトラサイクリンは、大腸菌に対してそれぞ
れ40、30及び12.5μg/mlの割合で用いた。エス・ラクチ
スの培養にはグルコース−M17−ブロスと寒天（文献14
参照）を用いた。エス・ラクチスの場合は、クロラムフ
エニコール及びエリスロマイシンをそれぞれ４μg/ml及
び１μg/mlの割合で使用した。エス・クレモリスWg2及
びエス・クレモリスHPは絶えず成分調整スキン・ミルク
を10％（w/v）含む滅菌培地中に保持した。グリセロホ
スフエート−ミルク−寒天培地（文献32参照）を0.001
％のブロモクレゾールパープルを加えて幾分修正したも
の及びクエン酸塩−ミルク−寒天培地（文献32a参照）
を、エス・ラクチス菌株のミルク蛋白の利用可能性につ
いての検査に用いた。 プラスミドDNAの分離 イシ−ホロヴイツ（Ish−Horowitz）らの方法（実施
例１及び文献16参照）により大腸菌からプラスミドを分
離した。枯草菌由来のプラスミドは実施例１の方法によ
り分離した。この方法はエス・ラクチスからのプラスミ
ドの極少量調製には有用であることが判明した。レブラ
ンク（LeBlanc）らの方法（文献33参照）をエス・クレ
モリスWg2及びエス・クレモリスHPからのプラスミドの
分離に使用した。 レブランクの方法の概要は次の通りである。 （１）培養した細胞を遠心分離により収集し、10ミリモ
ルのリン酸ソーダ緩衝液（pH7.0）で洗う （２）50ミリモルのトリス塩酸塩（pH8.0）に懸濁させ
る。 （３）40mg/mlのリゾチームを含むトリス塩酸塩を加
え、インキユベートする。 （４）0.25MのEDTAを加え、短時間氷上に保持する。 （５）20％のSDS（ドデシル硫酸ソーダ）を含むTE緩衝
液（50ミリモルのトリス塩酸塩−10ミリモルのEDTA、pH
＝8.0）を加えて溶菌させる。 （６）55℃でインキユベートし更に細胞溶解をおこさせ
る。 （７）3N NaOHを加えて、DNAを変性させる。 （８）水を加え一定量とし、２モルトリス塩酸（pH＝7.
0）を加えて中和して、混合する。 （９）更に適当量の２モルトリス塩酸を加えて混合す
る。 （10） 高分子の染色体DNAを20％のSDS TE液、及び直
後5MのNaClを加えてSDS−NaCl沈澱法により除去する。 （11）一晩サンプルを４℃に保持し、17000Gで遠心分離
により上澄液をうる。 （12）上澄液に二倍量の水を加え、煮沸、RNase（2mg/m
l水）を加えて、インキユベートし単鎖DNAをNaCl飽和フ
エノールで抽出除去する。 （13水相を当量のクロロホルム−イソアミルアルコール
（24:1）で抽出し、水相中のDNAをエタノールで分解し
たRNAを除去することにより分離し、３モルの酢酸ソー
ダと95％エタノールを必要量加えて−20℃で一晩保持す
る。 （14遠心分離しTES（10ミリモルのトリス塩酸塩、10ミ
リモルのEDTA、50ミリモルのNaCl、pH＝8.0）に懸濁す
る。アガロースゲル電気泳動により検査する。 pMV05の分離 エス・クレモリスWg2からの全プラスミドはトリス−
酢酸塩緩衝液（40ミリモルのトルス−酢酸塩、20mMの酢
酸ソーダ２ミリモルのEDTA;pH＝7.8）を用いて、0.5％
アガロースゲル中で分離した。pWV05をゲルより切り取
り、下記の点で修飾したブリン（Blin）らの方法（文献
34参照）によるKIの濃度勾配遠心分離法を用いてプロセ
ス化した。ゲル切り取り分を凍結（−20℃）し、溶解
し、6.5gの切り取り分に対して約12gの固体の沃化カリ
を加えた。全部のアガローズを溶解させるために、血液
細胞懸濁液ミキサー中で混合後、0.1mlのエチジウムブ
ロマイド（5mg/ml）を加え、得られた溶液を光屈折率を
1.444に調整した。勾配溶出物を20℃でベツクマン型式7
5Ti固定角度ローター中で53,000rpmで20時間遠心分離し
た。すべてのアガロースをDNA帯より除去するため二度
の運転が必要とされた。 制限酵素による解析及び分子クローニング 制限酵素及びT4DNAリガーゼはベーリンガー（西独マ
ンハイム市）より購入し、供給業者の指示に従い使用し
た。消化したDNA調製品はTBE緩衝液（89ミリモルのトリ
ス、89ミリモルのホウ酸、２ミリモルのEDTA、0.5μg/m
lのエチジウムブロマイド;pH＝8.0）中での水平アガロ
ースゲル中で電気泳動した。pWV05の制限酵素による断
片を、pBR329又はpACYC184中でKIにより精製したpWV05
を使用してシヨツトガン・クローニングを行なつた。ま
たは、特定の断片を全エス・クレモリスWg2のプラスミ
ドDNAの消化物からアガロースゲル電気泳動法により精
製し、次いで電気溶出した。大腸菌のコンピテント細胞
はマンデルらの方法（実施例１及び文献18参照）により
形質転換した。枯草菌のプロトプラストはチヤンらの方
法により形質転換した（実施例１及び文献17参照）。エ
ス・ラクチスのプロトプラストはオカモトらの方法（文
献35参照）を修飾した方法により調製した。すなわち、
グルコース−M17培地での一晩培養物をグルコース−M17
で100倍に希釈し、30℃で２時間インキユベートした。
細胞をTMS（30ミリモルのトリス塩酸塩、３ミリモルのM
gCl2、25％庶糖;pH＝8.0）で洗浄し、ml当り30μｇのリ
ゾチームを添加したTMSの当初液量の半量に再懸濁し
た。37℃で１時間インキユベートしたのち、プロトプラ
ストをSMM（25％庶糖、20ミリモルのMgCl2、20ミリモル
のマレイン酸塩;pH＝6.5）中で洗浄し、当初液量の1/30
のSMMに再懸濁した。プロトプラストの形質転換は、22.
5％ポリエチレングルコール中で室温で20分間プロトプ
ラストとDNAをインキユベートした以外は実施例１と同
様にして行なつた。 プラスミドpWV05のサブクローン化 エス・クレモリスWg2の全プラスミドのゲル電気泳動
及び引き続いての切り取つたpWV05帯のKI濃度勾配遠心
分離法により培養液当り約pWV05 1.5μｇを得た。数
種類の制限エントヌクレアーゼによる、精製pWV05の同
時又は継時的消化により誘導された制限酵素地図は第３
図に示した。pWV05の一部分をクローン化するために大
腸菌プラスミドpBR329（2.69Md）及びpACYC184（2.65M
d）を用いた。BamH I断片Ｂ（5.0Md）は、pACYC184中に
クローン化した（その結果プラスミドpGD4を生成：第３
図参照）。EcoR Iの断片Ａ（9.0Md）及び同Ｃ（2.0Md）
も同様であつた。シヨツトガン方式クローン化やベクタ
ーDNAへの特定断片のリゲーシヨンにより得られたいず
れの組換ベクター中にも、Hind III断片Ｃ（4.3Md）及
びEcoR I断片Ｂは、発見されなかつた。pWV05の残存部
をクローン化するため、全エス・クレモリスWg2プラス
ミドDNAのBamH I/Hind III二重消化物をpBR329のBamH I
/Hind III切断物とリゲートした。一つの組換体をとり
上げたところ、HindIII断片Ｃの左側を構成する1.4Mdの
BamH I/Hind IIIを含有していた。このスクランブルプ
ラスミド（第３表中のpGD6）中には、BamH I/Hind III
断片Ｂの右側及び0.5Mdの起原不明のHind III断片も含
まれていた。Hind III断片Ｃの連続性の切断及びEcoR I
断片Ｂとが大腸菌内でのサブブラグメントのクローン化
をなしうるということを示す上記結果は、DNA配列の特
別の性質がプラスミドの安定性を阻害するか、またはこ
のDNAの発現が大腸菌の活性により阻止されるというこ
とを示唆している。 交差免疫電気泳動法 枯草菌及びエス・ラクチスをml当り５μｇのエリスロ
マイシンを含むTYブロスあるいは、ml当り１μｇのエリ
スロマイシンを含むグルコーズ−M17−ブロス各500ml中
で一晩培養した。細胞を遠心分離により収集し、冷50ミ
ルモル リン酸カリウム塩溶液（pH＝6.8）で洗浄し、
１ミリモルのEDTAを含む同一の緩衝液2mlに再懸濁し
た。細胞は超音波により分解した。トリトンX100を最終
濃度４％になるまで添加し、30分間室温でインキユベー
トした後、４℃でベツクマンSW41ローター中で15000rpm
で15分間遠心分離することにより細胞破片を除去した。
無細胞抽出物をアトン沈澱法により濃縮した。蛋白濃度
はブラツドフオードの方法（文献36参照）により測定し
た。エス・クレモリスWg2の蛋白分解系の精製蛋白質に
対して高められた抗体の存在下で無細胞抽出物の交差免
疫電気泳動を前に記載した通りに行なつた（文献37参
照）。ゲルを第一次元では2.5V/cmで３時間、第２次元
では1.5V/cmで16−18時間泳動させた。 pGKV500の構築 pGKV2（第２図）はCATを暗号化した配列中に特異的な
Hind III部位を有している。この部位は、4.3Mdの、エ
ス・クレモリス プラスミドpWV05のHind IIIの消化物
から電気泳動により精製したHind III断片Ｃを挿入する
に用いられた。この構築により、pGKV500（7.4Md）が得
られた。制限酵素地図は、同一のEcoR I部位を地図の零
地点として直線状にして示してある。 エス・ラクチスへのプラスミドpGKV500の形質転換 pWV01由来のベクターは、枯草菌ばかりでなく大腸
菌、エス・ラクチスも形質転換する。それ故、枯草菌よ
り分離したpGKV500を、プラスミドを含まず、33Mdのラ
クトーズ及びプロテナーゼプラスミドを損失しているた
めに乳糖も醗酵できず、プロテナーゼも生産できないエ
ス・ラクチスMG1363のプロトプラストの形質転換に使用
した。５種類の無作為に抽出した形質転換体について迅
速プラスミドDNA抽出を実施したところ、これらはすべ
て枯草菌からのpGKV500の同一の分子量を有するプラス
ミドを含んでいることが明らかとなつた。 Hind III断片Ｃにより特異化された蛋白の特性化 pGKV500を保有するエス・ラクチス株のうちの一種と
枯草菌（pGKV500）から無細胞抽出物を精製し、交差免
疫電気泳動法（CIE）により解析した。第一次元により
分離した抽出物を、第二次元ではエス・クレモリスWg2
（Prt+）の精製蛋白系の蛋白に対して高められた抗体と
反応させた。CIEのパターンは次の如きものよりなる。 第５図:A枯草菌PSL1（pGKV500）の無細胞抽出物 B:エス・クレモリスWg2の精製した蛋白分解系 C:同一の穴に枯草菌PSL1（pGKV500）の無細胞抽
出物とエス・クレモリスWg2の精製蛋白分解系を適用し
たときの縦列免疫電気泳動 D:右側及び左側に別々に適用したほかはＣと同一 第６図A:エス・ラクチスMG1363（pGKV2）株の無細胞抽
出物 B:エス・ラクチスMG1363（pGKV500）株の無細胞
抽出物 ＡからＤ（第５図）においては、枯草菌抽出物（42μ
ｇ蛋白/ml）１μとエス・クレモリスの単離物（210μ
ｇ蛋白/ml）３μを使用した。第二次元ゲルは、エス
・クレモリスWg2の蛋白分解系に対する抗体（28mg/ml）
を30μ含有していた。 第６図のＡとＢにおいては、15μのエス・ラクチス
MG1363（pGKV2）抽出物（45mg蛋白/ml）及び15μのエ
ス・ラクチスMG1363（pGKV500）抽出物（53mg蛋白/ml）
を使用した。第二次元ゲルは、エス・クレモリスWg2の
蛋白分解系に対する抗体を28mg/ml含む溶液30μを含
有していた。 第５図Ｂの交差免疫電気泳動パターンは、エス・クレ
モリスWg2蛋白分解系の二つの主要な沈降線があり、そ
れぞれ、Ａ及びＢと命名された。蛋白Ａはカゼイン分解
性を有していることが判明した。ＡおよびＢの左側の弱
い線は、蛋白分解系には関係のない不純物のものであ
る。第５図Ａ及び第６図Ｂの交差免疫電気泳動パターン
は、枯草菌PSL1（pGKV50）及びエス・ラクチスMG1363
（pGKV500）も、抗体と一緒に沈澱する二つの蛋白質を
生産することを示す。この二つの蛋白質はエス・ラクチ
スMG1363（pGKV2）（第６図Ａの交差免疫電気泳動パタ
ーン参照）及び枯草菌PSL1（pGKV2）には存在していな
かつた。エス・ラクチスMG1363抽出物中のゲルからの流
出した沈降線（第６図の交差免疫電気泳動パターンＡ及
びＢ参照）は、エス・ラクチスMG1363（pGKV2）及びエ
ス・ラクチスMG1363（pGKV500）の両者に存在してい
た。それ故、共に挿入により生じたものとは考えられな
い。挿入した特定の蛋白質とエス・クレモリスWg2由来
の蛋白Ａ及びＢとの関係は縦形免疫電気泳動による実験
により調査した。 枯草菌PSL1（pGKV500）抽出物及びエス・クレモリスW
g2分離物を、同一サンプル穴に負荷したところ二つのピ
ークが明らかになつた（CIEパターンＣ）。このこと
は、枯草菌PSL1（pGKV500）の上と下のピークの蛋白
は、それぞれエス・クレモリスWg2蛋白分解系の成分Ａ
及びＢであることを示唆している。二つの櫛形ピークの
下の表面は個々のピークの合計にほゞ相当するという観
察は、この見解を強化するものである。同一のゲルの隣
接するサンプル穴にサンプルを適用したときの縦形免疫
電気泳動の結果を第５図Ｄは示す。 エス・クレモリスWg2のピークＢと枯草菌PSL1（pGKV5
00）の上部ピークの完全溶解物は、一つのより高くより
広いピークを与えた。エス・クレモリスWg2からの蛋白
Ａは枯草菌PSL1（pGKV500）及びエス・ラクチスMG1363
（pGKV500）の両調製物の下位の沈降線中の蛋白と共通
の特徴を有して居り、上記の二つの場合ともに一部はピ
ークがかなり合つて居り、抽出物のピークがやゝ高くも
ち上げられていた。 実施例4:枯草菌プロモータ統制下でのエス・ラクチス菌
内でのプロキモシンを暗号化している遺伝子のクローニ
ング及び発現〔pGKV20、pGKV210、pGKV21、pGKV41及びp
GKU1の構築：第７図及び第８図参照〕 用途の広いクローニングベクターを造るために、M13m
p11の多重クローン部位（以下MCSと称す；文献38参照）
を、プラスミドpGKV2のSP02プロモータとCAT遺伝子の間
に挿入（第７図参照）した。そのために、このプラスミ
ドを制限酵素EcoR Iで処理し、DNA分子内リゲーシヨン
に適合しているところの希釈条件下でリゲートした。リ
ゲーシヨン混合物で大腸菌BHB2600を形質転換後、形質
転換体にはpGKV2のEcoR Iの最大断片を含んでおり、pGK
V20と称されるプラスミドが得られた。プラスミドpGKV2
0とフアージM13mp11の複製可能な形態（RFと称す）を制
限酵素EcoR IとPst Iで消化した。pGKV20のEcoR I/Pst
Iの最大断片及びMCSの38bp EcoR I/Pst I断片を分離
し、リゲートしてpGKV210を創製した。 結果として、SP02プロモータは、再びCAT遺伝子の前
に位置することとなつた。pPL608のEcoR Iの最小断片の
このプラスミドのEcoR I消化物より分離し、EcoR Iで処
理したpGKV210とリゲートし、pGKV21を創製した。SP02
プロモータ含有断片は、二つの方向性に位置しうるの
で、形質転換体についてCmRによりコロニーを淘汰し
た。得られた形質転換体には、プロモータの指示により
CATの転写させるプラスミドが含まれていなければなら
ないことである。更に構築を実行化するために、pGKV21
の中のMCSのBamH I部位をCla I部位に変換させた。pGKV
21を制限酵素BamH Iで処理し、接着末端を大腸菌DNAポ
リメラーゼＩのレナウ断片で満し、得られた平滑末端を
内部リゲーシヨンを実施させるために希釈条件下でリゲ
ートさせた。得られたプラスミドはpGKV41と称するもの
であるが、これはBamH I部位を満した平滑末端リゲーシ
ヨンにより形成されたCla I部位を含有する。このプラ
スミドの中では、CAT遺伝子の一部がプロキモシンを暗
号化している遺伝子で置換されていた。この遺伝子は、
プラスミドpMS48上に位置して居り（枯草菌内のプレプ
ロキモンの発現及び排出の項参照）、枯草菌リボゾーム
結合部位（RBSと称す）とビー・アミロリクエフアシエ
インス（Ｂ・amyloliquefaciens）のアルフアーアミラ
ーゼ遺伝子の信号配列によりこのプラスミドに先導され
たものである。SP02プロモータの支配下で枯草菌内での
発現のために、それは導入されたものである。RBS、ア
ルフアーアミラーゼ信号配列及びプロキモシン暗号化配
列を含む全遺伝子を次の手順によりpGK41に挿入した。 PMS48を制限酵素BstE IIで処理し、接着末端を大腸菌
DNAポリメラーゼＩのレナウ断片で満した。次いで、当
該プラスミドを制限酵素Hind IIIで処理をし、約1Md
の、特にプロキモシン遺伝子を含む断片を分離した。pG
K41は制限酵素Cla Iで処理し、接着末端は大腸菌DNAポ
リメラーゼＩのレナウ断片で同様に満した。直鎖状にし
たプラスミドを制限酵素Hind IIIで処理し、最大の、と
りわけ、pWV01のori領域とEmRを暗号化した遺伝子を含
む断片を分離した。上記の両者の断片のリゲーシヨンの
結果、pGKU1と呼ばれる一つのプラスミドを得た。な
お、このプラスミドにはSP02プロモータの統制下でプロ
キモシンを暗号化している遺伝子を導入している。満さ
れたCla I及びBstE II部位の平滑末端のリゲーシヨンに
よりBstE II部位は再生された。このプラスミドでエス
・ラクチスMG1363を形質転換した。ウエスタンブロツト
（Western blots:文献39参照）は、プレプロキモシンが
枯草菌SP02プロモータの統制下でエス・ラクチス内で発
現することを示唆した。 上述と同様の方法によりpMS50のBstE II−Hind III断
片をpMS48のBstE II−Hind III断片の代りに使用して同
様の構築が可能である（後述の枯草菌のプレキモシンの
発現及び排出の項参照）。 実施例5:pGKV500で形質転換したエス・ラクチスMG1363
の成育及び産酸能 手順 グルコース−M17−ブロスで１晩培養した培養物を滅
菌蒸留水で洗浄し、0.5％のグルコースを含むスキンミ
ルク（10％重量／容量）で100倍に希釈した。30℃でイ
ンキユベートし、１時間間隔で試料を採取した。グルコ
ース−M17−寒天平板培地を用いて形成されたコロニー
数を数えた。酸度は0.1規定のNaOH液で滴定した。 エス・ラクチス（pGKV500）のミルク中の遺伝表現型 ストレプトコツカス属の乳酸菌は栄養要求的には特殊
栄養を必要とし多くのアミノ酸を外部から供給する必要
がある。ミルク中の小さなペプチド及びアミノ酸の濃度
が成育とそれに付随する産酸力を規制する。最適な成育
には、ミルク蛋白を加水分解する自己のプロテナーゼに
ストレプトコツカス属の乳酸菌は依存する。ミルク中の
成長及び産酸力の差異にもとづき、プロテナーゼ活性を
有する変種とそれを有しないものの分離のための培地を
開発した。pGKV500のHind III断片が、Prt-の宿主エス
・ラクチスMG1363内で成長及び産酸力を再生しうるかど
うか調べるために、エス・ラクチスMG1363（pGKV500）
のミルクを基材とした寒天平板培地上の成育及びミルク
中での産酸力を調査した。透明なクエン酸ミルク寒天培
地中に懸濁させたとき、エス・ラクチスMG1363（pGKV50
0）は、迅速な成長と酸性化により引き越されたカゼイ
ンの白色沈澱によりかこまれた典型的な、大きいPrt+コ
ロニーを形成した（第９図参照）。エス・ラクチスMG13
63（pKGV2）は、30℃で長時間インキユベートしたあと
でさえ、Prt-の遺伝表現型の特色である非常に小さなコ
ロニーを形成するにすぎない。 GMAB培地上では、エス・ラクチスMG1363（pGKV500）
は黄色のかさ（halo）をともなう明るい黄色のコロニー
を形成するに対し、エス・ラクチスMG1363（pGKV2）は
白色又は淡い黄色のかさ又はかさなしで小さなコロニー
を形成するにすぎない。 エス・ラクチスMG1363（pGKV500）、エス・ラクチスM
G1363（pGKV2）及びエス・クレモリスWg2のミルク中の
成長及び産酸力について比較した。この試験で一貫して
使用したプラスミドを含まないエス・ラクチスMG1363株
の母株で、33Mdのラクトーズ／プロテナーゼプラスミド
pLP712（文献８参照）を有するエス・ラクチス712をこ
の比較には使用した（第10図参照）。 この例から代謝機能に関する遺伝子を含むプラスミド
で形質転換した宿主細胞は、良好な成育を示すか又はプ
ラスミドを有しない細胞よりもより活発であることを立
証した。 乳糖は、乳酸菌の通常の炭素源であり、それ故プラス
ミドのマーカーとして乳糖の代謝に関する遺伝子の一つ
ないし数種の遺伝子を用いることは、それ故、魅力的で
ある。 乳酸代謝に関与する遺伝子を含有するpLP712のBcl I
の大きな断片を、pGKV41又はPGKV500のEmR遺伝子のBcl
I部位に結合することによりlac-宿主細胞にミルク又は
同様な基質中で他の淘汰圧をかけることなく良好な成長
を示す性質を与えるプラスミドを生成することが期待出
来よう。 実施例6:他のプロテアーゼ遺伝子を検出、分離するため
のプローブとしてpGD4からの5.0Md BamH I断片及びpGD6
からの1.4Md BamH I/Hind III断片の利用。 プロテナーゼ（プロテアーゼ）の最適pH及び温度をも
とに、エス・クレモリスの菌株は５種類のグループに分
類される。この分類によればエス・クレモリスHP株及び
同Wg2株は同一のグループに属する（文献40参照）。 更に、エス・クレモリスHP株は9Mdのプロテナーゼプ
ラスミドを保有していると報告されている（文献41参
照）。pGD4由来の5.0Md BamH I断片とpGD6由来の1.4Md
のBamH I/Hind III断片が、他の給源からの同属の又は
一部同属であるプロテナーゼ遺伝子の検出及び分離のた
めのプローブとして利用しうるか否かを知るために、以
下の実験を行なつた。pGD4からの5.0MdのBamH I断片及
びpGD6からのBamH I/Hind III断片を、両プラスミドの
制限酵素消化物より分離した。これらを〔アルフアー32
P〕dCTPを用いてニツク・トランスレーシヨン］し、
（文献42参照）サザンハイブリダイゼーシヨン（文献2
3）でプローブとして使用した。操作手順の確認のため
プローブをプロテナーゼの豊富な、あるいはプロテナー
ゼ欠損したエス・クレモリスWg2株の全プラスミドに使
用した。BamH I及びBamH I/Hind IIIの両断片ともエス
・クレモリスWg2（Prt+）のpWV05とのみハイブリダイズ
化し、エス・クレモリスWg2（Prt-）とは反応しなかつ
た。このことは、エス・クレモリスWg2（Prt+）の他の
プラスミド中には同属又は一部同属のプロテナーゼ遺伝
子がなくBamH I及びBamH I/Hind III断片は真にpWV05起
源のものであることを示唆している。 更に、エス・クレモリスHP（Prt-）のプラスミドとは
両断片ともハイブリダイズ化しなかつた。しかし、両者
ともエス・クレモリスHP中に存在する9Mdプラスミドと
ハイブリダイズ化した。このことは、このプラスミドも
勿論pWV05のプロテナーゼ遺伝子に同属の遺伝子を含ん
でいることを立証している。次の段階では、この9Mdの
プラスミドを制限酵素に消化させエス・クレモリスHPの
プロテナーゼ遺伝子が位置している断片を決定すること
である。それ故、pWV05のプロテナーゼの完全遺伝子又
はその断片を使用して、他の乳酸菌の別の同質又は一部
同質のプロテナーゼ遺伝子をプローブ及び分離すること
もできよう。 枯草菌内でのプレプロキシモンの発現及び排出 バチルス系の細菌はある種の蛋白質を体外に特に分泌
することができるので、クローン化した遺伝子の発現の
ための宿主細胞として使用するには魅力的な微生物群で
ある。バチルス系細菌を組換DNA発現用宿主として使用
するための可能性を確立するともに先にのべた菌外排出
プロセスを見極めるべく、（メチオニル）プロキモシン
それ自体として及びバクテリオフアージSP02プロモータ
及びα−アミラーゼ又は統合リボゾーム結合部位の統制
下でのビー・アミロリクエフアシエンスα−アミラーゼ
信号配列（プレプロキモシン）とのプロキモシンの正確
な融合としてのプロキモシンの発現及び排出を研究し
た。 プレプロキモシン蛋白は細胞内で一部プロセス化され
てプロキモシンと一緒に移動する形態となる。 プレプロキモシンは枯草菌により菌外に排出されるが
非常に不充分である。培養液中でのプロセス化した形態
の実証はできないが、プロセス化が全く起らないか、又
はプロセス化された形態が迅速に分解されるためであろ
う。プレプロキモシンを暗号化しているDNAを含有する
プラスミドpMS48は250世代の間の淘汰圧でも恒成分培養
そう中では安定であることが明らかとなつた。 はじめに バチルス属細菌は、クローン化された遺伝子の発現に
とつては魅力的な宿主である。このグラム陽性の微生物
は、非病原性でエンドトキシンを有さず、大規模で工業
的に酵素を製造するのに重要である。これらの酵素は菌
体外に高収率で製造される。組換DNA技術での宿主系と
しての微生物を開発するにあたつて肝に銘じておかなけ
ればならない点は、外来遺伝子製品の効率的発現と排出
である。 排出は収率を増加させ、かつ醗酵ブロスから蛋白質の
回収を簡便にするだけでなく、排出された蛋白の保持及
びそれに引き続いての機能に陽性の影響を与えるようで
ある。 このようにして今までに数種類の外来性蛋白がバチル
ス属の細菌内で作られて居り、それらの内にはマウスの
ジハイドホレート還元酵素（ウイルアムス等、文献58参
照）シユードモナス カテコール2,3−ジオキシゲナー
ゼ（ツコウスキー等、文献59参照）プロインシユリン
（モスバツク等、文献52参照）、ウイルスの抗原（ハー
デイ等、文献48参照）、大腸菌のβ−ラクタマーゼ（パ
ルバウ等、文献55及びオオムラ等、文献53参照）及びα
−インターフエロン（パルバア等、文献56参照）が含ま
れる。 外来性蛋白の排出はビー・アミロリクエフアシエンス
（パルバア等、文献55及び56参照）又は枯草菌（オオム
ラ等、前出）からのα−アミラーゼ、又はビー・リキニ
ホルミス（B. licheniformis；モスバツク等、前出）の
ペニシリナーゼの信号配列を上記の蛋白を暗号化してい
る配列と融合させたときに観察できた。これらの融合体
は、しかし、蛋白を誘導化する、当該蛋白の信号配列以
外に常に１ないしそれ以上のアミノ残基を余分に含んで
いるので、厳密な意味では存在していなかつた。キモシ
ン（レンネン、イー・シー３・４・23・４）は、はんす
うを開始していない仔牛の第４胃（アボマスム）に存在
するアスパルチルプロテナーゼである。この酵素はミル
ク中のκ−カゼインの制限された蛋白分解に関与し、そ
の結果ミルク中の蛋白を凝固させる（ホルトマン、文献
46参照）、チーズ製造において幾種かの製品で全世界的
に応用されているのでキモシンは重要な因子である。キ
モシンは不足しているが、微生物由来のプロテアーゼで
それを満すことは、法的規制や性状や味覚の点で好まし
くない副作用があることから、できない。キモシンの利
点と微生物による生産による多様性を結合させるため
に、mRNA−由来の二重鎖のDNA形態中へキモシンを暗号
化している遺伝情報の大腸菌への分子クローン化を行な
つた（マート等、文献49参照）。 キモシンは一次翻訳製品、プレプロキモシンの特定蛋
白分解により形成される成熟製品である。プレキモシン
は16個のアミノ酸残基の長さを有し、非常に疎水性の信
号配列の排出に関連した除去によりプロキモシンへとま
ず転換される。次いで、低pH−依存性の制限された加水
分解によりキモシンへと転換される。 バチルス属の細菌での排出プロセス及び収率に及ぼす
排出の影響を究明し、組換DNA発現宿主としてのバチル
ス属細菌の使用可能性を確定するためにプロキモシンそ
れ自体及びビー・アミロリクエアシエンスα−amylose
信号配列を用いての正確な融合蛋白としての発現を実施
した（パルバア等、文献54参照）。この融合製品はプレ
プロキモシンと名づけられた。 後次過変異を含むプラスミツドpMS48の安定性を恒成
分培養そう中で研究した。 材料及び方法 細菌 使用した細菌宿主は次の通りである。 1A435（VBBBa01−113）:pro−１ 1A436（VBBa01−105;1G20）:trpC2、hsdR、hsdM（デー
ン等、文献43参照）。 プラスミド及び酵素 プラスミドpMS48及びpMS50はpPL608の誘導体である。
（ウイルアムズ等、文献58参照） 制限酵素、T4−DNA−リガーゼ及びDNA−ポリメラーゼ
は、アメルシヤム社（Amersham Ltd）、エヌ・イー バ
イオラボ社、ベセスダ リサーチ ラボ社（Bethesda R
esearch Labs）及びベーリンガー社より入手した。 放射性化学物質はアメルシヤム社より入手した。 分子生物化学的手法 枯草菌をチヤン及びコーエンのプロトプラスト/PEG手
順（文献17参照）により系質転換した。単離、特性化及
びDNAの核酸配列の解析は、本質的にはマニアテス（Man
iatis;文献50参照）等の方法により実施した。プレプロ
キモシン及びプロキモシンをそれぞれ暗号化したpMS48
及びpMS50の構造はいずれ詳細に発表する予定である
（マートら、現在投稿中） プレプロキモシンの枯草菌による発現は次のようにし
てモニターした。すなわち、細菌を20マイクログラム/m
lのトリプトフアン、20マイクログラム/mlのアミノ酸、
7.5マイクログラム/mlのカナマイシン及び必要に応じて
２％のグルタミン酸ソーダをも含む、エバンスらの炭素
制限培地（文献45参照）で成育させた。 サンプルは、対数増殖期の成長培地から採取した。ED
TA（エチレンジアミンテトラアセテート）及びPMSF（フ
ツ化パラ−メチルスルホン酸）を、蛋白分解を停止させ
るために、それぞれ10ミルモル/ml及び100μg/mlの濃度
で加えた。 細胞は遠心分離により回収した。 細胞溶解物はペレツト状の細菌を10ミリモル／の、
１ミリモル／のEDTA、２％のSDS（ドデシル硫酸ソー
ダ）を含むpH7.0のリン酸カリウム緩衝液に再懸濁さ
せ、次いでフレンチプレスで破壊し、調製した。溶解物
は残つている細胞残さを除去するため遠心分離した。 培養液を凍結乾燥し、当初容量の10分の１量の蒸留水
中にとり、当量の20％TCA（トリクロロ酢酸）を加えて
沈澱させた。ペレツト化した蛋白を蒸留水中に溶解さ
せ、再び蛋白を10倍量のアセトンを加えて沈澱させた。
ペレツト状の残存蛋白をアセトンで洗い、真空乾燥し、
次いでクラツキング用緩衝液（エデンス等、文献44参
照）にとつた。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を上記文献記載に従い実施した。 ウエスタン ブロツト（Western blots）はゲル分離
蛋白をニトロセルロース上に電気泳動的に移行させた。
プレプロキモシンはトウビン等の方法（文献57参照）に
よりうさぎの抗キモシンIgG及び125I−蛋白Ａで反応さ
せ検出した。 恒成分培地そう 恒成分培地そう実験は50mlの実働容量のガラス製の醗
酵そうで0.6h-1の希釈率、細胞濃度109cfu/mlで37℃で
エヴンス等の炭素制限培地（前出）に上述の物質を補足
添加したものを用いて行なつた。 結果及び考察 枯草菌による外来遺伝子の発現及び排出を研究するモ
デルとしてpPL608の生長性のバクテリオフアージSP02−
プロモーターを含む一般的なプラスミドベクターを複数
作成した。プラスミドMS48は、ビー・アミロリクエフア
シエンスα−アミラーゼ信号配列がプロキモシンとの正
確な融合体（すなわちプレプロキモシン）となつて続い
ている同アミラーゼのリボソーム結合部位をも含有して
いる。プラスミドMS50は、そのSP02−プロモーターに加
えて、メチオニル−プロキモシンをともなう“統合”リ
ボゾームを含有する。 プラスミドpMS48及びpMS50の概要は第11図に示した。
リボゾーム結合部位及びNH2−ターミナル暗号化配列の
一部については第12図Ａ及び同Ｂに示した。 α−アミラーゼリボゾーム結合部位及び信号配列は化
学的に合成され、それはパラバア等（1981）に公表され
た配列の127位から268位にわたる。“統合”リボゾーム
結合部位は、17個のヌクレオチドを越える16Sリボゾー
ムRNAの３′−末端に対して充分に補足的であるように
合成されている。信号配列とプロキモシンの結合におけ
るSac II制限エンドヌクレアーゼ切断部位の存在（第12
図Ａ）及び“統合”リボゾーム結合部位のEcoR I制限エ
ンドヌクレアーゼ切断部位の下流（第12図Ｂ）は他の暗
号化配列の正確な導入を可能とし、構築されたプラスミ
ドの適用性を広げることとなる。全くプラスミドを含ま
ないか、プラスミドpMS48とpMS50を含まない枯草菌培養
物の細胞溶解物及び同上澄液のウエスタンブロツト解析
は第13図に示す。pMS50で暗号化されたプロキモシンは
すべて細胞間で検出されるのに対しpMS48で暗号化され
たプレプロキモシンは細胞溶解物（約５×104分子／細
胞）及び上澄液（約５×102分子／細胞）中で確認でき
る。 非常に特記すべき事実は、明らかに、プレプロキモシ
ンは細胞間で一部プロセス化されてプロキモシンと一緒
に移動する蛋白質となりプロセス化された形態のものは
上澄液中では検出されないことである。明らかに、プロ
セス化及び排出は、細胞中に存在する量（又はそれに付
着している量）と培地中の量で100倍の差異があるほど
に非常に不充分である。pMS50含有細胞の上澄液中で
は、プロキモシンを検出できないが、一方pMS48含有バ
チルスの上澄液中でのプレプロキモシンの検出は、細胞
溶解物そのものに起因するものとすることも出来ない。
細胞外のプレプロキモシンのこのフラクシヨンは、それ
故、細胞膜を通過してきたものであると考えなければな
らない。しかし、まだ、細胞溶解物中で検出されたプレ
プロキモシンが、非常に疎水性の信号配列を経由して細
胞膜に固定されているはずのものが、それから遊離して
きた蛋白から実際に一部でも構成されていると結論づけ
ることはできないし、また上澄液中のプレプロキモシン
が細胞膜から洗い出されたとすることもできない。プロ
セス化された形態のものが上澄液中に検出されないとい
う事実は、蛋白分解作用により説明できるのかもしれな
い。反対に、プレプロセス化されていない形態のものは
細胞壁と密接に連合しているので、それはプロテアーゼ
に対して良く防護されているのかもしれない。洗い出し
現象はEDTAの添加又は遠心分離工程により起りうる。グ
ルタミン酸塩による（エキソ）プロテアーゼの抑制は、
発現の水準には影響しなかつたようである（第14図、第
１及び第２レーン参照）。プロー１菌株の場合と比較し
てプレプロキモシンの発現水準は幾分高いようであつた
（第14図、第４レーン参照）加えて、プロセツシングの
量はこの場合、より低いようであつた。枯草菌1A436（V
BBBa01−105）内のpMS48上に位置するクローン化したDN
Aの安定性は、炭素源制限培地を用いた恒成分培養そう
を使用し決定した。μmax（Ｄ＝0.6h-1）の約80％で成
長させ、pMS48を含む枯草菌を種々の時間間隔でモニタ
ーした。250世代後においてさえ、制限酵素解析により
示した如く認めうる変化を有さず、元のまゝのプラスミ
ドを全細胞とも含んでいた。更に、すべての細胞もプレ
プロキモシンを依然として生産できた。 結論 − pPL608由来のベクターは、外来DNAの発現水準を比
較的高めることのできる安定な系の一標本であると思わ
れる。 − “統合”リボゾーム結合部合はそのまゝ機能する。 − ビー・アミロリクエフアシエンスの信号配列が正確
にプロキモシンに融合されているプレプロキモシンの部
分は枯草菌の細胞膜を通過する。 − このプレプロキモシンのプロキモシンと共に移動す
る形態へのプロセス化が起ることが立証されたが、しか
し、このような形態は細胞溶解物中でのみ検出できた。 − 明らかに効果的発現及びプロセス化には信号配列の
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物学誌53巻、159−162頁 （Mandal,M.,and A.Higa.1970.Calcium−dependent bac
teriophage DNA infection.J.Mol.Biol.53:159−162.） 19. ジエイ・ケイ・コンドー及びエル・エル・マツカ
イ著1982年、プラスミツドDNAによるストレプトコツカ
ス ラクテイスのプロトプラストの形質転換、応用環境
微生学誌、43巻、1213−1215頁 （Kondo,J.K.,and L.L.Mckay.1982.Transformation of
streptococcus lactis protoplasts by plasmid DNA.A
ppl.Environ.Microbiol.43:1213−1215.） 20. ジエイ・スピツツエン著、1958年、枯草菌の生物
化学的な欠損株のデオキシニユクレアートによる形質転
換、米国国立教養学会大会講演集、44巻、1072−1078頁 （Spizizen,J.1958.Transformation of biochemically
deficient strains of Bacillus subtilis by deoxynu
cleate.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 44:1072−1078.） 21. エム・エヌ・アダムス著1959年、バクテリオロフ
アージ インターサイエンス出版、ニユーヨーク （Adams,M.N.1959.Bacteriophages.Interscience Publi
shers,New York.） 22. ジエイ・シユエーアーアブラモヴイツ、エフ・ジ
エイ・グリクツアン及びデイ・ダブナウ著1981年、プラ
スミツドpE194及びpUB110の複製の起原及び様式、プラ
スミツド6;67−77頁 （Scheer−Abramowitz,J.,F.J.Gryczan,and D.Dabnau.1
981.Origin and mode of replication of plasmids pE1
94 and pUB110.Plasmid ６:67−77.） 23. イー・エム・サウザン著、1975年、ゲル電気泳動
により分離したDNA断片中の特異的配列の検出、分子生
物学誌、98巻、503−517頁 （Southern,E.M.1975.Detection of specific sequence
s among DNA fragments separated by gel electrophor
esis.J.Mol.Biol.98:503−517.） 24. エフ・バラニー、ジエイ・デイー・、ベエーク及
びエイ・トマス著、1982年、ストレプトコツカス ニユ
モニアー及び大腸菌の両者においてエリスロマイシン抵
抗性の複製及び発現する連鎖状球菌由来のプラスミツ
ド、米国国立教養学会大会講演集79巻、2991−2995頁 （Barany,F.,J.D.Boeke,and A.Tomasz.1982.staphyloco
ccal plasmids that replicate and express erythromy
cin resistance in both Streptococcus pneumoniae a
nd Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.U.S.A.79:2991
−2995.） 25. エイ・ゴーゼ及びエス・デイー・エールリツヒ
著、1980年、大腸菌内でのスタヒロコツカス アウレウ
ス由来のプラスミツドの複製、米国国立教養学会大会講
演集、77巻、7333−7337頁 （Goze,A.,and S.D.Ehrlich.1980.Replication of plas
mids from Staphylococcus aureus in Escherichia c
oli.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:7333−7337.） 26. エイ・ダブリユー・ジヤルビス及びビー・デイー
・ダブリユウ・ジヤルビス著、1981年、連鎖状球菌に属
する乳酸菌の間のデオキシ核酸の同質性、応用環境微生
物学誌、41巻、77−83頁 （Jarvis,A.W.,and B.D.W.Jarvis.1981.Deoxyribonucle
ic acid homology among lactic streptococci.Appl.En
vitron.Microbiol.41:77−83.） 27. エル・スイー・クロツ及びビー・エイチ・ジム
著、1972年、粘弾性測定によるDNAの大きさ：枯草菌及
び大腸菌のバクテリオフアージについての結果、分子生
物学72巻、779−800頁、 （klotz,L.C.,and B.H.Zimm.1972.Size of DNA by visc
oelastic measurements:resulte on bacteriophages.Ba
cillus subtilis and Escherichia coli.J.Mol.Biol.
72:779−800.） 28. ジイー・アール・オストロフ及びジエイ・ジエイ
・ペネ著、1983年、枯草菌内における二重機能プラスミ
ツドベクターを用いた分子クローニング：大腸菌繁殖性
キメラプラスミツドDNAの拡大された形質転換性を有す
る枯草菌の自然発生的変異株の分離、微生物学誌159
巻、934−936頁 （Ostroff,G.R.,and J.J.Pene.1983.Molecu−lar cloni
ng with bifunctional plasmid vectors in Ｂ．subtil
is:Isolation of a spontaneous mutant of B.subtilis
with enlarged transformability for Ｅ．coli−prop
agated chimeric plasmid DNA.J.Bacteriol.156:934−9
36.） 29. エフ・エイ・エクターケート著、1975年、エス・
クレモリスHP株の蛋白酵素系の予備的研究、オランダ牛
乳・酪農雑誌29巻、303−318頁（Exterkate,F.A.1975.A
n introductory study of the proteolytic system of
Ｓ．cremoris strain HP.Neth.Milk Dairy J.29:303−3
18.） 30. エル・コバアルビアス及びエフ・ボリーバー著、1
982年、新しいクローニングビークルの構造及び特長VI
逆転複写の第482番目の電子対を欠損しているpBR328の
新規誘導体プラスミドpBR329について、遺伝子17巻、79
−89頁 （Covarrubias,L.,and F.Bolivar.1982.Construction a
nd characterisation of new cloning vehicles VI.Pla
smid pBR329.a new derivative of pBR328 lacking the
482−base−pair inverted duplication.Gene 17:79−
89.） 31. エイ・スイー・ワイ・チヤン及びエス・エヌ・コ
ーエン著、1978年、隠れたミニプラスミツドPI5Aから誘
導された拡大可能性の多重コピー性DNAの構造及び特
性、微生物学誌、134巻、1141−1156頁 （Chang,A.C.Y.,and S.N.Cohen.1978.Construction and
characterization of ampliflable multicopy DNA clo
ning vehicles derived from the P15A cryptic minipl
asmid.J.Bacteriol.134:1141−1156.） 32. ジー・ケイ・ワイ・リムソウチン及びビー・イー
・テルザギイー著、1976年、連鎖状球菌に属する乳酸菌
の培養物中の迅速及び遅い濃縮性細胞の区別のための寒
天培地、ニユージーランド酪農科学及び技術雑誌11巻、
65−66頁 （Limsowtin,G.K.y.,and B.E.Terzaghi.1976.Agar medi
um for the differentiation of “fast" and “slow"
coagulating cells in lactic streptococcal culture
s.N.Z.J.Dairy Sci.Technol.11:65−66.） 32a. ブラウン等著、1922年、微生物用培地としての透
明牛乳（微生物学誌７巻511−514頁（Brown.,et al.192
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ー著、1979年、連鎖状球菌内のプラスミツド検出のため
の迅速スクリーニング手順、微生物学誌、140巻、1112
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J.Bacteriol.140:1112−1115.） 34. エヌ・ブリン、エイ・ヴイー・ガバイン及びエイ
チ・ブジヤート著、1975年、制限酵素で更に消化したも
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t.53:84−86.） 35. テイー・オカモト、ワイ・ブジタ及びアール・イ
リエ著、1983年、エス・ラクテイス細胞からのプロトプ
ラストの形成及び再生、日本農芸化学会誌（欧文）47
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染料結合原理応用のマイクログラム単位の蛋白定量のた
めの迅速かつ高感度方法、分析生化学、72巻、248−254
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or the quantitation of microgram quantities of pro
tein utilizing the principle of protein−dye bindi
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リングウエルフ、ピー・エイ・ミシエルズ、エイチ・ジ
ー・セイエン及びダブリユー・エヌ・コニングス著、19
79年、交差免疫電気泳動によるロドシユドモナス スヒ
ロイデスの膜ビークル及びマロマトホアの免疫学的分
析、エフ・イー・ビー・エス レター、107巻、300−30
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yen.and W.N.Konings.1979.Immunochemical analysis o
f membrane vesicles and chromatophores of Rhodopse
udomonas sphaeroides by crossed immuno−electroph
oresis.FEBS Lett.107:300−307.） 38. ジエイ・ノレンダー・テイー・ケムプ及びジエイ
・メセング著、1983年、オリゴーデオキシヌクレオチド
ーに指示された突然変異化を利用した改良されたM13ベ
クターの構造、遺伝子、26巻、101−106頁 （Norrander,J.,T.Kempe,and J.Messing.1983.Construc
tion of improved M13 vectors using oligo−deoxynuc
leotide−directed mutagenesis.Gene26101−106.） 39. エイチ・トウビン、テイー・ステヒリン及びジエ
イ・ゴードン著、1979年、ポリアクリドアミドゲルから
ニトロセローズ紙への蛋白質の電気泳動による移動：手
順及びその応用、米国国立教養科学会大会講演要旨集、
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に関連した蛋白分解能についてエス・クレモリス菌株間
の比較、オランダミルク・酪農雑誌、30巻、95−105頁 （Exterkate,F.A.1976.Comparison of strains of Ｓ．
cremoris for proteolytic activities associated wit
h the cell wall.Neth.Milk Dairy J.3095−105.） 41. エル・デイー・ラルセン及びエル・エル・マツカ
イ著、1979年、エス・クレモリス内のプラスミドDNAの
分離及び特性の決定、応用環境微生学、36巻、944−952
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ム・デークマン、スイー・ローデス及びピー・ベルグ
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よる試験管内でのDNAの高放射能活性標識、分子生物学
誌、113巻、237−251頁 （Rigby,P.W.J.,M.M.Dieckmann,C.Rhodes,and P.Berg.1
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l.Biol.113:237−251.） 43. デイー・エイチ・デイーン、デイー・エム・エリ
ス及びエム・ジエイ・ケールブリング著、1982年、バチ
リス属の遺伝貯蔵センター；菌株のカタログ、２版 （Dean,D.H.,Ellis,D.M.and Kaelbling,M.J.1982.The B
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ロツク、エイ・エム・マート、エム・ワイ・トーネン、
スイー・バイザー及びスイー・テイー・ベルリス著、19
82、甘味植物蛋白タウマチンを暗号化したcDNAのクロー
ニング及び大腸菌での発現、遺伝子18;12頁 （Edens,L.,Heslinga,L.,Klok,R.,Ledeboer,A.M.,Maat.
J.,Toonen.M.Y.,Visser,C.and Verrips,C.T.1982.Cloni
ng of cDNA encoding the sweet−tasting plant prote
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ルバート及びデイー・ダブリユー・テンペスト著、1970
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巻、第XIII章（ジエイ・アール・ノーリス及びデイー・
ダブリユー・リビンズ編）:277−327頁アカデミー出版
ニユーヨーク （Evans,C.G.T.,Herbert,D.and Tempest,D.W.1970.Cons
truction of a chemostat.Methods in Microbiology.Vo
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s）:277−327.Academic Press N.Y.） 46. ビー・ホルトマン著、1979年、酵素学における方
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３回ヨーロツパ微生物学会講演集（印刷中） （Maat,J.,Edens,L.,Bom.I.,Ledeboer,A.M.,Toonen,M.
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otechnology（in press）．） 50. テイー・マニアテス、イー・エフ・フリシユ及び
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験室手順書、コールドスプリングハーバーラボラトリー （Maniatis,T.,Fritsch,E.F.and Sambrook,J.1982.Mole
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or Laboratory.） 51. ジエイ・メツセング著、1979年、一重らせんDNAバ
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ecombinant DNA Technical Bulletin,NIH Publication
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ラ、ケイ・ヨダ、エム・ヤマサキ及びシイー・タムラ
著、1984年、枯草菌α−アミラーゼプロモーター及び信
号配列領域から誘導した枯草菌分泌ベクター系及び当該
ベクター系による大腸菌β−ラクタマーゼの分泌、日本
農芸化学会誌（欧文）95巻、87−93頁 （Ohmura,K.,Shiroza,T.,Nakamura,K.Yamana,K.,Yoda,
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mase by the vector system.J.Biochem.95:87−93.） 54. アイ・パルブ、アール・エフ・ペーターソン、エ
ヌ・カルクキンネン、ピイー・レクトバーラ、エム・サ
ルバス、エイチ・セーダーランド、ケイ・タキンネン及
びエル・ケールーネン著、1981年、バチルス アミロリ
クエフアシエンスからのプロモータ及びα−アミラーゼ
遺伝子のNH2−ターミナル信号ペプチド領域の核酸配列 （Palva,I.,Pettersson,R.F.,Kalkkinen,N.,Lektovaar
a,P.,Sarvas,M.,Sderlund,H.,Takkinen,k.and Kr
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and NH2−terminal signal peptide region of the α
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ne 15:43−51.） 55. アイ・パルバ、エム・サルバス、ピー・レクトバ
ーラ、エム・シバコフ、及びエル・ケール−ネン著、19
82年、α−アミラーゼ信号配列の助けによる枯草菌から
の大腸菌ラクタマーゼの分泌、米国国立教養学会講演
集、79巻、5582−5586頁 （Pelva,I.,Sarvas,M.,Lektovaara,P.,sibakov,m.and K
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β−lactamase from Bacillus subtilis by the aid
of α−amylase signal sequence.Proc.Natl.Acad.Sci.
USA79:5582−5586.） 56. アイ・パルバ、ピー・リクトバーラ、エル・ケー
ルーネン、エム・シバコフ、ケイ・カンテル、スイー・
エイチ・シヤイン、ケイ・カシワギ及びスイー・ワイス
マン、1983年、枯草菌によるインターフエロンの分泌、
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M.,Cantell,K.,Schein,C.H.,Kashiwagi,K.and Weissman
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lis.Gene22:229−235.） 57. エイチ・トウビン、テイー・ステヒリン及びジエ
イ・ゴードン著、1979年、ポリアクリドアミドゲルから
ニトロセルローズ紙への蛋白の電気泳動的移動：手順及
び数種の応用、米国国立教養学会大会講演集、第76巻、
4350〜4354頁 （Towbin,H.,Staehelin,T.and Gordon,J.1979.Electrop
horetic transfer of proteins from polyacryalamide
gels to nitrocellulose sheets:Procedure and some a
pplications.Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:4350−4354.） 58. デイー・エム・ウイリアムズ、アール・ジイー・
シヨナー、イー・ジエイ・デバール、エル・エイチ・プ
ライス及びピー・エス・ロベツト著、1981年、枯草菌内
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イドロホレート レダクターゼ遺伝子の発現、遺伝子、
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H.and Lovett,P.S.1981.Expression of Escheriachia c
oli trp genes and the mouse dihydrofolate reductas
e gene cloned in Bacillus sabtilis.Gene16:199−20
6.） 59. エム・エム・ツコワスキー、デイ・エフ・ガフネ
ー、デイー・スペツク、エム・カウフマン、エイ・フイ
ンデリ、エイ・ワイスカツプ及びジエイ・ピー・レコツ
ク著、1983年、クローン化したシユードモナス遺伝子の
発現にもとづく枯草菌での遺伝子制御信号の色素産生性
の決定、米国国立教養学会大会講演集、80巻、1101−11
05頁 （Zukowski,M.M.,Gaffney,D.F.,Speck,D.,kaufmann,M.,
Findeli,A.,Wisecup.A.and Lecocq,J−P.1983.Chromoge
nic identification of genetic regulatory signals i
n Bacillus subtilis based on expression of a clon
ed Pseudomonas gene.Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:1101
−1105.）
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ
(Ｃ１２Ｎ 15/09
Ｃ１２Ｒ 1:125
1:19
1:46）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:125）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:46）
(72)発明者 バン デル ボオセン，ヨセフス マウ
リテイウス ベルナルドウス マリア
オランダ国エヌエル‐9722 エツクスシ
ー グロニンゲン，トレセンプラツツ
41
(72)発明者 ベネマ，ゲラルド
オランダ国エヌエル‐9751 エヌエヌ
ハレン，カークラーン 26
(56)参考文献 Ｇｅｎｅ，19 （1982） Ｐ．345−
354
Ｇｅｎｅ，25 （1983） Ｐ．145−
150
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，153（１)
（1983） Ｐ．200−210
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，79（1982） Ｐ．2991−
2995
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．枯草菌（Bacillus subtilis）及び大腸菌（Escheri
chia coli）及び乳酸菌の菌体内で複製可能な組換えプ
ラスミドにして、当該組換えプラスミドが、乳酸菌内に
存在するプラスミドから構築されたもので、かつ上記３
種類の菌体内で発現可能な少なくとも１つのマーカー、
ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus crem
oris）のプラスミドpWV01の一部分でストレプトコッカ
ス・クレモリス内での発現のための複製Ori領域を含ん
だ部分、及びその発現により宿主菌体に改良された性質
又は新規な性質を付与するような少なくとも１つの挿入
DNA断片を含んでいることを特徴とする組換えプラスミ
ド。 ２．特許請求の範囲第１項記載の組換えプラスミドにお
いて、当該組換えプラスミドが、前記３種類の菌体内で
発現可能なマーカーを少なくとも２つ含んでいることを
特徴とする組換えプラスミド。 ３．特許請求の範囲第１項又は第２項記載の組換えプラ
スミドにおいて、当該組換えプラスミドが、挿入DNAの
挿入によって不活性化され得るマーカーを少なくとも１
つ含んでいることを特徴とする組換えプラスミド。 ４．特許請求の範囲第３項記載の組換えプラスミドにお
いて、当該組換えプラスミドが、マーカーとしてCmR及
びEmR遺伝子を含んでいることを特徴とする組換えプラ
スミド。 ５．特許請求の範囲第１項記載の組換えプラスミドにお
いて、当該組換えプラスミドが、少なくとも１つの栄養
要求性マーカー、好ましくはpLP712のBclIB断片に由来
する乳糖代謝遺伝子、を含んでいることを特徴とする組
換えプラスミド。 ６．特許請求の範囲第１項乃至第５項のいずれか１項記
載の組換えプラスミドにおいて、当該組換えプラスミド
が、ストレプトコッカス・クレモリスWg2株のプラスミ
ドpWV05の4.3MdのHind III断片ＣをプラスミドpGKV2の
ユニークHind III部位に挿入することによって得られる
プラスミドpGKV500からなることを特徴とする組換えプ
ラスミド。 ７．特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれか１項記
載の組換えプラスミドにおいて、当該組換えプラスミド
から少なくとも１つのマーカーが除去されていることを
特徴とする組換えプラスミド。 ８．枯草菌及び大腸菌及び乳酸菌の菌体内で複製可能で
あり、乳酸菌内に存在するプラスミドから構築され、か
つ上記３種類の菌体内で発現可能な少なくとも１つのマ
ーカー、ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococ
cus cremoris）のプラスミドpWV01の一部分でストレプ
トコッカス・クレモリス内での発現のための複製Ori領
域を含んだ部分、及びその発現により宿主菌体に改良さ
れた性質又は新規な性質を付与するような少なくとも１
つの挿入DNA断片を含む組換えプラスミドの調製のため
の出発原料として適する組換えベクタープラスミドにし
て、当該ベクタープラスミドが枯草菌及び大腸菌及び乳
酸菌、特に連鎖状球菌（Streptococcus）属の菌体内で
複製可能であり、上記３種類の菌体内で発現可能な少な
くとも１つのマーカー及びストレプトコッカス・クレモ
リスのプラスミドpWV01の一部分でストレプトコッカス
・クレモリス内での発現のための複製Ori領域を含んだ
部分を含んでいることを特徴とする組換えベクタープラ
スミド。 ９．特許請求の範囲第８項記載の組換えベクタープラス
ミドにおいて、当該ベクタープラスミドが、pWV01のMbo
I部位に、pGL112のCmR遺伝子保有Mbo I断片を挿入する
ことによって得られるプラスミドpGK1からなることを特
徴とする組換えベクタープラスミド。 １０．特許請求の範囲第８項記載の組換えベクタープラ
スミドにおいて、当該ベクタープラスミドが、pGK1をCl
a Iで処理して、得られた最大断片を再連結することに
よって得られるプラスミドpGK11からなることを特徴と
する組換えベクタープラスミド。 １１．特許請求の範囲第８項記載の組換えベクタープラ
スミドにおいて、当該ベクタープラスミドが、pGK11のC
la I部位に、pE194 cop−６のEmR保有Hpa II−Cla I最
大断片を挿入することによって得られるプラスミドpGK1
2からなることを特徴とする組換えベクタープラスミ
ド。 １２．特許請求の範囲第８項記載の組換えベクタープラ
スミドにおいて、当該ベクタープラスミドが、 （１）ストレプトコッカス・クレモリスWg2株のプラス
ミドpWV01をCla Iで処理し、この処理で得られる最大断
片を分離して、この最大断片とpE194 cop−６のEmR保有
Hpa II−Cla I最大断片とを連結してプラスミドpGK3を
得て、このプラスミドpGK3をCla Iで処理して線状化
し、その接着末端の一本鎖部分を大腸菌DNAポリメラー
ゼのクレノウ断片で埋めて、第一番目のDNAを得て、 （２）枯草菌ベクターpPL608をPvu IIで完全消化した後
EcoR Iで部分消化してSPO2プロモーター及びCAT遺伝子
を含むPvu II−EcoR I断片を分離し、EcoR I接着末端の
一本鎖部分を大腸菌DNAポリメラーゼのクレノウ断片で
埋めて、第二番目のDNAを得て、 （３）第一番目のDNAと第二番目のDNAとを連結すること
によって得られるpGKV1又はpGKV2からなることを特徴と
する組換えベクタープラスミド。 １３．枯草菌及び大腸菌及び乳酸菌の菌体内で複製可能
な組換えプラスミドの１又はそれ以上が導入された枯草
菌又は大腸菌又は乳酸菌にして、上記組換えプラスミド
が、乳酸菌内に存在するプラスミドから構築されたもの
で、かつ上記３種類の菌体内で発現可能な少なくとも１
つのマーカー、ストレプトコッカス・クレモリスのプラ
スミドpWVO1の一部分でストレプトコッカス・クレモリ
ス内での発現のための複製Ori領域を含んだ部分、及び
その発現により宿主菌体に改良された性質又は新規な性
質を付与するような少なくとも１つの挿入DNA断片を含
んでいることを特徴とする枯草菌又は大腸菌又は乳酸
菌。 １４．特許請求の範囲第13項記載の乳酸菌において、前
記組換えプラスミド中にプロテアーゼをコードする挿入
DNAが存在していて、その結果増大した安定性及び／又
はプロテアーゼ活性を有することを特徴とする乳酸菌。 １５．特許請求の範囲第13項記載の乳酸菌において、前
記組換えプラスミド中にバクテリオファージ耐性遺伝子
をコードする挿入DNAが存在していて、その結果低いバ
クテリオファージ感受性を示すことを特徴とする乳酸
菌。 １６．特許請求の範囲第13項記載の乳酸菌において、当
該乳酸菌が、牛乳凝固酵素又は乳製品醗酵時に牛乳凝固
酵素を生ずるような牛乳凝固酵素前駆体を産生すること
ができることを特徴とする乳酸菌。 １７．特許請求の範囲第13項記載の乳酸菌において、当
該乳酸菌が、キモシン、又は（メチオニル−）シュード
キモシンもしくは（メチオニル−）プロキモシンもしく
はプレプロキモシンなどのキモシン前駆体を産生するこ
とができることを特徴とする乳酸菌。 １８．特許請求の範囲第13項乃至第17項のいずれか１項
記載の乳酸菌において、当該乳酸菌がストレプトコッカ
ス属の乳酸菌であることを特徴とする乳酸菌。 １９．特許請求の範囲第18記載の乳酸菌において、前記
ストレプトコッカス属の乳酸菌が、ストレプトコッカス
・クレモリス、ストレプトコッカス・ダイアセチラクチ
ス（Streptococcus diacetylactis）及びストレプトコ
ッカス・ラクチス（Streptococcus lactis）からなる群
から選択されることを特徴とする乳酸菌。
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