Acide désoxyribonucléique synthétique et procédé pour
l'obtenir.
La présente invention concerne des molécules
d'acide désoxyribonucléique (ADN) contenant des séquences de polynucléotides construites artificiellement qui correspondent sensiblement à tout ou partie de l'acide ribonucléique
(ARN) du virus de la fièvre aphteuse et se rapporte, en particulier, à des séquences de polynucléotides codant pour
au moins une protéine. Elle concerne spécialement des molécules d'ADN comprenant des séquences de polynucléotides construites artificiellement codant pour l'ensemble ou une partie d'une ou plusieurs protéines existant dans le virus de la fièvre aphteuse (symbolisé ci-après par VFA) ou son précurseur ou une de ses modifications. De telles molécules d'ADN sont capables d'être exprimées sous forme d'un ou plusieurs polypeptides.
La fièvre aphteuse est l'une des maladies les plus virulentes et contagieuses des animaux d'élevage. Cette maladie est endémique dans différentes régions du monde et peut être observée dans de nombreux pays d'Afrique, d'Asie et d'Amérique du Sud où elle est combattue à des degrés divers par des campagnes d'immunisation. Les régions exemptes de cette affection ne le restent que par des mesures strictes de quarantaine à l'importation et par l'abattage des animaux lorsque la maladie apparaît.
Le virus de la fièvre aphteuse est un virus ARN appartenant au genre Aphtho virus de la famille des Picornaviridae (voir Cooper, P.D. et al., Intervirology, 10,
165-180, 1978). On connaît sept sérotypes de virus de la fièvre aphteuse, à savoir les sérotypes européens A, 0 et C, les sérotypes des territoires d'Afrique du Sud SAT 1, SAT 2 et SAT 3 et le sérotype Asie 1. On a pu identifier un certain nombre de sous-types antigénêtiquem e n t distincts dans chacun de ces sérotypes et du fait que ces sous-types sont tellement distincts, des vaccins de sous-types immunologiquement spécifiques sont nécessaires. Différents variants génétiquement distincts existent pour chaque sérotypes ou sous-types.
Le virus de la fièvre aphteuse comprend une chaîne
<EMI ID=1.1>
VP2, VP3 et VP4 qui constituent les protéines de la capside <EMI ID=2.1>
Strohmaier, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 85,
1640-1645, 1978; Bachrach, H.L. et al., Intervirology. 12,
<EMI ID=3.1>
poids moléculaire d'environ 26.0000, tandis que le poly- <EMI ID=4.1>
peptide VP4 a un poids moléculaire d'environ 8000 et il est généralement considéré qu'il existe environ 60 copies de chacun de ces polypeptides dans le virus. Les autres polypeptides traduits par l'ARN du virus ont probablement un rôle dans la réplication du virus.
La chaîne simple d'ARN du virus de la fièvre aphteuse a un poids moléculaire d'environ 2,6 x 106, ce qui est l'équivalent d'environ 8000 nucléotides, et est de polarité positive agissant comme modèle tant pour la traduction en polypeptides que pour la synthèse de l'ARN. L'un des produits de traduction primaires est une protéine dite P88 qui est ensuite scindée en les quatre protéines de la
<EMI ID=5.1>
ci-dessus, est susceptible de scission lorsque le virus intact est traité au moyen de trypsine, ce qui conduit à une diminution importante du pouvoir infectieux de la plupart des souches du virus de la fièvre aphteuse (Wild, T.F. et
<EMI ID=6.1>
par la trypsine peut aussi atténuer la capacité du virus à stimuler la production des anticorps neutralisants. Il
<EMI ID=7.1>
gène primaire capable d'induire une protection efficace contre l'infection par le virus de la fièvre aphteuse et, en
<EMI ID=8.1> produit l'anticorps neutralisant et assure une protection. efficace contre le virus (Laporte, J. et al., C. R. Acad. Se. Paris, t. 276 Série D, 339-3401, 1973;
Bachrach, H.L. et al., J. Immunology, 115, 1636-1641, 1975). La séparation des protéines naturelles de la capside du virus de la fièvre aphteuse, en particulier de la protéine
<EMI ID=9.1>
nécessaire d'entretenir des conditions très dénaturantes et est généralement considérée par les spécialistes comme nuisibles pour l'entretien du pouvoir immunogène optimal et la production d'un vaccin efficace.
Au moyen des techniques mises au point au cours des cinq dernières années, il est à présent possible d'introduire l'ADN codant pour des protéines non bactériennes dans des cellules bactériennes par l'intermédiaire d'un plasmide ou autre véhicule de clonage (voir, par exemple, Burrell, C.J., et al., Nature, 279, 43-47, 1979). En règle générale, la construction des molécules d'ADN recombinant comprend les stades suivants : obtenir l'ADN modèle codant pour la protéine désirée à partir du parent non bactérien et insérer ce modèle d'ADN hétérologue dans un véhicule de clonage, comme un plasmide bactérien, et ensuite transformer un hôte bactérien approprié à l'aide du plasmide modifié. Une discussion générale de la manipulation des gènes conduisant à la formation de l'ADN recombinant a été publiée par S. Cohen dans Scientific American, 233, 24-33, 1975.
Différents gènes non bactériens ont déjà été introduits et multipliés à l'intérieur de bactéries telles que Escherichia coli, et différentes protéines non bactériennes ont été exprimées par des bactéries suivant la technique de l'ADN recombinant, notamment l'hémagglutinin e des virus de l'influenza (Porter, A.G., et al., Nature, 282, 471-477, 1979) et la protéine du virus de l'hépatite B
(Burrell, C.J. et al., 1979, loc. cit.). Malgré les travaux considérables exécutés au cours des dernières années sur l'ADN recombinant, on manque encore de résultats se prêtant à une application immédiate et pratique, spécialement dans le domaine de l'ADN recombinant mettant en jeu la manipulation du matériel génétique viral.
La présente invention apporte la première description de la synthèse de polypeptides distincts sensiblement équivalents aux protéines de la capside des picornavirus naturels, en particulier aux protéines de la capside du virus de la fièvre aphteuse, ainsi que de la synthèse en série de différents peptides du virus de la fièvre aphteuse comme entités individuelles ou comme produits condensés de parties de deux protéines ou davantage. En outre, l'invention procure le moyen de synthétiser simultanément les protéines immunogènes normalement codées par différents variants du virus de la fièvre aphteuse sans exposer aux risques nombreux de la culture de ce virus.
Suivant l'un de ses aspects, l'invention a pour objet une molécule d'ADN comprenant une séquence de nucléotides correspondant sensiblement à tout ou partie de l'ARN du virus de la fièvre aphteuse ou à ses fragments biologiquement fonctionnels, comme défini ci-après. De préférence, la séquence de nucléotides code pour au moins un polypeptide du virus de la fièvre aphteuse. Une telle molécule d'ADN est susceptible d'être exprimée sous la forme d'un polypeptide reconnaissable comme correspondant sensiblement à une protéine du virus de la fièvre aphteuse. De préférence, la séquence de nucléotides code pour une protéine de structure
<EMI ID=10.1>
variante, peut coder pour l'ensemble des protéines de structure ou de la capside en contiguïté, ce qui permet de les synthétiser sous la forme d'un seul précurseur, par exemple P88, qui peut exiger une stabilisation par des inhibiteurs des enzymes tels que les protéases qui la décomposent en ses protéines constitutives. En variante, la
<EMI ID=11.1>
Suivant une autre variante, la séquence de nucléotides peut coder pour tout ou partie d'au moins deux protéines du virus de la fièvre aphteuse, dont chacune dérive d'un variant différent du virus de la fièvre aphteuse.
Suivant un aspect préféré, la séquence de nucléotides code pour une protéine du sérotype A ou O du virus de la fièvre aphteuse et plus avantageusement le sérotype A10 et, en particulier, la souche 61. En outre, la séquence de nucléotides peut comprendre des séquences de contrôle positionnées en position adjacente, ces séquences de contrôle dérivant soit de l'acide nucléique du virus de la fièvre aphteuse, soit d'une source hétérologue.
Suivant un autre aspect, l'invention a pour objet une molécule d'ADN recombinant comprenant un opéron qui
- comporte des séquences d'initiation et séquences de terminaison, comme défini ci-après, et une séquence de nucléotides codant en substance pour tout ou partie d'au moins une protéine du virus de la fièvre aphteuse, la séquence de nucléotides étant située entre les séquences d'initiation et séquences de terminaison de l'opéron.
L'invention a, en outre, pour objet un véhicule de clonage d'ADN recombinant capable d'exprimer tout ou partie d'une protéine du virus de la fièvre aphteuse comprenant un opéron qui comporte des séquences d'initiation et séquences de terminaison et une séquence de nucléotides codant sensiblement pour tout ou partie d'au moins une fraction du virus de la fièvre aphteuse, la séquence de nucléotides étant située entre les séquences d'initiation et séquences de terminaison de l'opéron.
Suivant un autre aspect, l'invention a pour objet une cellule hôte contenant un véhicule de cl onage d' ADN recombinant et/ou une molécule d'ADN recombinant comme défini ci-dessus.
L'invention a de plus pour objet un antigène pour stimuler la production d'anticorps contre le virus de la fièvre aphteuse chez un mammifère, qui comprend au moins un polypeptide suscitant l'immunité contre le virus de la fièvre aphteuse qui est préparé par expression d'une molécule d'ADN comme défini ci-dessus et qui est produit par une cellule hôte transformée par un véhicule de clonage d'ADN recombinant comme défini ci-dessus,
L'invention a par ailleurs pour objet un procédé pour préparer une molécule d'ADN codant sensiblement pour au moins un polypeptide du virus de la fièvre aphteuse suivant lequel :
(a) on isole de l'ARN monocaténaire du virus de la fièvre aphteuse;
(b) on prépare une première copie monocaténaire de l'ARN du virus de la fièvre aphteuse en ADN;
(c) on prépare une seconde chaîne simple d'ADN complémentaire de la première et fixée à celle-ci par des liaisons hydrogène pour obtenir une double chaîne d'ADN.
La double chaîne d'ADN ainsi obtenue peut être insérée dans un véhicule de clonage après digestion de celui-ci avec une endonucléase de restriction, les extré-mités libres du véhicule de clonage étant unies à la molécule d'ADN pour constituer un véhicule de clonage recombinant. Celui-ci, à son tour, peut être introduit dans une cellule hôte appropriée, par exemple par transformation.
Aux fins de l'invention, les termes utilisés ont les significations suivantes :
Nucléotide : unité d'ADN ou d'ARN comprenant un radical sucre (pentose), un phosphate et une base hétérocyclique azotée. La base est unie au radical sucre par le carbone glycosidique (carbone 1' du pentose) et la base caractérise le nucléotide. Les quatre bases d'ADN sont l'adénine (A), la guanine (G), la cytosine (C) et la thymine (T). Les quatre bases d'ARN sont A, G, C et l'uracile (U).
ADN recombinant : séquence d'ADN en double chaîne hybride comprenant au moins deux séquences de nucléotides d'ADN en double chaîne, la première séquence n'étant pas observée dans la nature en présence de la seconde séquence.
Véhicule de clonage : ADN en double chaîne non chromosomique capable de réplication après introduction dans un m icroorganisme unicellulaire.
Plasmide : véhicule de clonage provenant de virus ou de bactéries.
Gène de structure . séquence de nucléotides d'ADN qui code pour une séquence d'aminoacides caractéristique d'un polypeptide spécifique.
Séquences d'initiation : séquences de nucléotides d'ADN qui régulent l'initiation de la transcription ou traduction. Séquences de terminaison : séquences de nucléotides d'ADN auxquelles la transcription ou traduction cesse. Transcr iption : processus par lequel l'ARN polymérase est amenée à se mouvoir au long de la séquence d'ADN formant l'ARN messager.
Traduction : processus de production d'un polypeptide par un ARN messager.
Opéron : un ou plusieurs gènes de structure qui codent pour l'expression d'un polypeptide et qui sont précédés de séquences d'initiation et suivis de séquences de terminaison.
Expression : processus impliqué dans la production d'un polypeptide à partir d'un gène de structure.
Fragment biologiquement fonctionnel . molécule d'ADN qui code pour des déterminants antigéniques capables de susciter une réponse immunitaire chez un mammifère ou qui code pour une protéine ou partie de protéine qui est nécessaire pourla confirmation convenable d'un déterminant antigénique ou bien qui code pour une protéine ou une partie de celle-ci qui est importante pour le cycle vital du virus de la fièvre aphteuse in vivo et/ou in vitro.
L'invention est décrite davantage ci-après avec référence aux dessins annexés dans lesquels :
Fig. 1 est un schéma de la carte génétique de l'ARN du virus de la fièvre aphteuse et des protéines qui en dérivent; Fig. 2 est un schéma des cartes physiques des trois plasmides recombinants comparées à la carte génétique de l'ARN du virus de la fièvre aphteuse; Fig. 3 est un schéma de la région de structure de gènes de l'ARN du virus de la fièvre aphteuse et montre la partie VFA du plasmide combinant pFA61/t76 alignée avec la région de gènes de structure du virus; Fig. 4 à 7 sont des diagrammes des séquences d'ADN et d'aminoacides indiquées par des lignes épaisses à la Fig. 3:
Fig. 8 est un diagramme comparant les séquences <EMI ID=12.1>
de la fièvre aphteuse; Fig. 9 est un diagramme de la séquence de nucléotides C-terminale de VP3 et de la séquence de nucléo- <EMI ID=13.1>
pFA61/t76; Fig. 10 est un diagramme des séquences de r.ucléotides et d'aminoacides à la jonction de la région codant pour VP2 et VP3 dans le plasmide recombinant pFA61/t76 qui suit directement la séquence de la Fig. 5; Fig. 11 est un schéma de la région de gènes de structure de l'ARN de VFA et montre la partie VFA du <EMI ID=14.1>
gènes de structure de VFA; Fig. 12 est un diagramme de la séquence d'ADN et de la séquence d'aminoacides prévue de la région de gènes de structure de VFA insérée dans le plasmide recombinant pFA61/t76; Fig. 13 est un diagramme de la séquence d'ADN et de la séquence d'aminoacides prévue pour VP4, VP2, VP3 et
<EMI ID=15.1> Fig. 14 est un schéma de la construction du plasmide d'expression pXYl; Fig. 15 est un schéma de l'introduction d'une <EMI ID=16.1> Fig. 16 illustre la construction de plasmides d'expression; Fig. 17 illustre les produits protéiques et poids moléculaires des protéines obtenues par l'expression des plasmides montrés à la Fig. 16; Fig. 18 illustre les séquences d'aminoacides et de nucléotides. C-terminales des protéines montrées à la Fig. 17; Fig. 19 est un diagramme de la séquence de nucléotides de PFA61/t243 correspondant à l'extrémité 3' de l'ARN de VFA comprenant au moins une partie du rajout polyA.
La Fig. 1 est une carte simplifiée de l'ARN du virus de la fièvre aphteuse qui, comme déjà indiqué, a une longueur d'environ 8000 nucléotides. La traduction de l'ARN se fait de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3'. Comme pour de nombreuses molécules d'ARN messager, l'ARN de VFA contient une séquence d'acide polyadénylique à l'extrémité 3'. Il contient, en outre, une suite d'acide polycytidylique d'une longueur d'environ 100 à 200 nucléotides, suivant la souche de virus. La suite d'acide polycytidylique est située à environ 400 nucléotides de l'extrémité 5' de l'ARN
(Rowlands, D.J. étal., J. Virology, 26, 335-343, 1978).
L'ARN de VFA est traduit sous la forme d'une polyprotéine qui est scindée pendant la traduction en différents gros polypeptides appelés produits primaires et identifiés par la lettre "P" et un nombre. Ces produits primaires sont alors scindés, probablement par des protéases
<EMI ID=17.1>
existe des parties d'ARN de VFA qui ne codent pas pour une protéine, mais qui jouent un rôle important dans le cycle vital de VFA in vitro et/ou in vivo, par exemple qui influencent la viabilité du virus.
A partir de l'étude de la cinétique de la traduction de l'information virale en polypeptides, tant dans des cellules infectées par le virus que dans des systèmes synthétisant la protéine sans cellule, il a été possible de déduire l'ordre du génome viral de l'information génétique codant pour les polypeptides majeurs (Doel, T.R. et al.,
<EMI ID=18.1> J. Virol, 33, 59-68, 1980). A partir de ces études, il a été établi que les 550 premiers nucléotides de l'ARN de VFA, à partir de l'extrémité 5', ne paraissent pas coder pour un polypeptide quelconque. Les protéines P16 et P20a sont étroitement apparentées et contiennent le site d'initiation de la traduction de VFA, comme le montre le marquage exclusif par la N-formylméthionine au cours de l'analyse in vitro (Sanger, D.V. et al., 1980 loc. cit.). Le P88 est le produit primaire qui est scindé en VPl-4- A partir d'une évaluation des données connues, le gène pour VP a une longueur d'environ 700 nucléotides et doit se trouver dans la région délimitée par les positions des nucléotides 2300 et 3800.
Il existe différentes techniques pour préparer la molécule d'ADN recombinant conforme à l'invention, dont l'une comprend la synthèse d'une copie d'ADN en chaîne simple (cADN) de l'ARN purifié provenant d'un isolat de virus de fièvre aphteuse virulent complet au moyen d'une transcriptase inverse. Après que la chaîne d'ARN de départ a été dégradée, le cADN est converti en double chaîne (cADN dc) qui est ensuite soumis à un traitement visant à éliminer les boucles d'ADN qui peuvent s'être formées, par exemple au moyen d'une nucléase. Un autre moyen de préparer le cADN en double chaîne est la synthèse chimique suivant les techniques habituelles.
Lorsque le cADN en double chaîne a été produit, le stade suivant consiste dans son insertion dans un véhicule de clonage qui peut être, par exemple, un plasmide bactérien ou un bactériophage. Ce résultat peut être obtenu d'abord par scission de l'ADN du véhicule de clonage purifié à l'intervention d'une endonucléase de restriction comme PstI, qui scinde l'ADN en des sites où les nucléotides complé-mentaires sont agencés en symétrie palindromique. Le cADN en double chaîne de VFA peut être inséré ensuite et lié entre les extrémités libres du véhicule de clonage suivant l'un ou
<EMI ID=19.1>
peuvent être fixés à l'extrémité 3' du véhicule de clonage par un procédé dit du rajout homopolymère, qui consiste à utiliser une transférase terminale. De manière analogue, plusieurs nucléotides "C" sont ajoutés à l'extrémité 3' du cADN du VFA en double chaîne. Le véhicule de clonage augmenté du rajout et le cADN en double chaîne sont alors mélangés ensemble, à la suite de quoi les extrémités cohésives formées par le placement du rajout se soudent les unes aux autres.
Il existe différentes variantes au lieu de l'adaptation d'un rajout. L'une est la digestion du cADN en double chaîne avec des endonucléases formant des terminaisons franches ou cohésives. Les terminaisons franches peuvent être rendues cohésives par digestion avec une exonucléase. Dans un autre procédé, les extrémités franches peuvent être unies directement au moyen d'une ADN ligase. Suivant un autre procédé encore, des oligonucléotides synthétiques peuvent être unis à du cADN en double chaîne à extrémités franches et les nouvelles extrémités peuvent être rendues cohésives par digestion avec une exonucléase ou une endonucléase, avant la liaison à un véhicule de clonage convenablement linéarisé.
Lorsque le cADN de VFA en double chaîne a été soudé à l'ADN du véhicule de clonage, un hôte approprié, par exemple une bactérie, est transformé à l'aide du véhicule de clonage recombinant afin de permettre que l'hôte exprime le cADN en double chaîne de VFA et produise ainsi un ou des polypeptides manifestant le pouvoir antigène de VFA.
On connaît différentes combinaisons hôte-véhicule de clonage qui pourraient être utilisées pour l'expression des protéines de VFA. Par exemple, des véhicules de clonage utiles sont des plasmides bactériens comme pAT153,
(Twigg, A.J., Nature, 283, 216-218, 1980; procuré par le Prof. D. Sherratt, Université de Glasgow, Ecosse), pBR322,
(Sutcliffe, J.G. Cold Spring Harbour Symposium for Quantitative Biology, 43, 77-90, 1978, procuré par le Dr. H. Boyer, University of San Francisco, E.U.A.), et d'autres plasmides d'E. coli et plasmides d'hôtes plus divers. Des bactériophages comme les nombreux dérivés du phage � pourraient convenir aussi. Des hôtes qui peuvent être utilisés sont notamment des bactéries comme des souches de E. coli K. 12, par exemple E. coli HB101, (Boyer, H.W. et al., J. Mol. Biol., 41, 459-472, 1969; procuré par le Dr. H.
Boyer, University of San Francisco, E.U.A.), E. coli X1776, (Curtiss, R. et al., Ann Report Dept. of Microbiology University of Alabama, 1976, 96-106, procuré par le Dr. R. Curtiss III, University of Alabama, Birmingham, E.U.A.), E. coli X2282 (procuré par le Dr. R. Curtiss III) et E. coli MRC1, (procuré par le Dr. S. Bremer, University of Cambridge, England), des souches de Bacillus subtilis et Pseudomonas, de même que des levures et autres champignons et autres organismes unicellulaires. Il est cependant à prévoir que tous les hôtes ne soient pas également efficaces.
Dans chaque véhicule de clonage, divers sites peuvent être accessibles pour l'insertion de la copie d'ADN en double chaîne de VFA, chaque site étant désigné par l'endonucléase de restriction qui scinde l'ADN. Par exemple, l'enzyme PstI coupe le plasmide pAT153 dans le gène codant pour la résistance à la pénicilline. Il existe différentes autres endonucléases qui peuvent être utilisées, notamment HindIII et EcoRI.
La sélection du site sur le véhicule de clonage pour l'insertion du cADNdc du VFA peut être régie par différents facteurs, par exemple la dimension du polypeptide à exprimer et l'emplacement des séquences d'initiation et de terminaison. Par conséquent, tous les sites peuvent ne pas être également efficaces pour un polypeptide donné. Le choix du site peut être régi aussi par le procédé de dépistage initial pour détecter les recombinants, par exemple, comme indiqué, l'enzyme PstI coupe le plasmide pAT153 dans le gène codant pour la résistance à l'ampicilline, de sorte que des colonies de transformants manifestant de la résistance à la tétracycline mais de la sensibilité à l'ampicilline sont susceptibles de contenir au moins une certaine quantité d'ADN complémentaire en double chaîne de VFA.
Il est essentiel que l'ADN complémentaire en double hélice de VFA inséré dans le véhicule de clonage puisse être lu dans la phase correcte. A cette fin, il peut être nécessaire d'insérer des nucléotides supplémentaires, par exemple entre les points de départ de transcription et de traduction du fragment d'ADN complémentaire en double chaîne de VFA dont l'expression est désirée. L'addition de ces nucléotides ne peut évidemment pas former une séquence de nucléotides qui pourrait interrompre la traduction.
L'expression de l'ADN complémentaire en double chaîne de VFa, qui a été inséré dans un véhicule de clonage qui, à son tour, peut être utilisé pour transformer une cellule hôte appropriée, peut être décelée par l'apparition d'une fonction spécifique pour la protéine, c'est-à-dire l'activité immunologique dans le cas de VFA. Différents procédés sont applicables, par exemple le procédé de sélection d'une colonie essentiellement immunologique décrit par S. Eroome et W. Gilbert dans Proc. Nat. Acad. Sci . ,
1978, 75, 2746-2749. Une variante, qui est une technique un peu plus simple, consiste à injecter à un animal de laboratoire l'extrait bactérien brut provenant d'une culture de bactéries transformées à l'aide d'un véhicule de clonage convenablement conçu et à observer la formation d'anticorps appropriés.
Une seconde variante consiste à exécuter une immunoprécipitation d'un extrait brut des cellules bactériennes. Un autre procédé encore est la "technique Maxicell" décrite par Sancar et al., dans J Bact., 1979, 137, 692-693.
La nature du polypeptide produit en conséquence de l'expression par l'hôte de la molécule d'ADN recombinant de l'invention dépend du point d'insertion dans l'ADN du véhicule de clonage, de sorte qu'en pratique il est possible de former un polypeptide précurseur qui comprend un polypeptide codé par l'ADN complémentaire en double chaîne de VFA et un polypeptide supplémentaire codé par l'ADN du véhicule de clonage. Par exemple, si le plasmide pAT153 est coupé par l'enzyme PstI, un polypeptide précurseur comprenant une partie de la pénicillinase et le polypeptide codé par l'ADN complémentaire en double chaîne de VFA peuvent s'exprimer. Le polypeptide précuseur peut être ensuite scindé de manière que le polypeptide de VFA désiré soit séparé de la séquence d'aminoacides superflue.
La coupure initiale est effectuée d'habitude à l'extérieur de l'hôte après la collecte de la culture microbienne suivant des techniques connues du spécialiste. La coupure peut être nécessaire pour que le produit d'expression de VFA puisse exercer l'activité désirée, mais pendant la collecte de la culture microbienne, le fait qu'une séquence d'aminoacides superflue est liée au polypeptide de FVA désiré peut aider à empêcher la dégradation du produit d'expression par des enzymes endogènes. En variante, la coupure peut être effectuée à l'intérieur de l'hôte, ce qui peut être obtenu par insertion dans le véhicule de clonage d'un ADN codant pour les enzymes de coupure désirés.
La production d'un produit de fusion d'un polypeptide codé par l'ADN complémentaire en double chaîne de VFA et d'une fraction, par exemple, de pénicillase, peut augmenter la stabilité de la protéine hybride dans E. coli et même augmenter le pouvoir immunogène de la protéine de VFA.
En variante, les séquences de nucléotides appropriées provenant, par exemple, de l'ARN du VFA peuvent être insérées avant l'ADN complémentaire en double chaîne de VFA pour assurer que cet ADN complémentaire en double chaîne de VFA puisse être exprimé seul et non sous forme de produit de fusion avec un polypeptide de l'hôte.
Lorsque les transformants contenant au moins une certaine quantité d'ADN complémentaire en double chaîne de VFA ont été identifiés, comme indiqué ci-dessus, l'ADN recombinant du véhicule de clonage est purifié, puis est soumis à l'analyse pour la détermination de la quantité d'ADN complémentaire en double chaîne de VFA qui a été insérée. A cette fin, l'ADN recombinant de véhicule de clonage est traité à l'aide de diverses endonucléases de restriction, par exemple EcoRI, PstI, Sali, BglII, BamHl, HindIII et Hinfl, et les produits de digestion peuvent être analysés par électrophorèse sur gel.
En utilisant ces résultats et ceux obtenus quand on soumet les oligonucléotides produits par Tl, formés par digestion de l'ARN de VFA par la nucléase Tl qui est une ribonucléase, à l'hybridation avec les produits isolés de la digestion de l'ADN recombinant par la nucléase de restriction, on peut établir des cartes de l'ADN complémentaire en double chaîne de VFA inséré dans le véhicule de clonage qui sont semblables à celles de la Fig. 2. A partir de ces cartes, il est possible de sélectionner le recombinant qui contient le gène de VFA désiré, <EMI ID=20.1>
Suivant un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé pour établir la carte de la molécule d'ADN recombinant tel que défini ci-dessus, suivant lequel :
(a) on met l'ADN à digérer avec des endonucléases de restriction et on sépare les fragments;
(b) on ajoute des oligonucléotides marqués d'ARN <EMI ID=21.1>
(c) on identifie les produits de la digestion par les endonucléases de restriction avec lesquels les oligo- <EMI ID=22.1>
Les différentes molécules d'ADN peuvent être utiles comme moyens d'investigation pour le diagnotic in vitro de la présence de VFA dans des échantillons biologiques et, en particulier, peuvent être utilisées pour déterminer le sérotype ou sous-type provoquant une apparition de la fièvre aphteuse. A cette fin, les molécules d'ADN peuvent être marquées de manière connue à l'aide d'un isotope radio-actif. En outre, le produit d'expression du véhicule de clonage recombinant peut être utilisé pour le diagnotic sérologique et dans la préparation de vaccins simples ou multivalents contre la fièvre aphteuse, suivant des procédés classiques pour la préparation des vaccins. De tels vaccins sont efficaces pour faire apparaître des anticorps chez les animaux vaccinés et les protéger ainsi contre la fièvre aphteuse.
Suivant un autre aspect, l'invention a pour objet un vaccin pour stimuler la production d'anticorps contre le virus de la fièvre aphteuse chez un mammifère, qui comprend au moins une protéine manifestant un pouvoir immunogène contre VFA qui est produite par une cellule hôte comme défini ci-dessus, outre un excipient vétérinairement acceptable.
Suivant un autre aspect encore, l'invention a pour objet un procédé pour stimuler la production d'anticorps contre le virus de la fièvre aphteuse chez un mammifère, suivant lequel on administre une quantité non toxique et immunologiquement efficace d'un vaccin tel que défini ci-dessus. Par "quantité non toxique immunologiquement efficace", il convient d'entendre une quantité de protéine manifestant un pouvoir immunogène contre le virus de la fièvre aphteuse qui est suffisante pour susciter assez d'anticorps chez un mammifère pour que celui-ci, s'il vient en contact avec une forme virulente du virus de la fièvre aphteuse après la vaccination, ne succombe pas à l'affection, mais qui n'est pas toxique pour le mammifère.
D'autres particularités et caractéristiques de l'invention sont décrites dans les exemples ci-après, qui sont présentés à titre uniquement illustratif et non limitatif du cadre de l'invention.
EXEMPLE 1.-
Préparation de l'ARN de VFA.
On introduit environ 10 ml d'une récolte récente de VFA type A10 (souche A61) (s'obtenant gratuitement sur demande au Animal Virus Research Institute, Pirbright, Angleterre, en satisfaisant aux conditions légales des différents pays) dans du milieu d'Eagle dans chacune de
10 fioles de Roux contenant des monocouches d'environ
108 cellules BHK21. Après agitation modérée pendant 30 minutes, on décante le milieu et on introduit 20 ml de milieu frais dans chaque fiole. Après que l'infection par le virus a détruit les monocouches de cellules (3 à 4 heures), on décante le milieu et on sépare les débris cellulaires par centrifugation à 12.000 g pendant 15 minutes à 4[deg.]C. On rassemble le virus ensuite en un culot par centrifugation à
90.000 g pendant 1 heure à 4[deg.]C.
On remet le culot de virus en suspension dans 2 ml de tampon TNE [10 mM en chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, (pH 7,5), 150 mM en NaCl
<EMI ID=23.1>
limpide à 1,0% poids/volume de dodécylsulfate de sodium
(DSS) et on le dépose sur un gradient formé au préalable
(saccharose de 15 à 45% poids/volume) dans du tampons TN
(100 mM en chlorhydrate de tris(hydroxyéthyl)aminométhane, pH 7,6, 100 mM en NaCl) et on exécute la centrifugation à
100.000 g pendant 2 heures à 10[deg.]C. On surveille des fractions (1 ml) à 260 nm et on soumet les fractions contenant du virus à l'extraction une fois avec un volume égal de phénol:chloroforme (1:1), puis on précipite la phase aqueuse par addition de 2 volumes d'éthanol et on met à incuber jusqu'au lendemain à 20[deg.]C. On rassemble le précipité d'ARN par centrifugation à 5000 g pendant 30 minutes à 4[deg.]C.
On rejette le liquide surnageant, on égoutte le culot, puis on le dissout dans 0,5 ml de tampon TNES (10 mM en chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, pH 7,6, 150 mM en NaCl, 1 mM en EDTA et à 0,2% poids/volume de DSS). On dépose la solution sur un gradient de saccharose formé au préalable (5 à 25%) dans du tampon TNES et on exécute la centrifugation à
<EMI ID=24.1>
fractions (0,5 ml) contenant de l'ARN sédimentant à 35 s, on les extrait une fois au phénol-chloroforme, on les précipite par l'éthanol et on redissout les solides comme décrit ci-dessus pour le virus. On précipite la solution résultante par l'éthanol et finalement on redissout les solides dans 0,05 ml d'eau bidistillée.
Synthèse de l'ADN complémentaire en double chaîne (cADNdc).
<EMI ID=25.1>
provenant de Collaborative Research) dans un volume final de
100 ni) contenant du dithiothréitol 0,4 mM, du MgCl2 8 mM, du chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, pH 8,1,
32
<EMI ID=26.1>
phosphate à 2,5 Ci/mmole provenant de Radiochemical Centre, Amersham), du dTTP 0,2 mM (d-thymidinetriphosphate), du dCTP 0,2 mM (d-cytidinetriphosphate), du dGTP 0,2 mM (d-guano-
<EMI ID=27.1>
transcriptase inverse (procurée par Dr. J. Beard, Life Sciences Inc., Floride). On arrête la réaction par addition d'EDTA (20 mM) et de DSS (0,2% p/v). On dépose un échantillon (2%) de ce mélange après arrête de la réaction en gouttes sur des disques de papier-filtre DE81 de 2,5 cm
(Société Whatman). On les lave abondamment avec du Na2HP04 à 5% (p/v), puis brièvement (5 minutes) à l'eau distillée avant de les sécher et de les passer sur le compteur à scintillations. On peut déduire des résultats un rendement
<EMI ID=28.1>
reste du mélange de réaction au moyen du système phénol-chloroforme et on le précipite à l'éthanol comme décrit ci-dessus, mais en ajoutant de l'acétate de sodium jusqu'à 0,2 M avant l'addition de l'éthanol. On dissout le
<EMI ID=29.1>
à incuber à 70 *C pendant 20 minutes pour éliminer le modèle, à savoir l'ARN de VFA. On neutralise la solution à l'acide acétique et on sépare l'ADN complémentaire à partir de l'ARN dégradé par passage sur une colonne (100 mm x 15 mm) de perles de résine phénol-formaldéhyde dans le chloroforme. On met le culot desséché à nouveau en suspension jusqu' à un
<EMI ID=30.1>
en dithiothréitol, 10 mM en MgCl2, 0,4 mM en dCTP, 0,4 mM en
32
dGTP, 0,4 mM en dATP (5,5 Ci/mmole CaPj-dATP, Radiochemical Centre, Amersham), 0,4 mM en dTTP et contient 36 unités AMV de transcriptase inverse. Après 4 heures d'incubation à
45[deg.]C, on arrête la réaction par addition d'EDTA (20 mM) et de DSS (0,2% p/v). On extrait le mélange au moyen du système phénol-chloroforme, on ajoute du NaCl jusqu'à 0,2 M et on précipite le mélange au moyen de 2 volumes d'éthanol par repos jusqu'au lendemain à -20[deg.]C. On remet le culot desséché
<EMI ID=31.1>
comme entraîneur, on précipite à l'éthanol la substance du pic exclu. L'analyse sur disque de papier DE81, comme décrit précédemment, indique que la synthèse de la seconds chaîne atteint environ 60% du rendement théorique maximum. On remet le culot desséché .de la précipitation par l'éthanol en
<EMI ID=32.1>
échantillon (A) à -20'C, tandis qu'on met le reste (échan-
<EMI ID=33.1>
Société Sigma) pendant 30 minutes à 37*C. On arrête la réaction par extraction avec le système phénol-chloroforme et on précipite la substance de la phase aqueuse par l'éthanol. On remet le culot desséché en suspension dans,
<EMI ID=34.1>
pour éliminer les boucles de l'ADN complémentaire en double chaîne, on chauffe une petite quantité (2%) des échantil-
<EMI ID=35.1>
puis on refroidit les mélanges à 60[deg.]C et on y ajoute à divers moments (0; 0,25; 1 et 14 heures) 3 unités de SI
<EMI ID=36.1>
résistance à la nucléase SI par fixation sur disque de papier DE81 comme décrit ci-dessus. Les résultats prouvent que plus de 53% de l'échantillon A sont résistants à la digestion par la nucléase SI contre 2% de l'échantillon B, si les deux échantillons sont mis à incuber avec la nucléase Sl immédiatement après refroidissement jusqu'à 60[deg.]C. Si la nucléase SI est ajoutée 15 minutes après que les échantil-
<EMI ID=37.1>
81% et 15%, respectivement. Dès lors, le traitement initial par la nucléase SI a effectivement coupé les boucles existant après la synthèse de la seconde chaîne.
Une estimation de la dimension des molécules dans l'échantillon B par électrophorèse sur gel d'agarose indique qu'elles se répartissent entre des copies en pleine longueur
<EMI ID=38.1>
de 200 pb, avec une valeur moyenne de 2000 à 4000 pb. Rajout homopolymère sur plasmide et ADN complémentaire en double chaîne.
(a) Rajout dG sur le vecteur.
<EMI ID=39.1>
plasmide pAT153, à digérer avec l'endonucléase PstI dans les conditions recommandées par le fournisseur de l'enzyme
(Société Boehringer). On arrête la réaction par addition d'acétate de sodium jusqu'à 0,3 M et on exécute la préci-pitation par l'éthanol. On remet le culot desséché en
<EMI ID=40.1>
(200 mCi[8<3>-H]-dGTP/mmole). On ajoute au mélange 2 fil
(38 unités) de transférase terminale (TT) et on met le
<EMI ID=41.1>
tillons après 2,5, 5 et 10 minutes. Dans chaque cas, on arrête la réaction par refroidissement au bain de glace et addition d'EDTA jusqu'à 20 mM. L'analyse par précipitation à l'acide trichloracétique d'un échantillon de 5 fil sur chaque mélange montre que l'incorporation du <3>H dGMP ne se poursuit pas après 2,5 minutes et que la longueur moyenne du rajout homopolymère est à ce moment d'environ 25 nucléotides. On dilue le reste de l'échantillon de 2,5 minutes à
<EMI ID=42.1>
(hydroxyméthyl)aminométhane, pH 8,0 et 1 mM en EDTA) et on l'extrait une fois avec un volume égal de phénol saturé en TE. On extrait la phase aqueuse à quatre reprises à l'éther,
<EMI ID=43.1>
-10[deg.]C. On estime que la concentration en ADN de cette solu- <EMI ID=44.1>
(b) Rajout dC sur ADN complémentaire en double chaîne.
<EMI ID=45.1>
de'boeuf et 0,5 mM en <3>H dCTP (600 mCi[5-<3>H]-CTP/mmole) avec
<EMI ID=46.1>
5 minutes et on détermine l'incorporation par précipitation <EMI ID=47.1>
chacune. Cette analyse indique que la longueur moyenne du rajout homopolymère est d'environ 70 nucléotides après 2 minutes et 160 nucléotides après 5 minutes. On rassemble les deux aliquotes, on les extrait une fois au phénol et quatre fois à l'éther, puis on les précipite par l'éthanol,
<EMI ID=48.1>
Transformation avec du plasmide resoudé et de l'ADN complémentaire en double chaîne.
<EMI ID=49.1>
taire en double chaîne à rajout dC (0,2 à 0,4 pmole) à 65[deg.]C pendant 30 minutes dans 100 ^il de tampon TNE (10 mM en chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, pH 8,0,
200 mM en NaCl et 1 mM en EDTA). On abaisse la température d'incubation régulièrement jusqu'à 20[deg.]C en 4 heures, puis on
<EMI ID=50.1>
manière qu'elle soit finalement 15 mM en Tris-HCl, pH 7,5,
100 mM en NaCl, 10 mM en MgCl2, 10 mM en CaCl2 et 0,5 mM en
<EMI ID=51.1>
On prépare une culture de E. coli HB101 convenant pour la transformation en inoculant 1 ml d'une culture en phase fixe dans 60 ml de bouillon L (1% de tryptone Bacto Difco, 0,5% d'extrait de levure Bacto Difco et 0,5% de NaCl, pH 7,2) et en agitant le mélange à 37[deg.]C pendant environ
<EMI ID=52.1>
suspension dans 25 ml de MgCl2 0,1 M à 0[deg.]C et on les centrifuge à nouveau. On remet le culot en suspension dans 2 ml de
<EMI ID=53.1> pendant 30 minutes. On mélange doucement environ 0,2 ml d'une telle culture de cellules convenant pour la transformation avec 0,1 ml de pAR153/cADNdc resoudé et on laisse reposer le mélange pendant encore 30 minutes à 0*C, puis 2 minutes à 42*C et enfin 30 minutes à 0*C. On ajoute alors 1 ml de bouillon L et on met le mélange de transformation à incuber pendant 25 minutes à 37[deg.]C. On étale ensuite des échantillons de 0,1 ml du mélange sur des plaques L-Tc
<EMI ID=54.1>
cline de la Société Sigma) et on met les plaques à incuber à
37[deg.]C. A partir des dix plaques, on recueille 150 colonies résistant à la tétracycline qui sont pour environ 87% sensi-
<EMI ID=55.1>
l'insertion de l'ADN complémentaire au site PstI de pAT153. Préparation à grande échelle du plasmide recombinant.
On cultive en masse les transformants contenant les plasmides en introduisant par inoculation 10 ml de culture non agitée dans 500 ml de bouillon L et en agitant le
<EMI ID=56.1>
atteigne environ 1,0. On ajoute ensuite du chloramphénicol
(Société Sigma) jusqu'à 0,1 mg par ml et on agite les cultures à 37[deg.]C jusqu'au lendemain. Après cette multiplication, on rassemble les cellules en un culot par centrifugation à
5000 g pendant 5 minutes à 4[deg.]C. On désinfecte le liquide surnageant et on le rejette, puis on remet le culot de cellules en suspension dans 12 ml de tampon R [50 mM en chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (pH 8,0),
40 mM en EDTA et à 25% de saccharose]. On ajoute du lysosyme et de l'EDTA jusqu'à 1,4 mg par ml et 60 mM respectivement et on met la suspension à reposer sur de la glace pendant 5 minutes. A 16 ml de cette suspension, on ajoute 30 ml de mélange de Triton (à 0,1% de Triton X-100, 62,5 mM en EDTA, <EMI ID=57.1>
pH 8,0) et on laisse reposer le mélange sur de la glace pendant environ 10 minutes ou jusqu'à ce qu'il devienne visqueux. On clarifie le mélange ensuite par centrifugation
<EMI ID=58.1>
ment le liquide surnageant et on ajoute 0,95 g de chlorure de césium et 0,1 ml d'une solution à 10 mg par ml de bromure d'éthidium par ml. On centrifuge à 12.000 g dans un rotor
<EMI ID=59.1>
des plasmides par fluorescence au rayonnement ultraviolet de grande longueur d'onde et on la recueille à la seringue en perçant latéralement le tube. On centrifuge l'ADN de plasmide jusqu'à l'équilibre dans un second gradient chlorure de césium/bromure d'éthidium. On extrait la bande résultante à quatre reprises avec de l'isopropanol saturé en chlorure de sodium et en eau, puis on précipite l'ADN par l'éthanol, on le redissout dans du milieu TE et on le reprécipite. On
<EMI ID=60.1>
Tracé physique de la carte des plasmides recombinants à l'aide d*endonucléases de restriction.
On acquiert les endonucléases de restriction EcoRI, PstI, Sali, BglII et Small de la Société Boehringer; BamHI, HindIII, HinfI, AvaI, Xbal et HincII de la Société Bethesda Research Laboratories et KpnI de la Société New England Biolabs. On met l'ADN de plasmide recombinant purifié à digérer avec ces enzymes dans des conditions de réaction spécifiées par les fabricants. On soumet les produits de digestion à l'analyse par électrophorèse soit dans de l'agarose à 1%, soit dans du gel d'acrylamide à 7% et on les visualise par coloration au bromure d'éthidium et fluorescence dans l'ultraviolet. On utilise comme marqueurs pour la dimension de l'ADN de bactériophage lambda digéré par HindIII (Boehringer) et du plasmide pAT153 digéré par HinfI.
Orientation et repérage d'ADN de VFA inséré dans les plasmides au moyen des oligonucléotides provenant du traitement du
<EMI ID=61.1>
effectuant une électrophorèse sur gel à deux dimensions. On marque les oligonucléotides avant l'électrophorèse suivant le procédé de Harris (T J R Harris; Nucleic Acids Research,
<EMI ID=62.1>
1 unité de RNase Tl ou bien on les isole d'un gel bidimensionnel puis on les marque en position terminale. Dans le dernier cas, on soumet un produit de digestion de RNase Tl
<EMI ID=63.1>
T J R Harris & F Brown, 1978 loc. cit.) à la séparation par électrophorèse sur gel à deux dimensions et on effectue une
<EMI ID=64.1>
Dans chaque mode opératoire, on élue les oligonucléotides des morceaux de gel suivant le procédé d'écrasement et d'imbibition (A Maxam & W Gilbert: Proceedings of the National Academy of Sciences, E.U.A., 74, 560-564, 1977). L'ordre des oligonucléotides dans le génome est décrit par T J R Harris, K J H Robson & F Brown (J General Virology,
1980, sous presse).
On met l'ADN recombinant purifié à digérer avec des endonucléases de restriction, on sépare les produits sur un gel d'agarose à 1%, puis on les transfère sur un filtre nitrocellulosique suivant le procédé de Southern
(E M Southern: J Molecular Biology, 98, 503-513, 1975). On met le filtre à préincuber dans du tampon d'hybridation (à
40% de formamide, 0,4 M en NaCl, 10 mM en acide pipéra-zine-N,N'-bi�(2-éthanesulfonique)-NaOH, pH 6,4 (PIPES-NaOH,
<EMI ID=65.1>
0,04% de Ficoll [haut polymère synthétique de saccharose et d'épichlorhydrine] à 0,04% de polyvinyl pyrrol idone 400 et 0,04% d'albumine de boeuf) à 50 [deg.]C pendant 2 heures dans un sac en matière plastique scellé avant d'ajouter les oligonucléotides de RNase Tl marqués (75 à 150.000 coups par
<EMI ID=66.1>
milieu 2xSSC (8x250 ml en 6 heures), on le sèche à l'air et on en effectue l'autoradiographie à -70*C sur de la pellicule radiographique Fuji avec écran intensifiant. Résultats.
Les cartes physiques des trois plasmides recombinants, pFA61/t206, pFA61/t243 et pFA61/76, de même que leur alignement et la correspondance avec les gènes de VFA, déduits en application des procédés ci-dessus, sont données à la Fig. 2.
L'orientation du plus gros recombinant, à savoir pFA61/t206 qui contient une séquence d'environ 5800 paires de nucléotides correspondant à environ 73% de la séquence d'ARN de VFA, est déterminée d'abord au moyen d'oligonucléotides de ribonucléase Tl provenant de l'ARN du virus et dont la carte a été préalablement établie (Harris et al.,
1980 loc. cit.) Les oligonucléotides de Tl n* 3, 4 et 20 et
27 sont particulièrement utiles à cette fin en raison de la précision (indiquée à la Fig. 2) avec laquelle leur position dans l'ARN de VFA est connue. L'alignement des autres r�combinants (par exemple pFA61/76) par rapport au recombinant pFA61/t206 et à l'ARN de VFA se détermine par traçage de la carte des fragments d'endonucléases de restriction des recombinants et par hybridation avec des oligoribonucléo tides de Tl provenant de l'ARN du virus.
Deux des recombi-nants montrés à la Fig. 2 contiennent de manière évidente l'information génétique pour différentes protéines du virus
<EMI ID=67.1>
orientation pour l'expression d'un polypeptide consistant en un produit de fusion de la partie N-terminale de la �-lactamase codée par le plasmide et d'un polypeptide déterminé par VFA .
a) EXPRESSION.
Construction d'un vecteur d'expression, pXYl.
On exécute une préparation de plasmide recombinant à grande échelle de pOP 203-13 (à obtenir chez Forrest Fuller, Harvard University, E.U.A.) en appliquant les tech-
<EMI ID=68.1>
plasmide pAT153 à digérer avec 5 unités d'EcoRI et 5 unités de HindIII, comme ci-dessus. On fait passer les deux échantillons d'ADN alors sur un gel d'agarose. On découpe hors du gel d'agarose le fragment d'ADN de 0,5 kb (kilopaire de bases) de pOP 203-13 et le fragment d'ADN de 3,6 kb de pAT153 et on en exécute l'extraction suivant Vogelstein et Gillespie, Proc. Nat. Acad. Sci., 76, 615-619, 1979. On mélange les fragments d'ADN purifié et on en effectue la liaison au moyen de 0,1 unité d'ADN ligase T4 (Miles) pen-
<EMI ID=69.1>
parée comme ci-dessus) et on étale les cellules sur des
<EMI ID=70.1>
par ml d'ampicilline (Société Sigma)] et on met le tout à incuber à 37*C jusqu'au lendemain. On obtient de nombreux recombinants dont on caractérise l'un plus en détail en traçant la carte de restriction et qu'on désigne pXYl
(Fig. 14). Les fragments d'ADN complémentaire en double
<EMI ID=71.1>
peuvent conduire à l'expression d'une protéine hybride consistant en les premiers huit aminoacides de � -galactosidase, deux aminoacides du site EcoRI et un certain nombre d'aminoacides codés par le fragment d'ADN complémentaire en double chaîne de VFA introduit. Les protéines hybrides ainsi obtenues sont régies par l'opéron lac. La transcription peut être induite (accrue) par addition de
<EMI ID=72.1>
propyle) lorsque le plasmide recombinant se trouve dans une bactérie hôte contenant une quantité suffisante d'un répresseur protéique spécifique. Ceci peut être obtenu par intro-
<EMI ID=73.1>
bactérie hôte (voir Henning et al., Proc. Nat. Acad. Sci..
76, 4360-4364, 1979).
b) Introduction de l'ADN copié en double chaîne du virus de <EMI ID=74.1>
<EMI ID=75.1>
ci-dessus à digérer avec 6 unités d'EcoRI et 1 unité de PstI pendant 1 heure à 37[deg.]C. On obtient ainsi une digestion complète par EcoRI et une digestion qui n'est que partielle par PstI. On isole sur gel d'agarose, comme décrit précédemment, le produit de digestion partielle de 4,0 kb contenant tout l'ADN complémentaire inséré. On ajoute,le produit
<EMI ID=76.1>
2 unités d'EcoRI et de 2 unités de PstI) et on unit les fragments d'ADN ensemble par incubation avec de l' ADN
<EMI ID=77.1>
l' ADN pour transformer des cultures convenables d'E. coli HB101 qu'on met ensuite à croître sur des plaques type L-Tc <EMI ID=78.1>
cline). On obtient de nombreux recombinants qui sont sensibles à l'ampicilline, ce qui indique l'insertion d'un
<EMI ID=79.1>
davantage un tel plasmide recombinant en traçant la carte de restriction et on lui attribue la désignation pWRL 1000
(voir Fig. 15). Ce plasmide contient le promoteur lac et les séquences d'ADN complémentaires de VFA codant pour P88 dans l'orientation correcte.
<EMI ID=80.1>
Pour obtenir l'expression des séquences de VFA, il est nécessaire d'éliminer les segments d'ADN séparant l'ADN
<EMI ID=81.1>
pWRL 1000 purifié à digérer avec 10 unités de SacII et on effectue une précipitation par l'éthanol. On redissout l'ADN sec dans 0,1 ml de tampon (0,1 M en NaCl, 0,005 M en MgCl2, 0,005 M en CaCl2, 0,02 M en chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, pH 8,1, 0,001 M en EDTA) et on le fait réagir avec 0,2 unité de nucléase Bal 31 (BRL) à 18 "C pendant 15 minutes. On arrête la réaction par addition de
<EMI ID=82.1>
élimine en moyenne 300 paires de base d'ADN des extrémités de l'ADN en double chaîne linéaire. Après précipitation par l'éthanol, on met l'ADN à digérer avec 5 unités d'EcoRI et on effectue une nouvelle précipitation par l'éthanol. On
<EMI ID=83.1>
[(0,06 M en chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, pH 7,5, 0,008 M en MgCl2 et 0,2 mM en dATP, en dTTP, en dCTP et en dGTP , 0,01 M en P-mercaptoéthanol, 1 mM en ATP et contenant 1,4 unité d'ADN polymérase E. coli (gros frag-
<EMI ID=84.1>
10 minutes. On condense les extrémités franches du plasmide linéaire ensemble au moyen de 0,4 unité d'ADN ligase T4
<EMI ID=85.1>
On obtient un certain nombre de recombinants sur des plaques type L-Tc. On caractérise l'un des recombinants par le tracé de la carte de restriction et on lui donne la désignation
<EMI ID=86.1>
révèle avoir régénéré un site EcoRI à la jonction du promoteur lac et des séquences d'ADN complémentaire de VFA. Les protéines codées par le plasmide, examinées sur la souche AB2480 sensible à l'ultraviolet suivant la "technique Maxicell" (Sancar et al., J.Bact., 137, 692-693, 1979) montrent que pWRL 1004 synthétise de grosses protéines
(50.000 daltons) codées par l'ADN complémentaire de VFA.
d) Construction de plasmides d'expression supplémentaires.
<EMI ID=87.1>
<EMI ID=88.1>
<EMI ID=89.1>
nant une séquence reconnue par EcoRI).. L'introduction du "chaînon" EcoRI (provenant de Collaborative Research) se traduit par l'introduction d'un codon "stop" à une distance
<EMI ID=90.1>
"Maxicells".
<EMI ID=91.1>
de PvuII et 6 unités de PstI et on isole le fragment de 4,0 kb sur gel d'agarose comme décrit précédemment. La moitié de cet ADN est mise en oeuvre avec des cellules convenables de E. coli (conduisant à un plasmide pWRL 1140), tandis qu'on condense l'autre moitié en présence d'un chaînon EcoRI avant de 1.'utiliser pour transformer E. coli.
Un plasmide de ce dernier type se révèle contenir un site EcoRI supplémentaire introduit et est appelé pWRL 1130
(Fig. 16).
Résultats.
Les poids moléculaires et les séquences C-termi-
<EMI ID=92.1>
synthétisés par pWRL 1004, 1120, 1130 et 1140 sont indiqués aux Fig. 17 et 18. La fraction importante synthétisée par pWRL 1004 contient des séquences provenant du polypeptide p52 de VFA et est instable. Les protéines plus petites formées dans pWRL 1120 et 1130 contiennent principalement
<EMI ID=93.1>
"Maxicells". La protéine de 40.000 daltons produite par pWRL 1140 est un produit de fusion contenant les 104 aminoacides C-terminaux de p-lactamase, en plus des séquences de VFA, ce qui se traduit par une stabilisation du polypeptide. Les quatre polypeptides décrits ci-dessus sont synthétisés en quantités croissantes lorsque les bactéries sont
<EMI ID=94.1>
indique que la protéine est produite sous la commande de l'opéron lac. La protéine produite a une dimension identique à celle prévue.
Analyse des séquences de nucléotides.
On prépare des fragments d'ADN à partir des plasmides recombinants par digestion avec des endonucléases de restriction appropriées. On marque les fragments en position terminale de façon convenable et on détermine les séquences de nucléotides comme décrit par A Maxam et
<EMI ID=95.1>
détermine les détails de la région de gènes de structure de l'ARN de VFA, comme illustré à la Fig. 3. Les Fig. 4 à 10, 12 et 13 donnent des détails de l'ADN et des séquences d'aminoacides dans la région de la jonction VP4/VP2 et différentes autres parties des protéines de structure. La Fig. 9 donne des détails de la séquence d'ADN dans la partie
<EMI ID=96.1> Fig. 19 donne la séquence de nucléotides de l'extrémité 3' de l'ARN de VFA qui ne code pas pour une protéine.
EXEMPLE 2.-
On répète les procédés appliqués dans l'exemple 1 pour préparer des plasmides recombinants, mais en utilisant
<EMI ID=97.1>
Virus Research Institute).
Résultats.
La carte physique d'un plasmide recombinant
<EMI ID=98.1>
gènes de VFA, à déduire en application des procédés ci-dessus, sont montrés à la Fig. 11.
REVENDICATIONS
1.- Molécule d'ADN comprenant une séquence de nucléotides correspondant en substance à tout ou partie de
l'ARN du virus de la fièvre aphteuse (dit ci-après VFA).
Synthetic deoxyribonucleic acid and method for
get it.
The present invention relates to molecules
deoxyribonucleic acid (DNA) containing artificially constructed polynucleotide sequences which substantially correspond to all or part of the ribonucleic acid
FMD virus (RNA) and relates, in particular, to polynucleotide sequences encoding
at least one protein. It relates specifically to DNA molecules comprising artificially constructed polynucleotide sequences encoding all or part of one or more proteins existing in the FMD virus (symbolized below by VFA) or its precursor or a of its modifications. Such DNA molecules are capable of being expressed in the form of one or more polypeptides.
Foot and mouth disease is one of the most virulent and contagious diseases of farm animals. This disease is endemic in different regions of the world and can be observed in many countries in Africa, Asia and South America where it is combated to varying degrees by immunization campaigns. Regions free from this disease are only kept free by strict import quarantine measures and the slaughter of animals when the disease appears.
The FMD virus is an RNA virus belonging to the genus Aphtho virus of the Picornaviridae family (see Cooper, P.D. et al., Intervirology, 10,
165-180, 1978). Seven serotypes of FMD virus are known, namely the European serotypes A, 0 and C, the serotypes of the South African territories SAT 1, SAT 2 and SAT 3 and the serotype Asia 1. It has been possible to identify a a number of distinct antigenic subtypes in each of these serotypes and because these subtypes are so distinct, vaccines for immunologically specific subtypes are required. Different genetically distinct variants exist for each serotype or subtype.
The FMD virus has a chain
<EMI ID = 1.1>
VP2, VP3 and VP4 which constitute the proteins of the capsid <EMI ID = 2.1>
Strohmaier, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 85,
1640-1645, 1978; Bachrach, H.L. et al., Intervirology. 12,
<EMI ID = 3.1>
molecular weight of about 26.0000, while the poly- <EMI ID = 4.1>
VP4 peptide has a molecular weight of about 8000 and it is generally believed that there are about 60 copies of each of these polypeptides in the virus. The other polypeptides translated by the RNA of the virus probably have a role in the replication of the virus.
The FMD virus single RNA chain has a molecular weight of approximately 2.6 x 106, which is the equivalent of approximately 8000 nucleotides, and is of positive polarity acting as a model both for translation into polypeptides only for RNA synthesis. One of the primary translation products is a protein called P88 which is then split into the four proteins of the
<EMI ID = 5.1>
above, is susceptible to scission when the intact virus is treated with trypsin, which leads to a significant reduction in the infectious power of most strains of the FMD virus (Wild, T.F. and
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trypsin can also reduce the ability of the virus to stimulate the production of neutralizing antibodies. he
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primary gene capable of inducing effective protection against infection with the foot-and-mouth disease virus and, in
<EMI ID = 8.1> produces the neutralizing antibody and provides protection. effective against the virus (Laporte, J. et al., C. R. Acad. Sc. Paris, t. 276 Series D, 339-3401, 1973;
Bachrach, H.L. et al., J. Immunology, 115, 1636-1641, 1975). Separation of the natural proteins from the capsid of the FMD virus, in particular from the protein
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necessary to maintain very denaturing conditions and is generally considered by specialists as harmful for the maintenance of optimal immunogenicity and the production of an effective vaccine.
Using techniques developed over the past five years, it is now possible to introduce DNA encoding non-bacterial proteins into bacterial cells via a plasmid or other cloning vehicle (see , for example, Burrell, CJ, et al., Nature, 279, 43-47, 1979). Typically, the construction of recombinant DNA molecules involves the following stages: obtaining the model DNA encoding the desired protein from the non-bacterial parent and inserting this heterologous DNA model into a cloning vehicle, such as a plasmid bacterial, and then transform an appropriate bacterial host using the modified plasmid. A general discussion of the manipulation of genes leading to the formation of recombinant DNA has been published by S. Cohen in Scientific American, 233, 24-33, 1975.
Different non-bacterial genes have already been introduced and multiplied inside bacteria such as Escherichia coli, and different non-bacterial proteins have been expressed by bacteria according to the recombinant DNA technique, in particular the hemagglutinin of l viruses. influenza (Porter, AG, et al., Nature, 282, 471-477, 1979) and the hepatitis B virus protein
(Burrell, C.J. et al., 1979, loc. Cit.). Despite the considerable work carried out in recent years on recombinant DNA, there is still a lack of results which lend themselves to immediate and practical application, especially in the field of recombinant DNA involving the manipulation of viral genetic material.
The present invention provides the first description of the synthesis of distinct polypeptides substantially equivalent to the capsid proteins of natural picornaviruses, in particular to the capsid proteins of the foot-and-mouth disease virus, as well as to the serial synthesis of different peptides of the virus. FMD as individual entities or as condensed products of parts of two or more proteins. In addition, the invention provides the means of simultaneously synthesizing the immunogenic proteins normally encoded by different variants of the FMD virus without exposing to the numerous risks of the culture of this virus.
According to one of its aspects, the subject of the invention is a DNA molecule comprising a nucleotide sequence corresponding substantially to all or part of the RNA of the foot-and-mouth disease virus or to its biologically functional fragments, as defined above. -after. Preferably, the nucleotide sequence codes for at least one polypeptide of the FMD virus. Such a DNA molecule is capable of being expressed in the form of a polypeptide recognizable as corresponding substantially to a protein of the foot-and-mouth disease virus. Preferably, the nucleotide sequence codes for a structural protein
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variant, can code for all of the adjacent structural or capsid proteins, which makes it possible to synthesize them in the form of a single precursor, for example P88, which may require stabilization by inhibitors of enzymes such as the proteases which break it down into its constituent proteins. Alternatively, the
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According to another variant, the nucleotide sequence can code for all or part of at least two proteins of the foot-and-mouth disease virus, each of which derives from a different variant of the foot-and-mouth disease virus.
According to a preferred aspect, the nucleotide sequence codes for a protein of serotype A or O of the foot-and-mouth disease virus and more advantageously serotype A10 and, in particular, strain 61. In addition, the nucleotide sequence can comprise sequences control sequences positioned in an adjacent position, these control sequences deriving either from the nucleic acid of the FMD virus, or from a heterologous source.
According to another aspect, the subject of the invention is a recombinant DNA molecule comprising an operon which
- comprises initiation sequences and termination sequences, as defined below, and a nucleotide sequence coding in substance for all or part of at least one FMD virus protein, the nucleotide sequence being located between the initiation and termination sequences of the operon.
The invention further relates to a recombinant DNA cloning vehicle capable of expressing all or part of a foot-and-mouth disease virus protein comprising an operon which comprises initiation sequences and termination sequences and a nucleotide sequence encoding substantially all or part of at least a fraction of the FMD virus, the nucleotide sequence being located between the initiation sequences and termination sequences of the operon.
According to another aspect, the invention relates to a host cell containing a cloning vehicle for recombinant DNA and / or a recombinant DNA molecule as defined above.
The invention further relates to an antigen for stimulating the production of antibodies against the foot-and-mouth disease virus in a mammal, which comprises at least one polypeptide promoting immunity against the foot-and-mouth disease virus which is prepared by expression a DNA molecule as defined above and which is produced by a host cell transformed by a recombinant DNA cloning vehicle as defined above,
The subject of the invention is also a process for preparing a DNA molecule substantially coding for at least one polypeptide of the foot-and-mouth disease virus, according to which:
(a) isolating single-stranded RNA from the foot-and-mouth disease virus;
(b) preparing a first single-stranded copy of the FMD virus RNA into DNA;
(c) preparing a second single chain of DNA complementary to the first and attached to the latter by hydrogen bonds to obtain a double chain of DNA.
The double DNA chain thus obtained can be inserted into a cloning vehicle after digestion of the latter with a restriction endonuclease, the free ends of the cloning vehicle being joined to the DNA molecule to constitute a recombinant cloning. This, in turn, can be introduced into an appropriate host cell, for example by transformation.
For the purposes of the invention, the terms used have the following meanings:
Nucleotide: unit of DNA or RNA comprising a sugar radical (pentose), a phosphate and a nitrogen heterocyclic base. The base is united to the sugar radical by glycosidic carbon (carbon 1 'of pentose) and the base characterizes the nucleotide. The four DNA bases are adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and thymine (T). The four bases of RNA are A, G, C and uracil (U).
Recombinant DNA: hybrid double-chain DNA sequence comprising at least two double-chain DNA nucleotide sequences, the first sequence not being observed in nature in the presence of the second sequence.
Cloning vehicle: DNA in double non-chromosomal chain capable of replication after introduction into a unicellular microorganism.
Plasmid: cloning vehicle from viruses or bacteria.
Structural gene. DNA nucleotide sequence which codes for an amino acid sequence characteristic of a specific polypeptide.
Initiation sequences: DNA nucleotide sequences that regulate the initiation of transcription or translation. Termination sequences: DNA nucleotide sequences at which transcription or translation ceases. Transcr iption: process by which RNA polymerase is caused to move along the DNA sequence forming messenger RNA.
Translation: process of production of a polypeptide by a messenger RNA.
Operon: one or more structural genes which code for the expression of a polypeptide and which are preceded by initiation sequences and followed by termination sequences.
Expression: process involved in the production of a polypeptide from a structural gene.
Biologically functional fragment. DNA molecule which codes for antigenic determinants capable of stimulating an immune response in a mammal or which codes for a protein or part of protein which is necessary for the proper confirmation of an antigenic determinant or which codes for a protein or part which is important for the life cycle of the FMD virus in vivo and / or in vitro.
The invention is described further below with reference to the accompanying drawings in which:
Fig. 1 is a diagram of the genetic map of the RNA of the FMD virus and the proteins derived therefrom; Fig. 2 is a diagram of the physical maps of the three recombinant plasmids compared to the genetic map of the RNA of the foot-and-mouth disease virus; Fig. 3 is a diagram of the gene structure region of the FMD virus RNA and shows the VFA part of the combining plasmid pFA61 / t76 aligned with the gene structure region of the virus; Fig. 4 to 7 are diagrams of the DNA and amino acid sequences indicated by thick lines in FIG. 3:
Fig. 8 is a diagram comparing the sequences <EMI ID = 12.1>
foot and mouth disease; Fig. 9 is a diagram of the C-terminal nucleotide sequence of VP3 and the nucleotide sequence <EMI ID = 13.1>
pFA61 / t76; Fig. 10 is a diagram of the sequences of r.ucleotides and amino acids at the junction of the region coding for VP2 and VP3 in the recombinant plasmid pFA61 / t76 which directly follows the sequence of FIG. 5; Fig. 11 is a diagram of the structural gene region of the VFA RNA and shows the VFA part of the <EMI ID = 14.1>
VFA structural genes; Fig. 12 is a diagram of the DNA sequence and the predicted amino acid sequence of the VFA structural gene region inserted into the recombinant plasmid pFA61 / t76; Fig. 13 is a diagram of the DNA sequence and the amino acid sequence predicted for VP4, VP2, VP3 and
<EMI ID = 15.1> Fig. 14 is a diagram of the construction of the expression plasmid pXY1; Fig. 15 is a diagram of the introduction of a <EMI ID = 16.1> Fig. 16 illustrates the construction of expression plasmids; Fig. 17 illustrates the protein products and molecular weights of the proteins obtained by the expression of the plasmids shown in FIG. 16; Fig. 18 illustrates the amino acid and nucleotide sequences. C-terminals of the proteins shown in FIG. 17; Fig. 19 is a diagram of the nucleotide sequence of PFA61 / t243 corresponding to the 3 'end of the VFA RNA comprising at least part of the polyA addition.
Fig. 1 is a simplified map of the RNA of the FMD virus which, as already indicated, has a length of approximately 8000 nucleotides. RNA is translated from the 5 'end to the 3' end. As with many messenger RNA molecules, VFA RNA contains a polyadenylic acid sequence at the 3 'end. It also contains a series of polycytidylic acid with a length of around 100 to 200 nucleotides, depending on the strain of virus. The polycytidylic acid sequence is located approximately 400 nucleotides from the 5 'end of the RNA
(Rowlands, D.J. et al., J. Virology, 26, 335-343, 1978).
VFA RNA is translated as a polyprotein which is split during translation into different large polypeptides called primary products and identified by the letter "P" and a number. These primary products are then split, probably by proteases
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There are parts of VFA RNA which do not encode a protein, but which play an important role in the life cycle of VFA in vitro and / or in vivo, for example which influence the viability of the virus.
From the study of the kinetics of the translation of viral information into polypeptides, both in cells infected by the virus and in systems synthesizing the cell-free protein, it was possible to deduce the order of the viral genome genetic information coding for major polypeptides (Doel, TR et al.,
<EMI ID = 18.1> J. Virol, 33, 59-68, 1980). From these studies, it has been established that the first 550 nucleotides of VFA RNA, starting at the 5 'end, do not appear to code for any polypeptide. The proteins P16 and P20a are closely related and contain the VFA translation initiation site, as shown by the exclusive labeling with N-formylmethionine during in vitro analysis (Sanger, DV et al., 1980 loc . cit.). P88 is the primary product which is split into VP1-4. Based on an evaluation of known data, the gene for VP is approximately 700 nucleotides in length and must be located in the region delimited by the positions of nucleotides 2300. and 3800.
There are different techniques for preparing the recombinant DNA molecule according to the invention, one of which comprises the synthesis of a single chain DNA copy (cDNA) of purified RNA from a virus isolate complete virulent foot and mouth disease using reverse transcriptase. After the starting RNA chain has been degraded, the cDNA is converted into a double chain (cDNA dc) which is then subjected to a treatment aimed at eliminating the DNA loops which may have formed, for example by means of of a nuclease. Another means of preparing the double chain cDNA is chemical synthesis according to the usual techniques.
When the double chain cDNA has been produced, the next stage consists in its insertion into a cloning vehicle which can be, for example, a bacterial plasmid or a bacteriophage. This result can be obtained first by splitting the DNA of the purified cloning vehicle with the intervention of a restriction endonuclease such as PstI, which splits the DNA into sites where the complementary nucleotides are arranged in symmetry. palindromic. The VFA double chain cDNA can then be inserted and linked between the free ends of the cloning vehicle according to one or
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can be attached to the 3 'end of the cloning vehicle by a process known as homopolymer addition, which consists in using a terminal transferase. Likewise, several nucleotides "C" are added to the 3 'end of the double chain VFA cDNA. The cloning vehicle augmented by the addition and the double chain cDNA are then mixed together, whereupon the cohesive ends formed by the placement of the addition are welded together.
There are different variants instead of adapting an addition. One is the digestion of double chain cDNA with endonucleases forming blunt or cohesive terminations. Blunt ends can be made cohesive by digestion with an exonuclease. In another method, the blunt ends can be joined directly by means of DNA ligase. In yet another method, synthetic oligonucleotides can be joined to blunt-ended double-chain cDNA and the new ends can be made cohesive by digestion with an exonuclease or endonuclease, before binding to a suitably linearized cloning vehicle.
When the double-chain VFA cDNA has been linked to the DNA of the cloning vehicle, an appropriate host, for example a bacterium, is transformed using the recombinant cloning vehicle in order to allow the host to express the cDNA in double chain of VFA and thus produces one or more polypeptides manifesting the antigenic power of VFA.
Different host-cloning vehicle combinations are known which could be used for the expression of VFA proteins. For example, useful cloning vehicles are bacterial plasmids like pAT153,
(Twigg, A.J., Nature, 283, 216-218, 1980; provided by Prof. D. Sherratt, University of Glasgow, Scotland), pBR322,
(Sutcliffe, J.G. Cold Spring Harbor Symposium for Quantitative Biology, 43, 77-90, 1978, provided by Dr. H. Boyer, University of San Francisco, E.U.A.), and other E. plasmids. more diverse coli and host plasmids. Bacteriophages like the many phage derivatives � might be fine too. Hosts which can be used are in particular bacteria such as strains of E. coli K. 12, for example E. coli HB101, (Boyer, HW et al., J. Mol. Biol., 41, 459-472, 1969 ; provided by Dr. H.
Boyer, University of San Francisco, USA), E. coli X1776, (Curtiss, R. et al., Ann Report Dept. of Microbiology University of Alabama, 1976, 96-106, provided by Dr. R. Curtiss III, University of Alabama, Birmingham, USA), E. coli X2282 (procured by Dr. R. Curtiss III) and E. coli MRC1, (procured by Dr. S. Bremer, University of Cambridge, England), strains of Bacillus subtilis and Pseudomonas, as well as yeasts and other fungi and other single-celled organisms. However, it is to be expected that not all hosts will be equally efficient.
In each cloning vehicle, various sites can be accessible for the insertion of the double chain DNA copy of VFA, each site being designated by the restriction endonuclease which splits the DNA. For example, the enzyme PstI cuts the plasmid pAT153 in the gene coding for resistance to penicillin. There are various other endonucleases that can be used, including HindIII and EcoRI.
The selection of the site on the cloning vehicle for the insertion of the cDNA of VFA can be governed by various factors, for example the size of the polypeptide to be expressed and the location of the initiation and termination sequences. Therefore, not all sites may be equally effective for a given polypeptide. The choice of site can also be governed by the initial screening method to detect the recombinants, for example, as indicated, the enzyme PstI cuts the plasmid pAT153 in the gene coding for resistance to ampicillin, so that colonies transformants showing resistance to tetracycline but sensitivity to ampicillin are likely to contain at least a certain amount of complementary DNA in double chain of VFA.
It is essential that the complementary VFA double helix DNA inserted into the cloning vehicle can be read in the correct phase. To this end, it may be necessary to insert additional nucleotides, for example between the starting points for transcription and translation of the complementary DNA fragment into a double chain of VFA whose expression is desired. The addition of these nucleotides obviously cannot form a nucleotide sequence which could interrupt translation.
Expression of VFa double chain complementary DNA, which has been inserted into a cloning vehicle which, in turn, can be used to transform an appropriate host cell, can be detected by the appearance of a function specific for the protein, that is to say the immunological activity in the case of VFA. Different methods are applicable, for example the method of selecting an essentially immunological colony described by S. Eroome and W. Gilbert in Proc. Nat. Acad. Sci. ,
1978, 75, 2746-2749. An alternative, which is a slightly simpler technique, is to inject the raw bacterial extract from a culture of transformed bacteria into a laboratory animal using a suitably designed cloning vehicle and observe the formation appropriate antibodies.
A second variant consists in performing immunoprecipitation of a crude extract of the bacterial cells. Yet another method is the "Maxicell technique" described by Sancar et al., In J Bact., 1979, 137, 692-693.
The nature of the polypeptide produced as a result of the expression by the host of the recombinant DNA molecule of the invention depends on the point of insertion into the DNA of the cloning vehicle, so that in practice it is possible forming a precursor polypeptide which comprises a polypeptide encoded by the complementary double chain DNA of VFA and an additional polypeptide encoded by the DNA of the cloning vehicle. For example, if the plasmid pAT153 is cut by the PstI enzyme, a precursor polypeptide comprising part of the penicillinase and the polypeptide encoded by the complementary double chain DNA of VFA can be expressed. The precusor polypeptide can then be split so that the desired VFA polypeptide is separated from the superfluous amino acid sequence.
The initial cut is usually carried out outside the host after the collection of the microbial culture according to techniques known to the specialist. Cleavage may be necessary for the VFA expression product to perform the desired activity, but during collection of the microbial culture, the fact that an unnecessary amino acid sequence is linked to the desired FVA polypeptide may help prevent degradation of the expression product by endogenous enzymes. Alternatively, cleavage can be carried out inside the host, which can be achieved by inserting into the cloning vehicle DNA encoding the desired cleavage enzymes.
The production of a fusion product of a polypeptide encoded by the double chain complementary DNA of VFA and of a fraction, for example, of penicillase, can increase the stability of the hybrid protein in E. coli and even increase the immunogenic power of the VFA protein.
Alternatively, appropriate nucleotide sequences from, for example, VFA RNA can be inserted before the VFA double chain complementary DNA to ensure that this VFA double chain complementary DNA can be expressed alone and not as form of a fusion product with a host polypeptide.
When the transformants containing at least a certain amount of complementary DNA in double chain of VFA have been identified, as indicated above, the recombinant DNA of the cloning vehicle is purified, then is subjected to analysis for the determination of the amount of VFA double chain complementary DNA that has been inserted. To this end, the recombinant cloning vehicle DNA is treated using various restriction endonucleases, for example EcoRI, PstI, Sali, BglII, BamHI, HindIII and Hinfl, and the digestion products can be analyzed by electrophoresis. on gel.
Using these results and those obtained when the oligonucleotides produced by Tl, formed by digestion of VFA RNA by the nuclease Tl which is a ribonuclease, are subjected to hybridization with the products isolated from the digestion of recombinant DNA. by restriction nuclease, maps of complementary double chain DNA of VFA inserted into the cloning vehicle can be established which are similar to those of FIG. 2. From these maps, it is possible to select the recombinant which contains the desired VFA gene, <EMI ID = 20.1>
According to another aspect, the subject of the invention is a method for establishing the map of the recombinant DNA molecule as defined above, according to which:
(a) the DNA is digested with restriction endonucleases and the fragments are separated;
(b) adding RNA-labeled oligonucleotides <EMI ID = 21.1>
(c) identifying the products of digestion by the restriction endonucleases with which the oligo- <EMI ID = 22.1>
The different DNA molecules can be useful as means of investigation for the in vitro diagnosis of the presence of VFA in biological samples and, in particular, can be used to determine the serotype or subtype causing an onset of fever. mouth and mouth disease. To this end, the DNA molecules can be labeled in a known manner using a radioactive isotope. In addition, the expression product of the recombinant cloning vehicle can be used for serological diagnosis and in the preparation of single or multivalent vaccines against foot-and-mouth disease, according to conventional methods for the preparation of vaccines. Such vaccines are effective in raising antibodies in vaccinated animals and thus protecting them against foot-and-mouth disease.
According to another aspect, the subject of the invention is a vaccine for stimulating the production of antibodies against the foot-and-mouth disease virus in a mammal, which comprises at least one protein manifesting an immunogenic capacity against VFA which is produced by a host cell. as defined above, in addition to a veterinarily acceptable excipient.
According to yet another aspect, the invention relates to a method for stimulating the production of antibodies against the foot-and-mouth disease virus in a mammal, according to which a non-toxic and immunologically effective amount of a vaccine as defined is administered. above. By "immunologically effective non-toxic amount" is meant an amount of protein manifesting an immunogenic capacity against the FMD virus which is sufficient to raise enough antibodies in a mammal for it to, if it comes into contact with a virulent form of the FMD virus after vaccination, does not succumb to the condition, but is not toxic to the mammal.
Other particularities and characteristics of the invention are described in the examples below, which are presented by way of illustration only and without limitation of the scope of the invention.
EXAMPLE 1.-
Preparation of VFA RNA.
About 10 ml of a recent harvest of VFA type A10 (strain A61) (introduced free of charge on request from the Animal Virus Research Institute, Pirbright, England, satisfying the legal conditions of the different countries) are introduced into Eagle's environment in each of
10 vials of Roux containing monolayers of approximately
108 BHK21 cells. After moderate stirring for 30 minutes, the medium is decanted and 20 ml of fresh medium are introduced into each flask. After the virus infection has destroyed the cell monolayers (3 to 4 hours), the medium is decanted and the cell debris is separated by centrifugation at 12,000 g for 15 minutes at 4 [deg.] C. The virus is then collected in a pellet by centrifugation at
90,000 g for 1 hour at 4 [deg.] C.
The virus pellet is resuspended in 2 ml of TNE buffer [10 mM in tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride, (pH 7.5), 150 mM in NaCl
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clear at 1.0% w / v sodium dodecyl sulfate
(DSS) and it is deposited on a gradient formed beforehand
(sucrose from 15 to 45% weight / volume) in TN buffers
(100 mM in tris (hydroxyethyl) aminomethane hydrochloride, pH 7.6, 100 mM in NaCl) and centrifugation is carried out at
100,000 g for 2 hours at 10 [deg.] C. Fractions (1 ml) are monitored at 260 nm and the virus-containing fractions are extracted once with an equal volume of phenol: chloroform (1: 1), then the aqueous phase is precipitated by the addition of 2 volumes ethanol and incubate overnight at 20 [deg.] C. The RNA precipitate is collected by centrifugation at 5000 g for 30 minutes at 4 [deg.] C.
The supernatant liquid is discarded, the pellet is drained, then it is dissolved in 0.5 ml of TNES buffer (10 mM in tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride, pH 7.6, 150 mM in NaCl, 1 mM in EDTA and 0.2% w / v DSS). The solution is deposited on a sucrose gradient formed beforehand (5 to 25%) in TNES buffer and centrifugation is carried out at
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fractions (0.5 ml) containing RNA sedimenting at 35 s, they are extracted once with phenol-chloroform, they are precipitated with ethanol and the solids are redissolved as described above for the virus. The resulting solution is precipitated with ethanol and finally the solids are redissolved in 0.05 ml of double-distilled water.
Synthesis of complementary double chain DNA (cDNAdc).
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from Collaborative Research) in a final volume of
100 ni) containing 0.4 mM dithiothreitol, 8 mM MgCl2, tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride, pH 8.1,
32
<EMI ID = 26.1>
2.5 Ci / mmol phosphate from Radiochemical Center, Amersham), 0.2 mM dTTP (d-thymidinetriphosphate), 0.2 mM dCTP (d-cytidinetriphosphate), 0.2 mM dGTP (d-guano -
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reverse transcriptase (provided by Dr. J. Beard, Life Sciences Inc., Florida). The reaction is stopped by addition of EDTA (20 mM) and DSS (0.2% w / v). A sample (2%) of this mixture is deposited after the reaction has stopped in drops on 2.5 cm DE81 filter paper discs.
(Whatman Company). They are washed thoroughly with 5% Na2HPO4 (w / v), then briefly (5 minutes) with distilled water before drying and passing them over the scintillation counter. We can deduce from the results a return
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rest of the reaction mixture using the phenol-chloroform system and precipitated with ethanol as described above, but adding sodium acetate up to 0.2 M before the addition of ethanol . We dissolve the
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incubate at 70 ° C for 20 minutes to eliminate the template, namely the VFA RNA. The solution is neutralized with acetic acid and the complementary DNA is separated from the degraded RNA by passage over a column (100 mm × 15 mm) of phenol-formaldehyde resin beads in chloroform. The dried base is suspended again until
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in dithiothreitol, 10 mM in MgCl2, 0.4 mM in dCTP, 0.4 mM in
32
dGTP, 0.4 mM in dATP (5.5 Ci / mmol CaPj-dATP, Radiochemical Center, Amersham), 0.4 mM in dTTP and contains 36 AMV units of reverse transcriptase. After 4 hours of incubation at
45 [deg.] C, the reaction is stopped by addition of EDTA (20 mM) and DSS (0.2% w / v). The mixture is extracted using the phenol-chloroform system, NaCl is added to 0.2 M and the mixture is precipitated using 2 volumes of ethanol by standing overnight at -20 [deg.] C . We put back the dried up base
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as entrainer, the substance of the excluded peak is precipitated with ethanol. Analysis on a DE81 paper disc, as described above, indicates that the synthesis of the second chain reaches approximately 60% of the maximum theoretical yield. The dried pellet is returned from the ethanol precipitation in
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sample (A) at -20'C, while the rest (sample-
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Sigma Company) for 30 minutes at 37 ° C. The reaction is stopped by extraction with the phenol-chloroform system and the substance of the aqueous phase is precipitated with ethanol. We resuspend the dried pellet in,
<EMI ID = 34.1>
to eliminate the loops of the double chain complementary DNA, a small amount (2%) of the samples is heated
<EMI ID = 35.1>
then the mixtures are cooled to 60 [deg.] C and are added to it at various times (0; 0.25; 1 and 14 hours) 3 units of SI
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nuclease resistance SI by fixation on a DE81 paper disc as described above. The results show that more than 53% of sample A are resistant to digestion with nuclease SI against 2% of sample B, if the two samples are incubated with nuclease S1 immediately after cooling to 60 [deg.] C. If nuclease SI is added 15 minutes after the samples
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81% and 15%, respectively. Consequently, the initial treatment with nuclease SI effectively cut the loops existing after the synthesis of the second chain.
An estimate of the size of the molecules in sample B by agarose gel electrophoresis indicates that they are distributed among full-length copies
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from 200 bp, with an average value of 2000 to 4000 bp. Addition of homopolymer on plasmid and complementary DNA in double chain.
(a) Addition of dG to the vector.
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plasmid pAT153, to be digested with the endonuclease PstI under the conditions recommended by the supplier of the enzyme
(Boehringer Company). The reaction is stopped by addition of sodium acetate to 0.3 M and the precipitation is carried out with ethanol. We put the dried base back in
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(200 mCi [8 <3> -H] -dGTP / mmole). 2 threads are added to the mixture
(38 units) of terminal transferase (TT) and we put the
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after 2.5, 5 and 10 minutes. In each case, the reaction is stopped by cooling in an ice bath and addition of EDTA up to 20 mM. Analysis by precipitation with trichloroacetic acid of a 5-wire sample on each mixture shows that the incorporation of <3> H dGMP does not continue after 2.5 minutes and the average length of the homopolymer addition is at this time around 25 nucleotides. The rest of the sample is diluted 2.5 minutes to
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(hydroxymethyl) aminomethane, pH 8.0 and 1 mM in EDTA) and it is extracted once with an equal volume of phenol saturated with TE. The aqueous phase is extracted four times with ether,
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-10 [deg.] C. It is estimated that the DNA concentration of this solution <EMI ID = 44.1>
(b) Addition of dC to complementary DNA in double chain.
<EMI ID = 45.1>
of beef and 0.5 mM in <3> H dCTP (600 mCi [5- <3> H] -CTP / mmole) with
<EMI ID = 46.1>
5 minutes and the incorporation by precipitation is determined <EMI ID = 47.1>
each. This analysis indicates that the average length of the homopolymer addition is approximately 70 nucleotides after 2 minutes and 160 nucleotides after 5 minutes. The two aliquots are combined, they are extracted once with phenol and four times with ether, then they are precipitated with ethanol,
<EMI ID = 48.1>
Transformation with re-solved plasmid and double chain complementary DNA.
<EMI ID = 49.1>
keep silent in double chain with addition dC (0.2 to 0.4 pmole) at 65 [deg.] C for 30 minutes in 100 μl of TNE buffer (10 mM in tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride, pH 8.0 ,
200 mM in NaCl and 1 mM in EDTA). The incubation temperature is lowered regularly to 20 [deg.] C in 4 hours, then
<EMI ID = 50.1>
so that it is finally 15 mM in Tris-HCl, pH 7.5,
100 mM in NaCl, 10 mM in MgCl2, 10 mM in CaCl2 and 0.5 mM in
<EMI ID = 51.1>
A culture of E. coli HB101 suitable for transformation is prepared by inoculating 1 ml of a fixed-phase culture in 60 ml of broth L (1% Bacto Difco tryptone, 0.5% Bacto Difco yeast extract and 0.5% NaCl, pH 7.2) and stirring the mixture at 37 [deg.] C for approximately
<EMI ID = 52.1>
suspension in 25 ml of 0.1 M MgCl2 at 0 [deg.] C and centrifuged again. The pellet is resuspended in 2 ml of
<EMI ID = 53.1> for 30 minutes. Approximately 0.2 ml of such a cell culture suitable for transformation is gently mixed with 0.1 ml of soldered pAR153 / cDNA and the mixture is left to stand for a further 30 minutes at 0 ° C., then 2 minutes at 42 ° C. C and finally 30 minutes at 0 * C. 1 ml of broth L is then added and the transformation mixture is incubated for 25 minutes at 37 [deg.] C. 0.1 ml samples of the mixture are then spread on L-Tc plates
<EMI ID = 54.1>
cline from the Sigma Company) and the plates are incubated at
37 [deg.] C. From the ten plates, 150 tetracycline-resistant colonies are collected, which are approximately 87% sensitive.
<EMI ID = 55.1>
insertion of complementary DNA to the PstI site of pAT153. Large-scale preparation of the recombinant plasmid.
The transformants containing the plasmids are cultured en masse by introducing 10 ml of non-agitated culture into 500 ml of broth L and by inoculation.
<EMI ID = 56.1>
reaches about 1.0. Then add chloramphenicol
(Sigma Company) up to 0.1 mg per ml and the cultures are stirred at 37 [deg.] C overnight. After this multiplication, the cells are collected in a pellet by centrifugation at
5000 g for 5 minutes at 4 [deg.] C. The supernatant liquid is disinfected and discarded, then the cell pellet is resuspended in 12 ml of buffer R [50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (pH 8.0),
40 mM EDTA and 25% sucrose]. Lysosyme and EDTA are added up to 1.4 mg per ml and 60 mM respectively and the suspension is allowed to stand on ice for 5 minutes. To 16 ml of this suspension is added 30 ml of Triton mixture (0.1% Triton X-100, 62.5 mM in EDTA, <EMI ID = 57.1>
pH 8.0) and allow the mixture to sit on ice for about 10 minutes or until it becomes viscous. The mixture is then clarified by centrifugation
<EMI ID = 58.1>
the supernatant and 0.95 g of cesium chloride and 0.1 ml of a 10 mg solution per ml of ethidium bromide per ml are added. Centrifuge at 12,000 g in a rotor
<EMI ID = 59.1>
plasmids by fluorescence with long wavelength ultraviolet radiation and are collected by syringe by piercing the tube laterally. Plasmid DNA is centrifuged to equilibrium in a second cesium chloride / ethidium bromide gradient. The resulting strip is extracted four times with isopropanol saturated with sodium chloride and with water, then the DNA is precipitated with ethanol, it is redissolved in TE medium and it is reprecipitated. We
<EMI ID = 60.1>
Physical plot of the recombinant plasmid map using restriction endonucleases.
The restriction endonucleases EcoRI, PstI, Sali, BglII and Small from the company Boehringer are acquired; BamHI, HindIII, HinfI, AvaI, Xbal and HincII from the company Bethesda Research Laboratories and KpnI from the Company New England Biolabs. The purified recombinant plasmid DNA is digested with these enzymes under reaction conditions specified by the manufacturers. The digestion products are subjected to analysis by electrophoresis either in 1% agarose or in 7% acrylamide gel and they are visualized by staining with ethidium bromide and fluorescence in ultraviolet. The size of the DNA of bacteriophage lambda digested with HindIII (Boehringer) and of the plasmid pAT153 digested with HinfI are used as markers.
Orientation and tracking of VFA DNA inserted into the plasmids using oligonucleotides from the processing of
<EMI ID = 61.1>
performing two-dimensional gel electrophoresis. The oligonucleotides are marked before electrophoresis according to the Harris method (T J R Harris; Nucleic Acids Research,
<EMI ID = 62.1>
1 unit of RNase Tl or else they are isolated from a two-dimensional gel and then they are marked in the terminal position. In the latter case, we submit an RNase Tl digestion product
<EMI ID = 63.1>
T J R Harris & F Brown, 1978 loc. cit.) to separation by two-dimensional gel electrophoresis and a
<EMI ID = 64.1>
In each procedure, the oligonucleotides are eluted from the gel pieces according to the crushing and imbibition process (A Maxam & W Gilbert: Proceedings of the National Academy of Sciences, E.U.A., 74, 560-564, 1977). The order of the oligonucleotides in the genome is described by T J R Harris, K J H Robson & F Brown (J General Virology,
1980, in press).
The purified recombinant DNA is digested with restriction endonucleases, the products are separated on a 1% agarose gel, then they are transferred to a nitrocellulosic filter according to the Southern method.
(E M Southern: J Molecular Biology, 98, 503-513, 1975). We put the pre-incubated filter in hybridization buffer (at
40% formamide, 0.4 M NaCl, 10 mM piperazine-N acid, N'-bi & (65-ethanesulfonic) -NaOH, pH 6.4 (PIPES-NaOH,
<EMI ID = 65.1>
0.04% Ficoll [high synthetic polymer of sucrose and epichlorohydrin] at 0.04% polyvinyl pyrrol idone 400 and 0.04% beef albumin) at 50 [deg.] C for 2 hours in a plastic bag sealed before adding the labeled RNase Tl oligonucleotides (75 to 150,000 counts per
<EMI ID = 66.1>
2xSSC medium (8x250 ml in 6 hours), air-dried and autoradiographed at -70 ° C on Fuji radiographic film with intensifying screen. Results.
The physical maps of the three recombinant plasmids, pFA61 / t206, pFA61 / t243 and pFA61 / 76, as well as their alignment and correspondence with the VFA genes, deduced in application of the above methods, are given in FIG. 2.
The orientation of the largest recombinant, namely pFA61 / t206 which contains a sequence of approximately 5800 nucleotide pairs corresponding to approximately 73% of the VFA RNA sequence, is first determined by means of ribonuclease oligonucleotides Tl from the virus RNA and whose map has been previously established (Harris et al.,
1980 loc. cit.) The oligonucleotides of T1 no. 3, 4 and 20 and
27 are particularly useful for this purpose because of the precision (shown in Fig. 2) with which their position in the VFA RNA is known. The alignment of the other recombinants (for example pFA61 / 76) with respect to the recombinant pFA61 / t206 and to the VFA RNA is determined by tracing the restriction endonuclease fragment map of the recombinants and by hybridization. with Tl oligoribonucleotides from virus RNA.
Two of the recombinants shown in FIG. 2 obviously contain genetic information for different virus proteins
<EMI ID = 67.1>
orientation for the expression of a polypeptide consisting of a fusion product of the N-terminal part of &-lactamase encoded by the plasmid and of a polypeptide determined by VFA.
a) EXPRESSION.
Construction of an expression vector, pXYl.
A large-scale recombinant plasmid preparation of pOP 203-13 is performed (to be obtained from Forrest Fuller, Harvard University, E.U.A.) by applying the techniques.
<EMI ID = 68.1>
plasmid pAT153 to be digested with 5 units of EcoRI and 5 units of HindIII, as above. The two DNA samples are then passed over an agarose gel. The 0.5 kb DNA fragment (kilopair of bases) of pOP 203-13 and the 3.6 kb DNA fragment of pAT153 are cut out of the agarose gel and extracted according to Vogelstein and Gillespie, Proc. Nat. Acad. Sci., 76, 615-619, 1979. The purified DNA fragments are mixed and linked using 0.1 units of T4 DNA ligase (Miles)
<EMI ID = 69.1>
trimmed as above) and spread the cells over
<EMI ID = 70.1>
per ml of ampicillin (Sigma Company)] and the whole is incubated at 37 ° C. overnight. Many recombinants are obtained, one of which is characterized in more detail by plotting the restriction map and which is designated pXYl.
(Fig. 14). Duplicate complementary DNA fragments
<EMI ID = 71.1>
can lead to the expression of a hybrid protein consisting of the first eight amino acids of � -galactosidase, two amino acids from the EcoRI site and a number of amino acids encoded by the complementary double chain DNA fragment of VFA introduced. The hybrid proteins thus obtained are governed by the lac operon. Transcription can be induced (increased) by adding
<EMI ID = 72.1>
propyl) when the recombinant plasmid is found in a host bacterium containing a sufficient quantity of a specific protein repressor. This can be obtained by intro-
<EMI ID = 73.1>
host bacteria (see Henning et al., Proc. Nat. Acad. Sci ..
76, 4360-4364, 1979).
b) Introduction of the DNA copied in double chain of the virus of <EMI ID = 74.1>
<EMI ID = 75.1>
above to digest with 6 units of EcoRI and 1 unit of PstI for 1 hour at 37 [deg.] C. This gives a complete digestion with EcoRI and a digestion which is only partial with PstI. Is isolated on agarose gel, as described above, the partial digestion product of 4.0 kb containing all the complementary DNA inserted. We add, the product
<EMI ID = 76.1>
2 units of EcoRI and 2 units of PstI) and the DNA fragments are united together by incubation with DNA
<EMI ID = 77.1>
DNA to transform suitable cultures of E. coli HB101 which is then grown on L-Tc type plates <EMI ID = 78.1>
cline). Many recombinants are obtained which are sensitive to ampicillin, which indicates the insertion of a
<EMI ID = 79.1>
further such a recombinant plasmid by plotting the restriction map and assigning it the designation pWRL 1000
(see Fig. 15). This plasmid contains the lac promoter and the VFA complementary DNA sequences encoding P88 in the correct orientation.
<EMI ID = 80.1>
To obtain expression of VFA sequences, it is necessary to eliminate the DNA segments separating the DNA
<EMI ID = 81.1>
pWRL 1000 purified to digest with 10 units of SacII and precipitation is carried out with ethanol. The dry DNA is redissolved in 0.1 ml of buffer (0.1 M in NaCl, 0.005 M in MgCl2, 0.005 M in CaCl2, 0.02 M in tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride, pH 8.1, 0.001 M in EDTA) and it is reacted with 0.2 nuclease unit Bal 31 (BRL) at 18 "C for 15 minutes. The reaction is stopped by adding
<EMI ID = 82.1>
removes an average of 300 base pairs of DNA from the ends of the DNA in a double linear chain. After ethanol precipitation, the DNA is digested with 5 units of EcoRI and a further ethanol precipitation is carried out. We
<EMI ID = 83.1>
[(0.06 M in tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride, pH 7.5, 0.008 M in MgCl2 and 0.2 mM in dATP, in dTTP, in dCTP and in dGTP, 0.01 M in P-mercaptoethanol, 1 mM in ATP and containing 1.4 units of E. coli DNA polymerase (large frag-
<EMI ID = 84.1>
10 minutes. The blunt ends of the linear plasmid are condensed together using 0.4 units of T4 DNA ligase
<EMI ID = 85.1>
A certain number of recombinants are obtained on L-Tc type plates. One of the recombinants is characterized by the layout of the restriction map and is given the designation
<EMI ID = 86.1>
reveals that it has regenerated an EcoRI site at the junction of the lac promoter and VFA complementary DNA sequences. The proteins encoded by the plasmid, examined on the ultraviolet-sensitive strain AB2480 according to the "Maxicell technique" (Sancar et al., J. Bact., 137, 692-693, 1979) show that pWRL 1004 synthesizes large proteins
(50,000 daltons) encoded by VFA complementary DNA.
d) Construction of additional expression plasmids.
<EMI ID = 87.1>
<EMI ID = 88.1>
<EMI ID = 89.1>
a sequence recognized by EcoRI). The introduction of the EcoRI "link" (from Collaborative Research) results in the introduction of a "stop" codon at a distance
<EMI ID = 90.1>
"Maxicells".
<EMI ID = 91.1>
of PvuII and 6 units of PstI and the 4.0 kb fragment is isolated on agarose gel as described above. Half of this DNA is used with suitable E. coli cells (leading to a plasmid pWRL 1140), while the other half is condensed in the presence of an EcoRI link before being used to transform E. coli.
A plasmid of the latter type appears to contain an additional EcoRI site introduced and is called pWRL 1130
(Fig. 16).
Results.
Molecular weights and C-term sequences
<EMI ID = 92.1>
summarized by pWRL 1004, 1120, 1130 and 1140 are shown in Figs. 17 and 18. The large fraction synthesized by pWRL 1004 contains sequences originating from the p52 polypeptide of VFA and is unstable. The smaller proteins formed in pWRL 1120 and 1130 mainly contain
<EMI ID = 93.1>
"Maxicells". The 40,000 dalton protein produced by pWRL 1140 is a fusion product containing the 104 C-terminal amino acids of p-lactamase, in addition to the VFA sequences, which results in stabilization of the polypeptide. The four polypeptides described above are synthesized in increasing amounts when the bacteria are
<EMI ID = 94.1>
indicates that the protein is produced under the control of the lac operon. The protein produced has the same size as expected.
Analysis of nucleotide sequences.
DNA fragments are prepared from the recombinant plasmids by digestion with appropriate restriction endonucleases. The fragments are tagged in the appropriate position and the nucleotide sequences are determined as described by A Maxam and
<EMI ID = 95.1>
determines the details of the VFA RNA structural gene region, as illustrated in FIG. 3. Figs. 4 to 10, 12 and 13 give details of the DNA and amino acid sequences in the region of the VP4 / VP2 junction and various other parts of the structural proteins. Fig. 9 gives details of the DNA sequence in the section
<EMI ID = 96.1> Fig. 19 gives the nucleotide sequence of the 3 'end of the VFA RNA which does not code for a protein.
EXAMPLE 2.-
The procedures applied in Example 1 are repeated for preparing recombinant plasmids, but using
<EMI ID = 97.1>
Virus Research Institute).
Results.
The physical map of a recombinant plasmid
<EMI ID = 98.1>
VFA genes, to be deduced in application of the above methods, are shown in FIG. 11.
CLAIMS
1.- DNA molecule comprising a nucleotide sequence corresponding in substance to all or part of
FMD virus RNA (hereinafter referred to as VFA).