JPS61132179A - フアージ抵抗性大腸菌、およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ある種のファージ感染に対して本質的に非可
逆的な抵抗性を有する細菌に関するものである。また本
発明は、その様な、ファージ抵抗性の細菌を作成する方
法に関するものである。

細菌培養は広範囲に及ぶバクテリオファージの感染を受
は易い。ある種のファージによる感染の結果、特定の細
菌培養が破壊的な溶菌を起こすこともある。従来、その
様なファージ感染を除去するのに、感染した細菌培養を
破壊する方法が採られていた。これらの細菌培養は一般
に小規模であり、例え破壊されたとしても、感染してい
ない細菌源から容易に再補充され得るものであった。し
かしながら、近年の遺伝子工学の発達の結果、生物学的
に活性な組換えポリペプチドが、かなり大量に生産され
る可能性が出てきた。ところで、その様な生物学的産物
の大量生産には、通常、遺伝学的に処理された細菌の大
規模な発酵が必要となる。その様な大規模培養を得るた
めの努力、並びに経費に関連して、それらの培養を破壊
的なファージ感染から保護する必要性が生じてきた。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、　Ｅ、　
ｃｏｌｉ　）は組換えポリペプチドを発現させるのに通
常用いられる宿主である。ある種の大腸菌株に感染し、
溶菌する最も悪性のバクテリオファージの１つにバクテ
リオファージＴＩ（以下ＴＩと称する）がある。

Ｔ１は空気に対してかなりの安定性を有するので、Ｔ１
感染のコントロールは困難である。そこで、従来、Ｔ１
感染を克服するために、周期的に装置から培養物を除去
していたが、大規模な発酵装置の場合には、その様な培
養物の除去法では大量の細菌培養が破壊されてしまうこ
とになる。汚染されていないストック（貯蔵株）からこ
の様な遺伝子工学的に処理された培養を再生させるのに
要する時間と費用とを別にしても、上記の如き汚染によ
ってそれら、遺伝子工学的な処理培養物を得るための親
株が破壊されるおそれがある。

バクテリオファージＴ１およびバクテリオファージ、ｍ
８０（３２を下、０８０と称する）は、野生型大腸菌に
感染するのに、少なくとも２個の膜タンパク質を必要と
することが分っている（１）。それらのタンパク質の内
の１つであるｆｈｕ　Ｂ　（ｔｏｎ　Ｂとしても知られ
ている）は多くの鉄輸送系にとって必要なタンパク質で
ある（２）。もう１つのタンパク質はｆｈｕＡ　（ｔｏ
ｎＡとしても知られている）である。この外層膜タンパ
ク質は、フェリクロムを、外層膜を横切って輸送するの
に必要とされるタンパク質であって、Ｔ１および０８０
が細菌に感染する際に、最初に吸着する受容体でもある
（５）。

バクテリオファージＴ５（Ｊｌ下、Ｔ５と称する）も感
染に際し、少なくともｆｈｕ　Ａと相互作用するはずで
ある（２）。しかしながら、このＴ５はｆｈｕＢタンパ
ク質の存在を必要としない（２）。これらのタンパク質
をコードしている遺伝子も、それぞれｆｈｕＡおよびｆ
ｈｕ　Ｂと呼称される。

機能的なｆｈｕＡおよび／またはｆｈｕ　Ｂタンパク質
の生産能力を欠く突然変異大腸菌は、Ｔ１並びに０８０
に抵抗性を有することが予測される。その様な、機能的
な膜タンパク質の生産能力の欠損は、点突然変異によっ
てもたらされ得る。例えば、点突然変異によって、野性
型配列に含まれる１つのアミノ酸のためのコドンを３個
の既知の終止コドンの内の１つに変換することができる
。その様な突然変異が、タンパク質配列の初めの部分に
起こると、小さく、非機能的なポリペプチドが生産され
る。同様に、点突然変異によって１つの野生型のコドン
を別のアミノ酸をコードしているコドンに変換すること
もできる。この様なアミノ酸の置換が、タンパク質の重
要な部分に係っていれば、分子全体を非機能的にするこ
とができる。しかしながら、点突然変異は自然に元にも
どり、ファージに対する感受性が再生されることがある
。

染色体性物質の欠失によっても遺伝子機能が破壊され得
る。この欠失は点欠失（即ち、単一のヌクレオチドの欠
失）であることもあれば１以上のヌクレオチドの除去に
係る配列欠失であることもある。特定の遺伝子に欠失が
起ると、通常、非可逆的な突然変異をもたらす。自然に
、または化学的に導かれた突然変異体である２個の、Ｘ
８０およびＴ５耐性大腸菌株は、ｆｈｕＡ遺伝子の部分
およびこれまで知られていなかったｆｈｕＣ遺伝子を包
含する欠失によって得られたものである、と仮定された
（９）。しかしながら、これらの突然変異体は、細胞膜
を横切って行われる鉄イオンの輸送を容易にするロドト
ルリン酸（ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌｉｃａｃｉｄ　）、お
よび、多分、その他のヒドロキサマート・シデロフオレ
ス（ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ　５ｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ
ｓ）の利用が困難なものになっている（９）。

点突然変異や点欠失によらずに、遺伝子にトランスポゾ
ンを挿入する方法でも、膜タンパク質をコードしている
ＤＮＡ配列を変化させることができる。トランスポゾン
類は、細菌ゲノムの複数の部位に挿入され得る天然に存
在するＤＮＡ配列である。多くのトランスポゾンは、テ
トラサイクリン、ストレプトマイシンおよびカナマイシ
ン等、様々な抗生物質に対する耐性の付与に係る遺伝子
を有している（１１）。この抗生物質耐性が、特定のト
ランスポゾンをゲノムに組み込んだ菌株を選択するのに
役立つ特徴点となる。テトラサイクリン耐性を有するト
ランスポゾンＴｎ１０を用いてＴ１感染に抵抗性を有す
る大腸菌Ｋ１２の突然変異体を単離した例がある（９）
。これらの突然変異体の特徴は、ｆｈｕＡまたはｆｈｕ
　Ｂの正常な発現を損なう様にトランスポゾンが挿入さ
れていることにある。しかしながら、これらの突然変異
体は自然に、トランスポゾンを正確に切り取ってテトラ
サイクリン耐性を失ない、Ｔ１感受性を回復することが
ある。

従って、Ｔ１感染に対して抵抗性を有し、しかも、自然
にファージ感受性菌に逆戻りせず、さらに、野生型の増
殖（成長）特性を保持している菌が求められている。

本発明の目的は、本質的に非可逆的な、Ｔ１ファージに
対する抵抗性を付与する染色体中のＤＮＡ配列の欠失ま
たは逆位を有する大腸菌を提供すること、並びにその製
造方法を提供することにある。

さらに詳しくは、本発明は、ｆｈｕＡ遺伝子に関連する
ＤＮＡ配列の欠失または逆位により、ファージＴ１、Ｔ
５およびＸ８０による感染に対する抵抗性を得た大腸菌
、並びにその製造方法を提供することを目的とするもの
である。

総括すると、本発明は、特定のファージまたはファージ
群による感染に対し、本質的に非可逆的な抵抗性を有す
る細菌を提供することを目的とするものである。その様
な抵抗性は、特定のファージまたはファージ群が細菌を
感染させる際に必要とする遺伝子または遺伝子類に関連
したＤＮＡ配列の欠失、あるいは逆位を、該細―内に生
せしめることにより、与えられる。本発明は、その様な
、ファージ抵抗性細菌の製造方法を提供することを目的
とするものでもある。

本発明によれば、Ｔ１感染に必要な遺伝子と関連したＤ
ＮＡ配列に、欠失または逆位を生ぜしめる方法により、
Ｔ１に対して本質的に、非可逆的な抵抗性を有する細菌
を得ることができる。Ｔ１ファージ抵抗性菌を得るため
には、まず最初に、抗生物質耐性を担ったトランスポゾ
ンをその様な遺伝子に挿入する。次いで、この遺伝子か
ら不正確にトランスポゾンを排除せしめることにより、
Ｔ１感染に必要なりＮＡ配列の欠失または逆位を生じさ
せる。

更に詳しくは、本発明は、ｆｈｕＡ遺伝子と関連したＤ
ＮＡ配列の欠失または逆位を有する大腸菌を得る方法を
開示するものである。ｆｈｕＡはＴ１、Ｔ５およびダ８
０の各ファージが大腸菌に感染するのに必要とされる大
腸菌の外層膜タンパク質であるため（２）、ｆｈｕＡ　
ＤＮＡ配列に欠失または逆位を起こすことは、それらの
細菌に、Ｔ１、Ｔ５および０８０各フアージに対する本
質的に非可逆的な抵抗性を与える上で有効である。

本発明のその他の特徴は、以下の記載および図面から明
らかとなるであろう。添付の図面に於いで、第１図は本
発明方法を流れ図的に示したフローチャートである。

バクテリオファージＴ１および０８０による感染に対す
る大腸菌の抵抗性は、大腸菌染色体のｆｈｕＡまたはｆ
ｈｕＢ遺伝子の突然変異によってもたらされる。ｆｈｕ
Ａ遺伝子およびｆｈｕＢ遺伝子は、いずれもファージＴ
１およびファージ０８０が必要とする膜タンパク質を発
現する（２）。Ｅｈｕ　Ｂにおける突然変異は多形質発
現性であるため、そ、の様な突然変異は、変異体の発育
に悪影響を与えることがある。しかしながら、ｆｈｕＡ
遺伝子における突然変異は、ｆｈｕ　Ａ突然変異体の増
殖および再生産に重大な影響を及ぼすことは極めて少な
い。

従って、突然変異が起こっていない野生型の大腸菌と同
等の、もしくは実質上、それ以下でない比率で増殖し、
かつ遺伝子を発現することのできるＴ１、Ｔ５およびｙ
８０抵抗性突然変異体を得るためには、ｆｈｕＡ遺伝子
に突然変異を起こすことが好ましい。

ｆｈｕＡ遺伝子遺伝子実然変異は、点突然変異、トラン
スポゾンの挿入、欠失または逆位に分けることができる
。点突然変異およびトランスポゾンの挿入の場合には、
可逆反応が起き易く、ｆｈｕ　Ａ遺伝子およびＴ１感受
性が再生されるかもしれない。しかしｆｈｕＡ遺伝子遺
伝子実る欠失および逆位は本来、非可逆的な現象である
故に、好ましい。

欠失は、自然に起きるか、化学的な処理によって惹起さ
れる（９）。クローンした遺伝子の発現に用いた細菌４
株の中からｆｈｕ　Ａ遺伝子に自然に欠失を生じている
突然変異体は、偶然単離されることがあるかもしれない
が、その可能性は極めて少ない。他方、化学的な突然変
異誘発法で欠失を生じさせると、ゲノム内に複数の欠失
が起こるため、突然変異体の発育に悪影響を与えること
がある（９）。

本発明においては、トランスポゾンの不正確な切り取り
（排除）を利用してｆｈｕ　Ａ遺伝子に関連するＤＮＡ
配列の欠失または逆位を起こさせる。

その様な欠失または逆位により、ｆｈｕＡ膜タンパク質
が完全に消失するか、あるいは、ｆｈｕ〜タンΔ バク質がＴ１、Ｔ５または０８０と結合することができ
なくなるか、または細胞膜と機能的に結合し得なくなる
、という形で、機能的なｆｈｕＡ膜タンパク質が失なわ
れる。

通常、大腸菌のｆｈｕ　Ａ遺伝子と関連しているＤＮＡ
配列におけるトランスポゾン性の（トランスポゾンによ
って生じた）欠失または逆位は、発現可能な選択特性を
有する輸送可能な要素をｆｈｕ　Ａ遺伝子に挿入し、次
いで、Ｔ１、Ｔ５またはｚ８０に対して抵抗性を有し、
かつ上記の輸送可能な要素の選択特性を発現している菌
株を選択することにより、得られる。これらの株から輸
送可能な要素を不正確に排除せしめることにより、該輸
送要素の選択特性を喪失しているが、ファージ感染に必
要な細菌遺伝子の全てまたは一部の欠失、あるいは逆位
を有するためにファージに対する抵抗性は保持している
菌株が生産される。本発明の実施に際して用いられる特
定の選択特性を有するトランスポゾンには以下のものが
含まれる：Ｔｎ１０−テトラサイクリン耐性、Ｔｎ５−
カナマイシン耐性、Ｔｎ３−アンピリジン耐性、Ｔｎ９
−クロラムフェニコール耐性、並びにその他、当業者既
知のトランスポゾン（１１）。この方法は、ｆｈｕ　Ｂ
やｆｈｕ　Ａ内にあるＤＮＡ配列や、その他ファージ感
染に必要な野生型遺伝子内のＤＮＡ配列に欠失や逆位を
生じさせるのにも利用できる。

欠失を生じさせるためにトランスポゾンを用いることに
は幾つかの利点がある。一般に、欠失は、トランスポゾ
ンの挿入付近にしか起こらない（６）また、ＤＮＡの欠
失量において異なる、様々な欠失突然変異体が生成され
る（６）。優先的にｆｈｕ　Ａ遺伝子に影響を及ぼす、
トランスポゾン性の欠失を単離することにより、欠失に
伴なう悪影響を制限することができる。

逆位を生じさせるためにトランスポゾンを用いることは
、その様な逆位が一般に、トランスポゾンの挿入部位と
ゲノム上の第２の遺伝子座との間で起こるという点でも
好都合である（６）。即ち、トランスポゾンを含む遺伝
子の部分が第２の遺伝子座で反転し、第２の遺伝子座に
あったもので置き換えられることになる。これには、ト
ランスポゾンの除去が伴なう。この様にして、本来トラ
ンスポゾンを含有していた遺伝子の発現は損なわれる。

第２のゲノム遺伝子座の位置により、即ち、第２の遺伝
子座が構造遺伝子内にある場合は、この逆位により第２
の遺伝子座の単一の遺伝子に突然変異が起り、それがオ
ペロン内にある場合は極性効果を生じることがある。第
２の遺伝子座が遺伝子内でもオペロン内でもなければ、
逆位による効果は元々、トランスポゾンを含有していた
遺伝子の破損にのみ止まる。従って、主としてファージ
感染に必要な遺伝子に影響を及ぼす逆位を生じているも
のを単離することができる。

本発明によって得られた、ｆｈｕＡまたは、その他のフ
ァージ感染に必要な野生型遺伝子と関連したＤＮＡ配列
に、トランスポゾン性の欠失または逆位を有することを
特徴とする大腸菌は、天然の欠失または逆位による突然
変異体と明確に区別され得るので、本発明方法によれば
、他の遺伝子機能には殆んど影響を受けずに、主として
ｆｈｕＡまたはその他の該野生型遺伝子が影響を受けて
いる、本質的に非可逆的な突然変異体を選択することが
できる。

他方、天然に起きた突然変異体の場合、多くの遺伝子の
機能を破壊する様な欠失または逆位を生ずることがある
。その様な突然変異は一般に単一の突然変異株しか与え
ないので、他の遺伝子の機能の破壊か最少限度に止まっ
ている様な１つの株を選択することはできない。

また、化学的に誘導された欠失の場合には、細菌ゲノム
内に様々な欠失を有する多くの菌株が得られる。しかし
ながら、トランスポゾン性の欠失の場合とは違って、化
学的に誘導された欠失では、細菌ゲノムの１点を起源と
する一連の欠失を生じさせることがない。従って、遺伝
子機能の破壊か最少である突然変異株を単離することは
困難である。この様に、本発明に従って得られた突然変
異体細菌は、天然に存在する逆位または欠失突然変異体
や化学的に誘導された欠失突然変異体に比べて、その欠
失または逆位が特定の遺伝子に限定されることが多いと
期待される。従って、ｆｈｕＡまたは他の野生型遺伝子
に関連したＤＮＡ配列にトランスポゾン性の欠失または
逆位を有することを特徴とする本発明の細菌は、ｆｈｕ
Ａまたは他の野生型遺伝子に優先的に影響する欠失また
は逆位を有している突然変異細菌であるといえる。

本発明においては、大腸菌株Ｗ３１１０を用いて、ｆｈ
ｕ　Ａ遺伝子に関連したＤＮＡ配列の遺伝子欠失または
逆位を含んでいるＷ３１１０細菌株を組立てることが好
ましい。Ｗ３１１０株は、組換えＤＮＡ産物の発酵工業
において一般的な宿主であるという理由で選んだ。この
菌株は、第１図に示したフローチャートにおける出発物
質である。

第１図の第１工程においては、一般に、大腸菌Ｗ３１１
０に、輸送可能な要素であるＴｎ１０を含有しているラ
ムダ（λ）バクテリオファージ（λ：：Ｔｎ　１０　）
を形質導入する。バクテリオファージλ：：Ｔｎ１０に
よる形質導入によって、バクテリオファージに由来する
配列が挿入されることなく、細菌ゲノムの複数の部位に
正確にＴｎ１０トランスポゾンが挿入される。こうして
得られた細菌の集団（プール）をＷ３１１０　：：Ｔｎ
ｌｏと称する。

第１図における第２工程においては、Ｗ３１１０：：Ｔ
ｎｌｏをλ０８０感染に対する抵抗性に基づいて選択す
る。λＸ８０は、それが、大腸菌に吸着する際にｆｈｕ
　Ａタンパク質を用いること、並びに、大腸菌ストック
に対してＴ１程、危険ではないことを理由に選択された
。こうして選択した株をＷ３１１０　：：　Ｔｎｌｏ−
λ０８０λと称する。Ｗ３１１０　：：　Ｔｎ　ｌ　Ｏ
のファージ０８０抵抗性株をプールし、バクテリオファ
ージＰｌを感染させる。

得られたリゼイト（溶菌液）を用い、第３工程に示され
ている如く大腸菌ＡＴ９　ｓ　２　（３）に形質導入す
る。この形質導入によってＷ３１１０：：Ｔｎ１０−λ
０８０ＲＤＮＡのＤＮＡ配列と、ＡＴ９８２中のホモロ
ーガスな配列との組換えが起こる。ＡＴ９８２株は、ｄ
ａｐ　Ｄ突然変異を含んでいることを理由に選択された
。このｄａｐ　Ｄ遺伝子はｆｈｕＡ遺伝子と接近して位
置していることが知られている（１）。

従ッテ、ｆｈｕＡとｄａｐ　Ｄとは６５〜９１％の割合
で同時形質導入し得る（３）。しかしながら、ｆｈｕＢ
とｄａｐ　Ｄとは同時形質導入することができない。

Ｗ３１１０　：：Ｔｎ　１０−λ＊８０Ｒ（７）Ｐｉリ
ゼイトを用いてＡＴ９８２株に形質導入し、得られた形
質導入体を、ｆｈｕＡ遺伝子内にＴｎ１０が含有されて
いることを意味するテトラサイクリン耐性と、ｄａｐ　
Ｄ機能の再生とに基づいて形質導入体を選択する。

第２段階には、その他のｄａｐ　Ｄ突然変異大腸菌（３
）および、ｆｈｕＡ遺伝子と同時形質導入し得る他の遺
伝子を含有する大腸菌の突然変異体（１）を用いること
もできる。

第１図の第４段階においては、ｄａｐ　Ｄ機能を再生し
ているテトラサイクリン耐性株を、大腸菌Ｗ３１１０へ
のバクテリオファージ、Ｐ　１の形質導入のためのＤＮ
Ａ供給源とする。上記の如く、その様な形質導入により
、ホモローガスな配列を含有する領域に組換えが起こる
。テトラサイクリン耐性およびλ０８０抵抗性を示すＷ
３１１０形質導入体を選択する。これらの菌株を、大腸
菌Ｗ３３１０ｆｈｕＡ　：：　Ｔｎ　１０−λ０８０Ｒ
と称スル。コノ様な菌株は、第２段階で得たＷ３１１０
：：Ｔｎｌｏ　−λ０８０Ｒと機能的に同等である。し
かしながら、第３および第４段階において得られるこの
Ｗ３１１０ｆｈｕＡ　：：　Ｔｎ　ＩＱ−λ＊８０Ｒ株
は、Ｔ１、Ｔ５または０８０感染に対する抵抗性を与え
得るｆｈｕＢ遺伝子、あるいは他の未知の遺伝子ではな
く、ｆｈｕＡ遺伝子内にＴｎＩＱが挿入された株からな
ると予測される。従って、第３および第４段階を行うこ
とにより、第５段階で、ｆｈｕＡ遺伝子に関連したＤＮ
Ａ配列に欠失または逆位を有する、Ｔ１、Ｔ５または０
８０フアージ抵抗性の細菌を得ることができる可能性が
増す。しかしながら、本発明の実施には、第３およびｇ
Ｊ４段階が必須ではない、ということは理解されるであ
ろう。これらの工程は、ｆｈｕＡ遺伝子内にＴｎＩＱを
有する突然変異体の単離の可能性を最大にするためのも
のであり、本発明の範囲を制限する意図ではない。

第１図の第５段階では、第４段階で得た大腸菌Ｗ３１１
０　　ｆｈｕＡ　：：　Ｔｎ　１０−λｐ８０Ｒ，また
は、第２段階で得たＷ３１１０　：：　ＴｎｌＯ−λｐ
８ＱＲを、ファージλｙ８０惑染に対する低抗性、並び
にテトラサイクリン感受性への逆戻りに基づいて選択す
る（７）。このテトラサイクリン感受性に回復する際に
ＴｎＩＱ要素が正確に、または不正確に排除されること
になる。正確な排除があれば、機能的なｆｈｕＡ遺伝子
が再生する。不正確な排除は細菌あたり約１／１０の頻
度で起こるが、これは、しばしば、輸送可能な要素に接
近した配列の染色体性の欠失、あるいは逆位をもたらす
（６）。第３および第４段階で得たＷ３１１０　ｆｈｕ
Ａ　：：　Ｔｎ　１０−λ１ｆＢＯＲ−株は、Ｔｎ１０
がｆｈｕＡ遺伝子内に位置する可能性が最大になる様、
選択されているので、その様な菌株からのＴｎＩＱの不
正確な排除により、ｆｈｕ　Ａ遺伝子の欠失または逆位
が起こり、大腸菌Ｗ３１１０　ｆｈｕＡ−と命名された
菌株が生産されることか予測される。

λ：：ＴｎｌＯの組立てにおける出発物質はラムダｃＩ
８５７　ｂ２２１０ａｍ２９である。このλファージは
、３つの良く知られたス突然変異体を組み合わせた性質
を有する。Ｃｌ８５７遺伝子型は、可逆的に温度感受性
であるＣＩＩＪプレツサーを生産する（１２）。またｂ
２２１遺伝子型（１３、１７）は、必須でないλＤＮＡ
配列を欠失していることを特徴とする。このｂ２２１遺
伝子型は、λゲノム内に、ＴｎｌＯ）ランスポゾンを収
容する空隙を提供する。さらに、ｂ２２１欠失によって
λｉｎｔ　（組込み）遺伝子が除去され、そのことによ
り、その様なファージは、大腸菌内のプロファージの如
く正常な組込みがなされなくなってしまう。Ｏａｍ　２
９遺伝子型はスの０複製遺伝子中のアンバー突然変異を
特徴とする（　１４　、１６　、１８　）。このラムダ
ＣＩ　８５７ｂ２２１０ａｍ２９は当業者既知であり（
１４）、上記の各遺伝子型から、標準的な手法に従って
組立てられる。゛また、Ｔｎ１０誘導体も当業者には知
られており、以下の方法で組立てられる。ラムダＣ１８
５７ｂ２２１０ａｍ２９　のリゼイト（溶菌液）を、当
業者既知の方法で遺伝子操作して、これもまたＴｎｌｏ
ｌ−ランスポゾンを含有する様にした大腸菌Ｃ：６００
　（ＡＴＣＣ２３７２４）について調製する（１０）。

このリゼイトを用いて、アンバーサプレッサーと、Ｃｌ
８５７遺伝子型を持ったラムダプロファージとを含有し
ている大腸菌Ｃ６００（λＣ１８５７）に感染させる。

感染の多重度は１０であることが好ましい。３２℃で１
時間インキュベーションした後、遠心して細胞を濃縮し
、テトラサイクリン１５μｙ／ｗｅと０．０１Ｍピロリ
ン酸ナトリウムとを含有するブロス・プレート上にノセ
ル。

プレートを３２℃で一夜インキユベートする。熱誘導に
より、テトラサイクリン耐性コロニー（７）　ＩＪゼイ
トを調製する。このテトラサイクリン耐性コロニーを最
初３２℃で増殖させ、次いで、４２°Ｃで９０分間増殖
させる。このリゼイトを大腸菌Ｃ６００上にプレートす
る。大腸菌Ｃ６００上に現われるプラークを、大腸菌Ｃ
６００と、異種免疫プロファージ・ラムダ１ｍｍ４３４
を含有している大腸菌Ｗ３１０２　ｓｕｐ　　（λｔｍ
ｍ　４３４　）　（１６）上に、３２℃においてレプリ
カ平板処理する。異種免疫株主に現われるプラークをテ
トラサイクリンプレート（平板）に植える。これらのプ
レート上に現われるプラークはテトラサイクリン耐性を
形質導入する能力を有しており、従って、これらのプラ
ークに含まれているファージがＴｎ　ｌ　Ｑを担ってい
ることを示唆している。この様にして同定されたファー
ジを大腸菌Ｃ６００内で増殖させ、λ：：Ｔｎ１０　と
呼ばれるファージを得る。

他の型のλ：：”ｒｎｌ□も知られている（１６）。結
論として、本発明において用いられるλ：：ＴｎＩＱは
、本発明で開示したλ：：Ｔｎ１０と同程度有効な他の
λ誘導体からなっていてもよい。

λ０８０の組立て 大１１＃ｌ菌Ｗ３１１０をλｃＩファージ（１５）とｙ
８０ファージ（ＡＴＣＣ１１４５６ａ−Ｂ１）で感染さ
せる。感染の多重度は各ファージについて約５である。

３７℃で９０分間細胞を増殖させ、リゼイトを得る。こ
のリゼイトを３７℃において大腸菌Ｗ３１１０（Ｊ２ｆ
８０）／λ　上にプレートする。次いでこのプレートか
ら得たプラークを、大腸菌Ｗ３１１０上で精製する。こ
の様にして得られたλ８０のリゼイトを用いてＴ１感染
に対する抵抗性を分析する。

λとｙ８０との交雑については既に知られている（１９
）。従って、λおよびＪｚ１８０の他の株も本発明の実
施に際して用いることができる。しかしながら、その様
な組換え体は、ｆｈｕＡ膜タンパク質と結合する様、０
８０のティル（尾部）領域を含有していることが必要で
ある。

以下、実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 大腸菌Ｗ３１１０に、λ；：　Ｔｎ　１０を形質導入し
、大腸菌Ｗ３１１０のＴｎ　ｌ　Ｑ　ｈｏｐプールを調
製する。

この大腸菌Ｗ３１１０　：：　Ｔｎ　ｌ　Ｑ　ｈｏｐプ
ールを３７°Ｃにおいて、細胞密度か約Ｉ　Ｘ　１０　
／ｄになるまで増殖させる。この培養物０．５−を遠心
して得られたペレットを７．０　Ｘ　Ｉ　Ｏ’　ｐｆｕ
を含んた゛λ０８０溶菌液０．２ｄに再懸濁する。３７
°Ｃで３０分間、ファージを吸着させる。次いで、この
懸濁液を、テトラサイクリンを補充した（１５μｙ／−
）ＥＭＢプレート上に広げる。３７℃で一夜インキユベ
ートした後、淡いピンク色の物質を３ｄのＬブロス中に
プールし、３７℃で一夜増殖させ、２回洗浄した後、Ｌ
ブロスに再懸濁する。この培養物についてバクテリオフ
ァージＰｌｋｃリゼイトを調製する（８）。

このＰ１ｋｃ＋Ｊゼイトによって大腸菌ＡＴ　９８２Ｃ
１１ｋＬ４５４６、大腸菌ジエネーック・ストック・△ センター（Ｅ、　ｃｏ凰ｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃ
ｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　）　＝ユーヘブ７　（Ｎｅｗ　Ｈａ
ｖｅｎ　）、Ｃｏｎｎ、］に形質導入し、接菌をテトラ
サイクリン耐性にする。テトラサイクリン（１５μｙ／
ｉ　）とｄａｐ　（ジアミノピメリン酸）（４０μｙ／
ｍｚ　）を補充したしブロス上で形質導入体を選択する
。得られた形質導入体をテトラサイクリン耐性とｄａｐ
遺伝子の再生（ｄａｐ　、ｔｅｔＲ）に関してスクリー
ンする。次いで、ｄａｐ＋、ｔｅｔ　Ｒ形質導入体をλ
０８０に対する抵抗性の試験に委ねる。

次いで、幾つかのｄａｐ　、　ｔｅｔ　　、λ０８００
８０抵抗性してＰｌｋｃｌＪ−ｇイトを調製する。この
リゼイトを用いて大腸菌Ｗ３１１０に形質導入し、テト
ラサイクリン耐性にする。λ０８０耐性に関して形質導
入体をスクリーンする。

このｗ３１１０　　ｆｈｕＡ：：ＴｎｌＯ−λ０８０Ｒ
形質導入体から、テトラサイクリン感受性の単離体を選
択する（７）。単一のコロニーを精製した後、これらの
単離体のλ０８０抵抗性とテトラサイクリン感受性を検
査する。

幾つかのテトラサイクリン感受性のλ０８０抵抗性突然
変異体から単離したＤＮＡを５ｓｔｆ（で消化する。こ
のＳｓｔ■消化ＤＮＡを、放射活性に標識し、５ｓｔｌ
Ｉ消化したλ：：Ｔｎ１０　ＤＮＡをプローブとして用
いるサザーンプロット法にかけて特性化し、Ｔｎｌ□が
排除されているか否かを調べる（４）。テトラサイクリ
ン感受性の単離体の内の１つは、λ：：ＴｎＩＱ由来（
７）　Ｄ　Ｎ　Ａと、親であるＷ３１１０　ｆｈｕＡ　
：：　Ｔｎ　１０λ０８０Ｒとのハイブリダイゼーショ
ンの結果との比較によって、２個のハイブリダイゼーシ
ョンバンドヲ消失していることが示された。第３番目の
ハイブリダイゼーションバンドは移動度に変化を来して
おり、この欠失がＴｎｌｏの不正確な排除によって起こ
ったことを示唆している。

Ｔｎ　１０が不正確に排除されている株の外層膜タンパ
ク質標品を５ＤＳ−ゲル電気泳動にかけると、ｆｈｕＡ
タンパク質であると推定されるバンドの電気泳動におけ
る移動度が、野生型のｆｈｕ　Ａタンパク質のそれに比
べて変化していることが判る。

このタンパク質はλ０８０ファージの受容体としての機
能を持たない。ＳＤＳゲル法によると、Ｔｎｌｏの不正
確な排除がなされた第２の別の菌株中にはｆｈｕＡタン
パク質が存在していないことが判った。

これらの菌株のどれも、テトラサイクリン耐性あるいは
λ０８０感受性に逆戻りすることがなく、このことから
、ｆｈｕＡ遺伝子の部分的、または完全な欠失を伴なう
、トランスポゾン全体、または一部の、不正確な排除が
なされていることが示唆された。

上記の一般的手法を、ＥｈｕＡ遺伝子以外の部位のＤＮ
Ａ配列に欠失または逆位を有する細菌株を生ぜしめるの
に用い得ることは明らかである。その様な欠失または逆
位によって、ＴＩ、Ｔ５および０８０フアージ感染に対
する抵抗性以外の、望ましい、かつ永久的な性質が与え
られるかもしれない。その様な菌、並びにそれらを得る
ためにここに開示した方法は、本発明から予測され得る
ものである。

この明細書には、本発明に関する好ましい態様が記載さ
れているのであるから、ここに開示した態様には様々な
改良を加えることができ、その様な改良形もまた本発明
の範囲内に含まれるものであるということは、当業者に
とって明らかであろう。

以下に、本明細書中で引用した参照文献を、明細書中の
番号に従い、下記の文献目録に示す。

文献目録 １、ハフ　バーｖ　７　（Ｂａｃｈｍａｎｎ　）　、　
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ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　：１−ルド・スプリング・ハー
バ−・ラボラトリイ（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）　Ｎ。

Ｙ、Ｐ、３０４゜ ９、　　ｈ　トｔ　−（Ｋａｄｎｅｒ）、　ＲｏＪ、、
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３：２５６゜１０、クレツクナー、Ｎ、ら１９７７、　
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ１１６
：１２５゜１１、タレツクナー、Ｎ、、　　トランスポ
ーザブル・エレメンツ・イン・プロカリオーツ（Ｔｒａ
ｎｐｏ−ｓａｂｌｅ　Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｐｒｏ
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ブ・モレキュラー・バイオロジイ　１１６：１２５゜１
５、フ９　ツ’／　７　（Ｐｔａｓｈｎｅ）　Ｍ、１ｇ
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イ、Ａ。

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・ハーバ−・ラボラトリイ、コールド・スプリング・ハ
ーバ−Ｎ、Ｙ。

１６、クレックナーＮ、、ら、１９７８　ジエネテック
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１７、コート（Ｃｏｕｒｔ　）　Ｄ、およびオツヘンハ
イム（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ）　Ａ、　、　１９８３、ラ
ムダ■（ヘンドリツクス、Ｒ，Ｗ、ら編）　ＣＬａｍｂ
ｄａ　ＩＩ　（Ｈｅｎｄｒｉｘ　ＲｏＷ、　ｅｔ　ａｌ
　、　ｅｄ　）　］　ｐｐ　２５７−２７７　。

コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ、コー
ルド・スプリング　ハーバ−Ｎ、Ｙ。

１８、アーバー（Ａｒｂｅｒ　）　Ｗ、、ら、１９８３
、ラムダ■（ヘンドリックス、ＲｏＷ、ら編）ｐｐ　４
３３−４６６、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ
ラトリイ、コールド・スプリング・ハーバ−’　Ｎ、Ｙ
。

１９、シンガー（Ｓｉｎｇｅｔ）　Ｅ、Ｒ，、１９６４
、ヴイロロジイ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　２２　：６５０
−６５１゜

【図面の簡単な説明】

第１図は大腸菌Ｗ３１１０株を出発物質として、大腸菌
Ｗ３１１０　　ｆｈｕＡ−を得るための工程図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、野生型大腸菌に、該野生型大腸菌の少くとも１個の
   膜タンパク質を利用して感染するファージに対し、本質
   的に非可逆的な抵抗性を有する該野生型大腸菌の突然変
   異大腸菌であって、該野生型大腸菌の膜タンパク質群の
   少くとも１個の膜タンパク質と関連したＤＮＡ配列に、
   トランスポゾン性の欠失または逆位を生じていることを
   特徴とする突然変異大腸菌。 ２、突然変異がトランスポゾン性の欠失に基づくもので
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の突然
   変異大腸菌。 ３、該ＤＮＡ配列がｆｈｕＡ遺伝子と関連している特許
   請求の範囲第１項記載の突然変異大腸菌。 ４、該ファージが、Ｔ１、Ｔ５およびφ８０を包含する
   ものである特許請求の範囲第１項記載の突然変異大腸菌
   。 ５、該トランスポゾンがＴｎ１０である特許請求の範囲
   第１項記載の突然変異大腸菌。 ６、野生型大腸菌の少くとも１個の膜タンパク質に吸着
   することによって該野生型大腸菌に感染するファージに
   対し、本質的に非可逆的な抵抗性を有する突然変異大腸
   菌を製造する方法であって：大腸菌トランスポゾンｈｏ
   ｐプールから、該トランスポゾンを含有しており、かつ
   、上記ファージに抵抗性を有する第１の菌株を選択し、 この第１の菌株の中から、該トランスポゾンの選択特性
   を消失していることにより、また、該野生型大腸菌の膜
   タンパク質群の内、少くとも１個の膜タンパク質と関連
   したＤＮＡ配列にトランスポゾン性の欠失または逆位を
   生じ、それによって該ファージに対して本質的に非可逆
   的な抵抗性を得たことにより特徴づけられる少くとも１
   個の修飾された第１の細菌株を選択することからなる方
   法。 ７、該修飾された第１の細菌株が該トランスポゾン性の
   欠失によって得られたことを特徴とする特許請求の範囲
   第６項記載の方法。 ８、該ＤＮＡ配列がｆｈｕＡ遺伝子と関連するものであ
   る特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９、該ファージがＴ１、Ｔ５およびφ８０を包含する特
   許請求の範囲第６項記載の方法。 １０、該トランスポゾンがＴｎ１０であり、該選択特性
   がテトラサイクリン耐性である特許請求の範囲第６項記
   載の方法。