CN105039377A - 溶栓酶基因qk-02的表达方法及专用表达载体和工程菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种溶栓酶基因QK-02的专用表达载体，该载体由pET40b表达载体和溶栓酶基因经过Sal？I/EcoR？I酶切后重组而成。本发明还提供了一种用于表达枯草杆菌溶栓酶的工程菌，是将上述载体导入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中得到的重组菌。本发明还提供了一种溶栓酶基因QK-02的表达方法，是发酵上述工程菌经诱导后，再对发酵产物通过肠激酶酶切及镍柱的分离纯化得到qk-02。本发明的重组酶具有高活性，抗氧化，无致病性，高分泌特性的优点，可以直接将功能性胞外蛋白酶分泌到细胞周质中，大大增加了融合蛋白的可溶性，提高了蛋白的活性，避免了包涵体溶解及复性带来的麻烦，成本低。因此，该酶在心血管疾病治病中有重要的应用价值。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，具体的是指一种溶栓酶基因QK-02的表达方法及专用表达载体和工程菌。
【背景技术】
由于遗传背景较清楚，大肠杆菌作为基因克隆受体的首选菌株已被广泛应用于基因工程中，并取得了许多重大成果。大肠杆菌表达具有以下优势：目标基因表达水平高；表达系统成熟完善；易于培养(培养方法简单、生长快、培养周期短、抗污染能力强)、成本低；被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。然而，其表达也有一些缺点，如缺乏翻译后加工修饰，易形成包涵体蛋白，不利于后续的操作等。
枯草杆菌溶栓酶(BacillussubtilisQK02，保存序列号：CCTCCNO：M203078)是通过检测降解纤维蛋白能力的方法筛选到的，研究表明，该酶具有较强的纤溶活性，可产生大量的溶栓酶QK，是一种潜在的溶栓药物，它不仅具有良好的溶栓效果，而且可经口服达到纤溶目的，其特性优于当前临床应用的溶栓药物，如链激酶、尿激酶等。发明人还发现该酶在体内外及血管内皮细胞中具有拮抗由血红素、NaNO2和H2O2带来的损伤的能力。目前，该酶主要来源于野生枯草芽孢杆菌发酵的纳豆、豆豉等，但是纳豆、豆豉的风味还不能被许多人所习惯和接受，从发酵液中分离纯化枯草杆菌溶栓酶通常产量较低、生产成本高，这些因素都在一定程度上限制了枯草杆菌溶栓酶的开发和应用。
【发明内容】
有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明提供一种溶栓酶基因QK-02的表达方法及专用表达载体和工程菌。
为实现上述目的，本发明所提供的溶栓酶基因QK-02的专用表达载体，所述载体在细胞周质中高水平表达重组蛋白，引导重组蛋白分泌到培养基中，其特征在于：所述载体由pET40b表达载体和溶栓酶基因经过SalI/EcoRI酶切后重组而成；所述载体基于T7启动子通过添加lac操纵子改造成为IPTG诱导的启动子；所述载体具有His标签、肠激酶酶切位点，具有卡那霉素抗性，可表达出DsbC(二硫键异构酶)融合蛋白。
作为优选方案，所述载体中含有DsbC融合蛋白。
进一步地，本发明还提供一种用于表达枯草杆菌溶栓酶的工程菌，是将上述枯草杆菌溶栓酶的专用表达载体导入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中得到的重组菌。可采用生物工程领域中常用的方法，例如Cacl2法、电穿孔转化法、原生质体转化法等将所构建的重组表达载体导入BL21(DE3)感受态细胞中。
本发明还提供一种溶栓酶基因QK-02的表达方法，是发酵上述工程菌，经诱导后，再对发酵产物通过肠激酶酶切及镍柱的分离纯化得到qk-02。
进一步地，它包括如下步骤：
(1)从枯草杆菌BacillussutilisQK-02中提取基因组DNA，并利用PCR扩增得到DNA片段(即qk基因)；
(2)将qk基因克隆到表达载体pET40b中，然后转化到克隆菌株DH5α感受态中，筛选阳性克隆DH5α-qk；
(3)将阳性重组克隆DH5α-qk转化到表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中，并用IPTG诱导表达重组蛋白酶，SDS-PAGE及Westernblot法检测蛋白大小，BCA方法检测蛋白浓度；
(4)重组蛋白的分离纯化：用肠激酶酶切，His标签鎳柱及透析浓缩纯化的方法得到较纯的重组蛋白qk，SDS-PAGE检测；
(5)诱导表达条件的优化：加入IPTG，所加入IPTG的浓度为0.1-1mM，诱导温度为16-37℃，诱导时间为3-16小时；并进行Western及SDS-PAGE的检测。
进一步地，所述步骤(5)中加入IPTG的浓度为0.5mM，诱导温度为22℃，诱导时间为12小时。
本发明所提供的枯草杆菌溶栓酶的表达方法，是诱导表达上述枯草杆菌溶栓酶的专用表达工程菌，再通过肠激酶酶切，分离纯化得到枯草杆菌溶栓酶。
本发明的优点在于：本发明的用于表达枯草杆菌溶栓酶的载体，是新的载体pET40b允许在细胞周质中高水平表达重组蛋白。这种表达系统不同于传统的原核表达，能正确折叠二硫键，不需要复性就可以得到具有活性的多肽，相对而言简单有效，减少了样本在分离纯化、复性等过程中的损耗以及获得正确活性蛋白的不确定性。本发明的表达载体，高活性，抗氧化，无致病性，高分泌特性，可以直接将功能性胞外蛋白酶分泌到细胞周质中，大大增加了融合蛋白的可溶性，提高了蛋白的活性，避免了包涵体溶解及复性带来的麻烦，成本低。因此，该酶在心血管疾病治病中有重要的应用价值。
【附图说明】
图1为枯草杆菌溶栓酶诱导型表达载体pET40b(+)示意图。
图2为枯草杆菌溶栓酶PCR后结果图。图中：M:Marker1、2均为QK-O2DNA样品。
图3为pET40b的酶切鉴定结果。图中：M:Marker1为没有酶切的载体片段，2为双酶切后结果。
图4为枯草杆菌溶栓酶在大肠杆菌中诱导表达的Western结果。
图5为枯草杆菌溶栓酶在大肠杆菌中诱导型表达产物酶切后的SDS-PAGE检测结果。
图6为分泌表达的枯草杆菌溶栓酶的蛋白平板活性检测结果。
图7为检测温度、诱导时间和IPTG浓度对枯草杆菌溶栓酶诱导分泌表达影响的结果。
表1为枯草杆菌溶栓酶QK-2纯化结果。
【具体实施方式】
下面结合附图和具体实例对本发明进行详细的说明。
实施例一：枯草杆菌QK-02的制备过程
(1)取水稻叶85℃热处理10分钟，用其包裹灭过菌的大豆，42℃培养24小时，后用培养液浸泡培养过的大豆，将浸泡过大豆的培养液作10-2～10-6稀释，涂布营养琼脂平板，37℃倒置培养后在平板上长出菌落。
所获的菌落分别接种在5ml培养液中37℃，250rpm培养24h后，6000rpm离心5min。取20ul上清液在纤维蛋白平板上测定溶栓酶活性，然后选择酶活性最高的菌株。
实施例二：编码溶栓酶QK的基因qk的PCR扩增和克隆及序列测定
枯草杆菌BacillusSubtilisQK-02的基因组DNA提取按照常规方法(Saito，H.etal，1963，Biochim.Biophys.Acta72:619-629)来进行。
PCR扩增的引物设计：
引物P1：5’ACGCGTCGACATGGCGCAATCTGTTCCTTACGGC
引物P2：3’CCGGAATTCTAGCTATTATTGTGCAGCTGC
扩增出的片段大小为828bp
PCR扩增反应体系50ul体系中：5ul枯草杆菌基因组DNA作为模板，引物P1、P2(10uM)各1ul，10×PCR缓冲液5ul，dNTP(2mmol)5ul，KOD酶0.5ul，其余用无菌水补足。反应程序为：94℃5min，94℃30s，56℃10s，74℃30s，35个循环，74℃6min。扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳中检测。结果见图2。
扩增产物和pET40b载体(图谱见图1)都经SalⅠ，EcoRⅠ双酶切，胶回收后16℃连接过夜，CaCl2法转化到DH5α细胞中，转化产物涂布到含有卡那(Kan)抗生素的LB琼脂平板上，筛选重组子，37℃培养14-16h，挑选阳性克隆，提质粒双酶切鉴定(结果见图3)，并送测序。
实施例三：重组表达质粒qk的诱导表达
(1)将克隆后的重组质粒pET40b用钙转的方法转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中，涂布平板，筛选阳性重组子并鉴定。
(2)表达载体pET40b受T7启动子控制，用该载体构建的表达质粒在不同温度下IPTG诱导表达。挑取单个阳性菌落接种于2mlLB培养基中，置摇床37℃过夜活化，然后以1：50的比例稀释到新鲜LB培养基中，37℃培养至A600＝0.8～1.0，加入不同浓度的IPTG，分别诱导不同时间梯度，在3h，5h，7h，12h后分别离心收集菌体，用1×PBS溶解，超声波破碎，4℃离心取上清，Western检测蛋白表达(条带见图4)，并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。
(3)采用纤维蛋白平板法估测枯草杆菌溶栓酶活性。将2ml纤维蛋白原溶液(50mg/ml)加入40ml琼脂糖溶液(0.75％)中，混匀后取8ml加到装有40ul凝血酶溶液(100NIH/ml)的塑料平板里，然后立刻混匀并放置30分钟后，即为纤维蛋白平板。用合适孔径的吸管在纤维蛋白平板上打孔，以不同浓度尿激酶为标准品，各取20ul加到打好的孔中，IPTG诱导表达的菌液超声破碎后取20ul到孔中，37℃恒温箱中放置15h～20h后取出，测定纤维蛋白溶解面积。
实施例四：重组溶栓酶qk的肠激酶酶切及纯化
鎳柱纯化融合蛋白：由于融合蛋白在N端含6个His标签，因而可以用镍柱进行纯化。先平衡柱子，用低浓度的咪唑洗脱杂蛋白，再用高浓度咪唑吸附目的蛋白，收集洗脱峰，清洗柱子并再生。
透析：过高的盐离子浓度和咪唑会影响后续的肠激酶酶切效用。将含有目的蛋白的洗脱液用MW15000透析袋在4℃条件下用纯水进行透析，除去盐离子、咪唑以及一些小分子蛋白质。纯水量至少为洗脱液的50倍，每隔1h换一次水，一共换三次水，透析至少4h。
浓缩蛋白：用4ml10KMWCO的millipor超滤管，将蛋白以5000rpm/min的速度离心15分钟，直至所有的蛋白样品浓缩至300ul左右。再用稀释50倍后的肠激酶酶切缓冲液加至4ml，继续用500rpm/min的速度离心15min，重复两次，直至蛋白样品保持在300ul左右。
融合蛋白酶切：蛋白浓缩后通过肠激酶切除目的蛋白。总体系50ul，酶切体系为：10×肠激酶Buffer5ul，融合蛋白溶液20ul，肠激酶1ul，其余用水补足。22℃酶切14h。
鎳柱分离目的蛋白：将酶切后的样品溶液10000g/min离心两分钟后，取上清。用咪唑浓度为10mM的洗脱液平衡鎳柱后，将离心后的样品溶液过柱，收集流穿液。因为酶切后，N端的融合蛋白上有6×His标签，因此N端能够挂在柱上，而流穿液中含有目的蛋白。分别测蛋白浓度。
此纯化后的蛋白在SDS-PAGE显示只有一条带(结果见图5)。纤维蛋白平板法测定溶栓活性(结果见表1及图6)。
实施例五：检测不同诱导温度、诱导时间及IPTG浓度对枯草杆菌溶栓酶诱导表达的影响
(1)检测温度对枯草杆菌溶栓酶诱导表达的影响
在IPTG诱导浓度为0.5mM，诱导时间为6小时情况下，分别在16℃，22℃，30℃和37℃对工程菌BL21-pET40b-qk进行培养，测定菌液的菌体浓度和纤溶活性。结果见图7A，30℃培养时菌体的生长情况最好，枯草杆菌溶栓酶的表达活性也最高。然而低温有利于蛋白的分泌表达，所以采取温度为22℃
(2)检测诱导时间对枯草杆菌溶栓酶表达的影响
在IPTG诱导浓度为0.5mM，诱导温度为30℃情况下，分别在发酵3h，5h，7h，和12h时取样，测定菌液的菌体浓度和纤溶活性。结果见图7B，5小时时菌液浓度达到最大，而到7小时纤溶活性才达到最大值。由于温度降低时，菌体分泌活性蛋白需要更长的时间诱导，所以选取时间为12h。
(3)检测IPTG浓度对枯草杆菌溶栓酶表达的影响
在诱导温度为30℃，诱导时间为7小时情况下，分别用0.1mM，0.25mM，0.5mM，0.75mM，1.0mM的IPTG进行诱导，测定菌液的菌体浓度和纤溶活性。结果见图7C，在0.1～0.5mM范围内，纤溶活性随IPTG浓度的升高而升高，而当IPTG浓度超过0.5mM时，纤溶活性无明显变化，所以选0.5mM为最佳诱导浓度。(结果分别见图7A7B7C)
上述试验结果表明，枯草杆菌溶栓酶在大肠杆菌中诱导分泌表达的温度优选为22℃，诱导时间优选为12h，诱导物IPTG的浓度优选为0.5mM。
表1枯草杆菌溶栓酶QK-2纯化结果
本发明的重组酶与常规的溶栓药物相比有以下优点：
(1)高活性：该酶具有更高的纤溶活性，达到41000IU/mg，比枯草杆菌溶栓酶的溶栓能力高出3倍以上。
(2)抗氧化：可以保护由血红素、NaNO3、和H2O2引起的人血管内皮细胞氧化损伤的功能。
(3)抗PAI-1抑制作用：直接水解血栓中的纤维蛋白来溶栓，避免了PAI-1对t-PA等溶栓药物的抑制作用。
(4)纤维蛋白特异性：该酶只水解纤维蛋白，对纤维蛋白原没有作用，因而在一定程度上避免了出血现象的发生。
表达载体pET-40b(+)是一种用于周质表达的原核质粒，可表达出DsbC(二硫键异构酶)融合蛋白，包含T7启动子、His标签、肠激酶酶切位点，具有卡那霉素抗性。以pET-40b(+)作为表达载体，大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞的原核周质表达系统具有多方面的优势：(1)在DsbC的C末端进行融合表达，DsbC作为细菌蛋白的信号肽，引导目的蛋白穿膜到达周质空间。(2)DsbC能执行还原功能，帮助蛋白质形成正确的二硫键，还可增加蛋白的可溶性，该系统表达的蛋白不需氧化复性。(3)表达出的融合蛋白含有肠激酶酶切位点和His标签，可通过肠激酶酶切释放出目的蛋白。同时利用His标签，简化了用于融合蛋白纯化及融合蛋白酶切后目的蛋白分离的过程。(4)相对于酵母表达，周期较短。
实验证明，本发明工程菌的表达产物具有较高的纤溶活性，每毫升发酵液活性最高可达9424IU/mg，食用安全，对人体无毒副作用，稳定性好，适用于各种食品，便于直接口服，生产成本低的优点，为将枯草杆菌溶栓酶开发生产为口服溶栓功能性保健食品奠定了基础，工业应用前景广阔。
Claims (6)
1.一种溶栓酶基因QK-02的专用表达载体，所述载体在细胞周质中高水平表达重组蛋白，引导重组蛋白分泌到培养基中，其特征在于：所述载体由pET40b表达载体和溶栓酶基因经过SalI/EcoRI酶切后重组而成；所述载体基于T7启动子通过添加lac操纵子改造成为IPTG诱导的启动子；所述载体具有His标签、肠激酶酶切位点，具有卡那霉素抗性，表达出DsbC(二硫键异构酶)融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的溶栓酶基因QK-02的专用表达载体，其特征在于：所述载体中含有DsbC融合蛋白。
3.表达溶栓酶基因QK-02的工程菌，其特征在于：是将权利要求1或2所述的载体导入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)所得到的重组菌。
4.一种溶栓酶基因QK-02的表达方法，其特征在于：是发酵权利要求3所述的工程菌，经诱导后，再对发酵产物通过肠激酶酶切及镍柱的分离纯化得到qk-02。
5.根据权利要求4所述的溶栓酶基因QK-02的表达方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)从枯草杆菌BacillussutilisQK-02中提取基因组DNA，并利用PCR扩增得到DNA片段(即qk基因)；
(2)将qk基因克隆到表达载体pET40b中，然后转化到克隆菌株DH5α感受态中，筛选阳性克隆DH5α-qk；
(3)将阳性重组克隆DH5α-qk转化到表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中，并用IPTG诱导表达重组蛋白酶，SDS-PAGE及Westernblot法检测蛋白大小，BCA方法检测蛋白浓度；
(4)重组蛋白的分离纯化：用肠激酶酶切，His标签鎳柱及透析浓缩纯化的方法得到较纯的重组蛋白qk，SDS-PAGE检测；
(5)诱导表达条件的优化：加入IPTG，所加入IPTG的浓度为0.1-1mM，诱导温度为16-37℃，诱导时间为3-16小时；并进行Western及SDS-PAGE的检测。
6.根据权利要求4所述的溶栓酶基因QK-02的表达方法，其特征在于：所述步骤(5)中加入IPTG的浓度为0.5mM，诱导温度为22℃，诱导时间为12小时。
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|---|---|
| CN (1) | CN105039377A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113502309A (zh) * | 2021-06-21 | 2021-10-15 | 中国科学院海洋研究所 | 一种促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1563378A (zh) * | 2004-04-06 | 2005-01-12 | 武汉大学 | 溶栓酶基因、重组蛋白及其制备方法 |
| CN101225398A (zh) * | 2007-01-18 | 2008-07-23 | 王尚武 | 由原核细胞制备活性t-PA的技术 |
| CN101535492A (zh) * | 2005-02-11 | 2009-09-16 | 南加州大学 | 表达含有二硫键的蛋白质的方法 |
| CN101892253A (zh) * | 2010-06-30 | 2010-11-24 | 天津科技大学 | 在大肠杆菌中无需包涵体复性制备溶栓药物瑞替普酶的方法 |
| CN104928308A (zh) * | 2015-06-19 | 2015-09-23 | 武汉真福医药股份有限公司 | 溶栓酶基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌以及应用 |
-
2015
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1563378A (zh) * | 2004-04-06 | 2005-01-12 | 武汉大学 | 溶栓酶基因、重组蛋白及其制备方法 |
| CN101535492A (zh) * | 2005-02-11 | 2009-09-16 | 南加州大学 | 表达含有二硫键的蛋白质的方法 |
| CN101225398A (zh) * | 2007-01-18 | 2008-07-23 | 王尚武 | 由原核细胞制备活性t-PA的技术 |
| CN101892253A (zh) * | 2010-06-30 | 2010-11-24 | 天津科技大学 | 在大肠杆菌中无需包涵体复性制备溶栓药物瑞替普酶的方法 |
| CN104928308A (zh) * | 2015-06-19 | 2015-09-23 | 武汉真福医药股份有限公司 | 溶栓酶基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌以及应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SHOU-TAO ZHANG ET AL.: "Expression of Soluble and Functional Snake Venom Fibrinolytic Enzyme Fibrolase Via the Co-Expression of DsbC in Escherichia coli", 《PROTEIN & PEPTIDE LETTERS》 * |
| XIAO-FA ZHUOA ET AL.: "Co-expression of disulfide oxidoreductases DsbA/DsbC markedly enhanced soluble and functional expression of reteplase in Escherichia coli", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113502309A (zh) * | 2021-06-21 | 2021-10-15 | 中国科学院海洋研究所 | 一种促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法 |
| CN113502309B (zh) * | 2021-06-21 | 2023-02-17 | 中国科学院海洋研究所 | 一种促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法 |
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Application publication date: 20151111 |
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