JPS6366129A - Ｂ型肝炎ウィルス抗原の抗原性を示すポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の要約 組換えＤＮＡ分子およびそれにより変異されてＨＢＶ抗
原性を示すポリペプチドとそれをコード化する遺伝子と
を生産する宿主、ならびにこれらの分子、宿主、遺伝子
およびポリペプチドの製造および使用方法が開示される
。本発明の組換えＤＮＡ分子は、ＨＢＶ抗原性を示す少
なくとも７種のポリペプチドをコード化する構造遺伝子
を特徴とする。適当な宿主において、これら組換えＤＮ
Ａ分子は、ＨＢＶ抗原性を特徴とする遺伝子およびポリ
ペプチドの生産および同定と、組成物中におけるそれら
の使用と、人間におけるＨＢＶビールス感染を検出して
この感染に対する抗体の生産を刺戟する方法とを可能に
する。

本発明は、組換えＤＮＡ分子およびその製造方法に関す
るものである。さらに詳細には、本発明は、適当な宿主
生物において表現される組換えＤＮＡ分子に関するもの
である。本明細書中に開示する組換えＤＮＡ分子は、肝
炎Ｂビールス抗原の特異性を有するポリペプチドをコー
ド化するＤＮＡが特徴である。以下の記載から了解され
るように、組換えＤＮＡ分子は、人間における肝炎Ｂビ
ールスの検出およびこのビールスに対する人間における
抗体の刺戟のために使用することができる。

肝炎Ｂすなわち血清肝炎を引き起こすビールスは、人間
のみに感染すると思われ、人間における肝炎Ｂビールス
（ｒＨＢＶＪ　）感染は蔓延している。英国、米国およ
び西欧において、全供血者の約０．　／％はＨＢＶの慢
性保菌者である。

ビールス性肝炎による死亡率は高くないが（英国におい
て／り７ｊ年にはｉｏｏ万六当シ３人であった）、英国
における人口の！チおよび米国における人口の／よ％と
いう多くが感染していると示されている。多くのアフリ
カおよびアジア諸国においては、人口の２０％までがＨ
ＢＶの慢性保菌者であり、これら諸国における全成人の
５０％以上がＨＢＶに感染したかまたは感−ｌ弘− 染している。

肝炎の感染は、３つの一般的機作によって伝染される。

すなわち、（１）輸血におけるような多量でまたは事故
による皮膚刺通を介するような少量で、感染された血液
もしくは体液が非経口的に接種されることによるもの、
（２）近親または性交渉によるもの、および（３）妊娠
中に感染した母親が新生児にビールスを移すことによる
ものである。自然条件下では、ＨＢＶは大して感染性の
高いものでない。呼吸による伝染は、あったとしても稀
である。

大抵のＨＢＶ感染は準臨床的のものである。

臨床的疾病は通常３〜６週間続き、疾病塵において軟度
乃至急性電撃肝炎次いで肝硬変または死亡までの範囲に
わたる。臨床的および準臨床的なＨＢＶ感染からの回復
は通常完全である。

しかしながら、成る場合には重度の長期結果が生ずる。

（１）急性感染の約６％は肝炎Ｂビールス抗原の慢性保
有者であり、他人に対する感染潜在力を継続して有する
と共に肝臓損傷を進行さ一１５＝ せており、また（２）　ＨＢ　Ｖによる過去の感染は慢
性型活性肝炎、肝硬変および第−期肝臓癌というＨＢＶ
−血清陰性例の相当な割合を開始させる完全なまたは部
分的な原因となりうる。

分子生物学における最近の進歩は、特異的非細菌性成熟
核蛋白質をコード化するＤＮＡを細菌細胞中に導入する
ことを可能にした。一般に、化学合成によシ製造したも
の以外のＤＮＡを用いる場合、組換えＤＮＡ分子の構成
は、所望の蛋白質に対する精製メツセンジャー（ｍＲＮ
Ａ）雛型の単一鎖ＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ　）を生成さ
せ、このｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを二重鎖ＤＮＡに変換し、この
ＤＮＡを適当なりローン用ベヒクル（ＣＯＯ旧ｎｇｖｅ
ｈｉｃｌｅ　）における適当な部位に結合させそしてそ
の組換えＤＮＡ分子により適当な宿主を変異させる手順
からなっている。このような変異により、宿主は所望の
蛋白質を生産することが可能になる。さらに、少なくと
もオバルブミンＤＮＡの場合、強力な細菌促進子または
表現調節順序に対する特定ＤＮＡの適当な融合は、よ−
／を− り大量の所望オバルプミン蛋白質、すなわち大腸菌（Ｅ
、ｃｏｌｉ）細胞の全蛋白質の約Ｏよ〜／％を生成させ
ることが知られている（オー・メルセローープイジャロ
ン等、「組換えプラスミドを有するイー・コリに７．２
によるオバルブミン状蛋白質の合成」、ネーチャー誌第
−２７ｊ巻第ｓｏｓ〜ｓｉｏ頁（／り７Ｊ’）ならびに
ティー・エッチ・フレーザーおよびビー・ジエーｅブル
ース、「雛鳥オバルプミンはイー・コリにより合成かつ
分泌される」、プロシーデイング・ナショナル・アカデ
ミ−・サイエンス、Ｕ、Ｓ、Ａ、。

第７ｊ巻、第ｊり３６〜ｊり弘Ｏ頁（ｌり７ｇ））。

数種の非細菌性蛋白質および遺伝子が、組換えＤＮＡ技
術を用いて合成された。これらには、ラッテのプロイン
シュリン抗原決定子を示す蛋白’Ｊｔ（エル骨ヴイラー
コマロフ等、［プロインシュリンを合成する細菌クロー
ン」、プロシーディング噛ナショナル・アカデミ−・サ
イエンス、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、第７ｊ巻、第３７２７〜
３７３１頁（１９７ｇ））、ラッテの成長ホルモン（ピ
ー・エッチ・シーブルク等、「細菌による成長ホルモン
の合成」、ネーチャー誌、第２７６巻、第７りよ〜７り
ｒ頁（／　５’７．ｒ　）　）、ねずみのジヒドロフオ
レートレダクターゼ（ニー・シー・ワイ・チャンク等、
「ねずみのジヒドロフオレートレダクターゼをコード化
するＤＮＡ順序のイー・コリにおける表現型式」、ネー
チャー誌、第２７６巻、第、＜／７〜１２グ頁（／り７
ｇ））、ソマトスタチン（ター・イタクラ等、「ソマト
スタチンホルモンに対する化学合成された遺伝子のイー
・コリにおける表現」、サイエンス誌、第１りｒ巻、第
１０！ｔ　〜１０乙３頁（１５＞７７）、ならびに英国
特許第２．００’１ｔＶｊＡ号、第２ｏＯＺＡＶＡＡ号
および第２００ζ７２３Ａ号明細書およびそれらの他国
出願）、およびひとインシュリンのＡおよびＢポリペプ
チド鎖（ディー・ディー・ゲデル等、「ひとインシュリ
ンに対する化学合成された遺伝子のイー・コリにおける
表現」、プロシーデイング・ナショナル・アカデミ−・
サイエンス、Ｕ、Ｓ、Ａ、、第７を巻、第ｉｏｔ〜／１
０頁（ｌり７り）および上記英国特許明細書）が包含さ
れる。

しかし々から、本発明とは異なり、上記のものはいずれ
もたとえば肝炎Ｂビールス抗原のようなビールス性蛋白
質の組換えＤＮＡ合成に向けられていない。

ＨＢＶ感染は、ビールスの抗原に対して抗体の発生を惹
起することが知られている。これらの抗体は、ＨＢＶ感
染に対する人体の防禦メカニズムである。露呈前におけ
る或いは潜在露呈の場合における急速なこの種の抗体の
発生は、ビールス繁殖を実質的に減少させかつ撲滅する
と共に患者中に広がる。

しかしながら、肝炎Ｂビールスの抗原に対する人工的刺
戟による抗体の発生の問題は、このビールスの限られた
宿主範囲に生ずる。たとえば、人間に対し極めて感染度
が高いが、肝炎Ｂビールスによる実験的感染は、その他
二三の霊長類にしか得られなかった。また、このビール
スは組織培養においては繁殖されなかった。こ−／ター の限られた宿主範囲および組織培養細胞の感染不能は、
ビールスとその感染病理学の特性化ならびに迅速検出手
段と感染抑制および予防の効果的手段の開発を著しく妨
げている。

抗体を発生させまた感染を検知するため、ＨＢＶ感染の
犠牲者から単離された真正ＨＢＶビールス抗原を使用す
る試みが幾つかなされたが、これらの処置は活性様の供
給に限度があるため一般的に利用できない。さらに、こ
れら抗原を得るため人間を原材料として使用することは
、人間の単離物を使用する際の周知された汚染問題のた
め好ましくない。

本発明は、ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドをコード化
する構造遺伝子を特徴とする組換えＤＮＡ分子を本発明
によ勺提供して上記の諸問題を解決する。

本発明によれば、ワクチン製造のためならびにビールス
感染の検知およびその病理学と分子生物学の決定に使用
するため、ＨＢＶ抗原および遺伝子を汚染されていない
かなりの量で得ることが可能となる。このような供給物
は、このビールスの狭い宿主範囲および組織培養におけ
る繁殖不能のため、従来入手できなかった。

以下の記載から判るように、本発明の組換えＤＮＡ分子
は、適当な宿主において、ｒ（１３Ｖ抗原性を示す少な
くとも７種のビールス性ポリペプチドおよびそれをコー
ド化する構造遺伝子を生成させることができる。これら
組換えＤＮＡ分子と宿主とを用いて、ＨＢＶ抗原性を示
すポリペプチドとこれらポリペプチドをコード化する構
造遺伝子とを製造することができる。これら生産物はま
た同定かつ特性化されうると共に、宿主中で生成された
ままの状態で或いは適当に誘導体化もしくは改変した後
に、これら生産物自身の製造を改善する組成物および方
法に使用でき、またＨＢＶ感染を検知し、その病理学を
追跡しかつ人間におけるＨＢＶ抗体の生産を刺戟する組
成物および方法に使用することができる。

さらに本発明によれば、ディン粒子（Ｄｉｎｅｐａｒｔ
ｉａｌｅ　）の内生ＤＮＡから調製されたＤＮＡ順序を
ディン粒子以外の材料源から調製された他のＤＮＡ順序
に結合させることを特徴とする、組換えＤＮＡ分子の製
造方法が提供される。

本発明の方法は、上記した従来の方法とは次の点で区別
することができる。すなわち、従来法はいずれも組換え
ＤＮＡ分子を構成するための特定蛋白質を得る目的でま
たこの蛋白質もしくは遺伝子を生産する目的で天然遺伝
子またはＤＮＡを使用しない。その代シとして、従来法
は化学合成によシ作られた合成遺伝子またはｃ　Ｄ　Ｎ
　Ａ順序を作シ出すため供与体細胞から単離されたｍ　
ＲＮ　Ａを酵素的に転写することにより作られた人工遺
伝子のいずれかを使用する。

蛋白質の組換えＤＮＡ合成において天然ＤＮＡが従来直
接に使用されなかった理由の一つは、大抵の高等生物か
らの天然ＤＮＡおよび少なくとも成る種の動物ビールス
が「イントロン（Ｉｎｔｒｏｎ　）　Ｊすなわち付加的
なヌクレオチット順序を遺伝子の一部として含有するこ
とである。

これらイントロンは、遺伝子の最終的伝達体の一部を形
成しない。寧ろ、それらは高等生物において一次転写生
成物に作用する特殊処理酵素により生体内で除去されて
遺伝子の最終的メツセンジャー（ｍＲＮＡ）を与える。

細菌はこのようなイントロンを処理するのに使用できな
いと思われ、したがって天然ＤＮＡは細菌宿主において
表現することが期待されずまた所望の蛋白質はこれら宿
主により生産することが期待されないであろう。

第１図は、ディン粒子の内生ＤＮＡの構造を示す略図で
ある。これは２本の補完的ＤＮＡ鎖すなわちストランド
ａとｂとを示し、さらにストランドａにおける割目とス
トランドｌ）における間隙とを示すと共にこの間隙がＤ
ＮＡポリメラーゼ反応によシ閉鎖されることを示してい
る。

第２図は、本発明方法の好適具体例の略説明図であシ、
ディン粒子から単離された内生ＤＮＡの断片は大腸菌（
イー・コリ）ペニソリナーゼ遺伝子に対しプラズミドｐ
ＢＲ３−２２上のＰｓＬ　ｌ２３一 部位に融合される。イー・コＩＪＨＢ１０／に変異した
後、組換えＤＮＡ分子ｐＢＲｊ　２２−Ｐｓｔｌ　ｄＧ
　：　ＨＢＶ−Ｋｐｎ　ｌ　ｄＣはＨＢＶ抗原性を示す
ポリペプチドの合成に向けられる。

第３〜２図は、本発明により肝炎Ｂビールスゲノムの一
部について決定されたヌクレオチット順序を示している
。順序は、その上部に示された３つの読み枠における停
止コドンによシ示される。本発明で決定されたＨＢｃＡ
ｇをコード化する遺伝子については、開始コドンから任
意にナンバーが付される。ヌクレオチット−１０〜−／
はこの遺伝子に先行する主順序を示す。

ヌクレオチットｌ〜ｔ＜ｚりは肝炎Ｂビールス核抗原を
コード化する遺伝子につきヌクレオチット順序を示し、
この抗原のアミノ酸順序（読み枠／）はその順序の上部
に示される。ヌクレオチット／グ３７〜２／／≠は肝炎
Ｂｇ−ルス表面抗原の遺伝子につき決定されたヌクレオ
チット順序を示し、この抗原のアミノ酸順序（読み枠３
）はその順序の上部に示される。これら遺伝−２弘− 子における各種の制限エンドヌクレアーゼ識別部位につ
いても第３〜り図に示される。

第１Ｏ図は、本発明方法の略説明図であり、ここで肝炎
Ｂビールス核ｊｔ＆４４を示すポリペプチドを生産する
ことのできる組換えＤＮＡ分子は断片化され、この断片
は改善された表現制御順序、すなわち圧系に付加される
。

第１／図は、本発明方法の略説明図であり、ここで本発
明の組換えＤＮＡ分子は断片化されかつファージＤＮＡ
の断片に結合され、これは宿主細胞を溶菌させることに
よ少その中に遺伝子コピーの数を増加させる際に使用さ
れる。

第１２図は、本発明方法の別の具体例の略説明図であシ
、ここで肝炎Ｂビールス核ｔＩ４性を示すポリペプチド
を生産しない本発明の組換えＤＮＡ分子は断片化されて
ＨＢｓＡｇに対する構造遺伝子が除去され、この構造遺
伝子を使用して組換えＤＮＡ分子を生成させ、それによ
り適当な宿主においてＨＢｓＡｇを生産する。

本発明をさらに充分理解しうるよう、以下詳細に説明す
る。

以下の記載において、下記の用語を使用する。

ヌクレオチット：糖部分（ペントース）ト燐酸部分と窒
素系複素環塩基とからなるＤＮＡもしくはＲＮＡの単量
体単位。この塩基はグリコシド炭素（ペントースの／′
炭素）を介して糖部分に結合され、塩基と糖との結合物
はヌクレオシドである。塩基はヌクレオチットを特性化
する。μ種のＤＮＡ塩基はアデニン（”Ａ”）、クアニ
ン（“Ｇ”）、シトシン（”Ｃ”）およびチミン（”Ｔ
”）である。グ種のＲＮＡ塩基はＡｌＧ、Ｃおよびウラ
シル（”Ｕ”）である。

ＤＮＡ順序：隣接するペントースの３′炭素とｊ′炭素
との間のホスホジエステル結合によシ互いに結合された
ヌクレオチットの線状系列。

コドン：　　ｍＲＮＡを介してアミノ酸、翻訳開始信号
または翻訳終了信号をコード化する３種のヌクレオチッ
ト（トリプレット）のＤＮＡ順序。

たとえば、ヌクレオチットトリプレットＴＴＡ。

ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ，ＣＴＡおよびＣＴＧ　はアミ
ノ酸ロインン（“Ｌｅｕ″）をコード化し、ＴＡＧ、Ｔ
ＡＡおよびＴＧＡは翻訳停止信号であｐ、ＡＴＧは翻訳
開始信号である。

読み枠：　　ｍＲＮＡをアミノ酸順序に翻訳する際のコ
ドンのグループ化。翻訳の間、適正な読み枠は維持され
ねばならない。たとえば、＋Ｉｊｌ序ａＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＡＡＧ　　を３つの読み枠もしくは相において翻訳す
ることができ、その各々は異なるアミノ酸順序を与える
。すなわち、ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−ア
ミン基とカルボキシ基との間のペプチド結合により互い
に結合されたアミノ酸の線状系列。

ゲノム：物質の全ＤＮＡ０これは特に物質のポリペプチ
ドをコード化する構造遺伝子、ならびに作動子、促進子
およびたとえばシャインータ゛ルカ゛ルノ順序のような
順序を含むリホソーム結合および相互作用順序を包含す
る。

構造遺伝子：雛型またはメツセンジャーＲＮＡ（”ｍＲ
ＮＡ”）を介して特定ポリペプチドに特性的なアミノ酸
の順序をコード化するＤＮＡ順序。

転　写：構造遺伝子からｍＲＮＡを生成させる過程。

翻　訳：ｍ：ＲＮＡからポリペプチドを生成させる過程
。

表　現：構造遺伝子によシボリペプチドを生成させるた
めに受ける過程。これは転写と翻訳との組合せである。

プラスミド：完全「レプリコン」からなる非りロモソー
ム二重鎖ＤＮＡ順序であり、これによシブラスミドは宿
主細胞内で再現される。プラスミドを単細胞生物に入れ
ると、その生物の特性がプラスミドのＤＮＡの結果とし
て変化または変異する。たとえば、テトラサイクリン耐
性（Ｔｅｔ）についての遺伝子を担持するプラスミドは
従前テトラサイクリンに敏感であった細胞をこれに対し
抵抗性の細胞に変異させる。プラスミドにより変異され
た細胞を［変異体（ト２ｇ− ランスホーマント）Ｊと呼ぶ。

ビールスであり、その多くは蛋白質エンベロブもしくは
被覆（「カプシド」）中にカプセル化されたＤＮＡ順序
を有する。単細胞生物において、ファージは「トランス
２エク７ヨン」と呼ばれる工程により再現する。

主細胞中で再現しうるプラスミド、ファージＤＮＡまた
はその他のＤＮＡ順序であシ、これは１個または少数の
エンドヌクレアーゼ識別部位を特徴とし、この部位にお
いてこのＤＮＡ順序はＤＮＡの本質的な生物学的機能（
たとえば再現性）、被覆蛋白質の生成の喪失または促進
子もしくは結合部位の喪失を伴わずに決定可能に切断さ
れ、またこの部位は変異細胞の同定（たとえばテトラサ
イクリン耐性またはアンピシリン耐性）に使用するのに
適する印しを含有する。クローン用ベヒクルはしばしば
ベクターと呼ばれる。

クローン化（ｃＩｏｎｌｎｇ　）　：　　無性繁殖の過
程オチツド順序からなる混成りＮＡＩ序であり、第一の
順序は天然において第二の順序と一緒に調整するヌクレ
オチットのＤＮＡ順序。

次に、第１図を参照すれば、ディン粒子の内生ＤＮＡの
略図が示されている。デイン粒子は、肝炎Ｂビールス感
染し／＋患者の血漿中に検出される（ディー・ニス・デ
インおよびシー・エッチ・カメロン、「オーストラリア
−抗原に関する肝炎を持った患者の血清中におけるビー
ルス状粒子」、ランセット誌、第１巻、第６２よ〜６り
ｇ号（／り７０））。　この粒子は、肝炎Ｂの感染性ビ
ールス単位（ｖｉｒｉｏｎ　）と同一または密接に関連
すると考えられる。その大きさは知られているが（直径
≠λナノメータ）、その構造は充分には理解されていな
い。一般に、ディン粒子は外層と内核とからなると信じ
られる。粒子の外層は一般に、肝炎８表面抗原（”ＨＢ
ｓＡｇ”）として知られるポリペプチドを含有する。内
核（直径２７ナノメータ）は第二のポリペプチドすなわ
ち肝炎Ｂ核抗原（”ＨＢ　ｃ　Ａ　ｇ”　）ならびに、
；１ｉｙ、ｉｏ’ダルトンの内生二重鎖の円形ＤＮＡ分
子を含有し、これは種々な長さの単一ストランド間隙を
有する。第三のポリペプチド、すなわち”ｅ”抗原（”
ＨＢｅＡｇ“）もナイン粒子に関係する。さらに、デイ
ン粒子は内生ＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼを含む
と信じられ、これはそのＤＮＡをプライマ／雛型として
用いるポリメラーゼ反応によシ内生ＤＮＡ中の単一スト
ランド間隙を閉鎖する。デイン粒子、さらに詳しくはそ
のＤＮＡの構造および性質は幾つかの分析の主題である
（たとえばダブリュー・ニスーロビンソン、「肝炎Ｂビ
ールスのゲノム」、アニュアルφレビュー・オブーマイ
クロバイオロジー、第３７巻第３よ７〜３７７頁（ｌり
７７））。

しかしながら、各種の抗原凍たけその遺伝子の実際の構
造はまだ決定されていない。

−？ｌ− ディン粒子の内生ＤＮＡは、抽出によりデイン粒子から
単離されている。これは、小さな割目すなわちその中の
開口部を有する一定長さの１本のヌクレオチット鎖（第
１図、ストランドａ１〜３θθＯヌクレオチソド）と成
る程度変化しうる長さの第二のヌクレオチット鎖（第１
図、ストランド５１〜２０００ヌクレオチツト）とから
なっている。第二のストランドは第一のストランドに対
し補完的であシ、その割目を重ね合せて補完的塩基間に
おける水素結合によシ標準的ワトソンークリック方式で
円状構造を完成する。この重複部が第１図に見られる。

ディン粒子のＤＮＡポリメラーゼは、内生ＤＮＡの第二
ストランドをプライマとして使用すると共に第一ストラ
ンドを雛型として使用することにより種々の間隙を、第
一ストランドのヌクレオチットに対し補完的であるヌク
レオチットで埋めて約３０００ヌクレオチツト対の二重
鎖ＤＮＡを与えると思われる。

肝炎ＢビールスＤＮＡの調製方法 単一の）（ＢｓＡｇ陽性かつＨＢｅＡｇ陽性の供血者（
血清型ａｄｙｍ　）　　からのひと血清を等容量のＰＨ
７弘の緩衝液（０，／　Ｍ　）リス−ＨＣｌ、０．　／
　Ｍ塩水（ＮａＣＩ）、０．　／チの２−メルカプトエ
タノール、０．１％子牛血清アルブミン、ただしチは本
明細書中全てＷ／Ｖ％とする、およびＱ、００／ＭのＥ
ＤＴＡ）で希釈した。これをｐ℃にて３３．００Ｏｒｐ
ｍで２時間遠心分離した。かく得られたペレットを２０
０μｌの同じ緩衝液に再懸濁させ、２０％の蔗糖を含有
する遠沈管の頂部に層化させた。懸濁物を弘℃にて１１
０．００Ｏｒｐｍで２時間遠心分離した。かく得られた
ペレットを再び１００μｌのＰＨ７６の緩衝液（０，／
　Ｍ　）リス−ＨＣｌ、（１）、／Ｍ塩水）に再懸濁さ
せた。

次いで、得られたＤＮＡ含有のベレットを３Ｈまたは３
２ｐでラベルしくビー噂エム・カブラン等、「ひと肝炎
Ｂ抗原に関係するＤＮＡポリメラーゼＪ１　ジャーナル
・グイロロジー、第７．２巻第タタｊ〜１００６頁（ｌ
り７３））で、後の過程における追跡を容易にした。こ
のラベル化は、濃厚ディン粒子と３Ｈ−もしくは５２ｐ
−ラベルされたデオキシヌクレオシドトリホスフェート
（ｄＮＴＰ）との３７℃における≠時間の反応により得
られる。このＤＮＡポリメラーゼ反応の後、ＤＮＡ中の
単一ストランド間隙は部分的に閉鎖され（第１図参照）
、ラベル化された材料を蔗糖３０％含有の遠沈管の頂部
に層化させ、グ℃にて≠２，０００ｒｐｍで３．夕晴間
遠心分離した。

次いで、ＤＮＡを得られたベレットからフェノールによ
シ抽出した（エル・アイ・ルトウイツクおよびダブリュ
ー・ニス・ロビンンン、［肝炎Ｂディン粒子ＤＮＡポリ
メラーゼ反応で合成されるＤＮＡＪ、ジャーナル・グイ
ロロジー、第、！／巻第２６〜１０４Ｌ頁（／り７７）
の手順を使用）。次いで、抽出されたＤＮＡを０．０／
ＭトリスーＨＣｌ　、　０．００　／　ＭのＥＤＴＡの
溶液（ｐＨ、！’、　０　）で透析してフェノール溶媒
を除去した。かくして単離されたＤＮＡは制限酵素消化
に対して準備できた。これは〜／　０８ｃｐｍ／μＶの
比放射活性を示した。上記した方法を概略第２図に示す
。

上記のように単離した二重鎖ＤＮＡを無性増殖させるの
に、多種類の宿主−クローン用ベヒクル組合せ物を有効
に使用することができる。

たとえば、有用なりローン用ベヒクルはクロモソーム系
、非りロモンーム系および合成のＤＮＡ順序たとえば各
種の公知細菌性プラスミド（たとえばｐ　Ｂ　Ｒ３λ２
、その他イー・コリのプラスミドおよびそれらの誘導体
）、および広宿主範囲のプラスミド（たとえばＲＰ≠）
、ファ−ジＤＮＡたとえば多種のファージλの誘導体（
たとえばＮＭＪ’タタ）、およびプラスミドとファージ
ＤＮＡとの組合せ物から誘導されたベクター、たとえば
ファージＤＮＡ表現制御順序を使用するよう改変したプ
ラスミドを包含する。有用な宿主は細菌宿主たとえばイ
ー・コＩＪＸ／７７Ａ、イー　−コリＸ２２ｒ２、イー
−コリＩ（Ｂｌｏ／お＝３ター よびイー・コリＭＲＣ／およびシュードモナス、バチル
ス・ズブチリスおよびその他細菌の菌株、酵母菌および
その細菌類、動物または植物宿主（たとえば培養動物も
しくは植物細胞）、およびその他宿主を包含する。勿論
、全ての宿主が同等の効果をもつものではない。宿主−
クローン用ベヒクル組合せ物の特定の選択は、本発明の
範囲から逸脱することなく上記の原理を正当に考慮して
当業者が行なうことができる。

さらに、各特定ベクター中には、単離された二重鎖ＤＮ
Ａを挿入するため種々な部位を選択することができる。

通常これらの部位は、これらを切断する制限酵素すなわ
ちエンドヌクレアーゼによシ指定される。たとえば、ｐ
ＢＲＪ２２においては、Ｐｓｔ／部位はベニシリカーゼ
遺伝子中におけるベニシリナーゼ蛋白のアミノ酸／Ｊ’
／および／１２をコード化する。ヌクレオチットトリプ
レットの間に位置する。この部位は、ラッテプロインシ
ュリン決定子を示す蛋白質の合成の際上記のビラーコマ
ロフ等により用いらレタ。Ｈｉｎｄ　１１工ンドヌクレ
アーゼ識別部位は、アミノ酸１０／および１０２をコー
ド化するトリプレットの間に存在し、Ｔａｇ部位は１ｌ
ＢＲＪ、２．２におけるその蛋白のアミノＨｔａｒをコ
ード化するトリプレットに存在する。同様に、このプラ
スミドに対するＥｃｏ　ＲＩエンドヌクレアーゼ識別部
位は、それぞれテトラサイクリンおよびアンピシリンに
対する耐性をコード化する遺伝子の間に位置する。この
部位は、イタクラ等およびゲデル等により、上記した組
換えＤＮＡ合成法において使用された。第２図および第
１／図は、例示の目的でプラスミドｐＢＲＪＪ２および
ファージλＮＭりｒりにおける幾つかの制限部位を示し
ている。

選択ＤＮＡ断片をクローン用ベヒクル中に挿入して組換
えＤＮＡ分子を生成させるため選択される特定部位は種
々の因子により決定される。

これらは表現すべきポリペプチドの寸法および構造、宿
主細胞成分による内生酵素分解に７１する所望ポリペプ
チドの感受性およびその蛋白による汚染、たとえば閉止
および停止コドンの配置のような表現特性、ならびに当
業者に知られたその他因子を包含する。表現過程は充分
には理解されていないので、これら因子はいずれも単独
では特定ポリペプチドに関する挿入部位の選択を絶対に
制御しない。寧ろ、選択された部位はこれら因子をバラ
ンスさせる効果を有し、成る蛋白に対し必らずしも全て
の部位が同等の効果を示すものではない。

外来ＤＮＡをクローン用ベヒクル中に挿入して組換えＤ
ＮＡ分子を生成させるには幾つかの方法が当分野で知ら
れているが、本発明において好適な方法を第２図に示す
。これは、デイン粒子ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ
によシ開裂させ、開裂ＤＮＡの３′末端（ＤＮＡ糖骨格
のデオキシリボース炭素から便宜上名付けられる）にポ
リープオキシＣ順序を付加させ、そして伸長したＤＮＡ
をクローン用ベヒクルに結合させることを特徴とし、た
だしクローン用ベヒクルハ制御＋ｆｌエンドヌクレアー
ゼにより特定部位で切断されて、その切断の３′末端に
開裂ＤＮＡのポリーｄＣ順序に対し補完的なポリデオキ
シＧ順序を伸長させたものを使用する。ＤＮＡおよびク
ローン用ベヒクルの３′末端の補完的性質はこれら末端
の結合を可能にする。

本発明の方法において有用であるためには、ＨＩｊＶ、
ＤＮＡを開裂させるのに選択される制限酵素は、ＨＢＶ
抗原性を示すポリペプチドをコード化する遺伝子の必須
部分内においてＨＢＶ・ＤＮＡを開裂してはならず、特
に好適には制限された数の部位にてＤＮＡを開裂すべき
である。本発明で使用された制限酵素はＫｐｎ−１゜Ｂ
ｇｌ、［、Ｂａｍ−ＨＩ、ＡｖａｉｌおよびＥｃｏ−Ｒ
Ｉを包含する。その他の制限エンドヌクレアーゼも同様
に本発明において使用することができる。

これらの選択は、本発明の範囲を逸脱することなく、上
記した諸因子を考慮して当業者が行なうことができる。

第３〜り図は、ＨＢＶゲノムの一部における制限エンド
ヌクレアーゼ識別部位の幾つかを示している。

一３２＝ 勿論、ＤＮＡ順序をクローン用ベヒクル中に挿入して組
換えＤＮＡ分子を生成させるその他公知の方法も同等に
本発明において使用される。

これらには、たとえば同一の制限エンドヌクレアーゼを
使用してＨＢＶ、ＤＮＡとクローン用ベヒクルとを開裂
させるような直接結紮法が包含される。この方法は本質
的に補完的端部を結合に供する。

勿論、クローン用ベヒクルの選択制限部位に挿入された
ヌクレオチット順序または遺伝子断片は所望蛋白質に対
する実際の構造遺伝子の一部でないヌクレオチットを包
含し或いはその構造遺伝子の断片のみを包含することも
できると了解すべきである。と’ｍ１）ＮＡ西己ダリを
１申Ｘυでも変異された宿主はＨＢＶ抗原性を示すポリ
ペプチドを生産することｔｖ　２　ｂＮ”５ａ　９であ
る。２混成遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子を使用し
て宿主を変異させ、この宿主（変異体）が構造遺伝子ま
たはその断片を表現しかつ混成−≠Ｏ− ＤＮＡのコード化するポリペプチドまたはその一部を生
産するようにさせることもできる。また組換えＤＮＡ分
子を使用して宿主を変異させ、この宿主が再現性をもっ
て付加的な組換えＤＮＡ分子をＨＢＶ構造遺伝子および
その断片の源泉として生産するようにさせることもでき
る。これらいずれかの使用に対する適当な宿主の選択は
、当分野で知られた多くの因子により管理される。これ
らの因子には、たとえば選択ベクターとの適合性、共生
産物の毒性、所望ポリペプチドの回収容易性、表現特性
、生物学的安全性および価格が包含される。また、表現
のメカニズムは充分には理解されていないので、宿主の
絶対的選択をこれら因子のいずれか単独により特定の組
換えＤＮＡ分子またはポリペプチドについて行なうこと
はできないであろう。寧ろ、特定の組換えＤＮＡ分子の
表現に対・し全ての宿主が同等の効果を示しえないとい
う現実に鑑みてこれら因子をバランスさせねばならない
。

本発明の合成において、好適なりローン用ベヒクルは細
菌性プラスミドｐＢＲＪ２．２であり、そこの好適な制
限エンドヌクレアーゼ部位はＰｓｔ／部位である（第２
図）。このプラスミドは、抗生物質アンピアリン（Ａｍ
ｐ）およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）に対する耐性遺
伝子を担持する小さい（分子量約、２６メガダルトン）
プラスミドである。プラスミドは充分に特性化されてい
る（エフ・ポリヴアール等、「新規なりローン用ベヒク
ル１の構成および特性化。多目的クローン系」、ジーン
、第り！、／／３頁（／り７７））。本発明による好適
な宿主はイー・コリＨＢ　／　０　／である。

１、ｄＣ−伸長化したデイン粒子ＤＮＡの調製本発明の
好適具体例の実際的実施において、ディン粒子から上記
のように単離したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＫｐ
ｎ　ｌ　（／　ＯｍＭのトリｙ、　−ＨＣｌ　（ｐＨ７
ｊ　）、／　Ｏ’ｍＭのＭｇＣｌ２．１０ｍＭの２−メ
ルカプトエタノール、≠ＯｍＭのＮａＣｌ、０４μｍの
酵素調製物１ｏｔｔｌ中のＤＮＡ約ＪＯｎ、９）によ、
！１ｌ１３７℃にてり０分間消化させ、制限酵素を７０
″Ｃ，ｓ分間の加熱により不活性化させた。ポリープオ
キ７Ｃ順序（例示の目的で第２図にはＣＣＣとして示ス
）を、フェノールおよびクロロホルム（各２０μｌ）で
の抽出により残留蛋白質を除去した後、ポリヌクレオチ
ド末端トランスフェラーゼとの標準的反応により消化生
成物の３′末端に付加させた。エーテルでの抽出により
フェノールを水相から除去し、３Ｍの酢酸ナトリウム、
ＰＨ＋、−ｔ（ｊμｌ）と冷エタノールｏ、　／　ｍｌ
との添加によりＤＮＡを沈殿させた。−７０℃に７時間
保った後、沈殿ＤＮＡを／　Ｑ、０００　ｒｐｍで２０
分間遠心分離して回収し、このペレットを１０ｍＭのト
リス−ＭＣＩ、ｐｉ（Ｉｔ（１０μｌ）中に溶解させた
。

これに３μｌのｌＡＯＯｍＭカコジル酸カリウム（ＰＨ
７０）と≠ｍＭの塩化コバル・１・とグｍＭのデオキン
７トシントリホスフエート （ｄＣＴＰ）と２００　μｇ／ｍｅの子午面（＋’ｔア
ルブミンとを加え、混合物をｏ、　ｓ　ｔｉｅのボリヌ
ー弘３− クレオチツド末端トランスフェラーゼ（ｔｏｏｏｕ　／
ｍｅ）　　と共に、２７℃にて７０分間培養しそしてｊ
　ＯｍＭのＥＤＴＡ（／μＪ）を添加して反応を停止さ
せた。

３２２の調製 プラスミドｐＢＲｊ、！、２を制限エンドヌクレアーセ
ｐｓｔ　ｌ　　（これに対しプラスミドは１つの目標を
有する）により消化し、この生成物をＨＢＶ、ＤＮＡに
ついて上記したようにフェノール抽出およびエタノール
沈殿によシ精製した。ボＩＪ　−ｄ　Ｇ順序（例示の目
的で第２図にＧＧＧとして示す）を、ＨＢＶＫ対するポ
ＩＪ−ｄＣ順序の付加について上記したように、末端ト
ランスフェラーゼによシ線状ｐＢＲＪ、２．２の３′末
端に付加させ、ただしこの場合反応は３７℃にて行なっ
た。

−弘≠− とＨＢＶ、ＤＮＡ−ポリ−ｄＣとを混合し、補完的順序
を１００ｍＭのＮａＣｌ　、　　ｊ　ＯｍＭのトリス−
ＨＣＩ（、Ｉ］７ｊ）、ｊｍＭのＥＤＴＡ（ＴＮＥ）（
ｒＯμｌ）中にて６５℃で７時間、次いで弘７°Ｃで７
時間、３７℃で７時間および２０℃で１時間培養するこ
とにより結合させ、そして等容量のＴＮＥと２０μｌの
１００ｍＭのＭｇＣｌ　２．１００ｍＭのＣａＣｌ２．
１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７５）とを加えた
。

４、　イー俸コリＨＢ　／　０　／の変異変異に適した
イー・コリＦＩＢ１０／の培養物を、イー・エム・レー
ダーペルクおよびニス・エッチ・コーヘンによシ［プラ
スミドデオキシリボ核酸によるサルモネラ・チフイムリ
ウムの変異」、ジャーナル・バクテリオロジー、第１１
り巻、第７０７２〜１０７≠頁（／り７グ）に記載され
ているように調製した。

細胞の０．　／　ｍ２部をアニールされたＤＮＡ調製物
、２ｊμｌと混合し、θ′″Ｃで、２０分間培養し、次
いで２０℃にて７０分間培養した後、テトラサイクリン
（！０μｙ　／ｍｔ：　＞　を含有するＬ−寒天板上に
塗床して３７℃で一晩培養した。

プラスミドｐＢＲＪ２．２はテトラサイクリン耐性につ
いての遺伝子含有するので、このプラスミドにより変異
されたイー・コリ集落は、このように変異されなかった
イー・コリ集落を除いて、この抗生物質を含有する培養
物中で増殖するであろう。したがって、テトラサイクリ
ン含有の培養物における増殖は適切に変異された宿主の
選択を可能にする。

ング 培養されたテトラサイクリン含有り一寒天板上に増殖し
た細菌集落をアンピシリンに対する感度について試験し
た。プラスミドｐＢＲＪ、２２はアンピシリン耐性につ
いての遺伝子を有する。この遺伝子は混成遺伝子挿入の
提案部位である。したがって、選定識別部位に挿入され
たＤＮＡを有するプラスミドにより変異された集落はア
ンピアリンに対し感受性であるが、テトラサイクリンに
対する耐性を保持するであろう。アンピシリンに対し感
受性であるがテトラサイクリンに対し耐性であったイー
・コリ集落を、テトラサイクリンを含有するＬ−寒天板
上に支持されたミリボア硝酸セルロースフィルターの円
板の上に載置した。３７℃で一晩増殖させた後、このミ
リポアフィルタ−をテトラサイクリンとクロラムフェニ
コール（／　ｊｏ　ｔｔｌ　／ｍｅ）とを含有する新た
なし一寒天板に移し、３７℃にてさらに数時間培養して
細胞内のプラスミドのコピー数を増加させた（第１図）
。次いで、エム・グルンスタインおよヒテイーψニス・
ホグネスにより「集落交雑化：特異遺伝子を含有するク
ローン化ＤＮＡの単離方法」、プロシーデイング拳ナシ
ョナルｅアカデミ−・サイエンス、Ｕ、Ｓ、Ａ、第７２
巻第、３りｔ／〜３りｔｊ頁（／り７ｊ）に記載されて
いるように、集落交雑化のため、前記で調製した３２ｐ
−ラベルされたＨＢＶ−ＤＮＡを試料として一≠７− ミリポアフィルタ−を使用した。フィルターのラジオオ
ートグラフは、標準ＨＢＶ−ＤＮＡに対し補完的なりＮ
Ａ順序を含有する集落の存在を示した。

テトラサイクリンに耐性であシ、アンピシリンに感受性
であシかつ標準ＨＢＶ−ＤＮＡで交雑化した集落を、Ｈ
ＢＶ抗原特異性すなわち抗原性を示す少なくとも７種の
ポリペプチドを生産する能力について試験した。ここで
も集落を、テトラサイクリン含有のＬ−寒天板上に支持
されたミリポアフィルタ−の上に載置し、３７℃で一晩
培養した。バクテリオファーシュλヴイルの発病株を感
染させた（感染度約／の倍率）イー・コ＋）ｃｔｏｏの
培養物（軟質寒天２ｍｌ中０．　／　ｍｌ）を有する第
二のＬ−寒天板で覆い、３７℃で一晩培養し、その際細
菌叢は総合的にファージ（λヴイル）により溶菌された
（すなわち、実質的に全て一４’♂− の宿主細胞壁が破裂した）。本発明により変異された細
胞を含有するミリポアフィルタ−を板から釣り上げ、集
落を下面としてλラベルで溶菌されたイー・コリＣｔＯ
θのＬ−寒天板の表面に接触させた。この接触を約７０
分間続けて、ミリポアフィルタ−上に存在する細胞のλ
ラベルによる感染を行なわせた。

次いで、ミリポアフィルタ−をＬ−寒天の新だな板に移
し、３７℃十さらに５時間培養した。その間、ニス・プ
ルームおよびダブリュー・ギルバートによシ「特異的翻
訳生成物を検出する免疫学的スクリーニング方法」、プ
ロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス
、Ｕ、Ｓ、Ａ、第７ｊ巻第２７ｔ６〜２７≠り頁（／り
７Ｊ’）に記載されているように、ＨＢＶ抗体でポリビ
ニル円板を被覆した。

変異した細菌集落が明白に溶菌し・たミリポアフィルタ
−をその集落につき被覆ポリビニル円板と接触させ、＜
ｚ℃に３時間保った。この接触の結果、ミリポアフィル
タ−上の細胞から浴出したＨＢＶ抗原は全て円板のＨＢ
Ｖ抗体と結合する。被覆円板をミリポアフィルタ−から
分離し、次いで洗浄して１２５Ｉ−ラベルされたＨＢＶ
抗体と共に培養した。この培養の結果、ミリポアフィル
タ−からのＨＢＶ抗原が円板のＨＢＶ抗体によシ事前に
結合されてしまった円板上の個所が放射活性となる。

洗浄後、上記ブルームおよびギルバートにより記載され
ているようにラジオオートグラフィーにかけると、ＨＢ
Ｖ抗原特異性を有するポリペプチドを生成した集落はラ
ジオオートグラフにより位置確認された。

ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドとそれをコード化する
構造遺伝子および断片と・を、人間におけるＨＢＶ抗体
の存在を検知ししたがってこのビールスにより感染され
た人間および血液試料を識別するよう設計した方法およ
び装置に使用することができる。

たとえば、本発明の組換えＤＮＡ分子により変異された
宿主により生産されるＨ　Ｂ　ｃ　Ａ　Ｋを、肝炎Ｂビ
ールス検知のため現在利用しうる免疫学的診断試験、す
なわち放射性免疫分析法またはエリザ（ＥＬＩＳＡ、酵
素結合免疫吸着分析法）、に使用することができる。放
射性免疫分析法の一型式においては、実験動物中に成育
させた抗−核抗原抗体を固体相、たとえば試験管の内側
に付着させる。次いで、この試験管にＨＩ３ｃＡｇを加
えて抗体と結合させる。抗原−抗体複合物により被覆さ
れたこの試験管に、患者血清の試料と共にたとえば放射
性沃素のような放射性同位元素でラベルしたＨＢＶ抗−
核抗体の既知量を添加する。患者血清中のＨＢＶ抗体は
、抗原−抗体複合物の遊離結合部位に対しラベル化抗体
と競合するであろう。血清を作用・させた後、過剰の液
体を除去し、試験管を洗浄しそして放射活性の量を測定
する。陽性の結果、すなわち患者血清がＨＢＶ抗体を含
有するという結果は。

−ｆ／− 低放射計数によって示される。エリザ試験法の−型式に
おいては、マイクロ滴定板を）ｔＢｃＡｇで被覆し、こ
れに患者血清の試料を加える。抗体と抗原とを反応させ
る培養期間の後、板体を洗浄しそして実験動物で成育さ
せかつ酵素ラベルに結合させた抗−ひと抗体の調製物を
加え、培養して反応を生ぜしめ、次いで板体を再洗浄す
る。その後、酵素基質をマイクロ滴定板に加え、酵素を
基質に作用させる期間培養しそして最終調製物の吸着率
を測定する。吸着率における大きな変化は陽性結果を示
す。

本発明のイー・コリにおける組換えＤＮＡ分子から翻訳
された抗原性ポリペプチドの生物学的活性を試験するた
め、ＨＢｃＡｇを表現するために示した細菌細胞の無菌
抽出物を・、等容量のフインド補助液と混合した後、兎
に注射した。

２匹の動物には粗製の細菌抽出物を与え、また２匹の動
物には同じ抽出物の試料をセフアデノクスｔｓｏカラム
での分画の後に加えた。さらに、凍結および貯蔵した（
充分な抗原活性を保持する）同じ試料の注射を、最初の
注射から２週間後およびｊ週間後に与えた。これら動物
を、最初の注射から数週間後、時間間隔を置いて出血さ
せた。

オー・オウチタロニーにより「免疫拡散および免疫電気
泳動」、・・ンドブツク・オブ・エキスペリメンタル・
イミュノロジー（ディー・ダブリュー・ウェア編、ブラ
ックウェル・サイエンティフィック出版社、オツクスフ
オート・およびニシンバラ）、第１り章（／りＡ７）に
記載された方法を用いて免疫拡散実験を行ない、兎血清
（抗体）をひと肝臓から得られたＨＢｃＡｇを使用して
ひと肝炎Ｂビールス核抗体（”ＨＢｃＡｂ“）と比較し
た（ビー・リュー・コーヘンおよびワイ・イー・コサル
ト、［肝炎Ｂ核掟原に対する抗体のスクリーニング試験
の応用］、ジャーナル・クリニカル・バソロジー、　第
３ｏ９第７０７〜７／３頁（／り７７））。弘匹の兎の
血？＋＋を全ては、人間から得られたＨＢｃＡｇとＨＢ
ｃＡｂとの間に形成されたものと同一の、ＨＢｃＡｇを
有する沈降素ラインを与えた。したがって、本発明の組
換えＤＮＡ分子を用いてイー・コリ中で合成した核抗原
は生体内において血清学的に活性である。この活性は、
微生物細胞中で合成されたビールス抗原を用いる組成物
および方法を人間における抗体形成の刺戟のために使用
しうろことを確立した。この種の組成物および方法は、
本発明で製造された組換えＤＮＡ分子により変異された
宿主が生産するポリペプチドを特徴とする。これらのポ
リペプチドは、単独に或いは人間におけるビールス感染
の処置および予防のだめの組成物および方法に使用され
る当分野で認められているたとえば食塩溶液または他の
添加剤の如き周知の医薬上許容しうる担体と共に、使用
されるであろう。

前記したように、本発明の組換えＤＮＡ分子を製造する
には、上記ｆ（ｐｎ　ｌ／Ｐｓｔ　ｌ　組合せ物思外の
制限酵素も有効に使用することができる。プラスミドｐ
ＢＲＪ２．２およびＨＢＶゲノムの一部における他の制
限部位をそれぞれ第２図および第３図に示す。これらの
代案となるが余り好適でない具体例を説明するため、以
丁に実施例を示す。

Ｂａｍ　−ＨＩ、　Ｅｃｏ−ＲＩ、Ｂｇｌ　−１ｌ−Ｐ
ｓＬ　１組合せＫｐｎｌによシ生成されたものとは異な
り、ル徂・Ｈｌ、旦製・Ｒ１およびシリ・１の使用によ
り生成されたＨＢＶ−ＤＮＡ断片は、短かいよ′−単−
ストランド突出部が存在するため、直接に末端結合させ
ることが便利にできなかった。したがって、これらは、
３′末端にポリーｄＣ順序を付加させる前に、λエキソ
ヌクレアーゼで処理して上記突出部を除去した。これは
、制限されたＤＮＡ　（前記したように１０ｔｔｌの溶
液）を／ｊμｌの７００　ｍＭグリシン酸すトリウム（
ＰＨ９，６）、１０ｍＭのＭｇＣ’＋２、／　Ｑ　Ｏｔ
ｔ９７ｍｅの子牛血清アルブミン、ｊμｌのλエキソヌ
クレアーゼと共にＯ″Ｃにて７５時間培養することによ
り行なった９、次いで、混合物をフェノールとＳＳ− クロロホルムとで抽出し、工程を続けた。Ｂａｍ・Ｈｌ
を使用した調製物の場合、後の放射免疫分析法によりＨ
ＢＶ抗原特異性を有するポリペプチドの生成を確認した
。

上記したようにＤＮＡ断片を末端結合させる代りに、本
発明の方法において遺伝子断片の直接的結紮を用いるこ
とができる。たとえば、別（７）　−２ｓｏｙｉｒｗ物
ニオイテハ、ＨＢＶ、ＤＮＡ（２０ｎｇ）を１０ｍＭの
トリス−ＨＣＩ　（ｐＨ７ｊ；　）、１０ｍＭのＭｇ　
Ｃｌ　２．１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、ｊ　
ＯｍＭのＮａＣｌ　（／　ＯＩｌｌ　）中において制限
エンドヌクレアーゼＥｃｏ−ＲＩまたはシニ・ＨＩによ
り３７℃にてＡよ時間制限化処理し、同一条件下で同一
酵素と共に培養された過剰のｐＢＲ３２２と混合した。

濃厚緩衝溶液〔ｔｚＯｍＭのトリス−ＭＣＩ　（ｐＨ７
ｊ　）、／　００　ｍＭのＭｇＣｌ２　、　　／　Ｏｍ
ＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭの！−ノ／Ｌ、カプトエタノ
ール、’７００　ｍＭのＮａＣ１、／−ｊ乙− ｍ　ＭのＡＴＰ〕（２μｌ）を加え、この混合物をＴグ
・ＤＮＡリガーゼ（ｏ、ｓμ／）と共に１０℃で３時間
、次いで０℃で少なくとも２弘時間培養した。この浴液
を１０ｍＭのトリス−ＨＣＩ（Ｐｌ−１７５）により０
．　／　ｍｅに希釈し、前記したようにイー・コリＨＢ
１０／の適当な培養物を変異させるのに使用した。と、
ＨＩ調製した組換えＤＮＡ分子の場合、交雑化に対する
スクリーニングの前に、集落をアンピシリンに対してで
なくテトラサイクリンに対する感度について試験した。

何故なら、ｐＢＲｊＪλ中のＢ＋ｏｎ・ＨＩの目標はテ
トラサイクリン耐性をコード化する遺伝子内にちゃ、し
たがってこの識別部位において」二手に挿入すればＰｓ
ｔ１部位における挿入の場合と同様にアンピシリン耐性
でなくテトラサイクリン耐性の喪失が生ずるからである
。

旦ユ・ＲＩ部位を介して調製された組換えＤＮＡ分子の
場合には、交雑化についてのスクリーニングの前に、集
落をアンピシリンとテトラサイクリンとの両者に対する
耐性につき試験した。

何故なら、ｐＢＲ３２２中のＥｃｏ・ＲＩの目標はテト
ラサイクリンとアンピシリンとの耐性をコード化する遺
伝子間に存在し、したがってアンピシリンまたはテトラ
サイクリンの耐性に関する遺伝子の不活性化はこの部位
における混ｆｉｙ、ＤＮＡ挿入の除虫じないからである
。

本明細書中に記載した方法で調製された微生物は、／り
７ｒ年７２月／夕日にボートンダウン在のカルチャー・
コレクション・オプ・ザ・マイクロバイオロジカル・リ
サーチ・エスタブリツシュメントに寄託されかつｐＢＲ
Ｊ、２．２−ＨＢＶ−Ａ、Ｆとして同定された培養物に
よシ例示される。

詳細には、これら培養物の特徴は次の通シである。

これらと同一の培養物の一部を、／り７り年／２月／り
日にスコツトランド、アバディーン在ノカルチャーーコ
レクション・オブ・ザ・ナショナル・コレクション働オ
ブ◆インダストリアル・バクテリアにも寄託した。

培養物に対する上記命名は、次のような培養物の記載で
ある。宿主／クローン用ベヒクル−クローン用ベヒクル
中の制限部位であって、伸長ヌクレオチット（もし存在
すれば）を示す；肝炎Ｂビールス中の肝炎Ｂビールス制
限部位であって、伸長（もしあれば）を示すニーテトラ
サイクリン（Ｔｅｔ）およびアンピシリン（Ａｍｐ　）
に対する耐性（Ｒ）または感受性（Ｓ）二上記の集落交
雑化試験におけるＨＢＶ、ＤＮＡに対する陽性交雑化（
ＨＢ　Ｖ”）および上記のＨＢＶ抗原性十 を示すポリペプチドの生産（ＶＡ　　）。この命名を用
いれば、培養物ｐＢＲｊ、２２−ＨＢＶ−Ａは、プラス
ミドとして組換えＤＮＡ分子を含有するイー・コリＨＢ
１０／培養物を示し、この組換えＤＮＡ分子はＰｓｔ１
部位で開裂されかつ３′末端にボＩＪ　−ｄＧ端部が伸
長化されたｐＢＲ３２２からなり、さらにＨＢＶ、ＤＮ
ＡはＫｐｎ、　ｌによシ開裂されかつ３′末端にポリ−
ｄＣ端部が伸長化されており、また培養物はテトラサイ
クリン耐性とアンピシリン感受性と陽性のＨＢＶ・ＤＮ
Ａ交雑化試験とを示すと共にＨＢＶ抗原性を示すポリペ
プチドを生産する。

勿論、混成微生物、組換えＤＮＡ分子およびポリペプチ
ドならびにこれらに応用しうる本発明の方法は、上記の
好適具体例のみに限定されるものでないこ吉を了解すべ
きである。寧ろ、混成生物、組換えＤＮＡ分子およびポ
リペプチドは生産の途上でまたはその後に公知方法によ
り有利に改変することができる。たとえば、より効果的
な表現制御順序を利用してＨＢＶ遺伝子または混成遺伝
子の転写を得ることができ、捷だ望ましくない遺伝子生
成物の合成を減少させるよう突然変異を導入することが
でき、また宿主細胞中のプロテアーセレベル全減少させ
ることもでき、さらにＨＢＶ遺１尺子を含有する熱誘導
性リゾゲンを宿主クロモンーム中に一体化させることが
でき、或いはその他の改変および手順を行なって細胞中
の遺伝子コピーの数を増加させたり所望ポリペプチドを
生産する細胞の生産性を増大させたシすることもできる
。

ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドを生産させるためのそ
れらの使用の他、本発明の混成微生物は、肝炎Ｂビール
スに対するゲノムの全部または一部を含有する大量のＤ
ＮＡを生産するのにも有用である。たとえば、細胞濃度
が適当なレベルに達した時成育培地にクロラムフェニコ
ールを添加することによる増殖、或・いは突然変異を用
いてＨＢＶ順序を含むバクテリオファージヒブリドにお
ける溶菌を防ｔｌ−することは、従来得られなかった量
のＨＢＶ−ＤＮＡの製造を可能にする。

このように製造されたＨＢＶ、ＤＮＡを使用して、ゲノ
ムのヌクレオチド順序を決定することができ、これから
遺伝子ならびにＨＢＶ抗原および構造遺伝子自体のアミ
ノ酸順序を決定することができる。これら順序の知見は
、肝炎Ｂビールスの生物学を理解する上で役立ち、また
上記した改変を最も有利に用いることを可能にする。

上記の方法によシ製造された、固相放射免疫分析法によ
シ検出されるようなＨＢｃＡｇの合成能力を宿主細胞に
付与する一連の組換えＤＮＡ分子を順序分析のために使
用した。断片を適当な制限酵素での消化によ・シこれら
組換えＤＮＡ分子から調製し、この断片をそのｊ′末端
に〔α−３２Ｐ’１ＡＴＰとＴ４’ポリヌクレオチドキ
ナーゼとでラベルしｆｃ、ｕ次いで各断片のヌクレオチ
ット順序を周知の化学的分解法により決定した（ニー・
エム・マキサムおよびダブリューψギルバート、ＦＤＮ
Ａの新規な順序決定方法」、ブロアーディング・す７ヨ
ナル・アカデミ−・サイエンス、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

第７グ巻ｉｇＪｔＯ〜ｊＡＩＩ頁（／９７７））。

得られたヌクレオチット順序を第３〜夕図に示す。参考
のため、順序には核遺伝子のＡＴＧ翻訳開始コドンのＡ
からナンバーを伺する。

ＨＢｃＡｇに関する遺伝子のヌクレオチント順序および
この遺伝子から引出されるポリペプチドのアミノ酸順序
（読み枠ｌ）を第３〜り図においてヌクレオチット／〜
Ｓ＜ｔりの間に示す。この遺伝子によりコード化される
ポリペプチドの寸法は、デイン粒子からの核抗原につい
て観察された分子量／９０００に近いものである。しか
しながら、この・構造決定は、若干のアミノ酸が標準抗
原の生成の際生体内でこのポリペプチドのアミン末端か
ら切除されうる可能性を排除しない。さらに、この構造
は、他のひと酵素たとえば蛋白質をグリコツル化（ｇｌ
ｙｃｏｓｏｌａＬｅ　）するような酵素との相互作用に
よりもたらされるポリペプチドへのその他または追加的
改変をも考慮に入れない。

したがって、ここで決定されたポリペプチド構造は生体
内に見出されるＨＢｃＡｇとは同一で々いが、免疫反応
については同一でないにしろ極めて類似するであろう。

検査した組換えＤＮＡ分子の全ては挿入されたＨＢＶ、
ＤＮＡを有したので、核抗原遺伝子はｐＢＲＪ２２のペ
ニシリン耐性に関する遺伝子と同じ翻訳相に維持された
。さらに、各種の組換え物において、ＨＢＶ、ＤＮＡ挿
入物は１（ＢＶ順序における同じ位置の１個もしくは２
個のヌクレオデッド内で始まった。これら組換えＤＮＡ
分子は各種の制限酵素（たとえばＢａｍ−ＨＩおよび４
己・■）で消化されたＨＢＶ、ＤＮＡから生じたので、
この独特な付加は驚異的であシかつナイン粒子の内生Ｄ
ＮＡにおける割目でのＨＢＶ−ＤＮＡの偶発−Ａ〃− 的破ｉｇ′ｒｉたはポリヌクレオチド末端結合から生じ
たのであろう（第１図）。異なる翻訳相中にＨＢＶ−Ｄ
ＮＡ挿入物を有する組換えＤＮＡ分子はＨＢｃＡｇ遺伝
子を表現せず、またこの種の組換えＤＮＡ分子により変
異された宿主にはＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドが検
出されなかった。勿論、この種の非遺伝子表現宿主およ
び組換えＤＮＡ分子も本発明によりＨＢＶ、ＤＮＡを生
産するのに有用である。

ＨＢＶ−ＤＮＡ挿入物の表現を介して生成されたＨＢｃ
Ａｇ４たけその断片は少数のグリシン残基を介してペニ
シリナーゼ耐性に関する遺伝子の生成物（β−ラクタマ
ーゼ）に融合するであろうことが予測されたが、実際に
はそうでｋかった。寧ろ、各場合にβ−ラクタマーゼは
ｊ−４個のグリシンを介して同一のペプチド順序に融合
されたが、この順序は２ｔ個のアミノ酸の後に終端した
。この読み枠（枠／、第３図）において、停止コドン（
ＴＡＧ）に次いで３個のヌクレオチットが続き、その後
に開始コドンが続き、そこから翻訳が妨げられずに続い
てペプチドに１１３個のアミノ酸の長さを与える（第３
〜ｇ図）。

したがって、核抗原活性は、組換えＤＮＡ分子から転写
されたｍＲＮＡ内のｆ（ＢＶ順序により初めから翻訳さ
れた約、２’／、０００ダルトンのポリペプチド中に存
在する。このポリペプチドは宿主細胞内に残存しない。

何故なら、これはＨＢＶ・ＤＮＡ挿入物の停止コドンお
よび開始コドンの配置により分泌ペニシリナーゼ担体蛋
白質に結合されないからである。

２、肝炎８表面抗原 ＨＢｓＡｇに対する遺伝子のヌクレオチット順序および
この遺伝子から生ずるポリペプチドに対するアミノ酸順
序（読み枠３）も、第６〜ｇ図においてヌクレオチット
／’１３７〜２／／弘間に示される。このポリペプチド
のアミノ酸順序はＮ末端から始まって順序ｍｅｔ−ｇｌ
ｕ　−ｏｓｎ　−ｉ　ｌｅ　−Ｌｈｒ　−ｓｅｒを有す
る。この最初のアミノ酸順序は、ティー・エル・ビータ
ーンン等、「肝炎８表面抗原の２つの主成分ポリペプチ
ドの部分的アミノ酸順序」、プロ７−ゾイングーナ／ヨ
ナル・アカテミー・サイエンス、Ｕ、Ｓ、Ａ、、第７を
巻量１ｊ３０〜／、ｆ３／１．頁（／Ｐ７７）により、
標準ひとＨＢｓＡｇから決定された。この蛋白質のアミ
ノ酸順序は第乙〜ｒ図において停止コドンまで２２６個
のアミノ酸を続ける。この２２６ポリペプチド順序は２
５’１００ダルトンの蛋白質に相当する。

ＨＢｓＡｇのアミノ酸および長さは、ピー・バレンツエ
ラ等、「肝炎Ｂビールス表面抗原の主要蛋白質をコード
化する遺伝子のヌクレオチット順序」、ネーチャー誌、
第２１０巻、第ｆ　／　１ｔ−４／り頁（／り７り）に
より、適当な組換えＤＮＡ分子を順序決定することによ
り単独に確認された。

本発明の組換えＤＮＡ分子について決定されたヌクレオ
チット順序は、ＨＢ　”ｉＡ　ｇ　Ｋ対する遺伝子を表
現した検査されたもの全てが適当な宿主細胞内に表現さ
れることを期待する位置にＨＢＳＡｇに対する遺伝子を
持ち得ないことを示す。事実、ＨＢｃＡｇに対する遺伝
子を表現することが見出されたプラスミドにより変異さ
せた細胞の抽出物には、ＨＢｓＡｇは検出されなかった
。しかしながら、上記したように、これら遺伝子のヌク
レオチット順序の知見は、表現過程の改変が収率と効果
とを向上させかつ遺伝子の表現と従来表現もしくは検出
されなかったポリペプチドの生産とを容易化するのを可
能にする。

これら抗原の遺伝子およびアミノ酸順序は、細菌細胞当
シの抗原または遺伝子の生産レベルを高める方法を設計
する際有用である。

蛋白質の生産レベルはλつの主要因子により支配される
。すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数とこれら遺伝子
コピーを転写かつ翻訳する効率とである。転写および翻
訳（これは表現を６ｇ− も含む）の効率は、通常所望のコード化用順序の前方に
位置するヌクレオチット順序に依存する。これらのヌク
レオチット１１１序または表現制御、順序は、特にＲＮ
Ａポリメラーゼが相！ｊ反応して転写（促進子順序）を
開始しかつリポソームがｍＲＮＡ（転写の生成物）と結
合かつ相互反応して翻訳を開始する位置を規定する。こ
の種の表現制御順序全てが同等の効率をもって機能する
ものではない。したがって、隣接するヌクレオチット順
序から所望蛋白質に対する特異的コード化順序を分離し
、これらを公知の表現制御順序に融合させてよシ高度の
表現レベルを得ることが有利である。これは達成されて
おυ、新たに処理されたＤＮＡ断片を多コピープラスミ
ドまたはバクテリオファージ誘導体中に導入して、細胞
内の遺伝子コピーの数を増加させそれにより表現蛋白質
の収率をさらに改善することができる。

例示の目的で、　ＨＢｃＡｇの遺伝子について決定した
順序をこのようにして用いて、イー・コリにおけるＨＢ
ｃＡｇの生産を改善した。その一つの過程を第１Ｏ図に
示す。

第３図におけるＨＢｃＡｇについてのＤＮＡ順序を点検
すると、この遺伝子はヌクレオチット−，２／；ＫＡｌ
ｕ−１に対スル目標（ＡＧＣＴ）ｆ鳴し、ヌクレオテッ
ド２２および／よりＯＫ　Ｅｃｏ・ＲＩ　　に対する目
標を有し１．２０りにＥｃｏ−Ｒ１１に対する目標（Ｃ
ＣＴＧＧ）、２１０に二・■に対する目標（ＧＧＣＣ）
また２≠２およびグ６／にΔ巳・■に対する目標（ＧＧ
ＡＣＣ，ＧＧＴＣＣ）を有することが判る。この複雑性
が与えられると、核抗原コード化順序をよ逆効果的な表
現制御順序に２段階で移行させるのが便利である。

たとえば、本発明により製造されて約２３６０塩基対（
ヌクレオテッド）、すなわち第３図のヌクレオチット−
ど０〜約２２７０のＨＢＶ・ＤＮＡ挿入物を有する組換
えＤＮＡ分子をＡｕ・＊ １およびＥｃｏ−、Ｒ１で消化するよ、特にヌクレオチ
ット−２乙と２２との間に断片（断片Ａ）を与える一方
、旦輩声１　の単独消化はヌクレオデッド、２３〜／ｊ
ｇりに断片（断片Ｂ）を与えかつヌクレオテッド２３〜
６７６における断片（断片Ｂ’）の収率を低くする。こ
れらの断片は第３〜を図を参照して容易に確認すること
ができ、第７０図に図示する。断片ＡおよびＩ３はゲル
電＊ 気泳動により分別精製され、それらのＥｅｏ・Ｒ１を介
して端部結合し、合体断片（断片Ｃ）を与える。次いで
、必要に応じ断片Ｃを直接結紮により新たな表現制御順
序に付加させ、前記したようなＢ′端部結合法を介しま
たは合成的オリゴ−ヌクレオチット結合を介して正しい
翻訳相を維持する。この付加はよシ良好な表現制御順序
を使用して蛋白質生産を改善させるだけでな（、ＨＢｃ
Ａｇをコード化する遺伝子断片を表現制御順序自身によ
シ近接して付加させそれによシその遺伝子断片の表現の
制御を向上させることも可能にする。同様にして、断片
人およびＢ′を合体させ、または多くの他の調製断片を
合体させ、得られた断片を上記のように使用することが
できる。この方法は、特定ポリペプチドをコード化する
構造遺伝子の７部のみを本発明の組換えＤＮＡ分子（ｐ
ＨＢＶ／／≠）に使用する需要があることを示している
。

選択された遺伝子断片の特定表現制御順序と開始コドン
との間の距離をさらに短縮するため、特定断片をその末
端でまたは末端近くで特異的に作用するヌクレアーゼの
組合せ物によシ軽く処理するかまたはエキソヌクレアー
ゼおよびポリメラーゼ結合修復反応に使用して、断片の
開始コドンに先行する断片のヌクレオチットの全てまた
は幾つかを除去することができる。或いは、ヌクレオチ
ット−２ｚおよび３０で開裂して生ずるたとえばＡｉｕ
　−１断片のような断片を同様にエキンヌクレアーゼ処
理またはポリメラーゼ結合修復反応によシ短縮させ、次
いでＥｃｏ−ＲＩ　　で開裂させてヌクレオチット−２
ｔおよび／とヌクレオチット、２２との間から断片をも
たらし、断片Ｂに融合させた後に表現制御順序に付加さ
せることができる。別の経路は断片Ｂまたけ同等の断片
の交雑化を包含し、これはＤＮＡポリメラーゼおよび限
られた数のヌクレオシドトリホスフェートとの一連の反
応において伸長のため元の組換えＤＮＡ分子から適当な
単一ストランド雛型に対して行なわれ、したがって断片
ストランドはコード化順序の初めに再構成することがで
きるであろう。次いで雛型ストランドを伸長断片ストラ
ンドに関連する位置においてエンドヌクレアーセＳ／に
より開裂させ、そして得られた断片を表現制御順序に付
加させる。

幾つかの表現制御順序は、上記したように使用すること
ができる。これらは、イー・コリの乳糖オペロン（１＋
ｈＱＨ」＞の作動子、促進子およびリポソーム結合およ
び作用順序（たとえばシャインータ゛ゝルガ牧順序のよ
うな順序を含む）、イー・コリのトリプトファン合成醇
素系ＣｒＬｒｐ系」）の対応する順序、７アージλの主
要作動子および促進千載（０ＬＰＬおよび０ｒＬＰＲ１
）ならびにファージｒｄ被覆蛋白質の制御域を包含する
１、これら順序を含有するＤＮＡ断片は、垣もしくはＬ
ｒｐオペロンを担持する変換用ファージから単離された
ＤＮＡからまたはファージλもしくはｆｄのＤＮＡから
制限酵素での開裂により割出される。次いで、これら断
片をＨＢＶ抗原順序について記載したように処理して限
られた数の分子を得、重要な制御順序を断片Ｃについて
上記したように所望抗原に対するコード化順序の開始コ
ドンに極めて近接してまたはこれに並列させて結合させ
ることができる。

次いで、融合生成物を上記のようにクローン用ベヒクル
中に挿入して適当な宿主を変異させ、抗原生産レベルを
細胞の溶解の後に放射免疫分析により測定する。最も効
果的な表現を与える細胞はこのように選択することがで
きる。或いは、開始コドンに付加されたｌａｃ　、　　
ｔｒｐもしくはλＰＬ制御系を担持するクローン用ベヒ
クルを使用して、これをＨＢＶ抗原性を示すポリペプチ
ドをコード化する順序を持った断片に融合させ、構造遺
伝子断片をクローン用ベヒクルの開始コドンから正確に
翻訳する。

これらの実験を特にＨＢＶ核抗原の生産に関連させたが
、これらはたとえばＨＢｓＡｇおよびＨＢ　ｃ　Ａ　ｇ
遺伝子ならびにその断片のような他の遺伝子の表現を改
良するのにも使用することができる。

これら特定抗原の細胞収率における増加は、細胞中に使
用しうる遺伝子の数の増加に依存する。これは、例示の
目的であるが、上記したように得られた組換えＤＮＡ分
子を雛型バクテリオファージλ（ＮＭ９ｒり）中に挿入
することにより達成され、最も簡単にはプラスミドを制
限酵素、たとえば旦肥・Ｒ１または且狸し１１１　で消
化ｊ〜て線状分子を与え、次いでこれを制限ファージス
クローン用ベヒクル〔たとえばエヌ・イー・ムレ−等、
「組換え体の試験管内における回収を簡易化するラムダ
型ファージ」、モレキュラー・ジーン・ゲネテイック、
第ｉｓｏ巻第ｊ３〜Ｊ／頁（／り７７）およびエヌ・イ
ー會ムレー等、「バクテリオファージＴ４からのＤＮＡ
リガーゼ遺伝子の分子無性増殖」、ジャーナル・−７よ
− モレキュラー・バイオロジー、第１３２巻第グ２３〜６
０６頁（／り７り）に記載された種類〕と混合し、そし
て組換えＤＮＡ分子をＤＮＡＩＪガーゼとの培養により
生成させる。このような手順を第１／図に示す。次いで
、所望の組換えファージを、特定抗原に対する放射免疫
分析によりまたは放射ラベルしたＨＢＶ、Ｄ、ＮＡ順序
との交雑化により選択して、イー・コリの宿主株を溶菌
化するのに使用した。

特に有用なλクローン用ベヒクルは抑圧遺伝子ｃｌにお
ける感温性突然変異株および遺伝子旦における抑圧側突
然変異株を含み、その生成物は宿主細胞の溶解に必要で
あシ、さらに遺伝子Ｅに関するものも含みその生成物は
ビールスの主要なカプシド蛋白質である。この方式によ
れば、溶解性細胞を３２℃にて成育せしめ、次いで弘ｊ
℃に加熱してプロファージの割出を誘発させる。３７℃
にて長期成育させると高レベルの抗原生産をもたらし、
これが細胞内に保持される。何故なら、とわらはファー
ジ遺伝子生放物によシ通包のようにＦｉ溶屏されないか
らであり、またファージ遺伝子挿入物はカプセル化され
ないので、それは転写用として使用可能に留まるからで
ある。次いで、細胞の人工的ｍｍは抗原を高収率で遊離
させる（第１／図）。

これら実施↑ｆ＋Ｊが原理的に関係するイー・コリ系を
で加え、同じ型の処理を行なって、たとえば、バチルス
・ズブチリス、すなわち耐熱性細菌または酵母およびカ
ビのような他の微生物細胞或いは培養動物捷たは植物細
胞において抗原生産レベルを増大させることができる。

バチルス・ズブチリスの場合、バチルス・リヒエニホル
ミスから単離されたベニシリナーゼの決定子を担持する
プラスミドはこれら目的に有用な表現制御順序を提供す
る。

ＨＢＳＡｇについて決定した遺伝子およびアミノ酸順序
は、本発明の方法によりＨＢｓＡｇに対する遺伝子の表
現を可能にする方法を設計する際に有用である。このよ
うな表現は、ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドを生成し
た組換えＤＮＡ分子により変異させた宿主において従来
観察されなかった。

第ｚ〜ｒ図のヌクレオチット順序は、ヌクレオチット／
４ｔ３７と２／／グとの間のＨＢｓＡｇをコード化する
遺伝子を示す。この遺伝子は、第３〜り図のＨＢＶゲノ
ムにおけるＨＢｃＡｇをコード化する遺伝子（読み枠／
）とは異なる翻訳相（読み枠３）にある。したがって、
適当な宿主を変異させるために使用された時ＨＢｃＡｇ
を生成しなかったが、約２３！０個のヌクレオチット（
第３〜ｒ図の順序のヌクレオテッド−１０〜λλ７０に
ほぼ相当する）のＨＢＶ・ＤＮＡ挿入物を含有する組換
えＤＮＡ分子をＨＢｓＡｇ生産に使用するため選択した
。

選択された組換えＤＮＡ分子は、特にＨＢｓＡｇをコー
ド化する全遺伝子を含有した。この組換えＤＮＡ分子の
ＨＢＶ、ＤＮＡ挿入物のヌクレオチット順序を検査する
と、ＨＢｓＡｇをコード化する遺伝子を含有する断片の
割出を可能にする幾つかの制限エンドヌクレアーゼ目標
が示される。たとえば、ヌクレオチットｌ弘Ｏり（Ｘｈ
　ｏ　）、ヌクレオチット／ｐｌｏ（ＴａｇＬ　　ヌク
レオチット／４ｔＯり（ＡｖａｒＬ　およびヌクレオチ
ット／弘２１　（Ｈ１＋ａ　ｌ　）　（第２図）。これ
らのうち最後のもの（ＨｈａＪ）は特に有用である。何
故なら、ＨＢＶ−ＤＮＡ挿入物の開裂はヌクレオテッド
ｌ≠３０と／弘３／との間で起こり、ＨＢｓＡｇ自身に
対する遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の前方に僅か
６個のヌクレオチットが存在するからである。弘種の場
合全てにおいて、割出された断片は、選択されたＨＢＶ
−ＤＮＡ挿入物を越えて、組換えＤＮＡ分子のｐＢＲＪ
２，２部分のヌクレオチット順序内に位置する特定制限
エンドヌクレアーゼに対する目標まで延在する。したが
って、これら制限エンドヌクレアーゼおよびその他同様
に有用なものを単独または組合せて使用すると、開始コ
ドンの近辺であるがその前方と翻訳終末コドンの後とに
おいてＨＩＪ　Ｓ　Ａ　ｇ−７ター をコード化する遺伝子の割出が可能となる。勿論、ＨＢ
ｃＡｇに対する遺伝子の場合に示したように、全遺伝子
の断片のみを組換えＤＮＡ分子中に実際使用し、適当な
宿主においてＨＢｓＡｇ抗原性を示すポリヌクレオチッ
トを生成させうろことが了解されよう。

このような消化物から生ずるＨＢＶ、ＤＮＡの断片を、
核抗原をコード化する遺伝子および遺伝子断片について
記載したものに類似した一連の反応で処理した。たとえ
ば、遺伝子断片をｐＢＲ３２２のペニシリン耐性をコー
ド化する遺伝子（たとえばＰｓｔ　ｌ識別部位、第２図
）中に挿入してＨＢｓＡｇ抗原性を示すポリペプチドを
β−ラクタマーゼ（ベニシリナーゼ遺伝子の生成物）と
融合させて生成させることができ、遺伝子断片をρＢＲ
３２２におけるペニシリン耐性をコード化する遺伝子と
テトラサイ、タリン耐性をコード化する遺伝子との間（
Ｅｃｏ−Ｒ１またはＨｉｎｄ　［１識別部位、第２図）
に挿入して、これをそこでまたは挿入前に匣系表現制御
順序に−ざ０− 結合することによりＨＢｓｊｔ４抗原性を示すポリペプ
チドを生成させてｌａｃ系のβ−ガラクトシダーゼ蛋白
質に融合させることができ、遺伝子断片を、ＨＢｅＡｇ
をコード化する遺伝子について前記したと同様に、選択
された表現制ｊｉｌｌ順序自身にできるだけ近接してク
ローン用ベヒクル中に挿入することができ、或いは遺伝
子断片を本発明により記載したと同様に無性増殖させる
ことができる。

例示の目的で、一つのこの種の方法を第７２図に示す。

ここで、はぼヌクレオチット−ｇ。

と２２７０　（第３〜ｒ図）との間に延在したＨＢＶ、
ＤＮＡ挿入物を有する選択組換えＤＮＡ分子をＨｈａ・
■での消化により断片化させた。

得られた断片を、前記した３′末端結合法によ！１ｌｐ
ＢＲ３２２のヱ隻１部位に挿入した。この組換えＤＮＡ
分子により変異させた宿主は、ＨＢｓＡｇ抗原性を示す
ポリペプチドを生成した。。

他の断片（たとえばＡＶＩＩ　ｌ　、　Ｔ＋ｔＨ、Ｘｌ
＋ｏまたはＰｓＬｌ（部分消化））をもｐＢＲ３２２に
おけるＰＳＬ　Ｉ　ｔｔｚ別部位または他の部位に挿入
して、ＨＢｓＡｇ抗原性を示すポリペプチドまたはＨＢ
ｓＡｇをコード化する遺伝子断片の生産に有用な組換え
ＤＮＡ分子を生成させた。

さらに、この種の遺伝子断片をＰｓｔ　ｌにより開裂さ
れたｐＢＲ３２２に挿入し、次いで得られたベニシリナ
ーゼをコード化する遺伝子の断片を、ベニシリナーゼま
たはβ−ラクタマーゼのアミノ酸／１２をコード化する
コドンから成る場合にはアミノ酸３２をコード化するコ
ドンへとまた他の場合にはそのポリペプチドのアミノ酸
／３をコード化するコドンへと切シ離す。まｆｌ　ｐＢ
ＲＪ　２２−Ｐｓｔ・■′のこれら誘導化プラスミドを
ヌクレオチット／弘≠７から／７り乙まで延在するＨＢ
ｓＡｇ遺伝子断片（第６〜７図）と共に使用してＨＢｓ
’ＡｇＢｓ性を示すポリペプチドを生成させた。

ＨＢｓＡｇをコード化する構造遺伝子の直前におけるヌ
クレオチツドタ４ｔ♂〜／り３７間のヌクレオチット順
序を使用断片中に含ませて、ＨＢｓＡｇ抗原性を示すポ
リペプチドおよびＨＢｓＡｇに対する構造遺伝子の遺伝
子断片を生産するのに有用な組換えＤＮＡ分子を生成さ
せることもできる。このヌクレオチット順序は、遺伝子
の先駆体順序と呼ばれる。この先駆体順序とＨＢ　ｓ　
Ａ　ｇに対する構造遺伝子との両者を含む遺伝子断片を
Δ垣・Ｉ（ヌクレオチツドタ３り）　、　Ｈｈａ　−１
（ヌクレオチツドタＯθ）またはＨａｅ　−１１（ヌク
レオチット♂タタ）により創出することができる。Ａｌ
ｕ・ＩおよびＨｈａ・１の場合、部分消化と得られた断
片のたとえばゲル電気泳動による分離とが必要である。

何故なら、これら酵素に対する識別部位は、先駆体順序
内において、立・Ｉについてはヌクレオチット１０り／
にまたＨｈａ　−［についてはヌクレオチット／１１２
１にも生ずるからである。

以上、本発明の多くの具体例について記載したが、この
基本構成を変化させて、本発明方法を使用する他の具体
例を与えることもできることが明白である。したがって
、本発明の範囲は例示した特定実施例によシ規定さるべ
きでなく、特許請求の範囲の記載によシ規定さるべきで
あることが了解されよう。

本明細書中に記載した方法によシ調製した微生物は、／
り７り年ｌコ月ｌり日にスコツトランド、アバディーン
在のザ・カルチャー・コレクション・オブ・ザ・ナショ
ナル・コレクション・オブ・インダストリアル・）くク
チリア　（ＴｈｅＣｕｌｔｕ’ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ　ｏｒ　Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｂａｃ’ｔｅｒｉ
ａ　）　　に寄託されかつｐＢＲＪ　ｊ　２−ＨＢＶ−
Ｇ−Ｌと同定サレタ培養物ニよシ例示され、次のような
特性を有する。

Ｇ：イー・コリＨＢＩＯＩ　／ｐＢＲ３２２−Ｐｓｔ　
Ｉ　ｄＧ　：ＨＢＶ−Ｋｐｎ　Ｉ　ｄＣ（以下、“ｐＨ
ＢＶ１１４　”　）：　ＴｅｔＬＡｍｐ’ＨＢＶ” Ｈ：イー・コリ■ＢＩＯＩ　／　ｐＢＲ３２２−Ｐｓｔ
　Ｉ’ｄＧ　：ｐＨＢＶ１１４−Ｐｓｔ　Ｉ　：　Ｔｅ
ｔ’Ａｍ〆ＨＢＶ”ＶＡ”■：イー・コリＩＩＢＩＯＩ
　／　（（ｐＢＲ３２２−亜Ｒ１゜ＢａＩｗ旧：　　ｌ
ａｃ　　プロモータ配列）−皿ＨＩリンカー：　ＩＴＢ
Ｖ１１４−Ｈｈａ　ＩＲａｍ　　ＨＩ　　：　　Ｔｅｔ
’ＡｍｐＨＢＶ”ＶＡヤー♂弘− Ｊ：イー・３１月ＩＢＩＯＩ　／　ｐＬＩＲ２Ｅｃｏ　
Ｒ１：　ＩＩＢＶ１１４−Ｈｈａ　Ｉ上ｃｏ　Ｒ１リン
カー：　Ｔｅｔ’Ａｍｐ”ＨＢＶ＋ＶＡ十 に：イー・コリ）ＩＢＩＯＩ　／　ｐ［１Ｒ３２２−Ｐ
ｓｔ　Ｔ　ｄＧ　：ｐ）ｌＢＶ１１４−Ａｖａ　ｆ　ｄ
ＣＴｅｔ”Ａｍｐ’１ｌＢＶ”ｖＡ”Ｌ：イー・コリＨ
ＢＩＯＩ　／ｐＢＲ３２２ユＩｄＧ：ｐＨＢＶ１１４−
Ｔａｑ　ｄＣＴｅｔ”Ａｍｐ’１ｌＢｌ／”ＶＡ”※　
：テトラサイクリン耐性についてのポリペプチドをコー
ド化する遺伝子を含む ＤＮＡ順序を持ったρＢＲ３２２の誘導体を、イー・コ
リｌａｃ系を含むよシ小さいＤＮＡ順序で置き換えた。

【図面の簡単な説明】

第１図はディン粒子の内生ＤＮＡの構造を示す略図であ
り、第２図は本発明方法の好適具体例の略説明図であり
、第３〜り図は本発明により肝炎Ｂビールスゲノムの一
部について決定したヌクレオチット順序の説明図であり
、第１０図は肝炎Ｂビールス核抗原を示すポリペプチド
を生産することのできる組換えＤＮＡ分子を断片化し、
その断片を改善人肌制御順序に結合させる本発明方法の
略説明図であり、第１／図は本発明方法の略説明図であ
り、第１２図は本発明方法の他の具体例の略説明図であ
る。 ＡｍｐＲＴｅｌＲＡｒｎｐＲ 手　続　ネ１嘗】　　正　　５＝Ｌｒ　　（方ｊい昭和
６２イＩ　９１乙る日

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドをコードしかつ
   Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原をコードするＤＮＡ配列もし
   くはＢ型肝炎ウィルス表面抗原の抗原性を示すポリペプ
   チドをコードするその断片、Ｂ型肝炎ウィルス核抗原を
   コードするＤＮＡ配列もしくはＢ型肝炎ウィルス核抗原
   の抗原性を示すポリペプチドをコードするその断片、お
   よび前記ＤＮＡ配列または断片をその１部としかつＢ型
   肝炎ウィルス抗原の抗原性を示すポリペプチドをコード
   するＤＮＡ配列よりなる群から選択されるＤＮＡ配列を
   含む組換えＤＮＡ分子によって形質転換された単細胞宿
   主を培養し、前記ＤＮＡ配列は前記組換えＤＮＡ分子に
   おける発現制御配列に作用結合させていることを特徴と
   するＢ型肝炎ウィルス抗原の抗原性を示すポリペプチド
   の製造方法。
2. （２）ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡ配列がデイン粒子の内生ＤＮＡ、ＨＢＶ抗原性を示
   すポリペプチドをコードするその断片、およびＨＢＶ抗
   原性を示すポリペプチドをコードする合成されたその均
   等物よりなる群から選択される特許請求の範囲第１項記
   載の方法。
3. （３）ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡ配列が式： 【遺伝子配列があります】 のＤＮＡ配列およびＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドを
   コードするその断片よりなる群から選択される特許請求
   の範囲第１項または第２項記載の方法。
4. （４）ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡ配列が式： 【遺伝子配列があります】 のＤＮＡ配列およびＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドを
   コードするその断片よりなる群から選択される特許請求
   の範囲第１項または第２項記載の方法。
5. （５）単細胞宿主をイー・コリ、シュードモナス、バチ
   ルス・ズブチリスもしくはその他の細菌類、酵母、真菌
   類の菌株または動物および植物の培養細胞よりなる群か
   ら選択する特許請求の範囲第１項乃至第４項のいずれか
   に記載の方法。
6. （６）発現制御配列がｌａｃ系、ｔｒｐ系、ファージλ
   の主オペレータおよびプロモータ領域、並びにファージ
   ｆｄコート蛋白の制御領域よりなる群から選択される特
   許請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の方法
   。
7. （７）ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドが式：【アミノ
   酸配列があります】 のポリペプチドおよびＨＢＶ抗原性を示すその断片より
   なる群から選択される特許請求の範囲第１項乃至第６項
   のいずれかに記載の方法。
8. （８）特許請求の範囲第１項乃至第７項のいずれかに記
   載の方法により製造されたＨＢＶ抗原性を示す少なくと
   も１種のポリペプチドを含むことを特徴とする、ヒトに
   おけるＢ型肝炎ウィルス感染に対する抗体の産生を刺戟
   する組成物。
9. （９）抗体がＢ型肝炎ウィルス表面抗原に対する抗体、
   Ｂ型肝炎ウィルス核抗原に対する抗体またはその混合物
   からなることを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の
   組成物。
10. （１０）特許請求の範囲第８項記載の組成物により医薬
    上許容しうる方法でヒトを処置することを特徴とする、
    Ｂ型肝炎ウィルス感染に対するヒトにおける抗体の産生
    を刺戟する方法。
11. （１１）特許請求の範囲第１項乃至第７項のいずれかに
    記載の方法により産生されたＨＢＶ抗原性を示す少なく
    とも１種のポリペプチドを特徴とする血清におけるＨＢ
    Ｖ感染を検出する装置。
12. （１２）特許請求の範囲第１項乃至第７項のいずれかに
    記載の方法により産生されたＨＢＶ抗原性を示すポリペ
    プチドを用いることを特徴とするヒトにおけるＢ型肝炎
    ウィルス感染の存在を検出する方法。