CN104928308A - 溶栓酶基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌以及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种溶栓酶基因、由其构建的重组表达载体和重组菌以及其应用。本发明通过套叠PCR技术优化得到的qk序列可以更好地被大肠杆菌表达菌株DE3识别，同时选用增加蛋白可溶性的载体pET-40b与优化后的qk构建形成新的重组表达载体和制备表达蛋白的重组菌，可以将功能性胞外蛋白酶分泌到细胞周质中，增加融合蛋白的可溶性和活性，最终获得的表达量高和酶活性高的枯草杆菌溶栓酶。该方法不包含包涵体溶解及蛋白复性的操作，降低了成本，具有更好的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及一种溶栓酶基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌以及应用，属于生物技术领域。
背景技术
枯草杆菌溶栓酶(Bacillus subtilis QK02)是通过检测降解纤维蛋白能力的方法筛选到的。研究表明，该酶具有较强的纤溶活性，是一种潜在的溶栓药物。它不仅具有良好的溶栓效果，而且通过口服就可以达到纤溶目的，比当前临床应用的溶栓药物(如链激酶、尿激酶等)更具备优势。发明人还发现在体内外及血管内皮细胞中该酶具有拮抗由血红素、NaNO2和H2O2带来损伤的能力。目前，该酶主要来源于野生枯草芽孢杆菌发酵的纳豆、豆豉等，但是纳豆、豆豉的风味还不能被许多人所接受。此外，从发酵液中分离纯化纳豆激酶通常产量较低、活性较低、生产成本高，这些因素都在一定程度上限制了纳豆激酶的开发和利用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有溶栓酶产量低、酶活性较低、生产成本高的缺陷，提供一种能够高效表达枯草杆菌溶栓酶的溶栓酶基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌以及应用。
为实现上述目的，首先，本发明提供一种溶栓酶基因，其核苷酸序列或核苷酸序列的互补链如SEQ ID NO:1所示。
本发明所提供的溶栓酶基因是从枯草杆菌Bacillus sutilisQK-02中提取基因组DNA，再通过套叠PCR扩增优化得到，其中套叠PCR所用引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示。通过套叠PCR优化后的溶栓酶基因序列可以更好地被大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)识别，有助于蛋白的表达。
本发明还提供了上述溶栓酶基因在制备溶栓酶及相关药物中的应用。
第二，本发明提供了一种含有溶栓酶基因的重组载体，由pET40b表达载体和核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的溶栓酶基因经过Sal I/EcoR I酶切后重组而成。
优选地，上述重组载体的T7启动子前插入有lac操纵子。插入lac操纵子使该重组载体成为一种被IPTG高效诱导的启动子
本发明还提供了上述含有溶栓酶基因的重组载体在制备溶栓酶及相关药物中的应用。
第三，本发明提供了一种表达溶栓酶的重组菌，是将上述含有溶栓酶基因的重组载体通过钙转的方法导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中所得到的重组菌。该重组菌用于表达枯草杆菌溶栓酶，需要说明的是除了CaCl2法，其他如电穿孔转化法、原生质体转化法等途径也可以将含有溶栓酶基因的重组载体导入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到的重组菌。
本发明还提供了上述表达溶栓酶的重组菌在制备溶栓酶及相关药物中的应用。
第四，本发明所提供了—种溶栓酶的表达方法，的枯草杆菌重组蛋白的制备方法，该方法利用上述表达溶栓酶的重组菌在蛋白表达时，其诱导过程中加入IPTG诱导，再通过肠激酶酶切，分离纯化得到枯草杆菌溶栓酶；其中，所加入IPTG是诱导表达上述的工程菌，再通过肠激酶酶切，分离纯化得到枯草杆的浓度为0.1～1.0mM，优选为0.5mM，诱导温度为16～37℃，优选为22℃，诱导时间为3～16小时，优选为12小时。
本发明还提供了上述溶栓酶的表达方法在制备溶栓酶及相关药物中的应用。
针对本发明的设计原理作出如下说明
研究中，我们对现有的溶栓酶基因进行改造时，一般通过PCR扩增的方法得到枯草杆菌溶栓酶基因组DNA，但是由于大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)对基因序列具有一定的密码子偏爱性，因此常规方法得到的基因序列表达蛋白质的量并不高。
而套叠PCR技术可以将序列进行优化，从而解决这个问题。套叠PCR技术，又称重叠区扩增基因拼接法(gene splicing by overlap extension，gene SOEing)，是利用PCR技术在体外进行有效的基因重组和定点突变，而且不需要内切酶消化和连接酶处理。该技术使用简易，可利用这一技术很快获得其他依靠内切酶消化方法根本难以做到的产物。SOEing法的基本原理是向PCR产物内掺入一段新的、在原模板内不存在的序列。引物只需与其模板有效结合而不必完全匹配，特别是5’端序列。任何与原模板不匹配的碱基都将掺入到PCR产物中，这为创造定点突变提供了简便易行的方法。
表达载体的选择也会对蛋白表达量及蛋白活性有一定的影响。本发明人通过大量实验和数据得到，pET-40b与其他载体如pET-23a相比，在蛋白表达时更具备优势，可以提高蛋白的可溶性，进而增加目的蛋白的表达量。pET-40b是一种用于周质表达的原核质粒，包含T7启动子、His标签、肠激酶酶切位点，具有卡那霉素抗性，可表达出DsbC(二硫键异构酶)融合蛋白。以pET-40b作为表达载体，大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞的原核周质表达系统具有多方面的优势：(1)在DsbC的C末端进行融合表达，DsbC作为细菌蛋白的信号肽，引导目的蛋白穿膜到达周质空间。(2)DsbC具有还原性，能够帮助蛋白质形成正确的二硫键，还可增加蛋白的可溶性。因此该系统表达的蛋白不需氧化复性。(3)表达出的融合蛋白含有肠激酶酶切位点和His标签，可通过肠激酶酶切得到目的蛋白。同时His标签可以简化融合蛋白纯化及融合蛋白酶切后目的蛋白分离的过程。(4)相对于酵母表达，该表达系统周期较短。
本发明的有益效果：提供了一种溶栓酶基因、及由其构建的重组表达载体、重组菌以及应用，本发明通过套叠PCR技术优化得到的qk序列可以更好地被大肠杆菌表达菌株DE3识别，同时选用增加蛋白可溶性的载体pET-40b与优化后的qk构建形成新的重组表达载体和制备表达蛋白的重组菌，可以将功能性胞外蛋白酶分泌到细胞周质中，增加融合蛋白的可溶性和活性，最终获得的表达量高和酶活性高的枯草杆菌溶栓酶。该方法不包含包涵体溶解及蛋白复性的操作，降低了成本，具有更好的实用性。
附图说明
图1为枯草杆菌溶栓酶的基因qk扩增后PCR电泳结果图。
图2为枯草杆菌溶栓酶诱导型表达载体pET40b示意图。
图3为pET40b的酶切鉴定电泳结果。
图4为枯草杆菌溶栓酶在大肠杆菌中诱导表达的Western blot结果。
图5A为不同温度对枯草杆菌溶栓酶诱导分泌表达影响的电泳结果图。
图5B为不同诱导时间对枯草杆菌溶栓酶诱导分泌表达影响的电泳结果图。
图5C为IPTG浓度对枯草杆菌溶栓酶诱导分泌表达影响的电泳结果图。
图6分泌表达的枯草杆菌溶栓酶纯化后的电泳结果图。
图7为枯草杆菌溶栓酶在大肠杆菌中诱导型表达产物酶切后的SDS-PAGE凝胶电泳检测结果。
图8为分泌表达的枯草杆菌溶栓酶的蛋白平板活性检测结果照片。
图9为qk基因序列优化前后重组载体蛋白表达量对比电泳结果图。
图10为重组表达载体pET23a-qk和pET40b-qk上清裂解液蛋白表达量对比电泳结果图。
图11为重组表达载体pET23a-qk和pET40b-qk上清裂解液酶活力测定实验结果照片。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有引物合成及测序工作均由上海生工完成。
实施例1枯草杆菌QK-02的制备过程
将水稻叶置于85℃热处理10分钟，再用其包裹灭过菌的大豆，42℃培养24小时，后用培养液浸泡处理后的大豆，将浸泡过大豆的培养液作10-2～10-6稀释，涂布于营养琼脂平板，37℃倒置培养。所获的菌落分别接种在5mL培养液中，37℃，250rpm/min培养24h后，以6000rpm/min的转速离心5min。各取20μl上清液在纤维蛋白平板上测定溶栓酶活性，然后选择酶活性最高的菌株。
实施例2编码溶栓酶的基因qk的PCR扩增及序列优化
2.1编码枯草杆菌溶栓酶的基因qk的PCR扩增和克隆
枯草杆菌Bacillus Subtilis QK-02的基因组DNA提取按照常规方法(Saito，H.etal,1963,Biochim.Biophys.Acta 72:619-629)来进行。
PCR扩增的引物设计：
引物P1：5’ACGCGTCGACATGGCGCAATCTGTTCCTTACGGC
引物P2：3’CCGGAATTCTAGCTATTATTGTGCAGCTGC
PCR扩增反应体系50ul体系中：5μl枯草杆菌基因组DNA作为模板，引物P1、P2(10μM)各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTP(2mmol)5μl，KOD酶0.5μl，最后用无菌水补足至50ul。反应程序为：94℃，5min；94℃，30s；56℃，10s；74℃，30s；74℃，6min，一共35个循环。扩增完成后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，扩增出的片段大小为828bp。结果见图1，图中，M：Marker，1、2均为qk基因片段。
2.2编码溶栓酶的基因qk的优化
利用套叠PCR的方法优化qk基因。
引物如表1：
表1引物序列表
其中下划线标记为引入的酶切位点，最终扩增出的片段大小为1068bp，与原始序列对比多余的序列是帮助蛋白折叠。
实施例3溶栓酶重组表达载体的构建
优化后的qk基因片段和pET40b载体(图谱见图2)都经Sal I，EcoR I双酶切，片段经胶回收后与载体置于16℃连接过夜，再通过CaCl2法转化到DH5α细胞中，将转化产物涂布到含有卡那霉素(Kan)抗性的LB琼脂平板，37℃倒置培养14～16h。筛选出阳性克隆后提取质粒进行双酶切鉴定，如图3(M：Marker，1：酶切前的载体片段，2：经SalI/EcoRI双酶切后载体)，并将阳性重组子送至公司测序。
实施例4溶栓酶重组表达载体的诱导表达
(1)将克隆后的重组质粒pET40b-qk用钙转的方法转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中，涂布平板，筛选阳性重组子并鉴定。
(2)表达载体pET40b受T7启动子控制，该载体构建的重组重组菌在不同温度和不同浓度IPTG的诱导下，蛋白表达量不同。挑取单个阳性菌落接种于2mL LB培养基中，置摇床37℃过夜活化，然后以1:50的比例稀释到新鲜LB培养基中，37℃培养至A600＝0.8～1.0，加入不同浓度的IPTG，在不同温度条件下，分别诱导不同时间梯度，即在3h，5h，7h，12h后分别离心收集菌体，用1×PBS溶解，超声波破碎，4℃离心取上清，Western bolt检测蛋白表达(图4)，并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。
(3)采用纤维蛋白平板法估测枯草杆菌溶栓酶活性。将2mL纤维蛋白原溶液(50mg/mL)加入40mL琼脂糖溶液(0.75％)中，混匀后取8mL加到装有40μl凝血酶溶液(100NIH/mL)的塑料平板里，然后立刻混匀并放置30分钟，即为纤维蛋白平板。用合适孔径的吸管在纤维蛋白平板上打孔，以不同浓度尿激酶为标准品，各取20μl加到打好的孔中，IPTG诱导表达的菌液超声破碎后取20μl加入孔中，37℃恒温箱中放置15h～20h后取出，测定纤维蛋白溶解面积。
实施例5检测不同温度、诱导时间及IPTG浓度对枯草杆菌溶栓酶诱导表达的影响
5.1检测温度对枯草杆菌溶栓酶诱导表达的影响
在IPTG诱导浓度为0.5mM，诱导时间为6小时情况下，分别在16℃，22℃，30℃和37℃的条件下对重组菌BL21-pET40b-qk进行培养，分别测定菌液浓度和蛋白酶的纤溶活性。结果见图5A(1：16℃诱导蛋白表达结果，2：22℃诱导蛋白表达结果，3：30℃诱导蛋白表达结果，4：37℃诱导蛋白表达结果)，可得30℃条件下菌体的生长情况最好，枯草杆菌溶栓酶的表达活性也最高。然而低温有利于蛋白的分泌表达，最终采取温度为22℃。
5.2检测诱导时间对枯草杆菌溶栓酶表达的影响
在IPTG诱导浓度为0.5mM，诱导温度为30℃情况下，分别在发酵3h，5h，7h，和12h时取样，测定菌液的菌体浓度和纤溶活性。结果见图5B(1：3h诱导蛋白表达结果，2：5h诱导蛋白表达结果，3：7h诱导蛋白表达结果，4：12h诱导蛋白表达结果)，5小时时菌液浓度达到最大，而到7小时纤溶活性才达到最大值。由于温度降低时，菌体分泌活性蛋白需要更长的时间诱导，所以选取时间为12h。
5.3检测IPTG浓度对枯草杆菌溶栓酶表达的影响
在诱导温度为30℃，诱导时间为7小时情况下，分别用0.1mM，0.25mM，0.5mM，0.75mM，1.0mM的IPTG进行诱导，测定菌液的菌体浓度和纤溶活性。结果见图5C(1：0.1mM IPTG诱导蛋白表达结果，2：0.25mM IPTG诱导蛋白表达结果，3：0.5mM IPTG诱导蛋白表达结果，4：0.75mM IPTG诱导蛋白表达结果，5：1.0mM IPTG诱导蛋白表达结果)，在0.1～0.5mM范围内，纤溶活性随IPTG浓度的升高而升高，而当IPTG浓度超过0.5mM时，纤溶活性无明显变化，所以0.5mM为最佳诱导浓度。
上述试验结果表明，枯草杆菌溶栓酶在大肠杆菌中诱导分泌表达的温度优选为22℃，诱导时间优选为12h，诱导物IPTG的浓度优选为0.5mM。
实施例6重组溶栓酶QK的肠激酶酶切及纯化
6.1镍柱纯化融合蛋白
由于融合蛋白在N端含6个His标签，因而可以用镍柱进行纯化。先平衡柱子，用低浓度的咪唑洗脱杂蛋白，再用高浓度咪唑吸附目的蛋白，收集流出液，清洗柱子并再生(图6)。
6.2融合蛋白的透析
过高浓度的盐离子和咪唑会影响后续的肠激酶酶切效用。将含有目的蛋白的洗脱液用MW15000透析袋在4℃条件下用纯水进行透析，除去盐离子、咪唑以及一些小分子蛋白质。纯水量至少为洗脱液的50倍，每隔1h换一次水，一共换三次水，透析至少4h。
6.3蛋白浓缩
用4mL 10KMWCO的millipor超滤管，将蛋白以5000rpm/min的速度离心15min，直至所有的蛋白样品浓缩至300μl左右。再用稀释50倍后的肠激酶酶切缓冲液加至4mL，继续用500rpm/min的速度离心15min，重复两次，直至蛋白样品保持在300μl左右。
6.4融合蛋白酶切
蛋白浓缩后通过肠激酶酶切得到目的蛋白。总体系50μl，酶切体系为：10×肠激酶Buffer 5μl，融合蛋白溶液20μl，肠激酶1μl，最后用水补足至50μl。置于22℃，酶切14h。
6.5镍柱分离目的蛋白
将酶切后的样品溶液以10000g/min的转速离心两分钟后，取上清。用咪唑浓度为10mM的洗脱液平衡镍柱后，将离心后的样品溶液过柱，收集流出液。因为酶切后融合蛋白的N端上有6×His标签，因此能够结合到镍柱上，流出液中含有目的蛋白。收集目的蛋白后测蛋白浓度。
此纯化后的蛋白通过SDS-PAGE凝胶电泳检测，显示只有一条带(图7)。再通过纤维蛋白平板法测定溶栓活性(表2及图8)。
表2subtilisin QK纯化结果
| 步骤 | QK纤溶活性(1U/ml) | QK纯化倍数 |
| 培养基中 | 259.9 | |
| 镍柱纯化后 | 1325.5 | 7.2 |
| 透析后 | 3921.9 | 15.09 |
| 浓缩后 | 9424 | 36.26 |
试验例
1、将原始基因片段和优化后的基因片段经Sal I/EcoR I酶切后，分别与pET40b载体连接，构建成两个新的重组表达载体。再通过相同的方法，在同等条件下诱导表达溶栓酶蛋白，电泳检测序列优化前后蛋白表达量，如图9，其中1为包含原始序列的重组载体蛋白表达量，2为包含优化序列的重组载体蛋白表达量。从图中可知：qk序列经过优化后，重组表达载体的蛋白表达量提高。
2、将优化后的基因片段经Sal I/EcoR I酶切后，分别与载体pET23a和pET40b连接，构建成两个新的重组表达载体，经IPTG诱导表达出目的蛋白，二者裂解液通过电泳检测表达量的情况，如图10，其中1为pET23a裂解上清液，2为pET40b裂解上清液。再通过酶活力实验对比二者的活性，如图11，其中1、2、3为pET23a裂解上清液，5、6、7为pET40b裂解上清液，4为阴性对照。与普通的不携带DsbC融合蛋白表达载体pET23a对比，证明pET40b表达的酶具有高活性和高表达量的特点。
Claims (10)
1.一种溶栓酶基因，其核苷酸序列或核苷酸序列的互补链如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的溶栓酶基因，其特征在于：所述溶栓酶基因是从枯草杆菌Bacillus sutilis QK-02中提取基因组DNA，再通过套叠PCR扩增优化得到，其中套叠PCR所用引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示。
3.权利要求1或2所述溶栓酶基因在制备溶栓酶及相关药物中的应用。
4.一种含有溶栓酶基因的重组载体，其特征在于：所述重组载体由pET40b表达载体和核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的溶栓酶基因经过Sal I/EcoR I酶切后重组而成。
5.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体的T7启动子前插入有lac操纵子。
6.权利要求4或5所述含有溶栓酶基因的重组载体在制备溶栓酶及相关药物中的应用。
7.一种表达溶栓酶的重组菌，是将权利要求4或5所述的重组载体通过钙转的方法导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中所得到的重组菌。
8.权利要求7所述表达溶栓酶的重组菌在制备溶栓酶及相关药物中的应用。
9.一种溶栓酶的制备方法，其特征在于：利用权利要求7所述表达溶栓酶的重组菌在蛋白表达时，其诱导过程中加入IPTG诱导，再通过肠激酶酶切，分离纯化得到枯草杆菌溶栓酶；其中，所加入IPTG的浓度为0.1～1mM，诱导温度为16～37℃，诱导时间为3～16小时。
10.权利要求9所述溶栓酶的表达方法在制备溶栓酶及相关药物中的应用。
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